Prenos signala posredovan jedarnim receptorima

Regulacija biohemijskih procesa (školska 2019/2020.)

(Predavanje br. 7)

dr Milan R. Nikolić, docent

(mnikolic@chem.bg.ac.rs)

Be careful about reading health books.

You may die of a misprint.

Budite oprezni kada čitate knjige o zdravlju.

Možete umreti zbog štamparske greške.

Mark Twain (Samuel Langhorne Clemens)

(1835 – 1910)

Signaling receptors

Intracellular (nuclear)

Surface

Ion-channel

G protein-linked (GPCR)

Enzyme-linked

Receptor with guanylyl cyclases

Receptor with tyrosine kinases

Receptor without enzyme activity

Receptor with tyrosine phosphatases

Receptor with Ser/Thr kinases

Tri velike klase receptora na površini ćelije

Timescale: msec

Timescale: sec

Timescale: min

Next time!

Sadržaj predavanja

Steroidni vs. peptidni hormoni

Testosteron kao prototipski steroidni hormon (prvi glasnik)

Lokalizacija i struktura nuklearnih receptora

Opšti mehanizam aktivacije nuklearnih receptora

Kako nuklearni receptori iniciraju transkripciju?

Uloge hormon regulatornih elemenata i "heat-shock proteina"

Interakcije nuklearnih receptora sa drugim signalnim putevima

Regulacija prenošenja signala preko jedarnih receptora

Nuklearni receptori kao farmakološke mete

Višestruki koraci tokom

prenošenja signala

Apoptoza, opstanak, diferencijacija itd.

Signal = “prvi glasnik”

“drugi glasnik”

Steroidni vs. proteinski hormoni

Peptidni hormoni Steroidi

Polu-život u cirkulaciji kratak dugačak

Brzina delovanja brzo sporo

Trajanje efekata kratko dugačko

Lokalizacija receptora u ćeliji membrana unutar

Post-receptorna regulacija izražena niska

Amplifikacija signala visoka niska

Prirodni ligandi nuklearnih receptora

Lipofilni endokrini hormoni: a) steroidni hormoni (androgeni, estrogeni, gestrogeni, glukokortikoidi i mineralokortikoidi)

b) derivati aminokiselina (tiroksin)

c) derivati vitamina A (9-cis retinoidna kiselina) i vitamina D

d) derivati masnih kiselina (prostaglandini, leukotrieni, tromboksani...)

Koje hormone proizvode ove "žlezde su unutrašnjim lučenjem"?

Osa hipotalamus-hipofiza je esencijalna za aktivnost endokrinog sistema

Testosteron (T): kralj hormona!

Biosinteza i metabolizam steroidnih hormona

T secretion rate: 5 mg/day

Bog Zevs (T:AR)

(T/E2:AR/ER)

(DHT:AR)

(DHT:AR)

(E2:ER) T- Testosteron DHT- Dihidrotestosteron E2- Estradiol AR- Androgeni receptor ER- Estrogeni receptor

Receptori za testosteron u mozgu (snažan uticaj na mišljenje i način delanja)

(hipotalamus: fiziološke potrebe, nagoni, hormoni...)

(limbički sistem): memorija, agresija, emocije, zabava...)

(kora velikog mozga): viši intelektualni procesi, sveobuhvatna kontrola)

Kulturološke razlike!

Najvažniji seksualni organ je MOZAK (tzv. b-tačka)

• T povećava libido kod oba pola !!!

• Sezonske i cirkadijalne promene u nivou T

Koordinacija seksualne želje

i aktivnosti!

Nivo testesterona, brak i vernost

"testosterone-boosting super foods"

Non-optimal testosterone level

Anabolički efekti androgena (suprafiziološke koncentracije)

Mogući štetni (reverzibilni) efekti: • Ginokomastija • Atrofija testisa • Hepatotoksičnost (17-α-derivata) • Aktivacija koagulacionog sistema • Hipertofija miokarda

Efekti zavise od doze, pola i težine atlete,

trajanja ciklusa i unosa drugih supstanci.

Novo: Ligandrol (SARM)

Nandrolon (19-norT)

Winstrol (DHT derivat)

SAD: Klasa III kontrolisanih supstanci

Zabranjeni od 1974. g. (WADA)

The benefits of testosterone replacement-therapy for men and women

Opšti mehanizam odgovora na lipofilni signal

Transkripcija

Translacija

Citosol

Jedro

Nuklearna

ovojnica

Plazmina

membrana

Hormon putem krvi dolazi do ciljne ćelije.

Ulazak u ćeliju difuzijom kroz plazminu membranu.

Vezivanje hormona za receptor unutar ćelije uzrokuje aktivaciju i

dimerizaciju receptora.

Kompleks ulazi u jedro.

Njegovim vezivanjem za regulatorne elemente, dolazi do promene u

genskoj ekspresiji.

Promena sadržaja proteina u ćeliji.

Unutar-ćelijski

receptor

Promoter Ciljni gen “Hormone

response

element”

Ćiljna

ćelija

Steroidni hormon

NB: transportni proteini

HSA (humani serum albumin) • Relativno mali, neglikozilovani protein (66500 Da) • Najzastupljeniji (oko 50%) protein krvne plazme • Polu-život u cirkulaciji 18-21 dan

• Osnovne fiziološke uloge:

Održavanje koloidnog osmotskog pritiska

Puferska uloga u održanju kiselo-bazne ravnoteže

Transport nepolarnih fizioloških supstanci i lekova

Antioksidans: Cys34

SBHG: Sex binding hormone globuline

Nuklearni receptori (NR)

• Transkripcioni regulatori (promene u genskoj ekspresiji) • Aktiviraju se vezivanjem liganda (hormona) • Lokalizovani u citoplazmi i jedru ciljnih ćelija • Prirodni ligandi su mali liposolubilni signalni molekuli

Genomski (spori) efekti

Negenomski (brzi) efekti /uticaj hormona na druge signalne puteve u ćeliji/

Dugoročno prilagođavanje na promene u spoljašnjoj sredini i promene povezane sa razvićem!

Poremećaji u ovim procesima vode u patologije!

Klasifikacija i struktura nuklearnih receptora Tri podfamilije: Tip 1 - receptori za steroidne hormone: GR, MR, PR, ER i AR

Tip 2 - receptori za tiroidne hormone (T3R), retinoidnu kiselinu (RAR), vitamin D (D3R), derivate masnih kiselina itd. Tip 3 - orphan (‘siročići‘) receptori: nisu otkriveni prirodni ligandi

Modularna struktura - 3 glavna domena: LBD, ligand binding domain (C-terminalni deo) DBD, DNA binding domain (centralni deo) NTD, N-terminalni domain (najvarijabilniji)

Više pod-domena: H, hinge ili vezni region (signal za nuklearnu translokaciju) AF-1 i AF-2, activation function (regrutovanje regulatora transkripcije) Zn-fingers (dimerizacija receptora, vezivanje za DNK) CoR (regrutovanje transkripcionih ko-regulatora)

(AF-1 i AF-2)

Strukturna organizacija nuklearnih receptora

Izuzetna fleksibilnost strukture: različita konformaciona stanja!

Domen za vezivanje liganda (E)

Tri uloge: vezivanje liganda, dimerizacija, regulacija transkripcije

12 α-heliksa (H1-H12) Velika konformaciona promena

(menja hidrofilna površina H12 u jezgru AF-2)

Ligand se smešta u (veliki) hidrofobni džep

(hidrofobni efekat i H-veze)

Domen za vezivanje za DNK (C)

Evolutivno najočuvaniji: 70-80 aminokiselina Dva konzervirana C4 'Zn-fingers' strukturna motiva: • prema N-terminalu (P-Box); za veliku brazdu DNK ← interakcije sa HRE • prema C-terminalu (D-Box) ← dimerizacija receptora

NR vezuju za HRE kao homo (tip 1) ili hetero (tip 2) dimeri !!!

HRE, hormon response elements

(specifične nukleotidne sekvence, unutar promotora gena: 'pojačivači')

Dve kopije heksamerne sekvence!

Specifičnost određena: a) tipom sekvence; b) orijentacijom dva heksamera; c) rastojanjem između heksamera (1-5 bp).

'Krajevi' nuklearnih receptora

F: variabilni C-terminus (bez specifične funkcije)

A/B: varijabilni; AF-1 subdomen (N-terminus, posreduje u aktiviranju transkripcije na način nezavisan od prisustva liganda: fosforilacija* i vezivanje transkripcionih ko-aktivatora)

* MAPK, PI3K, Akt, c-Src (Tyr)...

Signalni put: tip I nuklearnih receptora

U odsustvu steroidnih hormona, nuklearni receptori su u citosolu ASOSOVANI sa ‘inhibitornim' heat-shock proteinima (HSP) u dinamičke multiproteinske komplekse

● aktivacija receptora vezivanjem hormona:

HSP disosuju, uz 'razotkrivanje' signala

za jedarnu translokaciju

● dimerizacija receptora u jedru ili citosolu; vezivanje

za DNK (via HRE); regrutovanje proteina i aktiviranje transkripcije

HSP čaperoni: stabilizuju određene konformacije i pomažu translokaciju

Citosolna aktivacija receptora za steroidne hormone

H

H H

dimerizacija

H H

Transkripcija gena HRE ciljni gen

5’ flanking region

Hsp90 H(hormon)

hsp70

p60

R Hsp70

H

homodimeri, palindromska sekvenca

Veoma čvrsto vezivanje H: KD~10-9 M

Hsp90 operates with a number of co-chaperones,

including Hsp70 and Hop (Hsp90 organizing protein,

also known as p60), to orchestrate the ATP-dependent

maturation of many client proteins.

When the native states of proteins (N) become unstable under heat stress, sHSPs passively protect cells against potentially deleterious aggregates by remodeling their oligomeric landscapes. Both increased dissociation of dimeric subunits and a shift to higher oligomeric structures are accompanied by higher affinity for unfolded client molecules (U). The resulting hetero-oligomeric sSHP:client complexes agglomerate into an array of co-aggregates that can be recovered by disaggregating Hsp chaperone teams.

Proteini toplotnog stresa ("molekulski sunđeri prirode")

Crystal structures of heat shock protein 90 (HSP90) dimers

Molekulski mehanizam delovanja testosterona

Normal function of the androgen receptor (AR). Testosterone (T) enters the cell and, if 5-α-reductase is present, in men ca. 5% is converted into more potent androgen dihydrotestone (DHT). DHT has two to three times greater receptor affinity than T. Upon steroid binding, the AR undergoes a conformational change and releases heat-shock proteins (hsps). Phosphorylation (P) occurs before or after steroid binding. The AR translocates to the nucleus where dimerization, DNA binding, and the recruitment of co-activators occur. Target genes are transcribed (mRNA) and translated into proteins.

Signalni put: tip II nuklearnih receptora U odsustvu hormona, receptori NISU ASOSOVANI sa HSP, već su u

jedru vezani (preko HRE) za DNK i regrutuju represorne ko-transkripcione faktore.

Aktivacija receptora vezivanjem hormona: konformaciona promena izlaže AF-2 (LBD) za regrutovanje transkripcionih koaktivatora.

heterodimeri (RAR/RXR ili D3R/RXR)

(glava-rep orjentisani dimeri)

Veoma čvrsto vezivanje: KD~10-9M

Aktivacija nuklearnih receptora

Signalni put: receptori 'siročici'

● Često monomeri (NGFI-B) & aktivni i bez prisustva liganda ● Bioaktivni lipidi kao prekursorni/signalni molekuli

NGFI-B=Nerve growth factor IB

Transkripciona regulacija

Kako? Direktne interakcije receptora sa brojnim (desetine) tkivno specifičnim proteinima*

1. Hormonalna aktivacija ciljnog gena: modifikacija strukture hromatina (modifikacija histona i remodelovanje nukleozoma)

● transkripcioni koaktivatori (preko AF-2: SRC-1/NCoA-1 familija [steroid receptor coactivator 1 / nuclear receptor coactivator 1]

2. Represija ciljnog gena u odsustvu hormona: T3R i RAR vezuju, preko coR, transkripcione korepresore: SMRT/NcoR

[silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptors/ nuclear receptor corepressor]

LxxLL-interakcije sa koaktivatorima i korepresorima

(dinamička i kombinatorna priroda)

* Kao transkripcioni regulatori “regrutuju” druge proteine (komponente medijatornog kompleksa, transkripcioni koaktivatori i korepresori); vremenska i tkivno-specifična dimenzija!

a

d

e

g

b

c

f

L

L

L

Genomic effects of glucocorticoids include trans-activation and trans-repression

doi:10.1038/ncprheum0898

Abbreviations: AP1, activator protein 1; cGCR, cytosolic glucocorticoid receptor; COX-2, cyclooxygenase 2; GRE, glucocorticoid response element; IκB, inhibitor of NFκB; IFN-γ, interferon γ; IL, interleukin; NF-AT, nuclear factor of activated T cells; NFκB, nuclear factor κB; STAT5, signal transducer and activator of transcription 5; TF, transcription factor; TNF, tumor necrosis factor; VEGF, vascular endothelial growth factor.

Željeni anti-inflamatorni i imuno-supresivni efekti glukokortikoida: selektivni agonisti, aktivirani GR vezuje za NF-κB (represivni transkripcioni regulator) umesto za DNK!

Ligand specifičan za gen i tkivo!

NF-κB=nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

Regulacija signalnih puteva posredovanim

nuklearnim receptorima

Kontroliše trajanje i amplituda efekta hormona na ekspresiju gena!

1. Koncentracija hormona

2. Kovalentna modifikacija receptora (ER; AF-1 fosforilacija Ser118 (MAPK) –> aktivacija i bez vezivanja liganda)

3. Aktivnost transkripcionih koregulatora

4. Interakcije sa drugim transkripcionim regulatorima (složeni promotori: recipročni antagonizam GR i NFκB)

5. Proteolitična degradacija receptora (u proteozomima, nakon ubikvitinacije)

Ubikvitin: mali regulatorni protein

Negenomske uloge nuklearnih receptora (komunikacija sa drugim signalnim putevima)

Efekti izvan jedra i/ili aktivacija nezavisna od sopstvenog liganda

Fiziološki efekti steroidnih hormona koji ne zavise od transkripcije: ● Primanje signala iz drugog signalnog puta

● Prenošenje signala na drugi signalni put

Promene u aktivnosti jonskih kanala i premeabilnosti membrana

Vezivanje 'hormona' za GPCR (Gi i Go)

Interakcija NR sa regulatornim elementima drugih puteva

Detaljno proučeni negenomski efekti estrogena

i glukokortikoida (klinički značaj)

Notice the relationship of the G-proteins, G protein receptor (GPCR) to the ion channel and the MAP kinase pathway. These pathways play an important role in fast cellular responses known as non-genomic signaling. The sex hormone binding globulin receptor (SHBGR) also uses the G-protein to stimulate the cyclic-AMP pathways which supply energy to many other fast acting pathways.

Farmakološka regulacija patofizioloških procesa

Tamoksifen blokira delovanje estrogena u tkivu dojke

(Kancer dojke je najčešći maligni tumor kod žena u Srbiji)

Expression patterns of ERs

• ERα – breast – uterus – cervix – vagina – brain regions

• ERβ – ovary – prostate, testis – spleen, thymus – lung – hypothalamus, other brain regions

Knockout phenotype: female sterility, no mammary gland development, obesity, male sterility, testicular degeneration ect.

Knockout phenotype: male-fertile, female-reduced fertility, ovarian dysfunction, vascular problems/ develop hypertension as they age

Estrogen receptor (ER) ligands can act through multiple mechanisms:

(1) classical ligand dependent induction thru an ERE (2) indirect ligand dependent induction by interaction with AP1

or perhaps other DNA bound transcription factors (3) ligand-dependent interactions with Src kinase in the

cytoplasm and the activation of MAP kinase signaling

Plejotropni efekti delovanja steroidnih hormona!

doi: 10.1038/nri1748

Popularna nauka