PRAKTIKUM IZ HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA … za organsku hemiju i...Listovi biljke čajevac, Camellia sinensis, od kojih se spravlja čaj, vrući aromatični napitak blago gorkog i

HEMIJA PRIRODNIH PRODUKATA – laboratorijske vjeţbe

1

PRAKTIKUM IZ

HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA

izabrane vjeţbe

akademska 2019/2020


2

________________________________IZOLACIJA ALKALOIDA

Vjeţba br. 1 IZOLACIJA PIPERINA I PIPERINSKE KISELINE IZ BIBERA

UVOD

Alkaloidi se obično definišu kao bazni nitrogenovi produkti biljaka koji imaju specifino dejstvo na

organizam ljudi i ţivotinja.

Strukturna karakteristika većine alkaloida je više ili manje sloţeni heterociklički sistem. Biološka

funkcija alkaloida u biljkama još je gotovo nepoznata, a na ţivotinjske organizme i ljude već mala

količina alkaloida pokazuje izvanredno fiziološko djelovanje. Na primjer kurare-alkaloidi, kojima se

zbog njihove otrovnosti juţnoamerički uroĎenici sluţe za premazivanje vršaka strelica. Muskarin je

isto tako snaţan otrov koji sadrţi gljiva muhara

U početku su u terapijama primjenjivane alkaloidne droge, a da njihove komponente nisu bile

poznate. Razvojem savremenih ekstrakcionih i instrumentalnih metoda bilo je moguće izolovati i

odrediti aktivne sastojke mnogih alkaloidnih droga.

U biljkama se alkaloidi nalaze uglavnom u obliku soli s kiselinama, kao što su oskalna, sirćetna,

mliječna, vinska.

Nosioci ljutog okusa bibera su alkaloidi koji sadrţe piperidinsku jezgru. Piperin je alkaloid

piperidinskog niza. Glavni je sastojak crnog bibera (Piper nigrum) koji se ubraja u porodicu

Pipereceae.

Alkaloid piperin nalazi se u zrnu crnog i bijelog bibera, i u nekim drugim srodnim biljkama. U zrnu

crnog bibera ima ga 6-9%.

C17H19NO3

O

O

N

O

Informacije za eksperiment:

Reagensi: Etanol, C2H5OH

Metanol CH3OH

10% Kalijumhidroksid, KOH

Hloridna kiselina, HCl

1,3,5-trinitrobenzol

Pribor: Soxletov aparat

Balon


3

Vodeno hladilo

Vodeno kupatilo

Rotavapor

Produkt: Piperin t.t 125-126°C

Piperinska kiselina t.t. 216-217°C

Postupak rada

Ekstrakcija

U Soxletov aparat za ekstrakciju stavi 40 g samljevenog crnog bibera

(Stavi biber u filter papir i umotaj tako da visina bude u visini bočne

cjevčiće kojom se preljeva rastvarč).

Nasuti etanol 8oko 100 mL) u balon i zagrijavaj na vodenom kupatilu

2h

Sakupljeni ekstrakt koncentruj na rotavaporu na temperaturi ne višoj od

60°C.

Ostatak poslije koncentrovanja tretira se sa 10-20 mL 10% kalijim

hidroksida u etanolu.

Poslije 10 minuta alkoholni rastvor se dekantiranjem odvoji od taloga

U filtrat dodati hladne vode i ostaviti da piperin iskristališe u obliku ţutih

kristalića.

Odrediti prinos piperina.

Filtrat ohladiti da bi se formirali kristali piperina, profiltrirati i isprati

kristale sa 2 mL hladne vode. Odrediti prinos piperina.

Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom H2SO4. Otopiti par

kristalića izoliranog spoja u etanolu i dodati par kapi koncentrovane

H2SO4, u prisustvu piperina nastaje intenzivno crveno obojenje koje

nestaje paţljivim dodatkom vode. OPREZ!!!!

Uraditi bojenu reakciju piperina s koncentrovanom HNO3. Otopiti par

kristalića izoliranog spoja u etanolu i dodati malo HNO3, u prisustvu

piperina nastaje zeleno-ţuto obojenje koje brzo prelazi u narandţasto i na

karaju u intenzivno crveno. OPREZ!!!!

Piperin sa 1,3,5-trinitrobenzolom (1:1) gradi kompleks u obliku crvenih

iglica.

Hidroliza

piperina

Hidrilizom piperina alkoholnim rastvorom kalijum hidroksida dobiva se

piperinska kiselina i piperidin

U balon od 50 mL, sa povratnim hladilom, stavi se 1 g piperina i 10 mL


4

10%-tnog alkoholnog rastvora kalijumhidroksida.

Reakciona smjesa se zagrijava 90 min na vodenom kupatilu.

Alkohol se predestilira iz reakcione smjese pod vakuumom na rotavaporu

Ostatak u balonu se ohladi na ledenom kpatilu

Izdvojena kalijumova so piperinske kiseline suspenduje se u malo vruće

vode i zakiseli hloridnom kiselinom

Nastali voluminozni ţuti talog odvoji se filtriranjem i ispere s malo

hladne vode

Prekristaliziraj nastali talog iz etanola, nastaju igličasti ţuti kristali.

Alkalni rastvor etanola dobiven destilacijom, zakiseli do jako kisele

reakcije i otpari do suha

Kristalizacijom ostatka iz metanola dobiva se piperidinhlorhidrat t.t.

244°C

IZVJEŠTAJ

Ime i prezime: ____________________________________ Grupa:__________

Izračunaj prinos piperina


5

Vjeţba br. 2a IZOLACIJA KOFEINA IZ ČAJA

UVOD

Alkaloidi su prirodni organski spojevi koji sadrţe nitrogen, a tako su nazvani zbog njihovog bazičnog

("alkalijama sličnog") karaktera kojem je razlog upravo nitrogen. Danas je poznato više od 12 000

alkaloida, pa pripadaju jednoj od najbrojnijih grupa prirodnih spojeva.

Izrazitog su, ali različitog, fiziološkog djelovanja na organizam čovjeka i ţivotinja. Djeluju već u vrlo

malim količinama. Neki se u malim dozama koriste kao jaki i nezamjenjivi lijekovi, dok su gotovo svi

u većim količinama vrlo jaki otrovi. U biljkama alkaloidi ne dolaze u slobodnom obliku, već su vezani

za neke organske kiseline (na primjer: oksalnu, octenu, mliječnu, vinsku, limunsku i druge) ili u obliku

estera, amida i glikozida. Čisti alkaloidi većinom su bijeli sitnokristalni prašci ili tekućine. Netopivi su

u vodi, ali topivi u anorganskim kiselinama i u organskim otapalima. Njihove su soli čvrste, topive u

vodi, a netopive u organskim otapalima.

Zbog raznolikosti i sloţenosti alkaloidnih struktura ne postoji sistematizovana klasifikacija ovih

jedinjenja. Prema hemijskoj klasifikaciji alkaloidi se mogu podijeliti u sljedeće grupe:

a) Derivati piridina i piperidina,

b) Derivati tropana

c) Derivati hinolina

d) Derivati izohinolina

e) Derivati indola

f) Derivati imidazola

g) Derivati purina

h) Aciklični alkaloidi

i) Sterodini alkaloidi

Spojevi koji se javljaju u prirodi imaju različite vrste primjene. Jedan od često korištenih je i kofein

Koristi se kao stimulans u nekim lijekovima, a većina nas ga koristi svakodnevno u pićima dobivenim

ekstrakcijom iz kafe ili čaja vrućom vodom. Kofein poticajno djeluje na središnji ţivčani sistem,

osobito na koru velikog mozga i neka središta u produţenoj moţdini. Pića koja ga sadrţe izazivaju

stanje budnosti, te prolazno i kratkotrajno uklanjaju znakove umora. Kofein umor ne uklanja u cijelosti

već samo privremeno ublaţava simptome, a kad djelovanje popusti, osjećaj umora još je intenzivniji.

To obično navodi na uzimanje nove doze kofeina čime zakidamo jedan od osnovnih načina kojim nas

tijelo upozorava da mu je potreban odmor.

Primarni izvor kofeina je zrno kafe koje sadrţi oko 2-3% kofeina. Sadrţaj kofeina u napitku varira od

40 do 120 mg, u zavisnosti od načina pripreme. Kafa takoĎe sadrţi tragove srodnog alkaloida

teofilina, ali ne i teobromina. Čaj je drugi vaţan izvor kofeina i mada sadrţi više kofeina nego kafa,

uobičajeni čajni napitak sadrţi mnogo manje kofeina. Za razliku od kafe, čaj sadrţi male količine

teobromina i nešto viši nivo teofilina.


6

KOFEIN TEOBROMIN TEOFILIN

Listovi biljke čajevac, Camellia sinensis, od kojih se spravlja čaj, vrući aromatični napitak blago

gorkog i oporog mirisa, sastoje se primarno od celuloze kao osnovnog gradivnog materijala svih

biljnih ćelija. Na sreću, celuloza nije topiva u vodi, pa korištenjem ekstrakcije vrućom vodom, mnogo

topiviji kofein moţe se razdvojiti. TakoĎe u vodi su topivi i sloţeni spojevi, tanini. Ovo su obojeni

fenolski spojevi velikih molekulskih masa(500-3000) koji imaju kiseli karakter. Ako se neka bazna so

kao što je natrijum karbonat doda vodenoj otopini, tanini će reagovati i formirati soli. Ove soli su ne

topive u organskom otapalu, kao što su hloroform ili dihlormetan, ali su topivi u vodi. Kako je kofein

slabije topiv u vodi (2g/100g hladne vode), a mnogo je topiviji u organskom otapalu (14g/100g

dihlormetana), kofein moţemo ekstrahovati iz bazne otopine čaja dihlormetanom, a natrijumove soli

tanina ostaju u vodenoj otopini. Otparavanjem dihlormetana ostaje sirovi kofein, koji se moţe

prečistiti sublimacijom.

EKSPERIMENTALNI RAD

ZADATAK VJEŢBE

- Izvršiti izolaciju kofeina

- Naučiti tehnike ekstrakcije

- Izvršiti prečišćavanje izoliranog produkta

HEMIKALIJE I REAGENSI

- Čaj ili filter vrećice čaja

- Natrijum karbonat, Na2CO3

- Dihlormetan, CH2Cl2

- Toluen C6H5CH3

- Heptan C7H16

- Bezvodni natrijumsulfat, Na2SO4

- Destilovana voda

OPREMA I PRIBOR

- Čaše od 100, 250, 600 mL

- Erlenmajerova tikvica od 50, 125 mL

- Menzura od 10, 100 mL

- Lijevak za odvajanje od 500 mL

- Büchnerov lijevak

- Vakuum boca

- Rešo


7

MJERE OPREZA

- Ne udišite pare organskih rastvarača

- Oprez pri radu sa vrućim priborom

SAVJETI

- Ekstrakcije dihlormetanom i prekristalizaciju radite u digestoru

PRODUKT

- Kofein, bijeli igličasti kristali t. t. 230°C

IZVOĐENJE VJEŢBE

Postupak I

Izolacija

U čašu od 600 mL naspi oko 200 mL vode i dodaj 15 g natrijum karbonata.

Zagrijavaj na rešou uz mješanje dok se karbonat ne rastvori.

Izvagaj oko 15 g čaja

Dodaj čaj u čašu sa vodom i zagrij do ključanja

Smanji grijanje i pusti da lagano ključa poklopljeno satnim staklom oko 30

min

Prekini zagrijavanje i pusti da se rastvor ohladi (hlaĎenje moţeš ubrzati

stavljanjem čaše pod mlaz hladne vode).

Profiltriraj dobivenu smjesu preko Büchnerovog lijevka

Pokvasi ostali čvrsti ostatak sa 10 mL destilovane vode i profiltriraj uz

pritiskanje malom erlenmajericom kako bi dobili maksimalnu količinu

tečnosti.

Ostavite čašu u ledeno kupatilo da se ohladi ispod sobne temperature

Ekstrakcija

Prebaci filtrat u lijevak za odvajanje od 500 mL

Dodaj 30 mL dihlormetana

Promućkaj sadrţaj nekoliko puta i ostavi da se razdvoje slojevi. (Nemojte

mućkati previše intenzivno kako bi izbjegli stvaranje pjene)

Ispusti dihlormetanski dio u čistu čašu od 250 mL pazeći da se slojevi što

preciznije odvoje ne ispuštajući vodu iz gornjeg sloja.

Ponovi ekstrakciju na isti način još 3 puta sa po 15 mL dihlormetanu

Sušenje Dodaj 15-20 g anhidrovanog natrijumsulfata u čašu sa dihlormetanskim

slojem kako bi izvršili sušenje

Uz povremeno miješanje ostavi da stoji 10 min (ako je rastvor mutan

prebaci ga u novu čašu i dodaj novu porciju natrijumsulfata).

Otparavanje

orgasnkog

radtvarača

Sastavi aparaturu za destilaciju, koristeći vodeno kupatilo kao sredstvo za

zagrijavanje, a destilat sakupite u tikvicu koja je uronjena u ledeno kupatilo.

Predestiliraj dihlormetan uz lagano zagrijavanje kako bi izbjegli stavranje

pjene.

Kada je rastvarač otpario kofein bi trebao da kristalizira.

U ovoj fazi kofein je oko 90% čist, ţućkastih kristala.


8

Prekristalizacija Naspi po 5 mL toluena i heptana u balon u kome se nalazi kofein

Zagrijte dok se kristali kofeina ne otope (moţda će biti potrebno po još 2

mL svakog rastvarača kako bi se rastvorili nastali kristali).

Prekinite zagrijavanje kada se otope kristali kofeina

Prebacite sadrţaj balona u čašu od 50 mL i pustite da doĎe do

rekristalizacije pri halĎenju na ledenom kupatilu

Ovako nastali kristali kofeina su bijele boje i obično 96-98% čisti

Nastali produkt profiltriraj kroz Buchnerov lijevak

Izvagajte nastali produkt i izračunajte prinos

Shema izolacije kofeina

Postupak II

U čaši ugrijati 100 mLvode i u ključalu vodu staviti tri vrećice indijskog čaja (oko 5 g refuznog čaja).

Vrećice drţati u vodi 5 minuta. Kofein je dobro topiv u vreloj vodi pa će preći u vodeni sloj. Izvaditi

vrećice iz čaše i istisnuti iz njih tečnost koju su upile.

Iz dobivene otopine se kofein ekstrahira u lijevku za odvajanje uz dihlormetan ili hloroform, tri puta

sa po 15 mL rastvarača. Kofein prelazi u organski sloj.

Nakon ekstrakcije organski sloj isprati dva puta sa po 20 mL hladnog 6M rastvora NaOH i jednom sa

20 mL hladne vode. Nakon toga organski sloj osušiti s anhidrovanim Na2SO4. Nakon sušenja

dekantirati rastvor u suhu i izvaganu kristalizirku i upariti do suha. Nakon otparavanja rastvarača

ostaju bijeli talog kofeina.

zagrijavanje

Ekstrakcija

CH2Cl2

ČAJ Nerastvorljivi

ostatak

KOFEIN u CH2Cl2

Soli tanina u

vodi

KOFEIN

Otparavanje

CH2Cl2

UZORAK

ČAJA

Na2CO3 u vrućoj vodi


9

Vježba br.2b IZOLACIJA TEOBROMINA IZ KAKAO PRAHA

Kakao prah

POSTUPAK I

U balon okruglog dna (500 mL) pripremi se smjesa kakao praha (20g) i metanola (30 mL), a zatim se

doda rastvor 3 MgO. Sve dobro izmješati i zagrijavati na rešou uz mješanje do stvaranja mrvičaste

čvrste forme. Ohladiti smjesu i dodati dihlormetan ili hloroform (150 mL) i zagrijavati pod refluksom

30 minuta. Smjesu ponovo ohladiti, filtrirati, a potom filtrat osušiti sa Na2SO4 i potom prebaciti u

balon okruglog dna (250 mL). Rastvor se koncentrira na rotavaporu do volumena 10-15 mL, a potom

dodati 30 mL dietiletera i ohladiti smjesu u ledenom kupatilu.. Nakon izdvajanja taloga izvršiti

filtriranje i ostaviti talog da se osuši. Izvagati masu dobijenog teobromina i izračunati prinos.

Vjeţba br. 2c IZOLACIJA NIKOTINA IZ LISTA DUVANA

UVOD

Duvan je biljak koja pripada porodici Solanaceae. U vrijeme otkrića duvan je bio autoktona

vrsta sa područja Juţne i Srednje Amerike. Komponenta koja ima najveći fiziološki efekat u

duvanu je alkaloid nikotin. Sadrţaj nikotina u duvanu varira, zavisno od vrste, a kreće se od

0,3-5% u suhoj biljci. Prvi put je izolovan iz duvana 1828 godine.

Nikotin se sintetizira u korjenu biljke, a nakuplja u listovima. Predstavlja jak neurotoksin, a

uključen je i u mnoge insekticide. U manjim količinama djeluje stimulativno.

Nikotin je higroskopna uljasta tečnost. Sa kiselinama gradi soli koje su topive u vodi.

Struktura nikotina

Teobromin


10

Informacije za eksperiment: Reagensi:

- Duvan

- Eter

- Kalij karbonat-bezvodni

- Metanol

- NaOH (5%)

- Zasićena otopina

- Pikrinske kiseline u metanolu

Pribor:

- Laboratorijska čaša od 250 mL

- Lijevak za odvajanje (250 mL)

- Erlenmajerove tikvice

- Büchnerov lijevak

Postupak rada

- Odvagati 10g duvana u laboratorijsku čašu

- Dodati 100 mL otopine NaOH i dobro mješati 15 minuta

- Nakon toga filtrirati preko Buchner-ovog liejvka i dobro pririsnuti duvan sa drugom čašom

- Duvan ponovo prenjeti u čašu i preliti ga sa 30 mL destilovane vode

- Sve dobro izmješati i filtrirati

- Sav filtrat sakupiti u jednu čašu i prebaciti ga lijevak za odvajanje

- Izvršiti ekstrakciju sa eterom (3x25mL)

- Sakupiti organski sloj i osušiti ga sa bezvodnim kalij karbonatom

- Filtritati i nakon toga otparavati eter na vodenom kupatilu

- Nakon otparavanja etera, dodati 4 mL metanola da se otopi dobijeno ulje

- Dodati 10 mL zasićene otopine pikrinske kiseline, ohladiti u ledenom kupatilu kako bi se

izdvojili kristali nikotin pikrat.

- Filtrirati, osušiti dobijene kristale, izvagati produkt i odrediti prinos

PRPIREMNA VJEŢBANJA

1. Zašto je vaţno dobro ohladiti vodeni ekstrakt čaja kao i polučvrstu masu kod izolacije

teobromina prije dodatka dihlormetana za ekstrakciju?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________


11

2. Kojim metodama je moguće izvršti prečišćavanje kofeina?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

3. Koja je uloga MgO pri izolaciji teobromina iz kako praha?

_______________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

_______________________________________________________________________________

IZVJEŠTAJ


Izračunati prinos kofeina Izračunati prinos teobromina Izračunati prinos nikotina


12

Vjeţba br. 3 IZOLACIJA I EKSTRAKCIJA ESENCIJALNIH ULJA

UVOD

Prirodni produkti su podjeljeni u dvije velike grupe spojeva. Metaboliti koji su uobičajeni za veliki

broj organizama, poznati kao primarni metaboliti, npr. amino kiseline. Općenito oni imaju dobro

definisan ulogu u biohemijskom sistemu. Druga velika grupa prirodnih produkata poznata je pod

imenom sekundarni metaboliti meĎu koje spadaju i esencijalna ulja.

Esencijalna ulja su volatilne tečnosti konzistencije ulja. Izolacija iz biljnog materijala vrši se različitim

metodama. Ulja imaju karakterističan miris biljke iz koje su izolirane.

Prije izolacije biljni materijal iz kojeg se dobiva esencijalno ulje se mora osušiti i usitniti. Izolacija

esencijalnog ulja iz biljnog materijala se moţe vršiti slijedećim metodama:

a) hidrodestilacija;

b) destilacija vodenom parom;

c) eskstrakcija rastvaračima;

d) anfleriranje;

e) maceracija;

f) presovanje.

Hidrodestilacija je metoda koja se najčešće koristi za izoliranje esencijalnih ulja. Ovaj metod se

bazira na činjenici da su navedene supstance veoma slabo rastvorljive u vodi. Procedura se sastoji u

destilaciji vode iz vodenog rastvora koji sadrţi organske spojeve pri čemu para nosi sa sobom i

organske spojeve. Para se moţe stvarati u sistemu i van njega. U sistemu se para stvara intenzivnim

ključanjem vode pomiješane sa materijalom koji sadrţi spojve koje je potrebno izolirati, uz povremeno

dodavanje vode kako bi se nivo vode odrţavao konstantnim.

Biljni materijal se kuha u vodi. Pare koje nastaju kondenzuju se u hladilu i sadrţe smjesu vode i

esencijalnog ulja. Iz destilata se ulje i voda odvajaju ekstrakcionim postupcima. Prilikom destilacije

dolazi do hidrolize pojedinih komponenata ulja što je uzrokovano visokom temperaturom.

Esencijalna ulja razlikuju se od masnih ulja po njihovoj isparljivosti i činjenici da nisu saponibilni

(saponifikacija je proces nastanka sapuna iz masti i baze), daju specifičan miris cvijetu, listu i drvetu

ili su izvedeni iz komponenata biljaka enzimatskom reakcijom. Esencijalna ulja često su zapaljiva,

rastvorljiva u alkoholu i eteru i samo slabo rastvorljivi u vodi. Mogu sadrţavati, ugljikovodike,

alkohole, fenole, etere, aldehide, ketone, kiseline i estere.

Začini su često kompleksne smjese različitog sastava. Mirisne komponente su najčešće povezane sa

esterima, a kakakteristični okus i aroma mnogih začina rezultat je prisustva aromatskih aldehida i

ketona. Primjeri takvih aldehida su vanilin (štapići vanilija), cimetaldehid (cimet), eugenol (klinčići),

karvon (kim)


13

OH

O

H

O CH3 O

H

OH

O CH3

CH2

CH3CH2

CH3

O

Vanilin Cimetaldehid Eugenol Karvon

Od davnina, posebno kada nije bilo friţidera, začini su se dodavali da maskiraju nepoţeljne mirise.

Antiseptici i antioksidansi prisutni u začinima bili su efikasni u produţenju roka trajanja hrane.

U ovom eksperimentu, vršićete izolaciju esencijalog ulja iz klinčića. Klinčići su pupoljci jednog

zimzelenog drveta iz istočne Indije. Esencijalno ulje se uglavnom sastoji od eugenola. Koristi se u

parfimeriji, za sintezu vanilina, kao anelgetik i antiseptik.

Cimetaldehid je glavni sastojak esencijalnog ulja koji se moţe izolirati iz suhih dijelova biljke

Cinnamomum, porjeklom iz istočne Indije i jugoistočne Azije. Cimetaldehid je i sintetiziran za

komercijalne svrhe, koristi se kao vještački začin. Cimetaldehid je meĎu nekoliko aldehida za koji se u

IUPAC sistemu zadrţalo uobičajeno ime.

Karvon je keton, pronaĎen u ulju kima, Carum carvi, i miroĎije. Nema komercijalnu primjenu. Kim

je dvogodišnja biljka iz familije peršuna, koja se uzgaja zbog sjemenki koje imaju intenzivan,

privlačan miris. Sjemenke kima se koriste kao začin za peciva i sluţe da poboljšaju probavu.

EKSPERIMENTALNI RAD

ZADATAK VJEŢBE

- Izolirati esencijalno ulje iz klinčića*1

- Izvršiti ekstrakciju esencijalnog ulja iz destilata

- Odrediti prinos


- 5% kalijum hidroksid, KOH

- 5% hloridna kiselina, HCl

- Dihlormetan, CH2Cl2

- Destilovana voda, H2O

- Bezvodni natrijum sulfat, Na2SO4

- Zasićeni rastvor natrijum hlorida, NaCl

PRIBOR I OPREMA

- Aparatura za destilaciju

- Erlenmeyerove tikvice 250 mL, 125 mL

- Menzura 100 mL

1 Ista procedura moţe se koristiti i za izolaciju esencijalnog ulja iz cimeta i kima


14

- Lijevak za odvajanje, 150 mL, 250 mL

- Vodeno kupatilo

- Univerzalni pH papir

MJERE OPREZA

- Nemoj udisati pare organskih otapala

- Budi oprezan pri radu sa kiselinama i bazama, u slučaju posipanja isperi koţu velikim

količinama vode

- Ekstrakciju dihlormetanom izvodi u digestoru

SAVJETI

- Nemoj bacati nijednu otopinu koja bi mogla sadrţavati ţeljeni produkt. Ostavite ih u propisno

označenim posudama do kraja eksperimenta. Uobičajena greška je korištenje pogrešne otopine

za nastavak eksperimenta tokom ekstrakcije. Ako nisi siguran prati upute u Shemi

- Prinos primarno odreĎuju destilacija i ekstrakcija dihlormetanom. Uspješnost destilacije

odreĎuje količina predestiliranog organskog materijala vodom, dok je uspješnost ekstrakcije

odreĎena količinom materijala koji se iz vodenog dijela prenese u organski.

- Formiranje emulzije moţe predstavljati ozbiljan problem tokom ekstrakcije, usporava cijeli

postupak i uzrokuje gubitak produkta.

- Pri drugoj destilaciji ili jednostavnom otparavanju otapala, produkt će ostati na dnu u malim

količinama, moţe ga biti tako malo da je gotovo nevidljiv, ali će vaganje potvrditi njegovo

postojanje.

- Ovaj eksperiment zahtijeva dobro planiranje i koordinaciju različitih poslova unutar grupe

kako bi se eksperiment mogao završiti na vrijeme. Počnite sa destilacijom što prije, to je dio

vjeţbe koji najduţe traje, a ostale poslove podijelite unutar grupe.

PRODUKT

- Esencijalno ulje klinčića je ţuta volatilna tečnost, t. k. 243°C

- Eugenol je bezbojna tečnost, t. k. 253°C, slabo topiv u vodi.

- Karvon je bezbojna tečnost t. k.245°C.

- Cimetaldehid je ţuta volatilna tečnost, t.k. 245°C

IZVOĐENJE VJEŢBE

a) Izolacija eugenola

Destilacija Sastavi aparaturu za hidrodestilaciju, zagrijavanje vrši na električnom

grijaču, a koristi vodeno hladilo.

Izvagaj 14-16 g klinčića, smrvi ih u avanu kako bi voda lakše prodrla u

njih. (20-25 g kima, 15-20 g štapića cimeta)

Stavi biljni uzorak u tikvicu za destilaciju i preko njega naspi oko 2/3

vode

Priključi vodu na hladilo i uključi grijač kako bi smjesa lagano

proključala da se ne stvara pjena. Kada ključanje otpočne, pojačaj

grijanje.


15

Prikupljaj destilat u Erlenmeyerovu tikvicu dok god vidiš emulziju koja

izlazi iz hladila (destilacija obično traje 45-60 min). Trebalo bi da

prikupiš najmanje 150-200 mL destilata.

Izbaci ostatke biljnog materijala iz balona dok je još vruć ili ga napuni

do vrha vodom, snaţno izmješaj i prebaci u veću čašu, otopinu iz čaše

dekantiraj u odvod, a čvrsti ostatak baci u kantu za smeće.

Ekstrakcija

Prebaci destilat u lijevak za odvajanje od 250 mL i dodaj oko 25 mL

dihlormetana.

Protresi lijevak nekoliko puta, (previše intenzivno miješanje moţe

prouzrokovati stvaranje emulzije; ako se emulzija stvori pokušaj izvršiti

isoljavanje). Okrećući lijevak za odvajanje naopako, kroz ventil moţeš

ispusti gasove koji nastaju pri ekstrakciji.

Ostavi lijevak da stoji na prstenu dok se slojevi ne razdvoje.

U Erlenmeyerovu tikvicu od 125 mL, ispusti donji organski sloj i ponovi

ekstrakciju još dva puta na isti način sa po 20 mL dihlormetana.

(Sljedeći dio vrijedi samo za ekstrakciju eugenola iz esencijalnog ulja)

Prebaci dihlormetanski dio u drugi lijevak za odvajanje i dodaj 30 mL

5% otopine KOH. Otopina u lijevku je topla jer se pri reakciji oslobaĎa

toplota.

Sačuvaj vodenu otopinu u Erlenmeyerici od 125 mL i vrati

dihlormetanski dio u lijevak za odvajanje.

Ekstrahuj dihlormetanski dio još dva puta sa po 25 mL 5% otopinom

KOH i spoji vodene slojeve.

Prebaci vodeni sloj ponovo u lijevak za odvajanje i još ga jednom isperi

novom porcijom dihlormetana.

Prebaci vodeni rastvor u čašu od 250 mL i polako zakiseli do pH 1

koristeći 5% rastvor HCl-a. Kiselinu dodaj u kapima i uz miješanje. pH

vrijednost kontroliši univerzalnim pH papirom; biće potrebno 20-50 mL

kiseline. Primjetićeš da se razvija toplota i da otopina postaje zamućena

kad pH postane kisela.

Prebaci zakiseljenu otopinu ponovo u lijevak za odvajanje i dodaj 20 mL

dihlormetana.

Sačuvaj dihlormetanski dio i ponovi ekstrakciju još dva puta sa po 25 mL

dihlormetana. Pazi pri razdvajanju da u organskom sloju ne bude vode.


16

Koristi isti lijevak za odvajanje da opereš sakupljeni organski dio sa 15

mL destilovane vode.

Nakon pranja vodom operi organski dio sa poluzasićenom otopinom

NaCl (napravi ga miješanjem 8 mL zasićene otopine NaCl sa 7 mL

destilovane vode).

Prebaci dihlormetanski dio u čistu i suhu Erlenmeyericu, dodaj 15 g

bezvodnog natrijum sulfata, Na2SO4, da osušiš organsku otopinu (ako

otopina ostaje mutna dodaj još bezvodnog natrijum sulfata).

Otparavanje

organskog

otapala

Izvagaj balon okruglog dna od 150 mL koji će biti korišten za destilaciju,

a ne za prikupljanje destilata.

Dekantiraj osušeni organski sloj iz Erlenmeyerice u izvagani balon i

sastavi aparaturu za destilaciju, koristeći vodeno kupatilo kao sredstvo za

zagrijavanje.

Predestiliraj dihlormetanski dio. Zagrijavanje vrši lagano, kako bi izbjegli

stvaranje pjene, sve dok otapalo izlazi iz hladila.

Kad je otapalo otparilo, izvagaj balon i iz razlike masa izračunaj masu

dobivenog produkta.

b) Izolacija ulja cimeta

Sastavi aparaturu za destilaciju vodenom parom, zagrijavanje vrši na

električnom grijaču, a koristi vodeno hladilo.

Izvagaj 20-25 g štapića cimeta, smrvi ih u avanu kako bi voda lakše

prodrla u njih. (20-25 g kima).

Stavi biljni uzorak u tikvicu za destilaciju i preko njega naspi oko 100-

150 mL destilovane vode.

Priključi vodu na hladilo i uključi grijač kako bi smjesa lagano

proključala da se ne stvara pjena. Kada ključanje otpočne, pojačaj

grijanje. Sakupiti 150-200 mL destilata.

Prebaci destilat u lijevak za odvajanje i dodaj oko 25 hloroforma.

Protresi lijevak nekoliko puta, (previše intenzivno miješanje moţe

prouzrokovati stvaranje emulzije; ako se emulzija stvori pokušaj izvršiti

isoljavanje). Okrećući lijevak za odvajanje naopako, kroz ventil moţeš


17

ispusti gasove koji nastaju pri ekstrakciji.

Ostavi lijevak da stoji na prstenu dok se slojevi ne razdvoje.

U Erlenmeyerovu tikvicu od 125 mL, ispusti donji organski sloj i ponovi

ekstrakciju još dva puta na isti način sa po 20 mL hloroforma

Sakupljeni ekstrakt osusiti sa anhidrovanim magnesiz sulfatom, višak

rastvaraca upariti na rotavaporu do volumena 10 mL.

Nakon uparavanja ostatak prebaciti u izvaganu kristalizirku.

Kad je otapalo otparilo, izvagaj kristalizirku i iz razlike masa izračunaj

masu dobivenog produkta.

PRIPREMNA VJEŢBANJA

1. Navedi metode kojima moţeš izolirati esencijalna ulja iz biljnog materijala!

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________ 2. Na koji način se vrši sušenje organskog ekstrakta?

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

______________________________________________________


18

IZVJEŠTAJ


1. Izračunaj prinos esencijalnog ulja u odnosu na početnu masu biljnog

materijala!

2. Izračunaj prinos eugenola u odnosu na masu dobivenog esencijalnog ulja

i u odnosu na početnu masu biljnog materijala!


19

1. Šta moţe uticati na prinos eugenola?

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

2. Objasni šta se dešava sa eugenolom u svakom korak

ekstrakcije!

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

_____________________________________________________

Eugenol u

klinčićima

Destilacija

Ekstrakcija sa CH2Cl2

Ekstrakcija sa KOH

Eugenol u baznom

ekstraktu

Ekstrahuj sa CH2Cl2

Isperi sa CH2Cl2

Zakiseli sa HCl

Eugenol u

CH2Cl2

ekstraktu

Isperi sa H2O

Isperi sa NaCl

Osuši sa Na2SO4

Otpari CH2Cl2

Eugenol

Eugenol u destilatu

Eugenol u CH2Cl2

ekstraktu


20

Vjeţba br. 4 IZOLACIJA LIKOPENA IZ PARADAJZA

UVOD

Karotenoidi su organska jedinjenja koja se svrstavaju u terpenoide; po formuli su tetra-terpenoidi,

zbog obojenosti pigmenti, a po fizičkim osobinama su lipidi. Osnovni biohemijski značaj karotenoida

je u tome što učestvuju uz hlorofile i fikobilinske pigmente u fotosintezi. Karotenoidi u toku

fotosinteze štite ćeliju od fotodinamičke destrukcije koju katalizuje hlorofil, i apsorbuju i prenose

svjetlosnu energiju do hlorofila A.

Dejstvo svjetlosti i molekulskog kiseonika moţe biti letalno za ćeliju. Pokazalo se da karotenoidi

inhibiraju fotodinamičku akciju svjetlosti i kiseonika na hlorofil.

Centralni dio molekule sastavljen je od dugog konjugovanog niza, najčešće osam izoprenskih jedinica

CH2=CHC(CH3)=CH2, vezanih tako da dvije CH3 grupe najbliţe centru zauzimaju poloţaj 1,6, a ostale

su u poloţaju 1,5. Na krajevima ovog niza nalaze se bilo dva otvorena niza, bilo dva prstena ili je na

jednom kraju otvoren niz, a na drugom prsten.

Posljedica ovakve strukture je velika reaktivnost karotenoida, podloţnost autoksidaciji, intezivna boja,

kao i karaktersitični apsorpcioni spektri.

Karotenoidi koji su ugljovodonici nazvani su karotenima, a oksidovani derivati karotena ksantofilima.

Svi karotenoidi su rastvorni u mastima, većina je rastvorna u organskim rastvaračima (karoteni), dok

su neki rastvorni u alkoholu i alkalijama (ksantofili). Karotenoidi koji su vezani za bjelančevine i

ugljikohidrate-oblik u kojem se najčešće nalaze u prirodi-jesu jedinjenja rastvorna u vodi.

Nekoliko pigmenata obično dolazi zajedno i to u malim količinama. U višim biljkama najčešće se i u

najvećim količinama nalaze β-karoten, lutein, kao i violaksantin i neoksantin, koji su najvaţniji

ksantofili u višim biljkama. U nekim biljkama je prisutan i α-karoten, mada u mnogo manjim

količinama.

Likopen je polien sa 11 dvostrukih veza (C40H56, aciklički tetraterpen). Svrstava se u grupu

karotenoida i strukturni je izomer karotena, ali ne pokazuje vitaminske aktivnosti. Nalazi se u

plodovima voća i povrća (jabuka, paradajz) da daje plodovima crvenu boju. Apsorpcioni maksimum je

na 504 nm.

Po strukturi su vrlo slični i njihovo čišćenje pomoću uobičajenih metoda kristalizacije je bilo vrlo

teško. Nagli razvoj na području hemije karotenoida započeo je primjenom hromatografske apsorpcije

na aluminijevom oksidu, magnezijevom oksidu ili kalcijevom karbonatu. Upravo pri odvajanju

karotenoida ova se tehnika ubrzano razvijala.

likopen

-karoten


21

ksantofil

EKSPERIMENTALNI DIO

Izolacija

Postupak 1

Odvagati 20 grama paradajz pirea u erlenmajericu (150-200 mL) i dodati 20 mL acetona. Smjesu

mješati 15-20 minuta na magetnoj mješalici i nakon toga je profiltrirati. Filtrat odbaciti, a talog

prenjeti u novu erlenmajericu, dodati dihlormetan (25 mL) i sadrţaj mješati 5 minuta. Sadrţaj

dekantirati preko Bihnerovog lijevka, ostavljajući glavninu taloga u erlenmajerici. Ponoviti ekstrakciju

sa novom količinom dihlormetana (10 mL). Sadrţaj profiltrirati u istu bocu, a potom ga osušiti sa

Na2SO4 i filtrirati u čistu izvaganu posudu. Na vodenom kupatilu otpariti višak rastvarača i izračunati

prinos.

Postupak 2

Odvagati 10 g paradjaz pirea u balon okruglog dna (250 mL) i dodati 15 mL metanola i 35 mL

dihlormetana. Smjesu zagrijavati 10 minuta pod refluksom. Nakon hlaĎenja, smjesu profiltrirati,

prebaciti u lijevak za odvajanje i oprati zasićenom otopinom NaCl (100 mL). Ako doĎe do stvaranja

pjenastog sloja na dnu lijevka, ispustiti nastali sloj u posebnu posudu, a zatim organski sloj u čistu

čašu. Organski sloj ponovo isprati sa 100 mL zasićene otopine NaCl. Osušiti organski sloj, prebaciti u

izvaganu kristalizirku da višak rastvarača otpari. Izračunati prinos dobijenog likopena.


3. Šta su karotenoidi?

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

4. Kakva je uloga karotenoida u biljakama?

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________


22

5. Kakva je razlika u strukturi izmeĎu likopena, -karotena i ksantofila?

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

IZVJEŠTAJ

masa uzorka ___________

masa kristalizirke ___________ masa kristalizirke likopena _____________

masa likopena _______________ prinos _________________


23

Vjeţba br. 5 SINTEZA 7-HIDROKSI-4-METILKUMARINA

UVOD

Kumarini spadaju u heterociklične spojeve koji u svojoj skeletnoj strukturi sadrţe atome oksigena kao

heteroatome. Kao prirodni produkti naĎeni su u mnogim biljkama. Samo ime kumarin potiče od

karipske riječi „coumarou“ za biljku tonkovac (Dipteryx odorata Willd.) iz koje je kumarin (Slika 1)

prvi put izoliran 1820. godine. Do danas je izolirano preko 2000 kumarinskih struktura iz različitih

biljnih vrsta.

O O Slika 1. Struktura kumarina.

Značajne koncentracije kumarinskih struktura se mogu naći u voću. Najviše u marelicama, višnjama,

jagodama, te začinskim biljkama kao što je cimet i lavanda.

Proizvodnja kumarina počela je 1868. godine kada su se prvi put počeli koristiti u industriji parfema i

pojačivača okusa. Njihova današnja upotreba se najviše zasniva na njihovim antikoagulacijskim

svojstvima, te kao otrov za pacove, upravo zbog tog svojstva. Zagrijavanjem kumarina nastaju

dikumaroli koji su jaki antikoagulanti. Kumarini takoĎer imaju snaţan uticaj na biosintezu vitamina K.

Pored ovih svojstava, kumarini posjeduju i antibakterijska i antigljivična svojstva.

Neke od bitnijih kumarinskih struktura naĎenih u biljnom svijetu su (Slika 2):

a) umbeliferon (1) – kumarin prisutan u aromatičnim biljkama familije Umbelliferae sa izrazitim

antigljivičnim svojstvima;

b) eskulin (2) – glikozidni kumarin iz ploda kestena sa vaskularnim terapeutskim svojstvima;

c) skopoletin (3) – kumarin iz bljke noni koji regulira krvni pritisak, ima značajna antibakterijska

svojstva, te regulira hormon serotonin, te smanjuje depresiju i anksioznost;

d) bergapten (4) – kumarin iz citrusnog voća bergamota koji spada u grupu furokumarina

(psoralena) koristi se kao aktivna komponenta krema i losiona za sunčanje.

O OOH

O

O

HHOH

H

H

OH OH

H

OH

O OOH O O

OH

O

CH31 2 3

O O

OCH3

O

4 Slika 2. Neke kumarinske strukture.

Biosinteza kumarina u biljkama kreće od cimetne kiseline koja se ciklizacijom prevodi u kumarinsku

strukturu. U laboratoriji se najčešće koriste mnoge sintetičke metode, a meĎu njima Perkinova,

Knoevenagelova i Pechmannova reakcija.


24

TEORIJSKE OSNOVE EKSPERIMENTA

U ovoj vjeţbi sinteza 7-hidroksi-4-metilkumarina će se izvršiti prema jednoj od najpoznatijih

sintetičkih metoda za dobivanje kumarina – Pechmannova reakcija. Hans von Pechmann je 1883.

godine sintetizirao kumarinsku strukturu kondenzirajući fenolski derivat sa β-ketonskim esterom.

Kondenzacija ove dvije molekule se uspješno provodi u prisustvu jake kiseline koja ima ulogu

katalizatora, pri čemu nastaje novi prsten u molekuli.

Cijeli tok kondenzacije zavisi od vrste fenolskog spoja, od estera, i od kiselog kondenzacionog

katalizatora.

Generalno, fenolski spojevi koji imaju aktivatorske grupe u meta- i para-poloţaju (CH3, OH, OCH3,

NH2) vrlo lako podlijeţu Pechmannovoj kondenzaciji. Ako je supstituent u orto-poloţaju, onda je već

zauzeta pozicija kondenziranja estera sa fenolom u novi prsten.

Slično, β-ketonski esteri koji imaju jednostavne alkilne grupe u α-poloţaju takoĎer lako podlijeţu

kondenzaciji.

U ovoj vrsti kondenzacije katalizator ima veliki uticaj na tok reakcije. Najčešće korišteni katalizatori

su koncentrovana sulfatna kiselina i polifosforna kiselina. Generalno, postoje dvije vrste mogućih

produkata Pechmannove kondenzacije: kumarin i hromen (Slika 3).

OH

+CH3

O CH3

O OO

CH3

O

O

O

CH3 Slika 3. Produkti Pechmannove kondenzacije

Koji će od ova dva produkta nastati, zavisi od upotrebljenog katalizatora. Uopšteno, vaţe slijedeća

pravila:

a) U prisustvu koncentrovane sulfatne kiseline nastaje kumarin. Jedino u slučaju kada se kao

fenolski derivat koristi β-naftol nastaje smjesa kumarina i hromena.

b) Fenoli koji u prisustvu koncentrovane sulfatne kiseline daju kumarinske strukture, u prisustvu

polifosforne kiseline takoĎer daju iste strukture.

U upotrebi su još neki katalizatori, preteţno Lewisove kiseline: aluminijum (III)-hlorid, cink (II)-

hlorid, indij (III)-hlorid, samarijum (III)-nitrat, bizmut (III)-nitrat, te kationske smole.


25

EKSPERIMENTALNI RAD

ZADATAK VJEŢBE

- Uradi pripremu za vjeţbu i ispiši je u svoj laboratorijski dnevnik

- Pripremi čisto i laboratorijsko posuĎe za sintezu.

- Izvrši sintezu 7-hidroksi-4-metilkumarina prema navedenim uputama.

- Prekristaliziraj sirove produkte.

- Odredi masu prektristaliziranog produkta.

- Odredi tačku topljenja prektristaliziranog produkta.

- Upiši rezultate u svoj laboratorijski dnevnik.


- koncentrovana sulfatna kiselina

- rezorcinol

- etilacetoacetat

- 5% otopina natrijum-hidroksida

- etanol

- destilovana voda

- aktivni ugalj

PRIBOR I OPREMA

- Erlenmajerova tikvica od 250 mL

- čaše od 50 mL, 100 mL i 400 mL

- lijevak za dokapavanje

- stakleni štapić

- pipeta, 20 mL

- Bucherov lijevak

- lijevak

MJERE OPREZA

- Natrijum hidroksid je nagrizajuća supstanca i u slučaju kontakta sa koţom treba ga isprati

velikim količinama vode.

- Koncentrovana sulfatna kiselina je takoĎet veoma nagrizajuća supstance. U kontaktu sa

koţom nagriţeni dio isprati velikim količinama vode.


26

IZVOĐENJE VJEŢBE

Sinteza 7-hidroksi-4-metilkumarina

U Erlenmajerovu tikvicu od 250 mL paţljivo nasuti 10 mL

koncentrovane sulfatne kiseline.

Tikvicu sa kiselinom prenijeti u ledeno kupatilo i pričvrstiti je za

laboratorijski stalak.

Iznad tikvice postaviti lijevak za dokapavanje.

U čaši od 50 mL otopiti 1 g rezorcinola u 3-5 mL etilacetoacetata i

smjesu pomoću uliti u lijevak za dokapavanje.

Paţljivo dokapavati smjesu rezorcinola i etilacetoacetata u

Erlenmayerovu tikvicu sa sulfatnom kiselinom (u porcijama od 1-2

mL). Pri tome paziti da temperatura reakcione smjese ne preĎe 10°C.

Nakon svakog dodavanja smjese rezorcinola i etilacetoacetata,

Erlenmayerovu tikvicu energično promiješati.

Kad je sva smjesa prenesena u tikvicu, tikvicu ostaviti na sobnoj

temperaturi 15-20 minuta.

Pripremiti 200 g smjese leda i vode u čaši od 400 mL.

Preliti reakcionu smjesu u smjesu leda i vode uz veliki oprez, i snaţno

promiješati. U prisustvu vode nastaju ţuti kristali 7-hidroksi-4-

metilkumarina.

Sirovi produkt profiltrirati na Büchnerovom lijevku i isprati ga sa 50

mL hladne destilovane vode.

Sirovi 7-hidroksi-4-metilkumarin otopiti u čaši sa 50 mL 5% vodene

otopine natrijum-hidroksida.

Nastalu otopinu profiltrirati i filtrat zakiseliti do neutralne reakcije.

Tokom neutralizacije smjesu snaţno miješati. Zakiseljavanjem

otopine ponovo dolazi do taloţenja 7-hidroksi-4-metilkumarina.

Prečišćeni produkt ponovo profilrirati na Buchnerovom lijevku i talog

isprati s 50 mL hladne destilovane vode.

Sirovi 7-hidroksi-4-metilkumarin prekristalizirati iz 95% etanola

koristeći aktivni ugalj.

Osušti prekristalizirani kumarin, izvagati svoj produkat na papirnoj

laĎici i odrediti tačku topljenja.

Rezultate upiši u svoj dnevnik.

Na papirnoj laĎici upiši svoje ime, podatke i naziv spoja kojeg si

sintetizirao, te predaj asistentu.


27


1. Objasni pojam reakcija kondenzacije!

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

2. Napiši reakciju sinteze 7-hidroksi-4-metilkumarina!

3. Objasni ulogu sulfatne kiseline u sintezi 7-hidroksi-4-metilkumarina!

________________________________________________________

________________________________________________________

__________________________________________________

________________________________________________________

____________________________________________________

4. Napiši sve moguće izomere rezorcinola i imenuj ih po IUPAC nomenklaturi?


28

IZVJEŠTAJ

Ime i prezime: _______________________________________ Grupa:___________

Datum: ___________________ Asistent: ___________________________________

masa rezorcinola: ____________ g

količina rezorcinola: ____________ mol

teorijski prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina

masa sintetiziranog 7-hidroksi-4-metilkumarina:

____________ g

____________ g

prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina: ___________ %

tačka topljenja 7-hidroksi-4-metilkumarina (interval topljenja) ______°C (_______°C)

PITANJA:

Koliki je prinos 7-hidroksi-4-metilkumarina ako si za sintezu uzeo/la 3 g rezorcinola, a dobio/la

si 4 g 7-hidroksi-4-metilkumarina?


29

Vjeţba br. 6 ODREĐIVANJE ANTIOKSIDACIJSKE AKTIVNOSTI

UVOD

Najšire prihvaćena definicija bioloških antioksidanasa jeste ona koju je dao Halliwell, 1990.

god , a prema kojoj su antioksidansi „ supstance koje prisutne u malim koncentracijama u odnosu na

supstrat (biomolekulu) koji se oksiduje, značajno usporavaju ili sprečavaju oksidaciju tog supstrata“.

Antioksidansi mogu ispoljavati svoju aktivnost različitim mehanizmima, zahvaljujući njihovoj

sposobnosti da:

djeluju kao „hvatači“ (skevindţer) slobodnih radikala

djeluju kao donori elektrona ili

donori H-atoma

Način djelovanja antioksidansa

Prema klasifikaciji antioksidanasa (Shi et al., 2001) izvršenoj na osnovu nivoa i načina

djelovanja u ljudskom organizmu, postoje: preventivni antioksidansi, „skevindţer“ antioksidansi i

„reparacioni“ antioksidansi. Preventivni antioksidansi sprječavaju nastanak slobodnih radikala.

„Skevindţer“ antioksidansi posjeduju sposobnost da „hvataju“ slobodne radikale. „Reparacioni“

antioksidansi djeluju posebnim mehanizmima, obnavljajući ili uklanjajući oštećene vitalne

biomolekule koji nastaju u uslovima oksidativnog stresa. U „reparacione“ antioksidanse ubrajaju se

fosfolipaze, proteaze, enzimi koji obnavljaju DNK, transferaze, itd.

Prema mjestu nastajanja, antioksidansi značajni za ljudski organizam dijele se na: endogene i

egzogene. Endogeni antioksidansi predstavljaju antioksidanse koji nastaju u ljudskom organizmu, dok

egzogeni unose putem hrane ili lijekova. Fenolna jedinjenja su jedna od najvaţnijih grupa prirodnih

egzogenih antioksidanasa, čija je aktivnost uslovljena strukturnim karakteristikama.

Antioksidansi mogu reducirati (deaktivirati) radikal kroz dva istraţena mehanizma. Krajnji

rezultat po oba mehanizma je isti, ali je razlika u kinetici i potencijalu pratećih reakcija. Pomenuti

mehanizmi se odnose na tzv. HAT (Hydrogen Atom Transfer) mehanizam i SET (Single Electron

Transfer) mehanizam.


30

HAT mehanizam i metode bazirane na HAT mehanizmu

HAT mehanizam podrazumijeva transfer atom vodika sa antioksidansa na radikal. Odvijanje

rekacije po HAT mehanizmu zavisi od niza faktora, kao što su struktura i osobine antioksidansa,

topivost antioksidansa i sistema rastvarača. Energija disocijacije veze i jonizacijski potencijal su dva

glavna faktora koji odreĎuju mehanizam i učinkovitost antioksidansa.

Metode bazirane na HAT mehanizmu podrazumjevaju mjerenje sposobnosti „neutralizacije“

radikala doniranjem vodikovog atoma.

Mnogi naučnici smatraju da je doniranje vodikovog atoma slobodnom radikalu upravo jedan

od presudnih koraka mehanizma po kojem antioksidansi „neutraliziraju“ iste. Faktor koji u najvećoj

mjeri determinira HAT mehanizam jeste energija disocijacije grupe koja donira vodikov atom

potencijalnog antioksidansa i dominira kod spojeva kod kojih je ΔBDE≈-10 kcal/mol i ΔIP<-36

kcal/mol. Mjerenja antioksidativne aktivnosti i kapaciteta temelji se na mjerenju kinetike same

reakcije. HAT mehanizam je ovisan o sistemu rastvarača kao i pH vrijednosti medija i obično se radi o

vrlo brzim reakcijama koje postiţu ravnoteţu reda sekundi do nekoliko minuta. Prisustvo redukujućih

vrsta, uključujući i metala, usloţnjavaju metode odreĎivanja antioksidativne aktivnosti bazirane na

HAT mehanizmu i vrlo često dovode do prividno velike antioksidativne aktivnosti

SET mehanizam i metode bazirane na SET mehanizmu

SET mehanizma podrazumjeva jednostavan transfer elektrona sa antioksidansa na aktivnu

vrstu. Prema tome, metode bazirane na SET mehanizmu mjere potencijal antioksidansa da prenese

elektron na neku reaktivnu vrstu, uključujući i metale, karbonile i radikale.

SET i HAT mehanizmi se redovito odvijaju zajedno u nekom sistemu, a odreĎeno je prirodom

antioksidansa i pH vrijednošću medija. Relativna reaktivnost prema SET mehanizmu odreĎena je

korakom deprotonacije i IP (Ionization potential) vrijednošću funkcionalne grupe, koja nastupa kao

donor pa su reakcije koje teku po SET mehanizmu jako pH ovisne. U opštem slučaju IP vrijednost se

smanjuje povećanjem pH medija, što odrţava povećani elektrodonorski kapacitet uz deprotonaciju.

SET mehanizam je dominantan ako se u sistemu nalazi spoj sa ΔIP>-45 kcal/mol. Reakcije koje se

odvijaju po SET mehanizmu su obično spore i treba im dosta vremena do uspostavljanja ravnoteţe, a

antioksidativna aktivnost se obično izraţava kao postotak smanjenja reaktivne vrste, a ne kinetičkim

parametrima.

Kada AH+.

ima dovoljno dug vijek trjanja, sekundarne reakcije postaju značajna smetnja u

testovima baziranim na SET mehanizmu. Reakcije koje teku po SET mehanizmu jako su osjetljive na

prisustvo askorbinske i mokraćne kiseline. Vaţne interferencije uzrokuju i nečistoće u tragovima

(naročito metali), naročito u pogledu promjenljivosti, dosljednosti i ponovljivosti u rezultatima


31

testova. Danas jako značajan broj metoda koje se koriste za odreĎivanje antioksidativne aktivnosti

upravo teku po SET mehanizmu. Takve su:

DPPH metoda

ABTS metoda

RP metoda

Metoda redukcije Mo(VI)

Inhibicija helatacije Fe(II) ferozinom

ABTS metoda

Metoda se zasniva na praćenju promjene apsorbanse ABTS•+

radikala na talasnoj duţini

maksimuma apsorpcije od 734 nm, prije i nakon reakcije sa antioksidansom . Sposobnost komponenti

uzorka da izvrše redukciju ABTS•+

radikal kationa mjerena je spektrofotometrijski. Originalna metoda

se sastojala u reakciji metmioglobina sa hidrogenperoksidom u prisustvu ABTS, kako bi se formirao

radikal kation, sa ili bez antioksidansa. Ovakav način je modificiran, tako da se prvo radikal prevede u

stabilnu formu, a nakon toga stupa u reakciju sa potencijalnim antioksidansom. Pored ostalih

modifikacija, ABTS je modificiran i na „microplate“ metod čime se smanjuje potrebno vrijeme za

analizu i reducira cijena. Plavozeleni hromofor ABTS•+

se priprema u reakciji sa kalijum persulfatom

12-16 sati ranije. Vaţna prednost ove metode je u tome da se ABTS moţe otopiti i u vodi i u

organskom otapalu, pa je na ovaj način moguće mjeriti antioksidacijsku aktivnost i hidrofilnih i

hidrofobnih spojeva u ispitivanom uzorku.

Rezultati se predstavljaju kao IC50 vrijednost. IC50 koja podrazumjeva veličinu koja prikazuje

koncentraciju antioksidansa koja inhibira 50% ABTS radikal katjona. Ona se odreĎuje na način da se

prati inhibicija ABTS radikal katjona pri dodatku različitih koncentracija antioksidansa, zatim se iz

grafika PI=f(cantioksidans) sa datom jednačinom pravca izračunava EC50 vrijednost. ABTS kapacitet se

poredi sa BHT (butil-hidroksi-toluen), BHA (butil-hidroksi-anizol) i vitaminom C.

Hemikalije

ABTS reagens,

Etanol-apsolutni,

Kalijum-persulfat,

Kvercetin,

Galna kiselina

Postupak

Pripema ABTS reagensa

- Pomješati jednake volumene ABTS reagensa, otopljenog u vodi (7 mM) i K2S2O8 (2,45mM) i

ostaviti 12-16 sati u mračnom, na temperaturi 4oC.

- Ovakvu otopinu razblaţiti toliko da njena aposrbansa bude 0,7-0,9.

Snimanje toka reakcije

- Etanol koristiti kao slijepu probu, a kao standard kvercetin ili galnu kiselinu


32

- Pripremiti rastvore standarda i uzoraka koncentracije 1mg/mL

- Razblaţenoj otopini ABTS reagensa dodati 100 µL standarda/uzorka •+

i pratiti tok reakcije u

toku 10 min, na 743 nm.

- Nacrtati grafik toka reakcije

- Na osnovu grafika toka reakcije, odrediti četiri koncentracije za standard i uzorke i mjeriti

%AA za sve njih

- Od osnovnog rastvora (1mg/mL) pripremiti odgovarajuće koncentracije

- Nakon dobijenih rezultata nacrtati grafik za standard i sve uzorke, %AA u funkciji

koncentracije.

Procenat inhibicije ABTS•+

radikala računat je po formuli :

0 0% / 100tAA A A A Ao - apsorbansa ABTS•+, At - apsorbansa uzorka nakon 10 min.

Izračunati IC50 je na osnovu jednačine pravca. Niţa vrijednost IC50, predstavlja jaču antioksidativnu

aktivnost.

IZVJEŠTAJ

Ime i prezime: _______________________________________ Grupa:___________

Datum: ___________________ Asistent: ___________________________________

IC50 (uzorka):_________________

IC50 (standarda):_______________

Uz izvještaj priloţiti grafik!!!

Šta moţete reći za antioksidaciju aktivnost ispitivanog uzorka?

___________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________


33

Vjeţba br. 7 HROMATOGRAFIJA NA TANKOM SLOJU (TLC)

UVOD

TLC je jednostavna, brza i jeftina procedura koja hemičaru daje odgovor koliko se komponenti

nalazi u smjesi. Ona se koristi za identifikaciju komponente uporeĎujući njenu Rf vrijednost sa Rf

vrijednošću poznate komponente (obje se nalaze na istoj ploči).

Kod TLC-a stacionarna faza (adsorbens) je u tankom sloju nanešena na staklenu ploču odreĎenih

dimenzija, najčešće 20 x 20 cm (10 x 10 cm). Kao adsorbensi koriste se silika gel, aluminij-oksid,

celulozni prah i poliamid. Moţe biti impregniran i cink-sulfid (fluerescirajuća supstanca) zbog

detekcije pod UV-svjetlom.

Izbor adsorbensa se vrši na osnovu njegove aktivnosti koja je odreĎena njegovom selektivnošću

(jačina aktivnih centara), kapacitetom (gustoća rasporeda aktivnih centara na površini adsorbensa),

veličinom čestica i aktivitetom (sadrţaj vode).

Veze kojima se organska komponenta veţe na adsorbens zavise od jačine slijedećih tipova

interakcije: ion-dipol, dipol-dipol, vodikove veze, dipol inducirani dipol, i Van der Walsove sile. Kod

silika gela dominantne interakcije izmeĎu adsorbensa i materijala koji treba biti razdvojen su dipol-

dipol tipa. Polarnije molekule djeluju poprilično jako sa polarnim Si-O vezama ovog adsorbensa i

nastojat će da se adsorbuju na fine čestice adsorbensa, dok slabije polarna molekule nisu tako jako

vezane. Slabije polarne molekule zbog toga nastoje da proĎu kroz adsorbens brţe od polarnih.

Različite komponente u uzorku putuju različitim brzinama zbog razlika u rastvorljivosti u

rastvaraču i razlikama u privlačnosti sa stacionarnom fazom. Rezultati ovise od upotrebljenog

rastvarača.

Vizualizacija tačaka se moţe napraviti tako što ploču prskamo sa odgovarajućim detekcionim

reagensima. Za svaku klasu organskih spojeva postoje karakteristični detekcioni reagensi koji sa

komponentema uzorka daju karakteristična obojenja ili pojavu fluorescencije.

Uzorak rastvoren u odgovarajućem rastvaraču se nanosi u vidu mrlje na jednu stranu ploče, na

udaljenosti 1 cm od ivice. Ploča se unosi u komoru na čijem dnu se nalazi rastvarač koji kapilarnim

silama prolazi kroz adsorbens noseći sa sobom komponente uzorka, koje se kreću do odreĎene

udaljenosti na ploči. Zbog različitog afiniteta komponente se zaustavljaju na različitim mjestima na

ploči, što omogućava njihovu identifikaciju

Za svaku komponentu karakteristična je njena Rf vrijednost koja se dobije iz omjera duţine

preĎenog puta komponente i duţine preĎenog puta mobilne faze. Rf vrijednost nije fizikalna konstanta

i ona zavisi od:

a) vrste mobilne faze i stepena zasićenosti atmosfere mobilnom fazom u kadi za razvijanje;

b) aktiviranja i uslova čuvanja ploča za hromatografiju;

c) veličine čestica adsorbensa;

d) debljine sloja adsorbensa.


34

Da bi se mogao identificirati odreĎeni spoj potrebno je imati standard odreĎene čistoće. Spoj je

identificiran TLC-om ako je nakon detekcije odreĎenim detekcionim reagensom isto obojen kao

njegov standard i ako ima istu Rf vrijednost kao i standard pod istim uslovima.

Hromatografija na tankom sloju ima široku primjenu u analizi organskih spojeva. Njome se vrše

preliminarna ispitivanja, separacija, identifikacija i odreĎivanje čistoće različitih spojeva.

Alkaloidi

Većina biljnih alkaloida su tercijarni amini; drugi sadrţe primarni, sekundarni ili kvanterni nitrogen.

Slika 1-4. Bazičnost alkaloida varira u zavisnosti kojem tipu od ova četiri pripada. Veličina uzorka

alkaloida koja će se aplicirati na TLC ploču mora biti izračunata prema srednjoj vrijednosti sadrţaja

alkaloida specifičnog ekstrakkta. Ekstrakcija se vrši na slijedeći način: usitnjena droga 1 g dobro se

izmiješa sa 1 ml 10% rastvorom amonijaka ili 10% rastvoromm Na2CO3 i onda se ekstrahira sa 5 ml

metanola 10 minuta pod povratnim hladilom. Filtrat se koncentrira prema sadrţaju ukupnih alkaloida

specifične droge, tako da 100 μl sadrţi 50 – 100 μg ukupnih alkaloida. Većina istraţivača koristi

silika gel 60 F254, ali aluminij oksid je takoĎer pogodan. Mnoge mobilne faze sadrţe hloroform, čija

se moć eluacije moţe smanjiti dodatkom cikloheksana ili povećati dodatkom acetona, etanola ili

metanola. Mobilna faza je obično bazna dodatkom amonijaka ili dietilamina do manje polarnih

rastvarača, ali dietilamin nije tako lako ukloniti prije prskanja. Najčešći eluenti su hloroform-metanol

(90:10) ili hloroform-dietilamin (90:10). TakoĎer se moţe koristiti i mješavina koja je pogodna za

većinu alkaloida toluen-etil acetat-dietilamin (70:20:10).

Detakcija alkaloida je moguća pod UV svjetlom 254 nm i 365 nm kao i sa dva reagensa. Dragendorff i

jodoplatinat.

Esencijalna ulja

Esencijalna ulja su mirisne komponente koje se nalaze u različitim djelovima biljke zbog toga što

isparavaju kada se izloţe zraku na sobnoj temperaturi zovu se i volatilna ulja, eterična ulja ili

esencijalna ulja. Najčešće se sastoje od (a) terpena npr. alkohola (borneol, geraniol, linalol, mentol),

aldenihda (anisaldehid, citral), ketona (tujon), estera (bornil acetat, linalil acetat) ili (b) fenil

propanskih derivata (eugenol, safrol) itd. Rastvorljiva su u etanolu i toluenu i najčešće se dobivaju

hidrodestilacijom biljnog materijala. Za pripremanje ekstrakta, mikro-destilacija je metod koji se

koristi da bi se izvuklo i sačuvalo esencijalno ulje. Esencijalno ulje se ekstrahuje toluenom, ili

ksilenom i sadrţi uzorak koji će biti analiziran metodom TLC, ali tkoĎer moţemo ga izolovati i sa

heksanom, eterom ili acetonom.

Najčesće stacionarna faza koja se koristi je silika gel, a mobilne faze koje se koriste su : benzen,

toluen, hloroform. Zbog svoje toksičnosti benzen se ne preporučuje kao rastvarač za TLC. Mobila faza

toluen-etil acetat (97:3) je pogodan za sva vaţna esencijalna ulja.različiti rastvarači mogu se primjeniti

u posebnim slučajevima npr. toluen (Pimpinella anisum), hloroform (Melissa officinalis), metilen

hlorid (Pimpinella, Juniperus, lavandula, Rosmarinus i Salvia), toluen-etil acetat (Eucaliptus,

Mentha), hloroform-toluen (75 : 25) za Thyms vulgaris i Chamomilla recutica.


35

Detekcija pod UV svjetlom na 254 nm za komponente koje sadrţe najmanje dvije konjugirane

dvostruke veze i gase tamne zone naspram zelenoj fluorescirajućoj pozadini. Ovo je slučaj kad su u

pitanju derivati fenil-propana (anetol, šafrol, eugenol itzd). Reagensi koji se koristi za prskanje su:

anisaldehid-sulfat koji daje plavo, zeleno, crveno i smeĎe obojenje i fosfomolibdenska kiselina koja

daje plave mrlje na ţutoj pozadini. Reagens koji se najčešće koristi je vanilin-sulfat koji daje širok

dijapazon boja.

EKSPERIMENTALNI RAD

1 ZADATAK VJEŢBE

- Pripremi ploče za tankoslojnu hromatografiju.

- Izvrši separaciju komponenti esencijalnog ulja tankoslojnom hromatografijom.

- Rezultate analize upiši u svoj laboratorijski dnevnik.

2 HEMIKALIJE I REAGENSI

- dihlormetan

- iod/škrob reagens za detekciju*

- vanilin/sulfatna kiselina reagens za detekciju*

- silika gel (GF-245)

- anhidrovani natrijum sulfat

- etilacetat

- toluen

3 PRIBOR I OPREMA

- Erlenmayerova tikvica, 250 mL

- čaša od 100 mL, 2 komada

- staklene kapilare

- ploče za tankoslojnu thomatografiju

- kada za tankoslojnu hromatografiju

- sprejalica za tankoslojnu hromatografiju

- UV-lampa

- eksikator

4 IZVOĐENJE VJEŢBE

Preliminarna ispitivanja heterogenosti uzorka ulja, rade se tankoslojnom hromatografijom.

Kao rastvarač koristi se sistem toluen – etilacetat (97:3)

Priprema reagenasa

Anisaldehid – sulfatna

kiselina

0,5 ml anisaldehida, 10 ml glacijalne sirćetne kiseline, 85 ml

metanola i 5 ml koncentrovane sulfatne kiseline, se pomiješa

navedenim redom i priprema neposredno pred upotrebu

Vanilin – sulfatna kiselina

C8H803/H2SO4 a) 1 % etanolni rastvor vanilina – rastvor I

b) 10 % etanolni rastvor sulfatne kiseline – rastvor II


36

Jod / škrob (pare joda /

1 % rastvor škroba)

2 g topivog škroba pomiješa se sa 5 ml vode i ulije u 45 ml

ključale vode, smjesa se zagrijava 2 min i spremna je za

upotrebu nakon hlaĎenja

Fosfomolibdenska

kiselina

P20524MoO3xH2O

20 % etanolni rastvor fosfomolibdenske kiseline

Tankoslojna hromatografija

Pripremi dvije hromatografske ploče. Na svaku nanesi pripremljene

uzorke

Odredi startnu liniju na hromatografskoj ploči, oko 1,5-2,0 cm od

ruba ploče.

Na startnu liniju nanesi uzorke esencijalnog ulja, tako da je najmanji

razmak meĎu mrljama 2 cm.

Na hromatografske ploče nanesi i uzorak standarda kojeg ćeš dobiti

od asistenta.

Kao mobilnu fazu pripremiti otopinu toluen – etilacetat u volumnom

omjeru 97:3.

Paţljivo prenesi hromatografske ploče u kadu u kojoj se nalazi

mobilna faza.

Startna linija mrlja uzoraka mora biti iznad površine mobilne faze.

Kada mobilna faza preĎe odreĎeni put na hromatografskoj ploči,

ploče paţljivo izvadi iz kade, označi front i ostavi ploče da se osuše.

Detekcija komponenata esencijalnog ulja

DETEKCIJA POD UV LAMPOM 365 nm i 254 nm

Suhu Ploču stavi pod UV lampu i uoči da li je neke od komponata

moguće detektovati na ovaj način

DETEKCIJA REAGENSOM IOD/ŠKROB*

Suhu hromatografsku ploču prenesi u eksikator u kojoj se nalaze

kristali ioda. Uočit ćeš ljubičaste pare ioda koji sublimira u

eksikatoru.

Kada na hromatogramu uočiš ţuto-smeĎe mrlje ioda koji se adirao na

komponente esencijalnog ulja, ploče paţljivo izvadi iz eksikatora.

Da bi se fiksirale detektirane ţute mrlje, razvijene hromatograme

sprejaj otopinom škroba koju ćeš dobiti od laboranta.

Detektovane ţute mrlje postat će modro-plave.


37

* Reagens iod/škrob je univerzalni detekcioni reagens na sve organske spojeve.

DETEKCIJA REAGENSOM ANISALDEHID – SULFATNA KISELINA

Ploča se prska sa 10 ml reagensa, zagrijava na 100 - 105°C, 5-10 min,

dok mrlje ne postignu maksimum intenziteta boje. Detekcija se vrši

na dnevnoj svjetlosti ili/i pod UV 365 nm. Reagens je specifičan za

različite prirodne materijale, posebno derivate terpena, ali i za fenole,

šećere i steroide, koji daju različito obojene produkte (ljubičasto,

plavo, crveno, ţuto ili zeleno) zavisno o vrsti jedinjenja.

DETEKCIJA REAGENSOM VANILIN – SULFATNA KISELINA

Ploča se prvo prska rastvorom I, a zatim odmah rastvorom II.

Zagrijavaj u sušnici na 110°C, 5-10 min. Reagens je specifičan za

komponente esencijalnog ulja, npr. terpenoide i fenilpropanoide.

Nastaju mrlje sličnih boja kao kod detekcije s anisaldehidom.

Hromatografsku ploču stavi pod UV svjetlost. Uočit ćeš

fluorescenciju različitih boja.

* Reagens vanilin/sulfatna kiselina je univerzalni detekcioni reagens na komponente

esencijalnih ulja.

DETEKCIJA REAGENSOM FOSFOMOLIBDENSKA KISELINA

Ploča se prska sa 10 ml rastvora, nakon čega se zagrijava na 100

- 110°C, 5 min nastaju plave mrlje na ţutoj pozadini.

Univerzalni reagens za reducirajuća jedinjenja uključujući

terpene.

Identifikacija komponenata esencijalnog ulja

Prebroj komponente svakog uzorka na oba razvijena hromatograma.

Odredi Rf vrijednosti standarda koje si dobio od asistenta i odredi da

li imaš iste komponente u svom uzorku.

Upiši rezultate u svoj laboratorijski dnevnik.


38

Rezultati vjeţbe

Uzorci___________________________________________________________________

Standardi _______________________________________________________________

Mobilna faza _____________________________________________________________

Stacionarna faza __________________________________________________________

Upiši Rf vrijednosti i odgovarajuću boju detektovane komponente u prvu kolonu, a u drugu

kolonu upiši podatke za korišteni standard

Uzorak Standard

Rf vrijednost Boja Rf vrijednost Boja

OVJERA VJEŢBE


39

Vjeţba br 7

IZOLACIJA I IDENTIFIKACIJA PRIRODNIH PRODUKATA

Naziv spoja

CAS broj

Molekulska masa

Molekulska

formula

Strukturna formula

Prirodni izvori

Maksimović et al, 2007

Načini izolacije

Navesti literaturni izvor

Identifikacija


Separacija


Kvantitativno

odreĎivanje


Literatura:

Napomena :

Na web stranici predmeta nalazi se isti ovaj formular u word-formatu koji moţete koristiti

pri pripremi ove vjeţbe.

Ovjera


40

UPUTE

Zadatak je predstaviti način izolacije i identifikacije odreĎenog prirodnog produkta,

pregledom dostupne literature.

Navesti ;

Ime, molekulska i strukturna formula, CAS broj, molekulska masa

prirodne izvore za zadati spoj (npr; biljnog porjelka, specificirati vrstu –e u kojima se

moţe naći i u kojim količinama)

specifičnosti ( nije obavezno ali ukoliko ima neku specifičnost npr. vezanu za

upotrebu, uticaj na ţivi organizam......)

način izolacije (npr; destilacije, ekstrakcije.......)

način separacije (npr; hromatografije, ekstrakcije........)

način identifikacije (npr; spektroskopske metode, IR, NMR....)

kvantitativno odreĎivanje (navesti instrumentalnu tehniku)

spisak literature (za svaki od navedenih koraka navesti literaturu predstavljenu

spiskom po harvardskom načinu pisanja literature) npr;

Maksimovic, M., Vidic, D., Milos, M., Solic, M. E., Abadzic, S., Siljak-Yakovlev, S. (2007)

Effect of the environmental conditions on essential oil profile in two Dinaric Salvia species: S.

brachyodon Vandas and S. officinalis L., Biochemical Systematics and Ecology, 35, 473-

478.

Documents

PRAKTIKUM IZ HEMIJE PRIRODNIH PRODUKATA … za organsku hemiju i...Listovi biljke čajevac, Camellia sinensis, od kojih se spravlja čaj, vrući aromatični napitak blago gorkog i