INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍAINGENIERÍA QUÍMICA

Prácticas de Microbiología Básica________________________________________________________________________________

Práctica 1Aislamiento de microorganismos del suelo

Objetivo

Aislar microorganismos a partir de muestras naturales de suelo y conservar algunos deellos en cultivo puro.

Materiales

1. Bata de laboratorio y marcador permanente.

2. Muestras de suelo: aprox. 2 g de suelo de diverso origen, resuspendido en 50 ml de agua mineral.3. Tubo con10 ml agua estéril, pipetas automáticas (P1000 o P200), puntas de pipeta estériles.4. 2 Placas de cada uno de los siguientes medios: AN (Agar Nutritivo), LB (Luria-Bertani), y SSM

(Streptomyces Selective Medium)5. Alcohol de quemar, mechero de alcohol, asa de siembra de vidrio.

Procedimiento

DÍA PRIMERO: Aislamiento I

1. Mezclar la muestra de suelo (en tubo de 50 ml) con 50 ml de agua mineral. Agitar vigorosamente durante

unos 5 minutos. Dejar reposar para que sedimente el material grueso.

2. Hacer una dilución 1/50 a partir del líquido sobrenadante de las muestras (200µl en 10ml en el tubo

preparado)

3. Inocular las 2 placas de los 3 medios con 200µl de sobrenadante sin diluir y 200µl de la dilución 1/50.

4. Incubar las placas a 30º C.

DÍA SEGUNDO: Aislamiento II1. Observar los microorganismos que han crecido en las placas. Calcular la carga microbiana de la

muestra inicial.2. Resembrar en placas nuevas de AN para aislar varios microorganismos: ¡Colonias aisladas!3. Incubar las placas hasta el día siguiente a 30º C.

Práctica 2Resiembra en tubo y Tinción de Gram

Objetivos

Resembrar en tubo de agar inclinado los microorganismos seleccionados en la Práctica 1.Tinción de Gram de los microorganismos seleccionados y resembrados en tubo de agarinclinado.Observaciones Tinción de Gram:

Es una tinción diferencial de gran importancia en Microbiología porque permite diferenciar dos grandes

grupos de bacterias, Gram+ y Gram-, según se comporten ante esta tinción. El fundamento radica en la diferente

estructura de la pared celular de ambos grupos. Se emplean dos colorantes, cristal violeta y safranina. Tras la

tinción con el primer colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con etanol que arrastrará al colorante sólo en

las Gram (-), mientras que en las Gram (+) el colorante queda retenido y las células permanecerán azules. Las

células Gram (-) se teñirán después con un colorante de contraste (safranina) para que puedan observarse.

Materiales

1. Bata de laboratorio, marcador permanente y encendedor de gas, mechero de alcohol, asa de siembra.2. Placas de los microorganismos aislados por estría en la Práctica 1

3. 4 Tubos de agar inclinado (Agar Nutritivo)4. Reactivos para la Tinción de Gram: Cristal violeta, Lugol, Etanol, Safranina, Agua.

5. Material para microscopía óptica: Portas y microscopio óptico y aceite de inmersión (para 100X)

Procedimiento

DÍA PRIMERO: Resiembra a tubo de agar inclinado1. Empleando la técnica estéril, inocular cada microorganismo aislado en un tubo de agar inclinado

(Agar Nutritivo). Incubar a 30º C hasta el día siguiente.

DÍA SEGUNDO: Tinción de Gram a partir de las resiembras del día anterior

1. Extensión de la muestra en el porta (hasta 2 microorganismos por porta)2. Fijar a la llama (¡SIN QUEMAR LA MUESTRA!)3. Cristal violeta 1-2 minutos. Tirar el exceso de colorante (¡NO lavar con agua!).4. Añadir lugol, esperar 1 minuto y tirar el exceso (¡No lavar con agua!)5. Decolorar con etanol (20 segundos). Lavar con agua.6. Añadir Safranina (colorante de contraste), esperar 1 minuto. Lavar con agua.7. Secar al aire (o ¡muy suavemente a la llama!)8. Observar al microscopio con objetivo 40X. Observar con objetivo 100X y aceite de inmersión.9. ANOTAR LOS RESULTADOS: FORMA, TINCIÓN GRAM, OBSERVACIONES.

Práctica 3Detección de actividades enzimáticas en placa

Objetivos

Comprobar si los microorganismos seleccionados poseen actividades enzimáticasextracelulares: amilasa, celulasa, proteasa.

Materiales

1. Bata de laboratorio, marcador permanente y encendedor de gas, mechero de alcohol, asa de siembra,guantes de plástico

2. Tubos de los microorganismos aislados en la Práctica 2

3. Placas de agar nutritivo con sustratos en superficie (Almidón, Carboximetil Celulosa, Caseína)4. Reactivos para revelar las actividades enzimáticas: Yodo resublimado, Rojo Congo 0.5% en agua,

Cloruro Sódico 1 M, TCA 1% en agua.

Procedimiento

DÍA PRIMERO: Inoculación de microorganismos seleccionados en placas de medio con sustratos1. Empleando la técnica estéril, hacer una estría de cada microorganismo aislado en cada placa de Agar

Nutritivo con sustrato. Incubar a 30º C hasta el día siguiente.

DÍA SEGUNDO: Observación de los halos de degradación de sustratos en placa

1. Observar las placas para ver halos de degradación de sustratos2. Revelar los halos de degradación para incrementar el contraste:

• Actividad amilásica: Vapores de Yodo resublimado (¡GUANTES Y EN CAMPANA DEEXTRACCIÓN!)

• Actividad Célulasica: Inundar la placa con Rojo Congo (0,5%) (. Esperar 10 minutos. Lavar conCloruro Sódico 1 M. (¡GUANTES!)

• Actividad proteásica: Inundar la placa con TCA 1%. (¡GUANTES!)