Praktikum Instrumentelle Analytik

Protokoll:Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

15.04.15

Juliana Storka (741708)Luisa Telpl (741024)

Hochschule DarmstadtFachbereich CuB

Biotechnologie, 2. Semester

Laborbetreuer:Herr Prof. Dr. Hüttenhain

Herr Dipl.-Ing. Kruse

HPLCJuliana Storka, Luisa Telpl

Inhalt

1. Informationen zu Coffein.....................................................................................................21.1. Chemische Eigenschaften...............................................................................................31.2. Geschichte........................................................................................................................31.3. Wirkung auf den Körper...............................................................................................3

2. Materialien und Methoden...................................................................................................42.1. Verwendete Chemikalien mit H-Sätzen.......................................................................42.2. Theorie der HPLC..........................................................................................................42.3. Aufbau.............................................................................................................................52.4. Chromatographische Bedingungen...............................................................................6

3. Vorbereitung.........................................................................................................................64. Durchführung........................................................................................................................7

5. Ergebnisse und Diskussion...............................................................................................86. Quellen.................................................................................................................................14

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1. Informationen zu Coffein

1.1. Chemische Eigenschaften

Abbildung 1: Struktur von Coffein [1]

Coffein 1 ist ein Alkaloid, welches in 63 verschiedenen Pflanzen zu finden ist. Es gehört zu der Stoffgruppe der Xanthine, welche stimulierend wirken. Unter IUPAC wird es als 1,3,7-Trimethylpurin-2,6-dione bezeichnet. Es ist ein weißes Kristallpulver ohne Geruch, dafür mit bitterem Geschmack. Der Schmelzpunkt liegt bei 235°C, es sublimiert bei 178°C. Es ist am besten in kochendem Wasser löslich. In Alkohol wird es in kleinen Mengen gelöst und in Ether gar nicht. Die Molare Masse des C8H10N4O2 beträgt 194,19 g/mol. Mit Säuren kann Coffein Salze bilden, welche jedoch leicht wieder zu lösen sind [2].

1.2. Geschichte1820 gelang es dem Chemiker Friedlieb Runge das erste Mal Coffein 1 aus Kaffeebohnen zu isolieren. 1832 bestimmten Christoph Pfaff und Justus von Liebig die Summenformel von Coffein: C8H10N4O2. Beweisen konnten sie dies allerdings nicht. Dies gelang Emil Fischer erst im Jahr 1895. Durch eine erste Vollsynthese konnte die bis dato nur vermutete Formel bewiesen werden. Seit diesem Zeitpunkt erfreut sich das Coffein 1 immer größerer Beliebtheit. Heute ist es in sehr vielen Lebensmitteln wie Schokolade, Kaffee, Schwarzem Tee und zahlreichen Energy-Drinks zu finden [3].

1.3. Wirkung auf den KörperCoffein 1 wurde durch die Tatsache Populär, dass es die Müdigkeit hemmt. Dies geschieht durch die kompetitive Hemmung der Adenosin-Rezeptoren des Nervensystems, welche erhöhte Herztätigkeit bewirken. Auch der Stoffwechsel und die Atmung werden beschleunigt. Die Aufmerksamkeit und die Konzentration werden ebenfalls gesteigert. Coffein 1 gelangt in alle Organe, da es auch die Blut-Hirn-Schranke überwindet. Somit kann es auch den sensorischen Teil des Gehirns beeinflussen und zu guter Laune führen. Die tödliche Dosis liegt beim Menschen bei 10g Coffein 1. Dies entspricht ca. 100 Tassen Kaffee. Doch auch bei kleineren Dosen können Nebenwirkungen auftreten. Einige sind zum Beispiel Schlaflosigkeit, Magen-Darm-Probleme, Kopfschmerzen und Reizbarkeit. Bei zu hohem Konsum kann es außerdem zu starkem Zittern und sogar zu leichten Herzbeschwerden führen. Coffein 1 ist zwar kein Suchtmittel kann jedoch nach regelmäßigem Nutzen und nachfolgendem Verzicht einige Wirkungen zeigen wie zum Beispiel Reizbarkeit, Nervosität und Konzentrationsbeschwerden [2-4].

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2. Materialien und Methoden

2.1. Verwendete Chemikalien mit H-Sätzen

Acetonitril 2 (Methylcyanid):

H225: Flüssigkeit und Dampf leicht entzündbar.H332: Gesundheitsschädlich bei Einatmen.H302: Gesundheitsschädlich bei Verschlucken.H312: Gesundheitsschädlich bei Hautkontakt.H319: Verursacht schwere Augenreizung.

Coffein 1:

H302: Gesundheitsschädlich bei Verschlucken. [2]

2.2. Theorie der HPLC

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (engl. high performance liquid chromatography, Abkürzung: HPLC) ist eine Methode für qualitative und quantitative Bestimmungen und Trennungen von Substanzen, welche im Gegensatz zur Gaschromatographie nicht flüchtig sein müssen. Die Auftrennung findet dabei aufgrund der unterschiedlichen Art und Stärke der Wechselwirkungen der Stoffkomponenten mit der stationären Phase und der mobilen Phase statt . Die HPLC ist heutzutage die am häufigsten verwendete analytische Trenntechnik die es gibt, sie wird zum Beispiel auch für die Synthesekontrolle eingesetzt. Sie entwickelte sich aus der Flüssigkeitschromatographie, bei der die Teilchengröße der stationären Phase im Bereich von 150 – 200 µm liegt. HPLC Kieselgele haben eine Partikelgröße von 3-5 µm. Je größer die Teilchen, desto größer ist auch die Streudiffusion, Eddy-Diffusion genannt. In den großen Teilchen ist es möglich, dass Poren sehr tief in den Kern des Teilchens hineinragen. Wenn die aufzutrennende Substanz in so eine Pore diffundiert, dauert es eine Weile bis sie diese wieder durch Eigendiffusion verlassen kann. In dieser Zeit strömt das Lösungsmittel mit den anderen Komponenten an der Pore vorbei. Das bedeutet im Endeffekt, dass die Banden der einzelnen Komponenten breiter und damit unscharf werden. Als Folge der kleineren Korngröße reicht der hydrostatische Druck nicht mehr, um die mobile Phase durch die Säule fließen zu lassen, man verwendet Pumpen, die Drücke bis 400 bar aufbringen. Heute verwendet man in der UHPLC auch schon Partikel die kleiner sind als 2 µm mit Drücken bis zu 1000 bar. Man ist so in der Lage, Ergebnisse in einer deutlich kürzeren Analysendauer und mit einer verbesserten Nachweisempfindlichkeit zu produzieren.Die Wahl der mobilen Phase hängt von den Eigenschaften, dabei vor allem von der Polarität der stationären Phase und der zu trennenden Substanz, ab. Mit ihr lässt sich die Retentionszeit der Stoffkomponenten steuern, denn ein zu schneller Durchfluss würde eine unsaubere Trennung mit sich ziehen [5].

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2.3. Aufbau

Die Trennleistung einer HPLC-Säule hängt maßgeblich von der Größe und Homogenität der Partikel des Packungsmaterials ab. Je kleiner die Teilchen, umso größer ist auch die Trennleistung. Um trotzdem eine sinnvolle Fließgeschwindigkeit zu erreichen genügt nicht nur die Schwerkraft. Es werden Pumpen eingesetzt, welche einen Druck von bis zu 400 bar realisieren. Zudem sollten die Pumpen einen möglichst pulsationsfreien Fluss ermöglichen und aus korrosionsbeständigen Bauteilen wie Teflon bestehen. Es gibt 3 verschiedene Pumpsysteme: Hubkolbenpumpen, Verdrängerpumpen und Pneumatische Pumpen. Hinter der Pumpe ist ein Restriktor geschaltet, der aufgrund des Drucks Rückschlüsse auf die Fließgeschwindigkeit ziehen kann und somit die Pumpe auf den eingestellten Wert reguliert. Vor der Pumpe befindet sich noch ein Membrandegaser, der das Elutionsmittel entgast, welches aus einem oder mehreren Behältern herausgepumpt wird. Dies kann alternativ auch durch Spülen mit Helium, Destillationssystemen, Erhitzen und Rühren oder einer Gasdusche erreicht werden; bzw. durch Ultraschallbehandlung der mobilen Phase. Würde man diesen Schritt weglassen, würde die Pumpe durch die Luftbläschen im Lösungsmittel diskontinuierlich arbeiten und es würden Pulsationen im System auftreten, die das Messergebnis verfälschen.Nun folgt die Injektion der Probe auf das Probenaufgabeventil mit Drehdosierschleife, welche sich in Ladeposition befindet. Nach dem Betätigen eines Hebels gelangt die Drehdosierschleife in die Injektionsstellung und das Elutionsmittel strömt in die Schleife und befördert die Probe zur Trennsäule. Dadurch wird ein konstantes Probenvolumen gewährleistet und ein Druckaufbau bei der Probenaufgabe verhindert.Die eigentliche Auftrennung der Stoffkomponenten findet in der Trennsäule beziehungsweise einer zusätzlichen Vorsäule statt. Je nach Retentionszeit (Zeit von der Injektion bis zur Detektion) gelangen die aufgetrennten Substanzen zu anderen Zeitpunkten zum Detektor. Dieser ist in den meisten Fällen ein UV-Detektor mit Gittermonochromator, es existieren jedoch auch Varianten mit Filtern. Einige weitere Varianten sind der DAD und der RI Detektor sowie der Massenselektive Detektor [5-7].

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Abbildung 2, HPLC Aufbau

2.4. Chromatographische Bedingungen

Bei der Bestimmung wird eine HPLC im Reversed-Phase-Modus durchgeführt ( Macherey-Nagel, Nucleosil 120-5 RP-18 ), das bedeutet, dass die stationäre Phase aus chemisch modifizierten unpolarem Kieselgelen besteht. Die mobile Phase dagegen besteht aus einem polaren Gemisch aus Wasser und Acetonitril mit einem Volumenverhältnis von 80:20. Es wird isokratisch gearbeitet, was wiederum bedeutet, dass die Konzentration des Lösungsmittels konstant bleibt, da die Retentionszeitendifferenz der einzelnen Stoffkomponenten nicht kritisch ist. Anderenfalls wäre eine Gradientenelution von Vorteil gewesen. Die Flussrate wird mit einer Pumpe der Firma Knauer auf 1 ml/min eingestellt, während der Druck 13,3 MPa beträgt. Das Probenschleifenvolumen liegt in diesem Versuch bei 20 µl. Die Signale wurden mit dem UV-Vis-Spektrometer der Fa. Jasco ( FP-6200) aufgenommen.

3. Vorbereitung

Als erstes wird die Stammlösung zur Kalibrierung vorbereitet, aus der später die gewünschten Konzentrationen hergestellt werden können. Hierzu werden 100 mg Coffein 1 eingewogen, in einen 100 ml-Erlenmeyerkolben vorgelegt, bis zur Eichmarke mit VE-Wasser aufgefüllt und schließlich im Ultraschallbad gelöst. Hieraus resultiert eine Konzentration von 1000 ppm bzw. mg/l.Um die drei Messlösungen für die Kalibrierung herzustellen, werden je ein ml Stammlösung mit einer Hubkolbenpipette abpipettiert und anschließend in je einen Messkolben gegeben. Die Genauigkeit des Pipettierens wird außerdem noch auf der Waage kontrolliert. Die drei 6

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Messkolben werden anschließend mit VE-Wasser bis zur Eichmarke von 25 ml, 50 ml und 100 ml aufgefüllt, was den Konzentrationen von 40, 20 und 10 ppm entspricht.Danach werden die Getränkeproben wie folgt hergestellt: der Kaffee wird 1:50 verdünnt (1 g Kaffee und 49 g VE-Wasser) und Cola und Tee jeweils 1:10 (3 g Probe und 27 g VE-Wasser).Um einem Verstopfen im Gerät vorzubeugen, werden die Proben noch filtriert. Hierzu werden je 2 mal 10 ml Probe mit einer Spritze aufgezogen und dann mit einem Membranfilter (Macherey & Nagel, PET-Membran, Porengröße: 0,45 μm, d=25 mm) filtriert.

4. Durchführung

Jede Kalibrier- und jede Messlösung wird zweimal chromatographiert und bei den Wellenlängen 273 nm und 245 nm gemessen. Dabei wird mit der kleinsten Konzentration von 10 ppm begonnen. Würde man mit der höchsten Konzentration beginnen, wäre danach ein häufiges Spülen der Spritze mit der neuen, niedriger konzentrierten Lösung notwendig, um eine Verfälschung der Konzentration ausschließen zu können. Wird mit der kleinsten Konzentration begonnen, genügt beim Wechsel der Kalibrierlösung ein zweimaliges Spülen der Spritze mit der höheren Konzentration.Die Auswertung der Chromatogramme geschieht mit der Clarity Auswerte-Software DataApex 2006.Bei der Darstellung ist auf der x-Achse die Zeit in Minuten und auf der y-Achse die Spannung in mV aufgetragen, die dem Messwert der Konzentration in der UV Messzelle entspricht. Vor der Messung ist ein „Auf Null setzen“ der beiden UV-Geräte notwendig. Des Weiteren wird vor jeder Messung der „Set Zero“-Befehl am Computer vorgenommen, um die Kurven auf die x-Achse zu stellen. Die Laufzeit wird auf 6 min eingestellt.

Bei der Messung der Kalibrierlösungen werden ca. 0,5 ml mit einer Spritze am Probenaufgabeventil eingefüllt. Nach ca. 2,5 min wird der Injektionspeak (Totzeit) als kleiner Ausschlag registriert, nach einer Retentionszeit von ca. 4 min eluiert das Coffein von der Säule. Da die automatische Integration den Negativpeak der Injektion mitintegriert wird die Messung manuell bearbeitet. Die Integrationsgrenzen werden neu jeweils vor und hinter den Coffein Peaks gesetzt, sodass für jeden Peak die Fläche (Area, in mV·s) berechnet wird. Abbildung 3 zeigt die Chromatogramme.

Der bei den Stammlösungen aus Abbildung 3 entstandene, erstmalige Ausschlag bei ca. 2,5 min ist der Totpunkt. Dieser kommt zustande, da sich das Lösungsmittel schneller durch die Säule bewegt und zuerst detektiert wird. Nach einer Retentionszeit von ca. 4 min wird das Coffein 1 detektiert. Für das Molekül ist spezifisch, dass es die Wellenlängen 273 nm und 245 nm absorbiert. Die beiden Wellenlängen werden jedoch nicht im gleichen Maße absorbiert. Dies ist daran zu erkennen, dass bei 273 nm ein deutlich höherer Peak entsteht und somit auch eine größere Fläche unter dem Peak als bei 245 nm. Das liegt daran, dass Coffein 1 sein Absorptionsmaximum bei 273 nm hat. Zudem ist auch eine Abhängigkeit der Konzentration von der Höhe des Peaks zu beobachten: Je höher die Konzentration und somit die Anzahl der Teilchen von Coffein 1, desto mehr Licht wird logischerweise auch absorbiert und desto höher fällt auch der Peak aus.

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Abbildung 3, zweifache Messung von Coffeinlösungen mit den Konzentrationen 10 ppm, 20 ppm und 40 ppm jeweils bei den Wellenlängen 273 nm und 245 nm

5. Ergebnisse und DiskussionUm Rückschlüsse auf die Konzentration von Coffein 1 in den drei Proben ziehen zu können, wird eine Coffein-Kalibriergerade bei 273 nm und 245 nm berechnet. Dazu wird für jede der drei Stammlösung-Konzentrationen und jeder der beiden Wellenlängen aus beiden Messungen ein Mittelwert der Fläche errechnet, sodass sich insgesamt 6 Zahlenwerte ergeben (Tab. 1, Tab.2).

Konzentration Coffein 1[ppm] Area [mV*s]0 010 76220 1529,1840 3024,866

Tabelle 1, Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration von Coffein bei 273

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Konzentration Coffein 1 [ppm] Area [mV*s]0 010 229,2720 454,5240 88,667

Tabelle 2, Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration von Coffein bei 245 nm

In Excel wird dann für jede Wellenlänge eine Tabelle erstellt von der Fläche der Peaks in Abhängigkeit von der Konzentration. Die Tabelle wird dann in ein Diagramm überführt, wobei die einzelnen Punkte miteinander verbunden werden und eine Geradengleichung berechnet wird. Jeder Graph wird zudem auch mit erzwungenem Nulldurchgang dargestellt, woraus eine andere Geradengleichung hervorkommt (Abb. 4-7).

Kalibriergerade 273 nm o.N.

y = 75,62x + 5,6628R2 = 1

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Konzentration [ppm]

Area

[mV*

s]

Abbildung 4, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration bei 273 nm und ohne Nulldurchgang

Kalibriergerade 273 nm m.N.

y = 75,809xR2 = 1

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Konzentration [ppm]

Area

[mV*

s]

Abbildung 5, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration bei 273 nm und mit Nulldurchgang

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Kalibriergerade 245 nm o.N.

y = 22,211x + 4,6786R2 = 0,9998

0100200300400500600700800900

1000

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Konzentration [ppm]

Are

a [m

V*s]

Abbildung 6, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration bei 245 nm und ohne Nulldurchgang

0 5 10 15 20 25 30 35 40 450

100200300400500600700800900

1000

f(x) = 22.3665619047619 xR² = 0.999897167389051

Kalibriergerade 245 nm m.N.

Konzentration [ppm]

Are

a [m

V*s

]

Abbildung 7, Kalibriergerade von Coffein von der Peakfläche in Abhängigkeit von der Konzentration bei 245 nm und mit Nulldurchgang

Im Anschluss an die Kalibrierlösungen wurden die einzelnen Getränkeproben zweimal bei beiden Wellenlängen mittels HPLC analysiert. Für jede Probe ergab sich ein spezifisches Diagramm mit mehreren Peaks (Abb. 8-10). Bei allen drei Diagrammen ist jedoch der Coffein-Peak nach ca. 4 min gut aufgelöst zu erkennen.

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Abbildung 8, zweimalige UV-Detektion von Kaffee jeweils bei den Wellenlängen 275 nm und 245 nm

Abbildung 9, zweimalige UV-Detektion von Cola jeweils bei den Wellenlängen 275 nm und 245 nm

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Abbildung 10, zweimalige UV-Detektion von Tee jeweils bei den Wellenlängen 275 nm und 245 nm

Die drei Getränkeproben aus Abbildung 8-10 weisen spezifische Diagramme auf, da jede Probe durch andere Stoffe zusammengesetzt ist, die aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften eine unterschiedlich stark mit der stationären Phase wechselwirken und dadurch auch unterschiedliche Retentionszeit aufweisen und die zwei Wellenlängen im unterschiedlichen Maß absorbieren. Lediglich nach einer Retentionszeit von ca. 4 min weißen alle drei Stoffe einen Peak auf, wodurch im Vergleich zu den Stammlösungen das Coffein 1 identifiziert werden kann. Jedoch sind die Flächen unter diesem Peak sehr unterschiedlich, nämlich bei den Peaks bei 275 nm 1012,63 mV*s bei Cola, 2422,15 mV*s bei Tee und 1548,20 mV*s bei Kaffee bei der ersten Messung.

Für jede Getränkeprobe wird der Mittelwert der Fläche der Peaks bei jeder Wellenlänge berechnet und kann für y in die entsprechende Kalibriergleichung eingesetzt werden. Am Ende müssen die Werte noch mit dem Verdünnungskoeffizienten der jeweiligen Probe multipliziert werden, um die endgültige Konzentration bestimmen zu können. Der Verdünnungskoeffizient beträgt bei Cola und Tee 10 und bei Kaffee 50.Die Endergebnisse der Konzentrationen der Getränkeproben sind in Tabelle 3 veranschaulicht. Den geringsten Coffeingehalt hat danach die Cola light mit ca. 132 ppm, gefolgt vom Tee mit ca. 327 ppm und schließlich dem Kaffee mit ca. 1028 ppm.

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Cola light Tee Kaffee

273 nm Anregungswellenlänge,ohne Nulldurchlauf(in ppm)

131,277 320,271 1032,865

273 nm Anregungswellenlänge,mit Nulldurchlauf(in ppm)

131,026 320,249 1033,520

245 nm Anregungswellenlänge,ohne Nulldurchlauf(in ppm)

132,026 333,326 1020,880

245 nm Anregungswellenlänge, mit Nulldurchlauf(in ppm)

133,197 333,093 1024,220

Tabelle 3: Konzentrationen von Coffein in den Proben

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6. Quellen

[1] http://www.chemie-im-alltag.de/articles/0125/Coffein.png

[2] http://gestis.itrust.de/nxt/gateway.dll/gestis_de/000000.xml?f=templates$fn=default.htm$3.0

[3] http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=2523

[4] http://flexikon.doccheck.com/de/Koffein

[5] Instrumentelle Analytik, Skoog Leary, 4. Auflage, S.675 ff

[6] http://analytik.pharmaziestudenten-hd.de/ms/theorie/theorie.htm

[7] http://www.uni-jena.de/unijenamedia/HPLC

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