Upload
annisa-rachmawati
View
17
Download
5
Embed Size (px)
DESCRIPTION
laporan praktikum di blok 3.
Citation preview
PRAKTIKUM 5
ISOLASI DNA
I. Judul Blok
Blok 3 (Sel & Molekul)
II. Topik Praktikum
Sel & molekul
III. Laboratorium Pelaksana
Laboratorium Biomol
IV. Tujuan Belajar
Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA genom
Mahasiswa dapat menjelaskan prosedur isolasi DNA plasmid
Mahasiswa dapat menjelaskan fungsi masing-masing reagen & tahapan dalam proses
isolasi DNA genom & DNA plasmid
V. Alat dan Bahan
ISOLASI DNA GENOM
Bahan: Tanaman sampel, alkohol 70%, alkohol 96 %, akuades, CTAB
(cetyltrimethylammonium bromide), β-merkaptol, KIA (kloroform: isoamilalkohol= 24:1),
isopropanol, bufer TE, SDS,RNA-se
RNAse, amonium asetat.
Alat: Tabung reaksi, beaker glass, spatula, mikropipet beserta tipnya, tabung mikrosentrifuga
1,5 ml, vortex, waterbath, mikrosentrifuga, LAF, freezer, dan sarung tangan.
ISOLASI DNA PLASMID
A. BAHAN
1. Solution I (150mM glukosa, 25mM Tris C1 (pH 8.0), 10mM EDTA (pH 8.0))
2. Solution II (0,2 n NaOH, 1% SDS)
3. Solution III (60 ml 5M potassium acetate, 11,5 ml Glacial acetic acid, 28,5 ml H20)
4. PCI/phenol : chloroform Isoamylalcohol (24:1)
5. Buffer TE
6. Ethanol pa
7. NaAc
B. ALAT
1. Mini sentrifuge berpendingin
2. Micropipet
3. Vortex
4. Pengering DNA
VI. Prosedur
A. CARA KERJA ISOLASI DNA GENOM
1. 2 gram sampel gerus dengan N2
2. Pindahkan serbuk sampel halus dalam kondisi beku ke tabung sentrifugasi
3. add 8 ml buffer ekstraksi, 10 µl betamercopto, 400 µl 20% SDS
4. Vortex sampai homogen, inkubasi pada suhu 65°C for 10min
5. Tambahkan 2,6 ml 5 M potasium acetat, mix dengan membolak-balik
6. Inkubasi on ice 20 min
7. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C
8. Take supernantan + 5 ml 1sopropanol, mix gentle
9. Jika DNA tampak melayang-layang, keringkan, larutkan dengan 600 µl TE buffer
10. Bila tidak inkubasikan suhu -20°C, for 30 min
11. Sentrifugasi 10.000 rpm, 10 min 4°C
12. Take pellet, keringkan +600 µl TE buffer
PURIFIKASI DNA
13. +5 µl RNA-se (10 mg/ml), inkubasi suhu 37°C, for 15 min
14. +PCI 700 µl, vortex,
15. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C
16. Kloroform equal volume, kemudian sentrifugasi seperti PCI
17. Pindahkan larutan bagian atas + 0,8 vol isoprapanol dan 0,2 vol 3M sodium asetat
18. Campur, inkubasi suhu -80°C, for 15 h
19. Sentrifugasi 10.000 rpm, 20 min, 40°C
20. Pellet cuci dengan 70% ethanol, kemudian disentrifugasi lagi.
21. Pellet DNA dikeringkan dengan vacum + 200 µl TE buffer
22. Estimasi kandungan DNA dengan spektrofotometer.
CARA KERJA ISOLASI DNA PLASMID
1. Transfer single koloni bakteri pada media LB 2 ml yang mengandung antibiotik dan
diinkubasi selama satu malam pada suhu 37°C di dalam penggojok dengan kecepatan 120
rpm
2. Masukkan 1,5 ml kultur bakteri pada ependolf. Sentrifuge pada 12.000 rpm selama 10
menit pada suhu 4°C, kemudian supernatan dibuang
3. Tambahkan 100 µl solution I, padfa pellet bakteri dan di vortex sampai bakteri benar-
benar tersuspensi
4. Tambahkan 200 µl fresh solution II, kemudian dibolak-balik 5c (swirling) dan jangan di
vortex. Inkubasi selama 5 menit sampai bening (menunjukkan lisis terjadi)
5. Tambahkan 150 µl solution III, lakukan swirling dan letakkan dalam es selama 5 menit
6. Sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4°C. Transfer supernatan pada tube
sentrifuge baru.
7. Selanjutnya ukur volume supernatan dan tambahkan PCI equal volume, lakukan vortex
dan sentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm selam 10 menit
8. Ambil supernatan (lap. Atas) lalu tambahkan ethanol pa dan 3M NaAc, ditambahkan
masing-masing sebanyak 2,5 dan 0,1 dari volume supernatan. Selanjutnya dipresipitasi
pada suhu -20°C selama satu jam
9. Kemudian di sentrifuge dengan kecepatan 12.000 rpm 10 menit pada suhu 4°C
10. Pellet dicuci dengan 1ml 70% ethanol dan disentrifuge pada kecepatan 12.000 rpm 5
menit pada suhu 4°C
11. Pellet dikeringkan dan diresuspensi dalam 20 µl buffer TE dan disimpan pada suhu 4°C
dan disimpan sampai siap digunakan
VII. DASAR TEORI
Komponen utama kromosom pada eukariota adalah DNA dan protein histon. Protein
histon ini bersifat basa, sehingga dapat menetralkan sifat asam dari DNA. Pada dasarnya sel
mengandung dua asam nukleat, yaitu RNA dan DNA. DNA yang terdapat di nukleus disebut
DNA kromosomal, sedangkan DNA lain yang terdapat di dalam sel dan di luar nukleus yaitu
DNA mitokondria, DNA kloroplas, dan DNA plasmid, ketiganya disebut DNA
ekstrakromomal.
Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA
dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel, yaitu pada motokondria dan
kloroplas. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk
memecahkan dinding sel dan membran inti, yang dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari
berbagai komponen sela yang lain. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak
rusak dan didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.
Faktor-Faktor yang Mempengaruhi Ekstraksi DNA
Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain – dengan
cara diekstraksi atau dilisiskan – biasanya dilakukan dengan homogenasi dengan penambahan
bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Pada kondisi sampel tertentu,
untuk membantu lisis dari membran sel/nukleus/organel atau juga dinding sel, maka sampel
daun dimasukkan dulu ke nitrogen cair dan langsung digerus sebelum ditambahkan bufer
ekstraksi. Senyawa yang biasa digunakan untuk memaksimalkan hasil isolat DNA yang
murni ditambahkan yaitu fenol, kloroform, dan isoamil alkohol.
Proses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau
kontaminan yang tidak diinginkan. Pemisahan DNA dari komponen sela yang lain, termasuk
debris sel, dilakukan dengan sentrifugasi.
Kontaminan yang umum ditemukan di antaranya adalah polisakarida yang dapat
mengganggu proses lanjutan seperti PCR, dimana terjajdi hambatan aktifitas Taq polimerase,
atau kontaminan lainnya yaitu polifenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA
secara kovalen. Untuk menghindari terjadinya hal ini, maka jaringan yang digunakan dijaga
tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi.
Setelah dilakukan ekstraksi, maka proses dilanjutkan dengan presipitasi DNA dengan
menggunakan etanol absolut atau isopropanol. Selain DNA, semua bahan yang lain akan larut
dalam etanol dingin. Dengan demikian, saat dilakukan sentrifugasi, maka DNA akan
mengendap dan terpisah dari senyawa-senyawa atau bahan lain. Pada sampel darah,
presipitasi dilakukan dengan salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein dan debris
sela dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi. Biasanya akan diperoleh
supernatan DNA yang kental pada saat dimasukkan ke etanol absolut. Bila hal ini terjadi,
siapkan tabung yang berisi 70%-etanol, dan segera ambil DNA tadi dengan mikropipet 1000
µL, dan pindahkan ke tabung yang berisi 70%-etanol.
Sebagai bahan dasar untuk analisis lanjutan seperti PCR, RFLP, kloning atau sekuensing,
maka DNA yang digunakan harus bersih dari kontaminan (mempunyai kemurnian tinggi) dan
memiliki berat molekul yang tinggi. Selama proses ekstraksi DNA, beberapa hal yang dapat
terjadi antara lain :
DNA patah-patah selama proses isolasi.
DNA terdegradasi oleh enzim nuklease.
Terjadi kontaminasi oleh polisakarida.
Metabolit sekunder ikut terisolasi.
Denaturasi dan Renaturasi DNA
Proses denutarasi dan renaturasi melekul DNA tergantung pada banyak faktor, antara lain:
1. Suhu. Suhu leleh (melting temperature, Tm) yang tinggi menyebabkan untai ganda DNA
akan terurai menjadi untai tunggal, tetapi bila suhu ini diturunkan secara perlahan, maka
akan terjadi renaturasi menjadi untai heliks ganda DNA seperti semula.
2. Derajat keasaman (pH) yang ekstrem (pH<3 atau pH>10) dapat menyebabkan DNA
terdenaturasi.
3. Konsentrasi isoelektrolit seperti Na+ dan K pada larutan ekstraksi yang digunakan.
4. Perbandingan kandungan antara basa nukleotida GC terdapat AT. Tingginya kandungan
GC akan memperlambat proses denaturasi molekul DNA. Sebaliknya, kandungan AT
yang tinggi akan menyebabkan pita DNA mudah putus/patah.