Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V
NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
Evidenčné číslo: 2118054
NUTRIČNÁ A TECHNOLOGICKÁ KVALITA ZRNA
FAREBNÝCH GENOTYPOV PŠENICE LETNEJ FORMY
OZIMNEJ
2010 Dáša Čandová, Bc.
SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE
FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA
NUTRIČNÁ A TECHNOLOGICKÁ KVALITA FAREBNÝCH
GENOTYPOV PŠENICE LETNEJ F. OZIMNEJ
Diplomová práca
Študijný program: Biotechnológie
Študijný obor: 4.2.1 Biológia
Školiace pracovisko (katedra/ústav): Katedra biochémie a biotechnológie
Školiteľ: Ing. Milan Chňapek, PhD.
Nitra 2010 Dáša Čandová, Bc.
Čestné vyhláseniePodpísaná Dáša Čandová vyhlasujem, že som záverečnú prácu na tému „Nutričná a
technologická kvalita zrna farebných genotypov pšenice letnej f. ozimnej“ vypracovala
samostatne s použitím uvedenej literatúry.
Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak hore uvedené údaje nie sú
pravdivé.
V Nitre 16. apríla 2010
PoďakovanieTouto cestou si dovoľujem poďakovať vedúcemu diplomovej práce Ing. Milanovi
Chňapekovi, PhD. za jeho všestrannú pomoc a odborné rady, ktoré mi poskytol pri
vypracovaní záverečnej práce.
V Nitre 16. apríla 2009
AbstraktTechnologické vlastnosti pšeničného zrna sú podmienené množstvom a zložením
zásobných bielkovín. Veľmi dôležitou vlastnosťou zásobných bielkovín pšeničného zrna je
schopnosť gliadínov a glutenínov tvoriť lepok. Elektroforetickou separáciou zásobných
bielkovín zrna pšenice pomocou SDS PAGE je možné identifikovať individuálne
vysokomolekulárne (HMW-GS) glutenínové podjednotky, na základe ktorých je možné
diferencovať jednotlivé genotypy a charakterizovať technologickú kvalitu zrna.
Cieľom našej práce bolo pomocou elektroforetickej separácie zásobných bielkovín zrna
pšenice v polyakrylamidovom gély, charakterizovať 4 genotypy konvenčnej pšenice letnej
(Triticum aestivum L.) v porovnaní so 4 farebnými (modré) genotypmi pšenice letnej. Z
dosiahnutých výsledkov vyplýva, že konvenčné odrody sa vyznačujú rozdielnym
zastúpením individuálnych HMW-GS. Najvyššiu technologickú kvalitu vykázala odroda
Astela, Samanta a Lívia.
Z elektroforeogramov farebných genotypov pšenice letnej formy ozimnej vyplýva, že 3
analyzované kultivary boli homogénne jednolíniové. V kultivare Barevná 9 bola
detegovaná dvojlíniovosť. Táto odroda vykázala Glu-skóre 7 a 9, čo predikuje dobrú
pekársku kvalitu
Z výsledkov ďalej vyplýva, že z génov kódovaných lokusom Glu-Al bola najčastejšie
identifikovaná podjednotka 1. Lokus Glu-Bl bol najčastejšie reprezentovaný HMW -
gluténovými subjednotkami 7+8 a 7+9 Z dosiahnutých výsledkov ďalej vyplýva, že na
pekársku kvalitu múky kladne vplývajúca dvojica podjednotiek 5+10 bola identifikovaná v
8 genotypoch.
Kľúčové slová: farebné genotypy pšenice, zásobné bielkoviny, SDS-PAGE
AbstraktTechnological qualities of a wheat seed are conditioned by the quantity and composition of
the storage proteins. A very important quality of the wheat seed storage proteins is the
ability of the gliadins and glutenins to form gluten. By an electroforetic separation of the
storage proteins using SDS PAGE it is possible to identify individual high-molecular
weight glutenin subunits (HMW-GS). According to that, differentiation of the particular
genotypes and defining of the technological quality of wheat is possible.
The aim of our work was to characterise 4 genotypes of common summer wheat (Triticum
aestivum L.) in comparison with 4 coloured (blue) genotypes of summer wheat using the
electroforetic separation of storage proteins in a polyacrylamid gel.
The result of our research is the fact that the common varieties of wheat are specific in
containing individual HMW-GS. The highest technological quality possesses the Astela,
Samanta and Lívia variety.
From the electroforeogram of the summer wheat coloured genotypes it is clear, that the 3
analysed cultivars were homogenously mono-lined. In the cultivar Barevná 9 the attribute
of dual-line was detected. This variety showed Glu-score 7 and 9, which predicts a good
baking quality.
Secondly, from the Glu-Al locus coded genes the subunit 1 was the most frequently
identified unit. The Glu-Bl locus was the most represented by HMW-gluten subunits 7+8
and 7+9. Thirdly, regarding baking quality of wheat, a positively influential pair of
subunits 5+10 was identified in 8 genotypes.
Key words: color bread wheat, zásobné bielkoviny, SDS-PAGE
Obsah
Úvod.......................................................................................................................................9
1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY........................11
1.1 Všeobecná charakteristika obilnín.........................................................................11
1.2 Morfológia zrna pšenice........................................................................................13
1.3 Chemické a nutričné zloženie zrna pšenice...........................................................14
1.4 Hodnotenie technologickej kvality zrna pšenice...................................................17
1.5 Vplyv zásobných bielkovín na technologickú kvalitu zrna...................................19
1.5.1 Vplyv HMV – GS na pekársku kvalitu..........................................................20
1.5.2 Vplyv gliadínov na pekársku kvalitu.............................................................23
1.6 Zvyšovanie technologickej kvality pšenice...........................................................24
1.6.1 Flavonoidy ako bioaktívne zlúčeniny............................................................24
1.6.2 Modrá farba zrna............................................................................................25
1.6.3 Purpurová farba zrna......................................................................................26
1.6.4 Červená farba zrna.........................................................................................26
1.6.5 Biela farba zrna..............................................................................................27
1.7 Metódy identifikácie genotypov pšenice...............................................................27
1.7.1 Molekulárne markery u pšenice.....................................................................27
1.8 Identifikácia genotypov cereálií elektroforetickými metódami............................28
1.8.1 Elektroforéza bielkovín v polyakrylamidových géloch.................................29
1.8.2 SDS – PAGE..................................................................................................30
2 CIEĽ PRÁCE................................................................................................................32
3 Materiál a metodika......................................................................................................33
3.1 Biologický materiál...............................................................................................33
3.2 Biochemické rozbory.............................................................................................34
3.2.1 Extrakcia a elektroforetické delenie glutenínov zrna pšenice........................34
3.2.2 Extrakcia a elektroforetické delenie gliadínov zrna pšenice..........................36
3.2.3 Farbenie a vizualizácia bielkovín...................................................................37
3.2.4 Vyhodnotenie a genetická interpretácia elektroforetických profilov bielkovín37
3.2.5 Výpočet obsahu bielkovín a koeficienta nutričnej kvality.............................38
3.2.6 Metóda diskontinuálnej frakcionácie bielkovinového komplexu zrna podľa Osborna 38
3.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov......................................................................38
4 VÝSLEDKY A DISKUSIA.........................................................................................39
5 ZÁVER.........................................................................................................................44
6 Zoznam použitej literatúry............................................................................................45
Úvod
Rastlinná výroba predstavuje základ svetového hospodárstva. Pripadajú na ňu
minimálne 2/3 hodnoty produkcie svetového poľnohospodárstva. Obilniny tvoria kľúčovú
skupinu plodín rastlinnej výroby Slovenska. Ich pestovanie je dominantné, pretože sa
podieľajú 40 % na energetickej hodnote spotrebovaných potravín a 35 % energetickej
hodnoty vo výžive zvierat. Prioritné postavenie v pestovaní a produkcii obilnín
v podmienkach Slovenska patrí pšenici, ktorá zaberá takmer štvrtinu výmery ornej pôdy,
čo predstavuje cca 51 %-ný podiel z celkovej plochy obilnín. Pšenica patrí k
najvýznamnejším konzumným obilninám, je energeticky a nutrične hodnotná a jej
kultivácia je ekonomicky efektívna.
Pšenica patrí medzi náročné obilniny, hlavne čo sa týka kvality pôd (černozeme a
hnedozeme s dostatkom humusu a vápna), teplôt (optimálne 25 – 30 ºC, minimálne 6 ºC) a
množstva zrážok. Aj napriek vysokým nárokom, sú areály vyšľachtených odrôd pšenice
veľmi rozsiahle a zahŕňajú prakticky všetky kontinenty. Celková produkcia obilnín vo
svete v rokoch 2000 – 2005 sa pohybovala v rozmedzí od 2042 do 2268 mil. ton, z toho
produkcia pšenice dosiahla 561 až 629,5 mil. ton. Pšenica sa pestuje najmä na severnej
pologuli. Najväčšími producentmi sú Čína, USA, India, Kanada, Nemecko a Rusko.
Pre potravinárstvo sa využívajú najmä odrody ozimnej a jarnej formy letnej pšenice
a odrody tvrdej pšenice. Pšeničné zrno sa využíva na výrobu chleba, pečiva, cestovín, krúp
a cukrárenských výrobkov. Pšenica má i vysokú dietetickú hodnotu, najmä celozrnný
chlieb, pri ktorom sa pozitívne hodnotí vplyv vlákniny na zníženie cholesterolu v krvi
a činnosť čriev. Obilniny obsahujú významné množstvo antioxidantov predovšetkým
polyfenolickej povahy, karotenoidov, tokoferolov, čím pozitívne vplývajú na celý rad
srdcovo – cievnych ochorení. Konzumáciou pšenice získava ľudstvo približne 21 %
energie. Pšeničné šroty a otruby slúžia ako sacharidové krmivo pre hospodárske zvieratá.
Priemyselne sa využíva ako surovina na výrobu lepkových bielkovín, lepidiel, škrobu
s následným využitím v papiernickom a textilnom priemysle, na výrobu alkoholu
a plastických látok.
Trvalý rast životnej úrovne a uspokojovanie stále vyšších potrieb obyvateľstva sú
základné atribúty rozvinutej spoločnosti. V súčasnosti sa kladie hlavný dôraz na to, aby
naša výživa bola vyvážená nielen v množstve ale aj štruktúre. Proces zlepšovania
kvalitatívnych vlastností odrôd pšenice letnej formy ozimnej je náročný výskumno–
šľachtiteľský proces, ktorý sa stáva zvlášť obtiažnym pri tvorbe materiálov s vysokým
úrodovým potenciálom a zároveň s vysokou technologickou kvalitou.
Pšenica letná je hexaploid (2n-6x-42) a jednotlivé znaky kvality sú kódované na
rôznych chromozómoch. Napriek značnej zložitosti genomu je známa rada markerov pre
tieto znaky: sedimentácia, obsah bielkovín, gliadíny, HMW (High Molecular Weight –
vysokomolekulárne) a LMW (Low Molecular Weight – nízkomolekulárne) podjednotky
glutenínu, obsah škrobu a jeho vlastnosti. Gliadínové a glutenínové profily pšenice sú
dostatočne polymorfické pre diferenciáciu aj počtom veľkých súborov genotypov. Z tohto
dôvodu sa pri pšenici, pre účely identifikácie a diferenciácie genetických zdrojov
používajú v prevažnej miere metódy analýzy bielkovinových markerov.
1 PREHĽAD O SÚČASNOM STAVE RIEŠENEJ PROBLEMATIKY
1.1 Všeobecná charakteristika obilnín
Pšenica je najdôležitejšia chlebová obilnina s vysokým podielom bielkovín a
kvalitného lepku. Predstavuje základný zdroj ľudskej výživy. Zo všetkých druhov sa
pestuje najviac. Je to mnohozrný, morfologicky a ekologicky značne plastický druh
(Karabínová et al., 1999).
Za pravlasť pšenice považujeme územie Prednej a Malej Ázie. Začiatky pestovania
pšenice úzko súvisia so vznikom poľnohospodárstva v 10.-8. tisícročí pred n.l. (Gajdošová
et al., 2004).
Pšenica letná (Triticum aestivum L.) je najrozšírenejším druhom tak vo svete, ako aj v SR.
Zaberá 80 – 90 % z celkovej pestovateľskej plochy. Má ozimné a jarné formy a takmer
všetky povolené odrody patria k uvedenému druhu. Pšenica letná forma ozimná (Obrázok
1) patrí k najdôležitejším chlebovým obilninám vo svete a jej význam sa neustále zvyšuje.
Z botanického hľadiska rod Pšenica (Triticum L.) patrí do čeľade lipnicovitých
(Poaceae). Zahŕňa niekoľko druhov a veľký počet foriem a kultivarov. Hlavné sú dva
druhy: pšenica obyčajná (Triticum aestivum L.) a pšenica tvrdá (Triticum durum Defs.).
Podľa počtu chromozómov rozdeľujeme pšenicu na tri skupiny:
a) diploidné pšenice so 14 chromozómami (Triticum monococcum L.),
b) tetraploidné pšenice s 28 chromozómami (Triticum dicocoides L.),
c) hexaploidné pšenice so 42 chromozómami (Triticum aestivum L., Triticum spelta L.)
(Zimolka et al., 2005).
Podľa prítomnosti obalových vrstiev delíme pšenicu na tri typy:
a) bezplevnatá (nahá) pšenica,
b) plevnatá pšenica,
d) nekultúrna (divoká) pšenica.
Obrázok 1. Rastlina a zrno pšenice letnej (Gajdošová et al., 2004).
Podľa farby klasu a zrna, ostinatosti sa Triticum aestivum delí do variet:
1. lutescens – farba klasu biela bezostinatá až ostinkatá,
2. milturum – farba klasu červená, bezostinatá až ostinkatá,
3. erythrospermum – farba klasu biela ostinatá,
4. ferrugineum – farba klasu červená ostinatá (Kulík et al., 2002).
Súčasné odrody pšenice boli získané skrížením pšenice dvojzrnkovej – dvojzrnky
(Triticum dicoccum). Nové kultivary sa získavajú krížením druhu (T. aestivum) s inými
druhmi, ktoré disponujú vlastnosťami ako napríklad odolnosť voči chorobám a škodcom,
lepší výnos zrna, vyšší obsah bielkovín (Pospíšil et al., 2008).
1.2 Morfológia zrna pšenice
Plodom pšenice je zrno vajcovitého tvaru, ktoré dosahuje dĺžku 4 až 10 mm v
závislosti od odrody a pozície klásku v klase. Dobre vyvinuté zrno väčšiny odrôd pšenice
je na povrchu hladké, s oblými hranami, na báze perikarpu v mieste umiestnenia embrya
mierne vráskavé. Na ventrálnej strane zrna sa nachádza brázda, ktorá sa smerom do stredu
zrna rozširuje a rozdeľuje zrno na dve lícne časti. Na vrchole zrna sa nachádza kefka
pozostávajúca z viacerých chĺpkov. Podľa tvrdosti zrna rozdeľujeme odrody pšenice na
mäkké, polotvrdé a tvrdé (Morfológia pšenice, 2010).
Najvrchnejšia vrstva zrna (oplodie) chráni zrno pred mechanickým poškodením, je
tvorená celulózou. Oplodie sa skladá z niekoľkých vrstiev:
1. pokožky – epidermis,
2. podpokožky – hypodermis,
3. vrstvy stredných, priečnych, rúrkovitých, alebo vakových buniek (Hrabe et al., 2006).
Podpovrchové vrstvy (osemenie) obsahujú v bunkách farbivá a určujú tak farebný
vzhľad zrna. Ďalšie vrstvy obsahujú polysacharidové látky schopné do určitej miery viazať
vodu, čím prispievajú k udržovaniu stálej vlhkosti zrna (Príhoda et al., 2004).
Endosperm tvorí 84 – 86 % hmotnosti zrna. Endosperm z veľkej časti pozostáva zo
škrobových granúl uložených v bielkovinovom matrixe (Evers et al., 1999). Správne
vyvinuté zrno má jemný, priemerný alebo škrobovitý endosperm (Morfológie pšenice,
2010).
Na rozhraní medzi obalovými vrstvami a endospermom sa nachádza jednoduchá
vrstva zložená z veľkých buniek nazývaná aleurónová vrstva. Bunky aleurónovej vrstvy
obsahujú vysoký podiel bielkovín (asi 30 %), čo je takmer trojnásobok obsahu v
endosperme. Tieto bunky obsahujú taktiež najvyšší obsah minerálnych látok zo všetkých
buniek zrna, preto sa pri vymieľaní aleurónovej vrstvy výrazne zvýši obsah minerálií v
múke (Príhoda et al., 2004). Skladba jednotlivých vrstiev zrna je znázornená na obrázku č.
2.
Obrázok 2. Skladba jednotlivých vrstiev zrna pšenice (Gajdošová et al., 2004).
1.3 Chemické a nutričné zloženie zrna pšenice
Na chemické a nutričné zloženie pšeničného zrna vplýva mnoho faktorov, ako
napríklad oblasť pestovania, odroda, hnojenie, doba siatia, klimatické podmienky a celý
rad ďalších činiteľov (Frančáková et al., 2002).
Pšeničné zrno (Tabuľka 1) obsahuje približne 12 – 14 % vody a zvyšok tvorí
sušina. Základné živiny, ktoré sú zastúpené v sušine sú bezdusíkaté extraktívne látky (64
%), bielkoviny (10 – 16 %), tuky (2,2 %), vláknina (2,4 %) a popoloviny (2 %)
(Karabínová et al., 1999).
Celé pšeničné zrno obsahuje mnoho vitamínov (skupina B, najmä tiamín) a
minerálnych látok (vápnik, železo, fosfor), najmä v obalovej vrstve a klíčku.
Obsah škrobu v pšeničnom zrne sa pohybuje od 50 – 70 %. Škrob sa skladá z dvoch
polysacharidov (amylóza a amylopektín). Molekula amylopektínu má rozvetvený reťazec,
v ktorom sa okrem väzieb 1,4 medzi uhlíkmi, vyskytujú i väzby 1,6, preto ľahšie odoláva
amylolytickým enzýmom, než molekula amylózy (Prugar et al., 2008).
Tabuľka 1: Hlavné zložky jednotlivých častí zrna pšenice (Gajdošová et al., 2004).
Chemické
komponenty
Obsah jednotlivých zložiek v %
Celé zrnoAleurónová
vrstvaZárodok Endosperm
Proteíny 10-17 23-33 36-42 9-14
Škrob 60-70 0 0 78-84
Celulóza 2,5-3,3 12-20 3-5 0,13-0,18
Lipidy 2,0-2,5 7,0-8,5 12-16 0,5-0,7
Minerálne látky 1,4-2,3 9-11 5-6 0,3-0,5
Zo všetkých látok obsiahnutých v zrne pšenice majú najväčší význam bielkoviny
a to z hľadiska technologického, nutričného i kŕmnej hodnoty (Karabínová et al., 1999).
Bielkoviny sú heterogénne látky, zložené z viacerých frakcií, ktoré sa ďalej
rozčleňujú na subfrakcie s charakteristickými vlastnosťami a aminokyselinovým zložením
(Prugar et al., 1986).
Zrelé zrno obsahuje 10-15 % bielkovín, z toho 80-90 % všetkých bielkovín tvoria
zásobné bielkoviny.
Najvyšší obsah bielkovín je v aleurónovej vrstve a v klíčku, kde sa vyskytujú vo
forme metabolicky a geneticky dôležitých látok ako sú enzýmy a nukleoproteiny (Prugar et
al., 2008).
Bielkoviny sa ukladajú v obilninách vo forme bielkovinových teliesok v škrobovom
endosperme a v aleurónových bunkách.
Pšeničná bielkovina je bohatá na aminokyseliny, prolín a kyselinu glutámovú, je
však deficitná na arginín, histidín a má veľmi nízky obsah lyzínu a treonínu (Karabínová et
al., 1999).
Podľa Michalíka (2005) môžeme bielkoviny rozdeliť z hľadiska fyzikálno-
chemických alebo biologických vlastností do rôznych skupín, pričom z hľadiska výživnej a
technologickej kvality je dôležité delenie na albumíny, globulíny, prolamíny (gliadíny pre
pšenicu) a glutelíny (gluteníny pre pšenicu). Vzhľadom na svoju veľkú relatívnu
molekulovú hmotnosť majú bielkoviny niektoré vlastnosti makromolekúl. Ide
predovšetkým o schopnosť tvorby vláknitých a plošných anizotropných štruktúr (filmov),
schopnosť bobtnania a schopnosť tvorby silno viskóznych roztokov s fyzikálnymi
vlastnosťami podobnými anorganickým koloidom.
Najvýznamnejšou vlastnosťou pšeničných bielkovín je tvorba lepku. Lepok tvoria
bielkoviny nerozpustné vo vode (gliadín a glutenín), pričom gliadín je považovaný za
nositeľa ťažnosti, glutenín za nositeľa pružnosti a napučiavania lepku (Frančáková et al.,
2002).
Biologická hodnota bielkovín ( BHB ) je súčasťou výživnej hodnoty bielkovín. Pod
biologickou hodnotou bielkovín sa rozumie zhoda aminokyselinového zloženia daných
bielkovín s aminokyselinovým zložením tých bielkovín, ktoré sa využívajú na stavbu
organizmu človeka, resp. živočícha. Rastlinné (i živočíšne) bielkoviny sa skladajú z 20
proteinogénnych aminokyselín, z ktorých niektoré sú tzv. esenciálne, pretože v organizme
človeka nedochádza k ich syntéze. Nedostatok niektorej esenciálnej aminokyseliny
v potrave obmedzuje využitie všetkých ostatných aminokyselín v potrave (Prugar et al.,
2008).
Z nutričného hľadiska sú dôležité aj pšeničné klíčky, ktoré sú zdrojom biologicky
vysoko hodnotných látok a obsahujú všetky vitamíny skupiny B, vitamíny A, C, D a E. Sú
zložené zo sacharidov, lipidov a bielkovín vyznačujúcich sa vysokým podielom
esenciálnych aminokyselín. Olej z pšeničných klíčkov má vysoký obsah vitamínu E, ktorý
má antioxidačné vlastnosti a chráni bunkové membrány.
Fenolické látky obsiahnuté v rastline ovplyvňujú jej vzhľad, chuť, vôňu, vyznačujú
sa antioxidačnými vlastnosťami a slúžia ako prevencia voči civilizačným ochoreniam.
Z fenolových kyselín bola zistená najmä kyselina ferulová v množstve 50μg/g v
pšeničnej múke a 500 μg/g tejto kyseliny v celej pšenici. V extraktoch pšeničných otrúb
boli identifikované kyselina prokatechínová, kyselina gentisínová, kyselina kávová,
kyselina ferulová. V podmienkach gastrointestinálneho pH a enzýmovej hydrolýzy vzrástla
rozpustnosť a antioxidačná aktivita pšeničných polyfenolov, vďaka čomu možno
považovať pšenicu za dôležitý antioxidačný doplnok. V klíčkoch pšenice sa zistila
koncentrácia 1947-4082 μg/g tokoferolov (Gálová, 2002).
1.4 Hodnotenie technologickej kvality zrna pšenice
Technologická kvalita pšenice sa posudzuje predovšetkým z obsahu lepkových
bielkovín, ktoré sú tvorené frakciami gliadínov a glutenínov a sú spolu so škrobom
významné pri spracovaní pšenice pre pekárenské využitie (Zálešáková et al., 2004).
Z hľadiska spracovateľského priemyslu je veľmi dôležitá kvalita pšeničného zrna,
ktorá zahŕňa širokú škálu aspektov a jej hodnotenie by malo byť vždy komplexné. Kvalitu
môžeme merať kvalitatívnymi a kvantitatívnymi parametrami a na jej zlepšenie alebo
zhoršenie vplývajú rôzne faktory: šľachtenie a výber odrôd, mykotická kontaminácia,
priebeh počasia, technológia pestovania, zber, pozberová úprava, transport a skladovanie
(Frančáková et al., 1995).
Podľa účelu použitia delíme pšenicu na: tvrdú, potravinársku, kŕmnu a osivo
pšenice. Kvalita pšenice na potravinárske účely sa hodnotí z hľadiska :
1. obchodného (hodnotí sa stav obilnej masy),
2. mlynárskeho (štruktúrne - mechanická skladby, chemické zloženie pšeničného zrna),
3. pekárenského (koloidný komplex škrob - bielkoviny a aktivita enzýmového systému).
Pri hodnotení charakteristík pšenice letnej (Triticum aestivum L.) sa najčastejšie
hodnotí mlynárska a pekárska kvality pšenice. Mlynsko – pekársku kvalitu pšenice
podmieňuje hlavne komponentná skladby gluténových bielkovín (podiel
vysokomolekulárnych a nízkomolekulárnych komponentov gluténu) (Karabínová et al.,
1999).
Mlynárska hodnota (stanovenie HTZ, stanovenie prvej triedy, stanovenie
objemovej hmotnosti, stanovenie obsahu popolovín) pšenice je závislá od štruktúrno–
mechanickej skladby a od chemického zloženia zrna. Prejavuje sa pri mletí obilia a má
vplyv na celý rad ďalších vlastností finálneho výrobku.
Pekársku kvalitu pšenice (stanovenie sušiny, stanovenie pádového čísla, stanovenie
hrubého proteínu, stanovenie obsahu škrobu, stanovenie mokrého lepku (G0), stanovenie
ťažnosti lepku (t0), stanovenie napučiavania lepku (Q0), stanovenie Zelenyho testu)
charakterizujú vnútorné vlastnosti a znaky, ktoré sa prejavujú až pri spracovávaní múky na
finálny pekársky výrobok. K základným ukazovateľom pekárskej akosti pšenice patrí
množstvo a vlastnosti lepku. Lepok podmieňuje reologické vlastnosti cesta a charakterizuje
silu múky (Černý et al., 1996).
Podľa Muchovej et al. (2008), pekárska kvalita pšeničnej múky závisí
predovšetkým od nasledovných vlastností:
schopnosť vytvoriť pri kysnutí určité množstvo CO2 (plynotvorná schopnosť múky),
schopnosť vytvoriť cesto, ktoré dokáže udržať vytvorené množstvo CO2 (závisí od
množstva a vlastností bielkovín) – čo ovplyvňuje výsledok kysnutia, prejaví sa v
objeme a tvare výrobku,
schopnosť tmavnúť(farba múky) – vplyv na farbu striedky.
Pšenica na potravinárske účely sa posudzuje pri výkupe podľa nasledovných
hodnôt, ktoré sú uvedené v tabuľke 2.
Tabuľka 2: Hodnoty potravinárskej pšenice (Frančáková, et al., 2002)
Akostné znaky JednotkaTrieda kvality
E A B P
Vlhkosť % 14 14 14 14
Objemová hmotnosť
min.g/l 800 780 760 750
Obsah dusíkatých
látok v sušine% 13,5 12,5 11,5 10
SDS-test min. ml 55 50 45 40
Prímesí spolu max. % 4 5 5 5
- najklíčené zrná
pšenice max.% 1 1 1 1
- zrnové prímesi max. % 1,5 2 2 2
Nečistoty max. % 0,5 0,5 0,5 0,5
Odporúčané znaky
kvality
Obsah mokrého lepku
v suš.min.% 30 27 25 22
Sedimentačný index
podľa Zelenyho min.ml 35 30 25 -
Podľa v súčasnosti platnej normy STN 46 1100-2 z roku 2003 sa potravinárska
pšenica letná zaraďuje do štyroch tried kvality:
E – elitná
A – vylepšujúca
B – štandardná
P – slabá pečivárenská (Frančáková, et al., 2002)
1.5 Vplyv zásobných bielkovín na technologickú kvalitu zrna
Rastlina akumuluje bielkoviny vo forme zásobných látok v špecializovaných
orgánoch a bunkách, nachádzajúcich sa hlavne v semenách a hľuzách. Tvoria zásobu
bielkovín využívanú pri vytváraní optimálnych podmienok pri vývoji nového rastlinného
jedinca. Tieto bielkoviny sa vďaka svojej funkcii nazývajú zásobné bielkoviny (Kraic,
2004). Zásobné bielkoviny slúžia ako zdroj dusíka pre rastúci organizmus a charakterizuje
ich vysoký obsah kyseliny glutámovej (často ako amid z glutamínu) a prolínu (Michalík,.
2008).
Na základe rozpustnosti, ktorá je determinovaná ich primárnou štruktúrou,
nekovalentnými väzbami (vodíkové väzby a hydrofóbne interakcie) a kovalentnými
(disulfidickými) väzbami, sa už niekoľko desaťročí používa ich klasifikácia na:
albumíny – rozpustné vo vode,
globulíny – rozpustné v roztokoch solí,
prolamíny – rozpustné v alkohole,
gluteníny – rozpustné v slabých kyselinách a zásadách (Kraic, 2004).
Zásobné bielkoviny v endosperme vytvárajú bielkovinový komplex, ktorý
z hľadiska chemickej skladby, fyzikálnych a biologických vlastností a lokalizácie v rámci
zrna tvorí komplex heterogénnych bielkovín (Michalík, 2008).
Zásobné bielkoviny pšenice (gliadíny a gluteníny) sú hlavnými komponentmi
lepku, ktorý je zodpovedný za reologické vlastnosti a chlebopekársku kvalitu pšeničnej
múky. Rozmanité kombinácie glutenínových podjednotiek ovplyvňujú technologickú
kvalitu odrôd pšenice rôznymi spôsobmi (Jomová et al., 2008).
Gluténové bielkoviny možno rozdeliť do troch skupín (Shewry et al., 1989):
na síru bohaté bielkoviny – tvoria 80 – 90 % všetkých gluténových bielkovín
(patria sem α-, β- a γ-gliadíny),
na síru chudobné bielkoviny (ω-gliadíny),
agregované bielkoviny s vysokou molekulovou hmotnosťou (HMW-GS) a s nízkou
molekulovou hmotnosťou (LMW-GS).
1.5.1 Vplyv HMV – GS na pekársku kvalitu
Pšeničný glutenín predstavuje vysokomolekulárnu frakciu lepku a predstavuje asi
40 % celkového obsahu bielkovín pšenice. Bola zistená nepriama úmernosť medzi
objemom pečiva a množstvom glutenínu rozpustnom v zriedenej kyseline octovej (0,05 M)
a priama úmernosť s glutenínmi nerozpustnými v zriedenej kyseline octovej, teda rozdiely
v akosti odrôd pšenice sú v značnej miere spôsobené rozdielmi v glutenínovej frakcii
pšeničných bielkovín (Frančáková, H. 2002).
Gluteníny sú heterogénnou zmesou polymérov, ktoré formujú disulfidové väzby
polypeptidov. Gluteníny sa podľa veľkosti molekúl delia na HMW-GS (glutenínové
podjednotky s vysokou molekulovou hmotnosťou) a LMW-GS (glutenínové podjednotky s
nízkou molekulovou hmotnosťou) (Zálešáková et al., 2004).
Štruktúra HMW glutenínovej podjednotky je zložená z alfa – helixu a beta špirály
(obrázok 3).
Obrázok 3. Molekulový model špirálnej štruktúry HMW podjednotiek glutenínu
(http://www.ars.usda.gov/Research/docs.htm?docid=12828&page=3&pf=1&cg_id=0)
Technologická akosť pšenice je podmienená radou génov kódujúcich syntézu
zásobných bielkovín zrna, z ktorých významnú úlohu majú vysokomolekulárne (HMW)
bielkovinové podjednotky, nachádzajúce sa na chromozómoch prvej (1A, 1B, 1D) a šiestej
(6A, 6B, 6D) homologickej skupiny. Medzi HMW podjednotky patria u pšenice gliadíny
a niektoré gluteíny, pričom zvlášť HMW gluteniny majú rozhodujúci význam. Takmer
všetky odrody pšenice s najlepšou pekárskou kvalitou (E a A) obsahujú na chromozóme
1D glutenínový lokus Glu-D1 s alelickým blokom d, ktorý kóduje vysokomolekulárne
(HMW) podjednotky 5+10. Podjednotky 5 a 10 sú vo veľmi tesnej genetickej väzbe
a fungujú ako jediný gén. Preto sa pre ne používa jeden genetický symbol Glu-D1d. Glu-
D1d významne prispievajú k dobrej pekárskej kvalite u pšenice (Martinek et al., 2006).
HMW-GS sú kódované lokusmi Glu-1, lokalizovanými na dlhých ramenách
chromozómov skupiny 1 (1A, 1B, 1D). Tieto gény sa označujú ako Glu-A1, Glu-B1 a Glu-
D1. Rôzne HMW-GS vplývajú rôzne na kvalitu lepku a pšenice ako celku (Zalesakova,
2004). Zo zastúpenia jednotlivých HMW-GS možno predigovať technologickú kvalitu
zrna pšenice vypočítaním Glu-hodnotenia (Vivodík et al., 2007).
Za zdroje vysokej pekárskej kvality sú označované odrody s HMW – Glu
komplexnými alelami 1 alebo 2* (lokus Glu-1A), 7+8, 17+18, 13+16 (lokus Glu–1B),
5+10 (lokus Glu-1D) (Gregová et al., 2001).
Payne et al. (1987) publikovali, aké sú príspevky HMW-GS na pekársku kvalitu vo
forme bodového hodnotenia (Tabuľka3), ktorého súčet pre jednotlivé genotypy pšenice sa
označuje ako tzv. Glu-skóre.
Tabuľka 3: Bodové predikčné hodnoty HMW-GS markerov pekárskej kvality.
Lokus Alela Body
1A
0 1
1 3
2* 3
1B
6+8 1
7 1
7+8 3
7+9 2
13+16 3
14+15 1
17+18 3
20 1
1D 2+12 2
3+13 2
4+12 1
5+10 4
Fyzikálno-chemické a biologické vlastnosti HMW-glutenínových podjednotiek
a tiež ich pomerné zastúpenie má významnejší vplyv na kvalitu múky ako celkový obsah
bielkovín (Holečková, Michalík, 1992). Vlastnosti cesta nie sú ovplyvnené len
glutenínovým zložením, významnú úlohu zohráva aj rovnováha medzi ďalšími jeho
zložkami, ako je škrob, gluténové proteíny, lipidy, voda a samozrejme interakcie medzi
týmito komponentmi (Tohver et al., 2001).
1.5.2 Vplyv gliadínov na pekársku kvalitu
Významnou frakciou zásobných bielkovín sú gliadíny, ktoré sú heterogénnou
zmesou jednovláknových polypeptidov. V zrne tvoria hlavnú časť bielkovín, pričom ich
obsah je rozličný a závisí od vonkajších podmienok, kultivaru a podmienok extrakcie
(Bajči et al., 1994).
Gliadíny majú značný vplyv na kvalitu múky. Počas formovania cesta netvoria
veľké kovalentne viazané siete, ale majú vplyv na plasticitu cesta, teda na extenzibilitu,
ktorá je dôležitou reologickou charakteristikou cesta (Zálešáková et al., 2004).
Pšeničné gliadíny (Gli) sú veľmi polymorfnou skupinou zásobných bielkovín
semien zložených zo sérií komplexných genetických lokusov nájdených na niekoľkých
ramenách chromozómov. Predstavujú gliadínové bielkoviny lepku, ktoré sa nachádzajú v
extrakte múky ako monomérne polypeptidy. V praxi boli gliadíny rozdelené podľa
pohyblivosti ku katóde v polyakrylamidovom géli pri nízkom pH (pH=3) do skupín
označených ako α-, β-, γ- a ω- gliadíny.
Existuje rozdelenie, podľa ktorého sa polypeptidy gliadínov vyskytujú v skupinách
(blokoch) podľa génov, ktoré ich kódujú. Hlavné bloky gliadínov sú umiestnené na
krátkych ramenách prvej a šiestej skupiny chromozómov (označené ako Gli-1 a Gli-2
lokusy) pre všetky tri genómy (A, B a D). Poloha génu zabezpečuje polypeptidmi
gliadínov a glutenínov a tiež komplementaritu, z ktorej vychádzajú názvy jednotlivých
gliadínových polypeptidov zodpovedajúcich ich špecifickým alelám na daných lokusoch
(napríklad Gli-A1a, Gli-A1b,...) (Branlard et al., 2003).
Alely kódujúce gliadíny sú početné a ich frekvencia sa líši podľa oblastí. Pšeničné
odrody pochádzajúce z rôznych krajín sú ľahko rozlíšiteľné elektroforetickou analýzou na
základe gliadínových bielkovín, zatiaľ čo odrody pochádzajúce z rovnakej krajiny často
disponujú podobnými znakmi (Jomová et al., 2008).
Gliadíny sa vyznačujú vysokou dedivosťou a špecifickosťou. Elektroforetické
profily gliadínov sa vplyvom podmienok pestovania nemenia, preto je možné na ich
základe presne identifikovať a diferencovať jednotlivé odrody a línie pšenice (Černý a
Šašek, 1995, 1996).
1.6 Zvyšovanie technologickej kvality pšenice
V poslednom období sa mení prístup a pohľad poľnohospodárov k šľachteniu
poľnohospodárskych plodín. Kým v minulosti boli pri šľachtení hlavnými požiadavkami
hektárová výťažnosť, odolnosť proti chorobám spôsobených fytopatogénmi v súčasnosti
popri nich stále viac vstupujú do pozornosti aj kvalitatívne parametre ako je obsah
vlákniny vo forme β-glukánov , minerálov, vitamínov, proteínov, ale aj sekundárnych
metabolitov s biologickými účinkami. Vďaka obsahu týchto cenných zložiek sú
poľnohospodárske plodiny základom pre výrobu tzv. funkčných potravín a nutraceutík
(Pšenáková et al., 2006). Nutričnú hodnotu produktov je možné zlepšiť šľachtením, ale v
mnohých prípadoch si to vyžaduje náročnú dlhoročnú prácu (Brindza, 2007).
Šľachtitelia sú v dôsledku požiadaviek trhu nútení zvyšovať okrem úrody zrna aj
mlynársku a pekársku kvalitu. Za účelom zlepšenia pestovateľských vlastností pšenice a
zvýšenia kvality pšeničného zrna sa využívajú metódy molekulovej biológie, genetiky a
biotechnológií (Bežo et al., 2005). V súlade s tradičnými šľachtiteľskými postupmi,
biotechnológia prispieva k vyvíjaniu nových účinnejších metód pre genetické manipulácie
a kontrolu tvorby nových odrôd.
Kvalitatívne vlastnosti odrôd pšenice sú komplexné a nemôžu byť hodnotené
jediným laboratórnym postupom. Je na to potrebná séria testovacích metód, ktoré hodnotia
mnoho testovaných komponentov kvality všetkých odrôd pšenice.
Obilniny vzhľadom na funkčné zložky (vlákninový komplex, minerálne látky,
esenciálne tuky, bielkoviny) nachádzajúce sa v prirodzenej alebo koncentrovanej forme
predovšetkým v obalových častiach zrna a v zárodku, môžu zohrávať významnú úlohu pri
vytváraní základu úspechu výroby obohatených ale aj funkčných potravín (Pšenáková et
al., 2006).
1.6.1 Flavonoidy ako bioaktívne zlúčeniny
Poľnohospodárske plodiny a výrobky z nich majú pozitívne fyziologické účinky.
Okrem vysokého množstva vlákniny obsahujú látky s antioxidačnými účinkami, vrátane
fenolových zlúčenín (Pšenáková et al., 2006). Bolo zistené, že netradične sfarbené
genotypy pšenice letnej vykazujú zvýšenú prítomnosť biologicky aktívnych látok
patriacich do skupiny fenolických zlúčenín. Fenolické látky obsiahnuté v rastline
ovplyvňujú jej vzhľad, chuť, vôňu, vyznačujú sa antioxidačnými vlastnosťami a slúžia ako
prevencia voči civilizačným ochoreniam.
Antokyány sú zložky flavonoidov rozpustné vo vode, ktoré dávajú zrnu
charakteristické modré, červené alebo purpurové zafarbenie. Lokalizované sú hlavne
v perikarpe (červené a purpurové genotypy), alebo v aleuronovej vrstve (modré genotypy)
zrna. Obsah antokyánov v modro sfarbených genotypoch kolíše v rozsahu 106-153 μg.g-1,
kým v červených a purpurových genotypoch od 13 do 139 μg.g-1 (Chňapek et al., 2010).
Antokyány tvoria najväčšiu skupinu vo vode rozpustných rastlinných pigmentov. Z
chemického hľadiska sa zaraďujú medzi pyránové farbivá. Môžu byť uložené v bunkovej
šťave buniek voľne ako antokyanidíny alebo sú viazané glykozidicky so sacharidom vo
forme antokyanínov (Matuškovič, 1998).
Antokyány sú v prírode veľmi rozšírené pigmenty s modrou, fialovou alebo
červenou farbou, ktoré sú zodpovedné za charakteristickú farbu kvetov, ovocia, prípadne
listov danej rastliny (Šimko et al., 2007). Podľa chemickej štruktúry sa flavonoidy triedia
do podskupín, ktorými sú antokyanidíny, flavonoly, flavóny, flavonoly, flavanóny,
chalkóny, dihydrochalkóny, dihydroflavonoly, auróny a izoflavonoidy (Pšenáková et al.,
2006).
Stabilitu antokyánov ovplyvňuje chemická štruktúra, pH prostredia, teplota,
prítomnosť kyslíka, kyselina askorbová, sacharidy, kovy a enzýmy. Antokyány výrazne
menia farbu so zmenou pH, čo súvisí s ich štrukturálnou transformáciou. Všeobecne
môžeme povedať, že sa antokyaníny v kyslom prostredí sfarbujú do červena, v neutrálnom
prostredí do modra a v alkalickom do fialova (Paulovicsová et al., 2007).
Dlhodobé výskumy potvrdzujú pozitívny účinok antokyanínových pigmentov na
živé organizmy. Antokyány sa vyznačujú antioxidačným účinkom a sú schopné
vychytávať hydroxidové, peroxidové a hyperperoxidové radikály a spolu s oxidmi dusíka
aktívne pôsobiaproti deštrukcii látok v organizme (Šimko et al., 2007). Ďalej sú známe
napr. antialergické, protizápalové, antikancerogénne, antidiabetické, kardioprotektívne a
antivírusové účinky rôznych flavonoidov (Pšenáková et al., 2006).
1.6.2 Modrá farba zrna
Qualset et al. hovorí o existencii jarnej pšenice UC66049B s modrým zrnom.
Uvádza, že modrý aleuron je riadený kodominantne pôsobiacim génom Ba (blue aleurone).
Do pšenice sa gén Ba dostal prenesením celého ramena chromozómu z Elytrigia pontica.
Pri vzorke TRI 2401 (Triticum aestivum var. tschermakianum Mansf.) pochádzajúcej
z génovej banky v IPK Gatersleben v Nemecku, sa uvádza iný spôsob získania modrého
zrna. Modré zrno bolo získané disubmickou substitúciou chromozómu 4A iným
chromozómom neznámeho pôvodu. Podľa odchylok v spôsobe dedičnosti modrého zrna sa
uvažuje, že môže ísť o odlišný gén od génu Ba z Elytrigia pontica.
Pri pšenici s modrým zrnom obsahoval šrot 251 mg.kg-1 antokyánov a otruby 104 mg.kg-1
antokyánov (Martinek et al., 2006).
1.6.3 Purpurová farba zrna
Purpurová farba zrna bola prenesená z purpurových tatraploidných a hexaploidných
pšeníc, pochádzajúcich z Etiópie. Purpurové zrno obsahuje antokyány v povrchových
vrstách zrna (perikarp), najviac je zastúpený kyanidin-3-glycosid. V purpurových
pšeniciach sa uvádza priemerný obsah antokyánov v štore 157 mg.kg-1 a v otrubách 458
mg.kg-1.
Pre purpurovú farbu zrna, pochádzajúcu z austrálskej odrody Purple Feed
a kanadsej Purple, boli vytvorené takmer dve izogénne línie. Purpurová farba zrna je
podmienená génom Pb (purple pericarp). Pomocou monosomickej analýzy boli gény
z Purple Feed lokalizované na 7B(Pp1) a na 6A (Pp2).
1.6.4 Červená farba zrna
Červená farba zrna sa vyskytuje u väčšiny bežných odrôd. Červený perikarp je
podmienený dominantnými alelami lokusu R. Predpokladá sa, že R gény môžu byť
transkripčnými faktormi pre syntézu flavonoidov.
Fenolické látky obmedzujú výskyt voľných radikálov, inhibujú lipoxydgenázu
a fungujú ako nešpecifické inhibítory (Martinek et al., 2006).
1.6.5 Biela farba zrna
Biela farba zrna je riadena zostavou recesívnych alel r1, r2, r3. Pšenica s bielym
zrnom má nižší obsah fenolických žložiek, ktoré sú horké. Neobsahuje polyfenol oxidázu,
ktorá sa u červenorznej pšenice nachádza v povrchových vrstvách. Neprítomnosť horkých
látok spôsobuje, že je produkt prirodzene sladší (význam v cukrárstve) (Martinek et al.,
2006).
1.7 Metódy identifikácie genotypov pšenice
1.7.1 Molekulárne markery u pšenice
Pri rozlišovaní genotypov obilnín sú najčastejšie používanými markermi zásobné
bielkoviny. Pšenica je ideálnym príkladom pre využitie zásobných bielkovín, ako vysoko
polymorfných markerov. Bielkovinové frakcie rozpustné v alkohole a slabej kyseline, teda
gliadíny, resp. gluteníny endospermu pšeničného zrna, sú dostatočne polymorfné pre
rozlíšenie, počtom rozsiahlych súborov genotypov pšenice (Kraic, 2004).
Pšeničný genóm je zložený z troch samostatných genómov A, B a D, pričom každý
z nich obsahuje sedem párov chromozómov, je rôzneho pôvodu a prispieva k celkovej
variabilite bielkovín (Kraic, 2004).
Pre pšenicu letnú (Triticum aestivum L.) sa využívajú predovšetkým
vysokomolekulové podjednotky glutenínov (HMW-GS) ako bielkovinové markery
pekárskej kvality pšenice (Kraic, 2004).
Gliadínové bielkoviny spĺňajú základné požiadavky, ktoré sa vyžadujú od markérov
hospodársky dôležitých vlastností. Gliadínové spektrá sa vyznačujú výrazným
polymorfizmom, podmieneným genetickou variabilitou v biosyntéze gliadínu.
Polymorfizmus gliadínov umožňuje markérovať celý rad hospodársky významných znakov
a vlastností pšenice. Biosyntéza gliadínov má vysokú dedivosť. Zloženie gliadínových
spektier a koncentráciu gliadínov v jednotlivých zónach neovplyvňujú podmienky
prostredia (Prugar et al., 1986).
Identifikácia, charakteristika a diferenciácia genotypov pšenice je možná na úrovni
polymorfizmu bielkovín a DNA, pričom je dôležité, aby použitá metóda bola
jednoznačná, s vysokou rozlišovacou schopnosťou (Gregáňová, 2005)
Pšeničné gluteníny a gliadíny sú kódované génmi lokusov (Gálová, 2002) :
lokus Glu – 1: je lokalizovaný na dlhom ramene chromozómov A1, B1, D1 s génmi
kódujúcimi HMW glutenínové podjednotky,
lokus Gli – 1 a Glu – 3: sú lokalizované na krátkom ramene chromozómov A1, B1, D1
s génmi kódujúcimi LMW glutenínové podjednotky, γ-gliadíny a ω- gliadíny,
lokus Gli – 2: je lokalizovaný na krátkom ramene chromozómov A6, B6 a D6 s génmi
kódujúcimi α-gliadíny a β-gliadíny.
Pre prácu s genetickými zdrojmi rastlín sa využíva niekoľko typov molekulárnych
markerov. Bielkovinovými markermi sú frakcie zásobných bielkovín zrelého semena
(prolamíny a glutelíny) a izoenzýmy (endopeptidázy) (Vivodík et al., 2007).
1.8 Identifikácia genotypov cereálií elektroforetickými metódami
Identifikácia jednotlivých genotypov je nevyhnutná hlavne v období sejby a zberu.
Producenti potrebujú mať istotu, že rastliny, ktoré pestujú majú požadovaný genotyp a tiež,
spracovatelia musia byť presvedčení o tom, že zberané zrno dosahuje deklarované
kvalitatívne parametre (Wrigley et al. 1992).
Elektroforéza je analytická metóda chromatografie, je citlivá a umožňuje separáciu
elektricky nabitých molekúl v roztoku vplyvom pôsobenia elektrického poľa. Ako prvý ju
použil švédsky biochemik a fyzikálny chemik Arne Wilhelm Kauris Tiselius v 30-tych
rokoch 20-teho storočia, aby rozdelil proteíny ľudského séra na albumín, α-globulín, β-
globulín a γ-globulín. Za výskum v oblasti elektroforézy a za objasnenie vlastností
ľudských bielkovín dostal Nobelovu cenu v roku 1948 (Vrbová, 2006).
Elektroforetické metódy sú fyzikálno – chemické metódy, ktoré sa využívajú sa
separáciu látok nesúcich elektrické náboje. Ak sa zmes takýchto látok vystaví v určitom
prostredí pôsobeniu elektrického poľa, začnú sa molekuly látok (častice) pohybovať. Ich
pohyblivosť závisí od veľkosti náboja, veľkosti a tvaru molekúl, podmienok prostredia a
sily elektrického poľa. Veľkosť náboja molekuly alebo častice ovplyvňuje stupeň
ionizácie, pH a iónová sila prostredia (Bauerová et al., 2005).
Elektroforéza prebieha v prostredí voľného elektrolytu, alebo v pórovitých
nosičoch, ktoré sú nasýtené elektrolytom. Ako nosiče sa používajú škrob, dextran, agaróza
a polyakrylamidové gély. Koncentrácia akrylamidu býva v rozsahu od 3 do 30 %, čo
umožňuje separovať látky od 102 do 106 g/mol, čo odpovedá peptidom s veľkosťou rádovo
od jednej aminokyseliny do 102 prípadne až 103 aminokyselinových zvyškov.
V súčasnosti sa pri elektroforetickej separácii najviac používajú agarózové
(obrázok 4) a polyakrylamidové gély (Sedlák et al., 2007).
Obrázok 4. Jednoduchá agarózová elektroforéza (Oc – open circular, L – linear, Sc –
supercoiled DNA) (Sedlák et al., 2007).
Úsilie dosiahnuť čo najlepšie separácie viedla k vypracovaniu veľkého množstva
rôznych techník a ich modifikácií, ktoré sa môžu zhrnúť do štyroch základných skupín:
1. voľná elektroforéza – s pohyblivým rozhraním
2. elektroforéza na nosičoch – zonálna
3. rovnovážna elektroforéza reprezentovaná izoelektrickou fokusáciou
4. kapilárna elektroforéza (Vrbová, 2006).
1.8.1 Elektroforéza bielkovín v polyakrylamidových géloch
Elektroforéza v polyakrylamidovom géli (PAGE) patrí v súčasnosti k najviac
využívaným elektroforetickým technikám. PAGE sa veľmi často využíva predovšetkým
k analýze bielkovín, a to na zistenie homogenity preparátu v rôznych stupňoch izolačného
postupu a k čiastočne fyzikálo-chemickej charakterizácií bielkoviny (Brenkus, 2006).
Polyakrylamidový gél bol pri elektroforéze prvý krát použitý v roku 1959
Raimondom a Weintraubom (Sedlák et al., 2007).
Polyakrylamid vykazuje mnoho výhod oproti škrobovému gélu, ktorý sa používa
čoraz menej ako médium pre vysokorozlišovaciu elektroforézu. Kvôli jeho syntetickej
povahe a veľkosti pórov môže byť ľahšie kontrolovaný (Holme et al., 1998).
Polyakrylamidový gél má veľmi dobré mechanické vlastnosti, je priesvitný, pri
príprave sa dá zabezpečiť požadovaná veľkosť pórov a zo všetkých nosičov má najväčšiu
rozlišovaciu kapacitu (Bauerová et al., 2005).
Polyakrylamidový gél vzniká polymerizáciou základného monoméru akrylamidu
(a) a sieťovacieho monoméru N, N´- metylén-bis-akrylamidu (BIS)(b):
a) CH2= CH-CO-NH2
b) CH2= CH-CO-NH- CH2 – NH-CO- CH2 (Bauerová et al., 2005).
Zmes akrylamidu a bisakrylamidu polymerizuje pri izbovej teplote v pufre (0,5 x
TBE) pomocou voľných radikálov poskytovaných persulfátom amónnym (APS).
K urýchleniu polymerizácie sa používa voľná zásada TEMED (tetrametyléndiamin), ktorý
katalyzuje tvorbu voľných radikálov persulfátu amónneho. Iným používaným iniciátorom
polymerizácie je riboflavín, ktorý je účinný už pri veľmi nízkych koncentráciách 5-10 ng/l
(Knoll et al., 2002).
Polyakrylamidový gél sa pripravuje vo forme platní na sklách s rôznymi
veľkosťami alebo vo forme stĺpikov (valčekov) v sklených rúrkach.
Podľa štruktúry a zloženia gélu, vlastností tlmivých roztokov a podmienok delenia
sa rozlišujú viaceré typy PAGE (Lookhart, 1991) :
1.) Konvenčná PAGE
2.) PAGE, pri ktorej sa látky delia len podľa veľkosti svojich molekúl :
2.1.) Elektroforéza v gradientovom géli
2.2.) PAGE v prostredí dodecylsíranu sodného
3.) Disková elektroforéza
4.) Izoelektrická fokusácia
5.) Izotachoforéza
1.8.2 SDS – PAGE
Na separáciu proteínov podľa veľkosti molekúl sa využíva PAGE v prostredí
dodecylsíranu sodného (SDS). SDS je anionaktívny detergent, ktorý sa viaže na peptidové
väzby a zásadité skupiny proteínov, v dôsledku čoho všetky proteíny získajú skoro
rovnako veľký záporný náboj (počas elektroforézy sa pohybujú k anóde) a pri
elektroforéze sa potom delia len podľa veľkosti svojich molekúl – menšie molekuly sa
pohybujú rýchlejšie, veľké molekuly pomalšie (Bauerová et al., 2005).
Tento typ elektroforézy sa dá použiť aj na separáciu subjednotiek alebo
jednotlivých reťazcov z komplexnej molekuly proteínov, lebo zabraňuje ich opätovnej
asociácii. Polyakrylamidová elektroforéza v prostredí SDS sa používa najmä pri rýchlom a
jednoduchom určení relatívnych molekulových hmotností proteínov. Táto metóda je
vhodná hlavne pri identifikácii glutenínov pšenice (Cooke, 1995, Černý et al. 1996).
SDS elektroforéza má veľa praktických výhod:
SDS rozpúšťa takmer všetky bielkoviny
Proteíny oddeľované s SDS lepšie viažu farbivá
Proteínové komplexy majú vysokú elektrofotretickú mobilitu
Všetky frakcie putujú v jednom smere
Poskytuje vysoké rozlíšenie
Zóny sa ľahko fixujú
Separácia je založená iba na molekulovej hmotnosti
Pri elektroforéze proteínov pomocou SDS – PAGE sa pripravuje gél pozostávajúci
z dvoch koncentračne odlišných častí – koncentrovanejší deliaci gél ( v spodnej časti
platne) a menej koncentrovaný štartovací gél. Farbenie gélu sa uskutočňuje špecifickými
farbivami, napr. Coomassie Brilliant R-250 alebo farbením pomocou dusičnanu
strieborného (farbenie striebrom) (Bauerová et al., 2005).
Zásobné bielkoviny sa extrahujú zo zrna obilnín a elektroforeticky separujú,
najčastejšie pomocou SDS-PAGE, A-PAGE, následne sa ich profily geneticky interpretujú
(Kraic et al, 1995).
2 CIEĽ PRÁCE
Cieľom diplomovej práce bolo analyzovať 4 konvenčné genotypy pšenice letnej a 5
farebných genotypov pšenice letnej f. ozimnej (Triticum aestivum L.).
V súvislosti s tým bolo potrebné:
1. Identifikovať, diferencovať a charakterizovať genotypy pšenice letnej f. ozimnej na
základe bielkovinových markerov.
2. Pomocou vysokomolekulárnych glutenínových podjednotiek (HMW-GS) identifikovať
a diferencovať jednotlivé analyzované druhy pšeníc.
3. Vypočítaním Glu-skóre pšeníc charakterizovať technologickú kvalitu zrna.
4. Zostrojením dendrogramov príbuznosti detegovať genetickú podobnosť resp.
rozdielnosť analyzovaných genotypov.
3 Materiál a metodika
3.1 Biologický materiálV práci bolo analyzovaných 5 farebných genotypov a 4 konvenčné odrody pšenice
letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.), ktoré boli získané z Génovej banky
semenných druhov SR CVRV VÚRV v Piešťanoch (Tabuľka 4) (Obrázok 5).
Pri analýzach zásobných bielkovín boli použité chemikálie dodávané firmami:
Sigma, Serva, Fluka, Pharmacia-KLB, LCHM-Labochem, Gibco BRL.
Tabuľka 4: Analyzované genotypy pšenice letnej (Triticum aestivum L.)
Názov Krajina pôvodu Farba zrna
Konvenčné genotypy pšenice letnej
Samanta SVK žltá
Lívia SVK žltá
Astela SVK žltá
Torysa SVK žltá
Farebné genotypy pšenice letnej
Modré zrno ČR modrá
UC 66094 USA modrá
Barevná 25 - modrá ČR modrá
UC 66049 - modré TC USA modrá
Barevná 9 ČR modrá
Obrázok 5. Genotypy pšenice letnej – A) konvenčné zrno, B) modré zrno
3.2 Biochemické rozbory
3.2.1 Extrakcia a elektroforetické delenie glutenínov zrna pšenice
Zásobné bielkoviny boli izolované z endospermu celých, suchých, zrelých zŕn. Z
každej odrody sa analyzovalo 20 zŕn. Zrno sa odvážilo, zhomogenizovalo mechanicky –
rozmliaždením, vložilo do Eppendorfovej skúmavky a bielkoviny boli extrahované
v extrakčnom roztoku.
Extrakcia glutenínov
Extrakcia glutenínov sa realizovala podľa štandardnej referenčnej metódy ISTA
(Wrigley, 1992). Zloženie zásobného roztoku pre extrakciu glutenínov:
0,125 mol.dm-3 Tris-HCl pH 6,8
20 ml glycerolu
4,1 ml destilovanej vody
4 g SDS
20 mg Pyronínu G
Pred extrakciou bol pripravený vždy čerstvý extrakčný roztok nasledovne:
zásobný roztok pre extrakciu
2-merkaptoetanol
redestilovaná voda (v pomere 17:3:40)
Na 1 mg rozdrveného zrna sa pridalo 8 µl takto pripraveného extrakčného roztoku.
Extrakcia bielkovín prebiehala 1 hodinu pri 25 oC za stáleho trepania v trepačke. Pred
nanesením do gélu bola vzorka zdenaturovaná vo vodnom kúpeli pri teplote 100 oC počas
10 minút. Po inkubácii sa vzorky vybrali z vodného kúpeľa, vychladili a odstredili v
odstredivke pri 12000 otáčkach za minútu po dobu 10 minút.
Elektroforetické delenie glutenínov v SDS-PAGE
Elektroforetická separácia gluténových bielkovín bola uskutočnená v systéme
diskontinuálnej SDS-PAGE podľa štandardnej metodiky ISTA (Wrigley, 1992) v
elektroforetickej separačnej jednotke Protean II (Bio-Rad). Vyextrahované bielkoviny boli
nanesené do gélu v množstve 5 µl na jednu aplikačnú dráhu gélu. Elektroforetické delenie
prebiehalo pri veľkosti prúdu 30 mA, 6-10 hodín, pri konštantnej teplote 10 oC, až pokiaľ
marker nedosiahol spodný okraj gélu. Prvých 15 minút delenie prebiehalo pri veľkosti
prúdu 5 mA, ďalších 25 minút pri 10 mA a zvyšný čas pri veľkosti prúdu 30 mA.
Zloženie deliaceho gélu:
0,381 mol.dm-3 Tris-HCl, pH 8,8
17,48ml bis-akrylamidu (AA-bis), (12,7g akrylamid + 0,168g N,N´-
Metylénbisakrylamid v objeme 58,27ml)
0,3ml 10% SDS
0,76ml 1% APS
60µl TEMED
Zloženie štartovacieho gélu:
0,247 mol.dm-3 Tris-HCl, pH 6,8
8,3ml AA-Bis (1,21g akrylamid + 20,8mg N,N´-Metylénbisakrylamid v
objeme 16,6 ml)
0,1 ml 10% SDS
0,8ml 1% APS
30µl TEMED
Zloženie elektródového roztoku:
3g Tris-HCl
14,1g glycínu
1g SDS, v objeme 1000 ml, pH = 8,3
3.2.2 Extrakcia a elektroforetické delenie gliadínov zrna pšeniceZásobné bielkoviny sme izolovali z endospermu celých, suchých, zrelých zŕn. Z
každej odrody sme analyzovali 20 zŕn. Zrno sme odvážili, zhomogenizovali mechanicky –
rozmliaždením, vložili do Eppendorfovej skúmavky a uskutočnili extrakciu bielkovín.
Extrakcia gliadínov
Extrakciu gliadínov sme realizovali podľa štandardnej referenčnej metódy ISTA v
kyslom prostredí (Draper, 1987). Zloženie extrakčného roztoku:
25% 2-chlóretanol
0,05% Pyronín G
Na 1mg zhomogenizovaného zrna sme pridali 5 µl extrakčného roztoku. Vzorky
sme premiešali a nechali extrahovať cez noc pri laboratórnej teplote. Pred nanesením
vzorky do gélu sme extrakt odstredili v odstredivke pri 12000 otáčkach za minútu počas 10
minút.
Elektroforetické delenie gliadínov v A-PAGE
Štandardná referenčná metóda schválená medzinárodnou organizáciou (ISTA,
Draper 1987) využíva pri elektroforetickom delení gliadínov elektrolyt, ktorý je pripravený
zmiešaním glycínu a kyseliny octovej s hodnotou pH 3,2. Separáciu gliadínov sme
uskutočnili v kontinuálnych polyakrylamidových géloch v kyslom prostredí s pH 3,2
(Draper, 1987).
Zloženie gélového tlmivého roztoku:
2% ľadová kyselina octová
0,1% glycín
pH 3,2
Príprava 100 ml separačného gélu:
60ml gélového tlmivého roztoku
10g akrylamidu
6g močoviny
0,4g N,N´- Metylénbisakrylamidu
0,1g kyseliny askorbovej
0,005g síranu železnatého
doplniť gélovým tlmivým roztokom do 100 ml
pridať 10% APS (0,2-0,3 ml)
0,3 ml TEMED
Zloženie elektródového tlmivého roztoku:
0,4g ľadová kyselina octová
4ml glycín
v objeme 1000 ml destilovanej vody, pH 3,2
Elektroforéza prebiehala pri konštantnom napätí 500 V počas trojnásobku behu markera
Pyronínu G, pri teplote 3oC v elektroforetickej jednotke SE 600 (Hoefer Pharmacia
Biotech).
3.2.3 Farbenie a vizualizácia bielkovín Všetky frakcie zásobných bielkovín separované v SDS-PAGE a A-PAGE sme
zafarbili v roztoku pripravenom zmiešaním 95 ml 10% kyseliny trichlóroctovej a 5 ml
0,5% roztoku Coomassie Brilliant Blue R250 v etanole. Prebytočné farbivo sme z gélu
odstránili premývaním gélu v destilovanej vode 12-24 hodín.
3.2.4 Vyhodnotenie a genetická interpretácia elektroforetických profilov bielkovín Elektorforetické profily sme načítali pomocou čierno-bielej CCD kamery UVP s
filtrom a šošovkami H6x8-II 8-48 mm. Vyhodnocovací systém ďalej pozostáva z UV/VIS
tmavej komory, transiluminátora a termocitlivej tlačiarne. Načítané bielkovinové gély sme
vyhodnotili pomocou dokumentačného a vyhodnocovacieho systému Grab-It a GelWorks
1D pre Windows.
Ako štandardy sme použili odrody pšenice letnej (Triticum aestivum L.) Chinese
Spring a Marquis. Genetickú interpretáciu alelickej zostavy v lokusoch Glu – 1A, Glu – 1B
a Glu – 1D a následný výpočet Glu – hodnotenia sme uskutočnili podľa katalógu alel
Payne et. al. (1987).
3.2.5 Výpočet obsahu bielkovín a koeficienta nutričnej kvalityPercentuálne zastúpenie hrubých bielkovín bolo vypočítané prepočtom z obsahu
dusíka stanoveného podľa Kjeldahla (Michalík et al., 2006), ktorý bol vynásobený
prepočítacím koeficientom (%N x 5,7). Koeficient nutričnej kvality bol vypočítaný zo
zastúpenia bielkovinových frakcií: (Albumíny + Globulíny + Zvyšok/gliadíny)x100
3.2.6 Metóda diskontinuálnej frakcionácie bielkovinového komplexu zrna podľa Osborna
Bielkovinové frakcie (albumíny, globulíny, gliadíny, gluteníny) boli determinované
extrakciou v príslušných rozpúšťadlách podľa unifikovanej Golenkovej metódy - ICC
metóda podľa Michalíka (2002).
3.3 Štatistické vyhodnotenie výsledkov Základné štatistické údaje boli vypočítané v programe Stagraphics 5.1.
4 VÝSLEDKY A DISKUSIA
Pre technologickú kvalitu pšenice majú najväčší význam bielkoviny. Dôležitou
frakciou zásobných bielkovín sú gliadíny, ktoré majú značný vplyv na kvalitu múky
a plasticitu cesta. Druhou významnou frakciou sú gluteníny, ktoré sa podľa veľkosti delia
na na HMW-GS (glutenínové podjednotky s vysokou molekulovou hmotnosťou) a LMW-
GS (glutenínové podjednotky s nízkou molekulovou hmotnosťou).
Zloženie zásobných bielkovín endospermu zrna, ktoré tvoria komplex nazývaný lepok
vyznačujúci sa viskoelastickými vlastnosťami, je genotypovou záležitosťou a determinuje
spracovanie a využitie múky (Novotný a Jureček, 2000). Predikciu chlebopekárskej kvality
je možné uskutočniť na základe hodnotenia biochemickej skladby lepkového komplexu,
analýzou gliadínov a podjednotiek glutenínov s vysokou molekulovou hmotnosťou, s čím
sa stotožňujú viacerí autori (GREGOVÁ et al., 2001; ŠAŠEK, ČERNÝ, 1996).
Na základe viacerých výskumov bolo zistené, že čím je vyššie Glu-skóre, tým je
väčšia pravdepodobnosť, že odroda bude mať chlebopekársku kvalitu. Pravdepodobnosť
výskytu odrôd s lepšou chlebopekárskou kvalitou pri nízkom Glu-skóre je minimálna.
Naopak, pri odrodách s vysokým Glu-skóre môžeme s veľkou pravdepodobnosťou
predpokladať vyššiu chlebopekársku kvalitu, môžu sa však vyskytnúť aj prípady, kde
pekárska akosť nebude zodpovedať vysokej predikčnej hodnote. Za zdroje vysokej
chlebopekárskej kvality sú označované odrody s HMW – Glu komplexnými alelami 1
alebo 2* (lokus Glu-1A), 7+8, 17+18, 13+16 (lokus Glu–1B), 5+10 (lokus Glu-1D)
(Gregová et al., 2001). Od percentuálneho zastúpenia jednotlivých frakcií bielkovín závisí
smer využitia zrna (pšenica na mlynsko – pekárske spracovanie, pšenica kŕmna, pšenica na
špeciálne potravinárske využitie).
V súlade s STN 461100-1 bol stanovený celkový obsah dusíka a bielkovín
(Tabuľka 5). Zvýšený obsah celkového dusíka bol zistený pri odrode Barevná 9, ostatné
odrody spĺňali STN normu. 2 genotypy vykazovali nižší obsah bielkovín, čo mohlo byť
zapríčinené nevhodnými agro-klimatickými podmienkami počas vegetácie.
Tabuľka 5: Stanovenie celkového dusíka a bielkovín
Názov vzorky Celk.N % Obsah bielkovín
(Celk.N*5,7 %)
MODRÉ ZRNO 1,964 11,195
UC 66094 2,076 11,833
BAREVNA 25 1,936 11,035
BAREVNA 9 2,104 11,993
Priemer 2,02 11,514
STN 461100 - 1 2,018 11,500
Tabuľka 6: Obsah a frakčná skladba bielkovín (%)
Názov vzorky Alb+Glob Gliadíny Gluteníny Zvyšok
Konvenčné genotypy pšenice letnej
Samanta 29,01 33,00 28,01 8,98
Lívia 22,24 43,67 27,16 6,42
Astela 25,10 36,67 31,34 6,80
Torysa 24,45 39,93 29,93 5,69
Priemer 25,20 38,32 29.11 6.97
Farebné genotypy pšenice letnej
Modré zrno 25,41 43,13 21,74 8,55
UC 66094 25,67 42,97 22,30 8,38
Barevná 25 -
modrá
23,19 39,15 30,01 7,54
Barevná 9 24,00 41,35 25,33 8,27
Priemer 24,57 41,65 24,85 8,19
Vysvetlivky: Alb+Glob – albumíny a globulíny
Obsah bielkovín v zrne pšenice je dôležitý kvalitatívny ukazovateľ. Z našich
výsledkov vyplýva (Tabuľka 5), že priemerný obsah bielkovín v konvenčných odrodách
bol 11,11%. Najvyšší obsah bielkovín dosiahla odroda Torysa (13,75%) a najnižší odroda
Samanta (7,99%). Pri hodnotení farebných genotypov pšenice letnej, možno konštatovať,
že priemerný obsah bielkovín bol 11,51%, pričom pri jednotlivých kultivaroch varíroval
v rozsahu od 11,04% do 11,99%.
Uvedené výsledky potvrdzujú závery viacerých autorov (Shewry et al., 2002;
Skylas et al., 2005; Michalík et al., 2006; Šramková et al., 2009), ktorí v sledovaných
kolekciách pšenice letnej stanovili obsah celkových bielkovín v rozsahu 10-18%.
Nutričná kvalita zrna pšenice je ovplyvnená hlavne zastúpením albumínov
a globulínov, ktoré sa vyznačujú najvhodnejším aminokyselinovým zložením, nakoľko sa
v nich nachádza najviac esenciálnych aminokyselín (Michalík et al., 2006). Z našich
výsledkov (Tabuľka 6) vyplýva, že najvyššie zastúpenie albumínov a globulínov
v konvenčných odrodách vykázala odroda Samanta (29,1%), najnižšie Lívia (22,24%),
s priemerom ostatných odrôd 25,20%, z čoho vyplýva, že z hľadiska nutričného je
najlepšia odroda Samanta. Obsah nutrične najvýznamnejších bielkovín vo farebných
pšeniciach bol v priemere 24,57%, s najvyšším zastúpením v genotype UC 66094 (25,67
%). Najnižší obsah albumínov a globulínov bol zistený v genotype Barevná 25 - modrá
(23,19%).
Zo zastúpenia jednotlivých bielkovinových frakcií je možné vypočítať koeficient
nutričnej kvality zrna (KNK), ktorý je dôležitým znakom pre posúdenie výživnej kvality
zrna. Hodnota KNK sa v konvenčných vzorkách pohybovala v rozpätí od 65,63 – 115,12%
s priemerom 85,81%, kým vo farebných pšeniciach od 78,04% do 79,24%, s priemernou
hodnotou 78,63%, z čoho vyplýva, že z hľadiska hodnoty koeficienta nutričnej kvality sa
ako lepšie ukázali konvenčné pšenice. Dosiahnuté výsledky potvrdzujú práce viacerých
autorov (Bojňanská, 1995; Gálová et al., 2003; Michalík et al., 2006), ktorí uvádzajú, že
pomer jednotlivých zložiek bielkovinového komplexu zrna a ich množstvo je veľmi
variabilné, mení sa v značných rozmeroch so zmenou obsahu celkových bielkovín,
v závislosti od podmienok pestovania, genetických zvláštností a tiež v procese dozrievania
zrna.
Základnú charakteristiku analyzovaných genotypov pšenice letnej je možné
dokresliť elektroforetickými analýzami na PAGE v prítomnosti SDS, pomocou ktorých sa
gluténové bielkoviny rozdelia na monomérne gliadíny (alfa-, beta-, gama- a omega-
gliadíny) a agregované gluteníny tvorené vysokomolekulárnymi (HMW-GS)
a nízkomolekulárnymi glutenínovými podjednotkami (LMW-GS). HMW-GS vystupujú
ako molekulárne markery, ktoré predikujú technologickú kvalitu pšenice. Poznanie
genetického pozadia jednotlivých genotypov pomáha šľachtiteľom v procese kríženia
získavať potomstvá s požadovanými akostnými parametrami (Bushuk a Bekes, 2002).
V nadväznosti na uvedené, sa realizovala detekcia individuálnych
vysokomolekulárnych glutenínových podjednotiek (HMW-GS), pričom sa sledovala
variabilita elektroforetického spektra HMW-GS vo vzťahu k technologickej kvalite zrna v
analyzovaných konvenčných a farebných genotypoch pšenice.
Z dosiahnutých výsledkov vyplýva (Tabuľka 7, Príloha B a C), že konvenčné
odrody sa vyznačujú rozdielnym zastúpením individuálnych HMW-GS, čo sa odzrkadlilo
aj na hodnote Glu-skóre, z ktorého vyplýva, že najvyššiu technologickú kvalitu vykázala
odroda Astela, potom Samanta, Lívia a najnižšiu hodnotu dosiahla Torysa, v ktorej bola
detegovaná podjednotka 2+12 (11,11 %), ktorá vystupuje ako marker nevhodnej
technologickej kvality zrna pšenice. Z elektroforeogramov farebných genotypov pšenice
letnej formy ozimnej vyplýva, že 3 analyzované kultivary boli homogénne jednolíniové.
V kultivare Barevná 9 bola detegovaná dvojlíniovosť. Táto odroda vykázala Glu-skóre 7
a 9, čo predikuje dobrú pekársku kvalitu.
Tabuľka 7: Zastúpenie glutenínových podjednotiek a Glu-skóre v pšenici letnej.
Názov
HMW-GSGlu-
skóre
Blok
Gld 1B3Ražné
skóreGlu-A1 Glu-B1 Glu-D1
Konvenčné genotypy pšenice letnej
Samanta 0 7+8 5+10 8 NIE -
Lívia 0 7+9 5+10 7 NIE -
Astela 2* 7+9 5+10 9 NIE -
Torysa 0 7+8 2+12 6 NIE -
Farebné genotypy pšenice letnej
Modré zrno 1 20 5+10 8 ÁNO 6
UC 66094 1 7+8 5+10 10 NIE -
Barevná 25 - modrá 0 20 5+10 6 NIE -
UC 66049 - modré TC 1 7+8 5+10 10 NIE -
Barevná 9 1 7+9 5+10 9 NIE -
Barevna 9 1 7+9 2+12 7 NIE -
Z analyzovaných vzoriek sa najčastejšie vyskytovali genotypy s komponentnou
vskladbou HMW-GS 1, 7+9, 5+10 (22,22 %). Kolekcia bola taká polymorfná, že všetky
ostatné elektroforetické profily sa vyskytovali vždy iba v jednom opakovaní. Uvedené je v
súlade s výsledkami zistenými inými autormi, ktorí analyzovali domáci sortiment pšeníc
ako Gregová et al. (1995), Kraic et al. (1999), Gálova et al. (2002, 2003) a ďalšími, ktorí
svojimi analýzami potvrdili jednolíniovosť pšenice letnej formy ozimnej a teda aj
vhodnosť glutenínových bielkovín pri identifikácii, charakteristike a diferenciácii
jednotlivých genotypov. Elektroforetický profil individuálnych genotypov pšenice letnej
formy ozimnej (Príloha C) môžeme považovať za tzv. „fingerprinting“.
Z výsledkov ďalej vyplýva (Tabuľka 7) (Príloha A), že z génov kódovaných
lokusom Glu-Al bola najčastejšie identifikovaná podjednotka 1 v 5 kultivaroch (55,6%).
V 4 kultivaroch sa vyskytovala nulová alela (44%) a podjednotka 2* v jednej línií (Astela)
(11,1%).
Lokus Glu-Bl bol reprezentovaný HMW - gluténovými subjednotkami 7+8 (11,11 %) a
podjednotky 7+9 (11,11 %). Podjednotka 20 bola detegovaná v 2 genotypoch Modré zrno
a Barevná 25 – modrá.
Alely lokalizované na lokuse Glu-Dl, majú najvyšší vplyv na technologickú kvalitu
múky zrna pšenice. Pozitívne sa však prejavia len v kombinácii s vysokokvalitnými
HMW-GS kódovanými lokusmi Glu-Al a Glu-B1 (Kolster et al., 1993). Z dosiahnutých
výsledkov vyplýva, že na pekársku kvalitu múky kladne vplývajúca dvojica podjednotiek
5+10 bola identifikovaná v 8 genotypoch. Uvedené výsledky sú v súlade s inými autormi,
ktorí variabilitu HMW-GS kódovaných jednotlivými lokusmi pripisujú predovšetkým
agroklimatickým podmienkam pestovania v danom geografickom území (Branlard et al.,
2003, Demir et al., 2004).
Zo zastúpenia jednotlivých HMW glutenínových podjednotiek možno predigovať
technologickú kvalitu zrna pšenice vypočítaním Glu-hodnotenia (Payne et al. 1987),
ktorého najvyššia hodnota môže byť 10. V tomto smere najvyššie bodové Glu-hodnotenie
(10) dosiahli genotypy UC 66049 a UC 66094, kým najnižšiu hodnotu (6) dosiahli
genotypy Torysa a Barevná 25 - modrá (Tabuľka 7). Uvedené je v zhode s rozsiahlymi
prácami venovanými vplyvu bielkovín na technologickú kvalitu realizované
Veraverbekom et al. (2002) a Laszititym (2003) a ďalšími.
Ďalšou dobre preštudovanou frakciou zásobných bielkovín pšenice sú gliadíny,
ktoré zároveň spĺňajú kritéria vhodných genetických markerov. Gliadíny sú významnou
súčasťou lepkového komplexu, a pôsobia preto výrazne na akosť múky. Niektoré
gliadínové bloky zvyšujú akosť muky, iné ju naopak znižujú alebo pôsobia neutrálne. Je
známy inhibičný účinok sekalínového bloku Gld 1B3 translokovaného z ražného
chromozómu 1R do genómu pšenice na 1B chromozóm, ktorý slúži ako marker akosti,
avšak súčasne aj ako marker odolnosti k hrdzi trávovej. Z jeho prítomnosti vyplýva, že
génom pšenice je obohatený o sekalínové gény, ktoré majú za následok výrazné
zhoršovanie kvality pšeničného lepku a gény odolnosti voči hrdzi trávovej Sr31 (Gálová et
al., 2003).
V našej práci sme sa zamerali na detekciu sekalínového bloku analýzou gliadínovej
frakcie zásobných bielkovín pomocou A-PAGE v zrne pšenice letnej formy ozimnej, ktorá
je dominantným druhom pšenice, ktorý aj svojimi technologickými parametrami najlepšie
spĺňa podmienky pre využitie v potravinárskom priemysle.
Z analyzovaných materiálov (Tabuľka 7) ( Príloha D) vyplýva, že sekalínový blok
Gld 1B3 bol detegovaný v gliadínovom spektre 1 hodnoteného genotypu pšenice letnej
(Modré zrno), čo má za následok zníženie Glu-hodnotenia o dva body. Z uvedeného tiež
vyplýva, že daný genotyp sa síce vyznačuje nízkou technologickou kvalitou avšak dobrou
odolnosťou voči hrdzi trávovej.
5 ZÁVER
Obilniny predstavujú základnú a nepostrádateľnú zložku ľudskej výživy a výživy
hospodárskych zvierat. Vhodne spracované obilniny sú v celosvetovom meradle
najvýznamnejším donorom energie formou sacharidov. Okrem toho sú bohatým zdrojom
cukrov a plnohodnotných bielkovín, vitamínov, minerálnych látok, vlákniny.
V podmienkach trhovej ekonomiky sa okrem ekonomickej efektívnosti výroby
obilnín pre ľudskú výživu zvyšujú aj požiadavky na rast technologickej, nutričnej a
hygienickej kvality produkcie. Za účelom dosiahnutia požadovanej kvality širokého
sortimentu cereálnych potravín je potrebné pestovať obilniny podľa predpokladaných
úžitkových smerov. Jednou z dôležitých informácií pri šľachtení pšenice na kvalitu je
obsah a kvalita zásobných bielkovín pšeničného zrna, medzi ktoré patria gliadíny a
gluteníny. Zásobné bielkoviny pšenice (gliadíny, gluteníny) sú hlavnou zložkou lepku,
ktorý významne ovplyvňuje chlebopekárske vlastnosti pšeničnej múky.
Na základe našich výsledkov môžme skonštatovať, že využitie farebných genotypov
pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum, L.) je aj napriek nižšiemu obsahu
hrubých bielkovín veľmi perspektívne v procese kríženia. Technologická kvalita
hodnotených genotypov pšenice letnej na základe elektroforetických analýz HMW-GS
a Glu-skóre vykázala dobrú až veľmi dobrú kvalitu, pričom boli detekované HMW-GS,
ktoré sa bežne nevyskytujú v sortimente slovenských pšeníc (20, 7, 14+15), a ktoré môžu
slúžiť ako donory pri šľachtení na vyššiu technologickú kvalitu zrna.
Farebné pšenice letnej sú významné aj z hľadiska zvýšeného obsahu fenolických
látok, hlavne antokyánov, ktoré sa v modrých pšeniciach vyskytujú v aleurónovej vrstve.
Antokyány sú bioaktívne látky, ktoré pozitívne vplývajú pri prevencii kardiovaskulárnych
a karcinogénnych ochorení. V súčasnosti sa do popredia dostávajú funkčné potraviny, kde
majú farebné pšenice svoj opodstatnený význam. Vzhľadom k tomu, že úloha antokyánov
je zo zdravotného hľadiska prospešná, netradične sfarbené pšenice môžu byť zdrojom
nových látok. Strava bohatá na antioxidanty typu antokyány, flavonoidy a karotenoidy
pôsobia preventívne na výskyt aterosklerózy, ischemické choroby srdca, zlepšujú funkcie
zraku a pozitívne ovplyvňujú ochranné procesy v organizme. Vďaka pokroku v oblasti
metabolického a génového inžinierstva predstavujú v súčasnosti biotechnologické metódy
veľmi perspektívnu možnosť produkcie funkčných potravín.
6 Zoznam použitej literatúry
BAJČI, P. – BOJŇANSKÁ, T. – FRANČÁKOVÁ, H. 1994. Hodnotenie surovín
rastlinného pôvodu. Nitra: VŠP – VES, 224 s. ISBN 80-8069-483-4
BAUEROVÁ, M. – OMELKA, R. – BAUER, M. 2005 Návody na laboratórne cvičenia
z molekulárnej biológie. Nitra : FPV UKF, 2005. 54-56 s. ISBN 80-8050-898-4
BEŽO, M. et al. 2005. Biotechnologické metódy v šľachtení rastlín. In BIOS 2005
[Zborník]. Nitra, 2005. ISBN 80-8069-586-5
BRANLARD, G. - DARDEVET, M. - AMIOUR, N. - IGREJAS, G. 2003. Allelic
diversity of HMW and LMW glutenin subunits and omega-gliadins in French bread wheat
(Triticum aestivum L.). In Genet. Resour. And Crop Evolution 50, 2003, s. 669-679
BRENKUS, M. 2006. Analýza proteínového profilu buniek MDCK a HeLa za rozdielnych
fyziologických podmienok pomocou elektroforetických metód: diplomová práca. Bratislava:
UK, 2006. 83 s.
BRINDZA, J. 2007. Základy šľachtenia rastlín. 4 vyd. Nitra: SPU, 2007. ISBN 978-80-
8069-918-5
ČERNÝ, J. – ŠAŠEK, A. 1995. Common wheat marking by determination of approximate
depence frequency of allelic gliadin quality grade agronomic charackter. In Scientia
Agriculture Bohemoslovaca, vol. 26, 1995, no.4.p.245-258
ČERNÝ, J. - ŠAŠEK, A. 1996. Bílkovinné signální gény pšenice obecné, UZPI Praha,
1996
EVERS, A.D. – BLANKEY, A.B. – BRIEN, L. O. 1999. Cereal structure and composition.
In Australian Journal of Agricultural Research. vol.50, 1999, no.5, p 629-650
FRANČÁKOVÁ, H. et al. 2002. Hodnotenie poľnohospodárskych produktov. 1. vyd.
Nitra: SPU, 2002. ISBN 80-7137-980-8
FRANČÁKOVÁ, H.– MUCHOVÁ, Z. – HORČIN, V. 1995. Požiadavky na kvalitu
rastlinných produktov pri nákupe. Nitra 1995. ISBN 80-85330-24-5
GAJDOŠOVÁ, A. – ŠTURDÍK, E. 2004. Biologické, chemické a nutrično-zdravotné
charakterisktiky pekárskych cereálií. In Nova Biotechnologica, 2004, 136-138 s.
GÁLOVÁ, Z. 2002. Genetické markéry technologickej kvality zrna pšenice a jačmeňa. In
Mapovanie genómu zrna pšenice pre účely determinácie genetickej diverzity obilnín,
VEGA projekt. Č 1/7648/20: Záverečná správa, 2002. s. 1-3
GÁLOVÁ, Z. – STAROVIČOVÁ, M. – KNOBLOCHOVÁ, H. 2003. Identification of
glutenin markers in cultivars of three wheat species. In Czech journal of genetics and plant
breeding, 39, 2003, p. 51-57
GREGÁŇOVÁ, Ž. 2005. Molekulárne markery v identifikovaní a charakteristike pšenice
letnej: dizertačná práca. Nitra: SPU, 2005, 2-4 s.
GREGOVÁ, E. - HERMUTH, J. - KRAIC, J. - DOTLAČIL, L. 2006. Protein geterogenity
in European wheat landraces and obsolete cultivars: Additional information II. In Genetic
Resources of Crop Evolution, 53, 2006, p. 876-871
HANKOVÁ, A. – GREGOVÁ, E. 2006. Kvalitatívne ukazovatele ako selekčné kritérium
pri tvorbe genetických zdrojov pšenice. In Nové poznatky z genetiky a šľachtenia
poľnohospodárskych rastlín [Zborník]. Piešťany, 2006, s. 89, 90. ISBN 80-88872-57-X
HOLEČKOVÁ, J. - MICHALÍK, I. 1993. Elektrofoterická analýza gluténových bielkovín
zrna pšenice. In Agriculture 39, č. 11, 1993, s. 866-876
HOLME, D. - PECK, H. 1998. Analytical biochemistry. 3 vyd. London : Longman, 1998,
481 s. ISBN 0-582-29438-X.
HRABE, J. – ROP, O. – HOZA, I. 2006. Technológie výroby potravin rostlinného puvodu.
Praha: UTB, 1.vyd., 2006, 178s. ISBN 80-7318-372-2
CHŇAPEK, M. – GÁLOVÁ, Z. – TOMKA, M. 2010. Nutričná a technologická kvalita
farebných genotypov pšenice letnej formy ozimnej (Triticum aestivum L.). In
Potravinárstvo. roč. 4, 2010, č. 1, s. 20
JOMOVÁ, K. – MEDVECKÁ, E. 2008. Zásobné bielkoviny ako markery technologickej
kvality zrna pšenice. In Chemické listy. roč. 102 , 2008, 758 s.
KARABINOVÁ, M. – KULÍK, D. – PROCHÁDZKOVÁ, M.1999. Obilniny I. Nitra 1999,
ISBN 80-85330-63-6 str. 5, 101, 104
KOLSTER P. - VEREIJKEN, J. M. 1993. Evaluating HMW glutenin subunits to improve
bread-making quality of wheat. Cereal Food World, 2, 1993, p. 76-83
KRAIC, J. Genetické markéry rastlín, 2004, SPU v Nitre, ISBN 80-8069-381-1 str. 40
KULÍK, D. et al. 2004. Technológia rastlinnej výroby. 1 vyd. Nitra : SPU, 2004. 41-43 s.
ISBN 80-8069-089-8
LOOKHART, G. T. – HAGMAN, K. – KASARDA, D. D. 1993. High-molecular-weight
glutenin subunits of the most commonly grown wheat cultivars in the U. S. Plant Breeding,
12, 1993, p. 48 – 62
MARTINEK, P. et al. 2006. Netradiční barva obilek pšenice (Triticum aestivum L.), její
genetická podmínenosť a možnost využití v potravinárstvi. In Nové poznatky z genetiky
a šľachtenia poľnohospodárskych rastlín [Zborník]. Piešťany, 2006, s. 95-98. ISBN 80-
88872-57-X
MARTINEK, P. et al. 2006. Identifikace zdroju tritikale se sníženou aktivitou
amylasových enzymu a vhodnejším složením bílkovín pro zlepšení pekarské kvality. In
Nové poznatky z genetiky a šľachtenia poľnohospodárskych rastlín [Zborník]. Piešťany,
2006, s. 95-98. ISBN 80-88872-57-X
MATÚŠKOVÁ, K. – HANKOVÁ, A. – RUCKSCHLOSS, Ľ. 2009. Pokrok v šľachtení
pšenice letnej f. ozimnej na výšku úrod na VŠS Vígľaš – Pstruša. In Acta fytotechnica et
zootechnica. Nitra, 2009, s. 424
MEDVECKÁ, E. et al. 2009. Molekulárna charakteristika pšenice tvrdej pomocou MHW
glutenínových podjednotiek. In Acta fytotechnica et zootechnical. Nitra, 2009, s. 429, 430
MICHALÍK, I. 2005. Nové poznatky v oblasti štúdia molekulárnych mechanizmov
klíčenia a prerastania zrna pšenice. In Nové poznatky z genetiky a šľachtenia
poľnohospodárskych rastlín, 2005, s. 12-15
MICHALÍK, I. 2008. Biochémia. 6 vyd. Nitra: SPU, 2008. ISBN 978-80-552-0020-0
MOLNÁROVÁ, J. – ŽEMBERY, J. – ILÉŠ, L. 2009 Rastlinná výroba I, Nitra 2009, 2
vyd., ISBN 978-80-552-0194-8
Morfológia pšenice, [online] [cit. 2010-01-15]. Dostupné na:
http://www.plantprotection.hu/modulok/szlovak/wheat/morf_wheat.htm
MUCHOVÁ, Z. et al. 2008. Hodnotenie surovín a potravín rastlinného pôvodu. 5 vyd.
Nitra, 2008. ISBN 978-80-552-0127-6
PAULOVICSOVÁ, B. – BOLOGHOVÁ, M. – POKORNÁ-JURÍKOVÁ, T. 2007.
Dôležité postavenie drobného a kôstkového ovocia vo výžive ľudí, 8. vedecká konferencia
doktorantov a mladých vedeckých pracovníkov, Nitra : FPV UKF, s. 77, 78
PAYNE, P. I. 1987. Genetics of wheat storage proteins and the effect of allelic vairation
on bread-making quality. Ann. Rev. Plant Physiol. 38, 1987, p. 141 - 153
POSPÍŠIL, R. et al. 2008. Integrovaná rastlinná výroba. 1 vyd. Nitra, 2008. ISBN 978-80-
552-0141-2
PŘÍHODA, J. – SKŘIVAN, P. – HRUŠKOVÁ, M. 1986. Cereální chemie a technologie I:
cereální chemie mlýnská technologie, technologie výroby těstovin. 1. Vyd. Vysoká škola
chemicko – technologická v Praze, Praha 2004. ISBN 80-7080-530-7
PRUGAR, J. 2008. Kvalita rostlinných produktu na prahu 3. tisiciletí. Praha 2008. 75-77 s.
ISBN 978-80-86576-28-2
PRUGAR, J.– HRAŠKA, Š. 1986. Kvalita pšenice. Bratislava 1986. 8, 37-38 s. ISBN 64-
133-86
PŠENÁKOVÁ, I. – FARAGÓ, J. 2006. Rastlinné flavonoidy a ich potenciál pre funkčné
potraviny a nutraceutiká. In Nové poznatky z genetiky a šľachtenia poľnohospodárskych
rastlín [Zborník]. Piešťany, 2006, s. 27,28
SEDLÁK, D. et al. 2007. Praktikum z biochémie. 2 vyd.
SHEWRY, P.R. - TATHAM, A.S. 2002. New light on an old technology: the structure of
wheat gluten and its role in bredmaking. Outlook Agric., 18, 1989 p.65-71
SOLNICOVÁ, S. 2006. Transformácia funkčných zložiek cereálií v potravinách nového
typu: dizertačná práca. Nitra: SPU, 2006, 18 s.
STN 46 1100-2: 2003 Potravinárske obilniny. Časť 2: Zrno potravinárskej pšenice letnej.
Bratislava: vyd. SÚTN, 2003, pub. 90367
ŠIMKO, J.– MATUŠKOVIČ, J. – POKORNÁ-JURÍKOVÁ, T. 2007. Jedlé zemolezy –
nový hodnotný zdroj antokyanínov, 8. vedecká konferencia doktorantov a mladých
vedeckých pracovníkov, Nitra : FPV UKF, s. 107-109
VRBOVÁ, B. 2006. Analýza obrazů z gelové elektroforézy: bakalárska práca. Praha:
ČVÚT, 2006, 3 s.
VIVODÍK, M. et al. 2007. Využitie molekulárnych markérov na identifikáciu genotypov
pšenice, 8. vedecká konferencia doktorantov a mladých vedeckých pracovníkov, Nitra :
FPV UKF, s. 194, 195
ZÁLEŠÁKOVÁ, A. – BIELIKOVA, S. – GREGOVÁ, E. – KRAIC, J. 2004.
Vyhľadávanie zdrojov kvality v kolekcii genetických zdrojov pšenice. In Nova
Biotechnologica, 2004, 235, 236 s.
ZIMOLKA, J. et al. 2005. Pšenice : pěstování, hodnocení a užití zrna. 1. vyd. Praha, 2005.
9 s. ISBN 80-86726-09-6
Prílohy
Príloha A Grafické znázornenie percentuálneho zastúpenia alelickej zostavy na GLU-A1, GLU-
B1 a GLU-D1
40%
10%
50%
Glu - A1
02*1
40%
40%
20%
Glu - B1
7+87+920
80%
20%Glu - D1
5+102+12
Príloha B Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody Modré zrno
Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody UC66094
1 5
20
10
1
5
7
810
Denzitometrický záznam elektroforetického profilu Modré zrno a UC66094
Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody Barevná 9
1
1 5
20
10
5
7
8
1
7 1
9
10
Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody UC 66049 - modré TC
Denzitometrický záznam elektroforetického profilu odrody Barevná 25
1
5
7 1
810 1
5
1
10
20
Príloha C Elektroforetické profily zásobných bielkovín zrna farebných genotypov pšenice letnej
v SDS - PAGE
1 1 1 2 2 2 3 3 3 4 4 5 5 M Ch
Legenda k prílohe
1 – Modré zrno2 – UC660943 – Barevná 25 – modrá4 – UC 66049
5 – Barevná 9Marquis - štandardChinese spring - štandard
HMW-GS
LMW-GS+
gliadíny
Albumíny+
globulíny
Príloha DElektroforetické profily zásobných bielkovín zrna pšenice letnej v A - PAGE
1 1 2 2 3 4 5 6 7 8 8 8 9 10 11 10 11 11 12 13
Legenda k prílohe
1 – Modré zrno2 – Barevná modrá 253 – Samanta4 – Astela5 – Lívia6 – Torysa7 – Astela
8 – Barevná 99 – UC 66094 – modrá10 – ILAVA11 – UC 6604912 – ORMIL13 - ISTAR
GlD 1b3
Príloha EElektronický nosič