Preparación De Medio De Cultivo, Técnicas De Siembra De

Microrganismos y Técnicas de Tinción

Preparation of Culture Medium, Sowing Techniques

Microorganisms and staining techniques

Francisco Javier Carvajal Andrade1, José Ricardo Mora Escobar2

Resumen

En este artículo, se dará a conocer los procedimientos y técnicas empleados en la preparación, siembra y posterior

tinción los cuales se desarrollaron en 3 diferentes prácticas para la identificación de los microrganismos presentes en

una muestra de cultivo. El estudio se llevo a cabo en el laboratorio de Conservación de productos Agropecuarios

(practica 1 y 2) y de Biología (practica 3) ubicados en la Universidad Surcolombiana.

En la práctica n° 1 se utilizo los procedimientos en la preparación para dos medios de cultivo, uno en medio solido

con agar y el otro en medio liquido con agua peptona. 8 días después en la practica n° 2 se empleo las técnicas de

siembra por superficie, triple estría, en profundidad y doble capa. Los microorganismos a observar se obtuvieron de

los baños de hombres y mujeres ubicados en la facultad de ingeniería de la misma universidad. Pasados otros 8 días

en la practica n° 3 se fijo y mediante la técnica de tinción Gram se agregó colorantes para la identificación de

bacterias Gram positivos y/o Gram negativos. Se pudo identificar la formación de colonias aisladas en la siembra de

triple estría y en la tinción de Gram se observaron microorganismos con forma de coco y bacilos, además Gram

positivos y Gram negativos.

Palabras Claves: tinción de Gram; técnicas de siembra; Gram positivos; Gram negativos; microrganismos; muestras de

cultivo

Summary

In this article, we will present the methods and techniques used in the preparation, planting and subsequent staining

which developed in 3 different practices for the identification of microorganisms present in a sample of culture. The

study was conducted in the laboratory of Conservation Agricultural products (practice 1 and 2) and Biology

(practice 3) located at the University Surcolombiana.

In practice no.1 preparation procedures for two culture media, one in solid agar medium and the other in liquid

medium with peptone water was used. 8 days after the practice is job No. 2 seeding techniques for surface triple

groove, ball and double layer. Microorganisms were obtained to observe the bathrooms for men and women located

in the Faculty of Engineering at the same university. After a further 8 days in practice fixed No 3 and by gram

staining technique for identifying dyes Gram positive bacteria and / or Gram negative added . Could identify isolated

1Estudiante de Ingeniería Agrícola. Universidad Surcolombiana- Neiva. Av. Pastrana – Carrera 1. Carvacho23@hotmail.com 2Estudiante de Ingeniería Agrícola. Universidad Surcolombiana- Neiva. Av. Pastrana – Carrera 1. jose911925@hotmail.com

colony formation in triple planting groove and Gram stain coconut shaped organisms and Gram-negative bacilli was

observed Gram positive addition.

Keywords: Gram stain, planting techniques, Gram positive, Gram negative, microorganisms, culture samples

1. Introducción

Los ambientes capaces de albergar vida microbiana reflejan el amplio espectro de la evolución de estos organismos.

Se han encontrado especies que viven a temperaturas comprendidas entre el punto de congelación y el punto de

ebullición del agua, en agua salada y en agua dulce, en presencia y en ausencia de aire. Algunos han desarrollado

ciclos de vida que incluyen una fase de latencia en respuesta a la falta de nutrientes. Los microorganismos se hallan

capacitados para acometer una extensa gama de reacciones metabólicas y adaptarse a muchos ambientes diferentes.

Por su poco peso pueden ser transportados por las corrientes de aire y estar en todas partes, pero las características

del ambiente determinan cuáles especies pueden multiplicarse. Existen varias clases de microorganismos: mohos,

levaduras, bacterias, actinomicetos, protozoos, algas, virus. (http://www.unsa.edu.ar/matbib/micragri/micagricap1.pdf).

Los laboratorios de microbiología constituyen ambientes de trabajo especiales, que pueden presentar riesgos de

enfermedades infecciosas para las personas que se encuentren en o cerca de ellos. El trabajo diario en el laboratorio

es un trabajo de grupo, en donde la actitud de cada uno de los integrantes ante las prácticas, así como el

entrenamiento que posean en las técnicas requeridas para el manejo de material contaminado, determinan su propia

seguridad, así como la de sus compañeros y la de la colectividad en general.

Es por ello que antes de comenzar con las actividades prácticas, todas las personas involucradas (estudiantes y

profesores) tienen la obligación de conocer cuáles son las normas de seguridad a seguir en el laboratorio de manera

tal, que el trabajo se realice con un riesgo mínimo de exposición, tanto para las personas que lo ejecutan como para

el medio ambiente. (Normas de seguridad en el laboratorio de microbiología.pdf).

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los microorganismos. La

composición precisa dependerá de la especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían

considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio normales

y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para

crecer. (https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-microbiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo).

Una de las características más importante de las bacterias es su morfología, definida por el tamaño, la forma, el

arreglo y la estructura. Existen bacterias en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilíndrica, denominadas

bacilos y una tercera morfología como son las que tienen forma de espirales, denominadas espirilos. A su vez cada

categoría puede sub clasificarse con base a diferentes arreglos.

Estas características pueden determinarse examinando muestras al microscopio. Las células no teñidas son

prácticamente transparentes, pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lámina y

laminilla o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de fases o de campo oscuro. (http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Morfolog%C3%ADa_y_Tinci%C3%B3n.

pdf)

2. Metodología.

2.1 Preparación de medio de cultivo (Ver Figura 7)

2.1.1 Preparación medio de cultivo con agar: Se tuvo en cuenta la relación de preparación entre agua y

agar especificados en la etiqueta del producto (ver figura 1), por ende se pesó 2,3 gr de agar (ver figura 2

para 100 ml de agua destilada, se vertió en un Erlenmeyer (ver figura 3), se homogenizo y

posteriormente se tapo con papel aluminio. Finalmente se colocó cinta autoclave se llevó al autoclave a

121 °C hasta el cambio de color en la cinta y se dejó atemperar (figura 7).

Figura 1. Especificaciones etiqueta.

Laboratorios Merck KGaA

Figura 2. Peso del agar utilizado

Pesa Scout Pro (DHAUS)

Figura 3. Vertimiento en

Erlenmeyer

2.1.2 Preparación del cultivo liquido: Se tuvo en cuenta la relación de agua peptona especificados en la

etiqueta del producto (ver figura 4), por ende se pesó 1,3 gr de peptona para 50 ml de agua destilada, se

vertió en un vaso de precipitados (ver figura 5), y se homogenizo con ayuda del agitador magnético.

luego por medio de un dosificador estéril se adicionó 9 ml a cada tubo de ensayo y se tapó con papel

aluminio. Finalmente se llevó a la autoclave a 121 ° C durante un tiempo aproximado de 20 min

(Figura 7).

Figura 4. Especificaciones etiqueta

Laboratorios Merck KGaA

Figura 5. Vertido y homogenizado

Heidolph MR Hei-Mix S

Figura 6. Adición 9 ml a tubos de

ensayo

Figura 7. Autoclave a 121 °C de los dos

Medios de cultivo.

All American Model No 25X

PREPARACION

DE MEDIO

MEDIO

Preparación

medio de cultivo

con agar

Preparación

cultivo líquido

Se pesó gr para

100 ml de agua

destilada

Se pesó 1,3 gr

para 50 ml de

agua destilada

Se envaso en un

Erlenmeyer, se

homogenizo y

tapo con papel

aluminio.

Se envaso en vaso de

precipitado, se homogenizo y

luego con un dosificador se

adiciono 9 ml a cada tubo de

ensayo y se tapo con papel

aluminio

Se llevo hasta a la

autoclave a 121

° C durante un

tiempo aprox. De

20 min.

Figura 8. Mapa Procedimiento de preparación medio del cultivo

2.2 Técnicas de siembra de microorganismos:

Se realizó soluciones seriadas hasta el orden de 10-4 unidades formadoras de colonias por gramo (UFC/gr)

a partir de una disolución madre para realizar cada una de las técnicas de siembra de microorganismos (Ver

figura 9.)

Figura 9. Diluciones seriadas de la muestra para cada tipo de siembra.

2.2.1 Siembra profundidad (S.P.): Se vertió cierta cantidad de PC (medio de cultivo solido, agar) a una

placa. Seguidamente se adiciono 1 ml del tubo -2 y se homogenizo la suspensión con movimientos

horarios y anti horario. Finalmente se incubo y se observo a un tiempo óptimo el crecimiento

microbiano. (figura 10)

2.2.2 Siembra doble capa (S.D.C.): Se vertió cierta cantidad de PC (medio de cultivo solido, agar) a una

placa. Se adicionó 1 ml de la muestra del tubo -4, y luego se homogenizó la suspensión con

movimientos horarios y anti horario. Se dejó solidificar. Posteriormente se adicionó otra cantidad de PC

y se incubo. Se observo a un tiempo óptimo el crecimiento microbiano. (figura 10)

2.2.3 Siembra por masa (S.M.): Se adicionó 1 ml de muestra del tubo -3 a una caja de Petri. Se extendió

homogéneamente con un asa de platino. finalmente se incubó y se observó en un tiempo óptimo el

crecimiento microbiano. (figura 10)

2.2.4 Siembra triple estría: Se tomó el asa que se utilizo en la siembra por masa sin esterilizar con

contenido microbiano y se sembró en la mitad de una placa con medio de cultivo, posteriormente

se flameo el asa al rojo vivo y luego de enfriarse se realizó una segunda estría a partir de la anterior. Se

flameo nuevamente y se hizo una última estría. Finalmente se incubó durante un tiempo óptimo y se

observó el crecimiento microbiano. (figura 10)

Figura 10. Incubación

2.3 Tinción de Gram (Ver Figura 11): Se tomó un portaobjetos delimitando la zona de estudio para cada

muestra (hombre y mujeres), se agregó a cada zona una gota de agua destilada para extender y fijar; luego

se tiñó durante un minuto con violeta de genciana y sin lavar se remplazó el colorante por el reactivo del

lugol, lo cual arrastró el primer colorante y se dejó actuar durante 1 minuto. fue necesario lavar con agua y

alcohol durante treinta segundos para teñir con fuchsina básica durante 3 minutos; finalmente se lavó,

secó y se observó al microscopio. (Ver Figura 12, 13, 14 y 15)

Figura 11. Mapa del proceso tinción Gram

Figura 12. Flameado de la muestra figura 13. Resultado final

3. Resultados y Discusión:

Para lograr un buen análisis en la observación de microorganismos es importante seguir un protocolo de

seguridad en el laboratorio y en el manejo del material, de esta forma se evitará alteraciones en las muestras

por contaminación, además se debe tener en cuenta que en el laboratorio de microbiología de la Universidad

Surcolombiana se pueden encontrar condiciones de trabajos riesgosas como: No se monitorea el flujo de aire

en el laboratorio, no se usan campanas para gases y vapores nocivos, todas las áreas están expuestas a las

muestras , no se descontaminan las áreas de trabajo diariamente, no hay equipo de protección especial, no

hay contenedores especiales para materiales contaminados, se usan sustancias cancerígenas, las mayorías de

las soluciones se preparan en el laboratorio, no hay superficies anti resbalantes y los puestos de trabajo no

están diseñados ergonómicamente.(Buesa, 2008)

3.1 Preparación de medio

A la hora de realizar los medios

La falta de implementos y equipos necesarios para la realización de una buena práctica en el laboratorio, el

estar expuestos al ambiente, además de la falta de experiencia de los estudiantes al emplear las técnicas y

métodos requeridos para este trabajo, generó errores como por ejemplo; no se logró la adecuada

solidificación de los medios sólidos.

Tinción de Gram (ver figuras 15,16)

Se observó antes de empezar el laboratorio, que para nuestro caso las colonias no estaban del todo aisladas

debido a la falta de experiencia al realizar los procedimientos en las anteriores prácticas.

Después de la tinción, se observó por medio del microscopio la presencia de microorganismos en su

tamaño, morfología y la organización de las células. Además se observó presencia de bacterias Gram

positivas (de color violeta ver figura 16) y Gram negativas como Enterobacterias (de color rosa ver figura

15). De igual manera se presenció bacilos y cocos.

Este efecto es ocasionado por la diferencia de la formación taxonómica de cada tipo de microorganismos,

debido a que las Gram Negativas presentan dos membranas lipídicas entre las que se localiza una fina pared

celular de peptidoglicanopermite la extracción del cristal violeta – lugol por medio del alcohol además su

Figura 14. Extensión de la muestra Figura 15. Observación en microscopio

pared externa contienen porinasque son proteínas las cuales tienen como función regular la entrada y salida

de diferentes sustancias(Cisneros Martínez, 2011), al contrario las Gran Positivas por poseer paredes

gruesas formadas por peptiglicano al entrar en contacto con el alcohol se deshidratan evitando la salida del

cristal.

Los bacilos “Gram-negativos” incluyen un gran número de especies. Algunos de ellos causan

principalmente enfermedades respiratorias (Haemophilusinfluenzae, Klebsiellapneumoniae,

Legionellapneumophila, Pseudomonasaeruginosa), enfermedades urinarias (Escherichiacoli,

Proteusmirabilis, Enterobactercloacae, Serratiamarcescens) y enfermedades gastrointestinales (Helicobacter

pylori, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi). Otros están asociadas a infecciones nosocomiales

(Acinetobacterbaumanii). (Bernabe Alfaro, y otros, 2010)

.

3.2 Técnicas de siembra

Es importante tener claro que cuando se trabaja en microbiología, cualquier microbio usado o estudiado en

el laboratorio no debe ser contaminado con otros del ambiente o por el mismo microbiólogo.

Las técnicas empleadas en la siembra de microorganismos son siembra por superficie, triple estría y en

profundidad. Cuando se siembra en placa por extensión y en estrías, se extiende una mezcla de células

sobre una superficie de agar, cada célula aislada se multiplicará formando una colonia independiente, cada

colonia representa un cultivo puro. Dicha colonia se toma y posteriormente se siembra por superficie

haciendo la extensión uniforme de la colonia por el medio de cultivo ó se toma una muestra líquida, la cual

se adiciona a la placa que contiene el medio de cultivo y luego se extiende con ayuda de un asa. Las células

diseminadas sobre la superficie desarrollaran colonias aisladas, el número de colonias que se desarrollen

corresponden al número de organismos viables de la muestra, siempre y cuando se proporcionen las

condiciones óptimas para su desarrollo (Prescott, et al., 2002). La siembra por extensión es muy empleada

para determinar en una muestra la concentración bacteriana

Figura 15. Resultado de la tinción. Muestra

mg. Gram negativas como Enterobacterias

Figura 16. Resultado de la tinción. Muestra mh. Triple estría. Gram positivas

La siembra en estrías facilita la obtención de colonias aisladas. La cual consiste, en extender la mezcla

microbiana en un extremo de la placa en masa, luego se flamea el asa y se extiende un estría que sale a

partir de la extensión inicial, posteriormente se vuelve a flamear el asa y se hace otra estría que sale de la

anterior. Las colonias que crecen en la superficie de una placa se pueden inocular en un medio fresco y

preparar cultivos puros (Prescott, et al., 2002).

Se observó que los resultados son diferentes en cada técnica empleada, ya que algunas facilitan el

crecimiento de colonias aisladas más que otras. Sin embargo no se logró formar colonias aisladas en todas

las siembras tal vez por la falta de experiencia a la hora de realizar las siembras. Solo se obtuvo colonias

aisladas en la siembra triple estría.

Una de las ventajas de la siembra en profundidad es que es un método utilizado para el recuento de

microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

4. Conclusiones

La falta de implementos y equipos, además de la falta de experiencia a la hora de realizar las prácticas

interfirió en los resultados.

Al realizar el medio solido estos no se solidificaron del todo probablemente al incorrecto seguimiento

del protocolo para esa práctica.

Por medio de la técnica de Tinción de Gram se logró observar microorganismos Gran positivos y Gran

negativos

Se aprendió que las porinas son proteínas de membrana externa presentes en bacterias Gram negativas

que tienen como función regular la entrada y salida de diferentes sustancias. Y que el alcohol permite

el escape del complejo cristal violeta – lugol lo cual induce al descoloramiento de los

microorganismos.

Después de la tinción, se observó por medio del microscopio la presencia de microorganismos en su

tamaño, morfología y la organización de las células.

Se conoció y empleo La forma de esterilizar los medios de cultivo en la autoclave.

Se aprendió a utilizar los diferentes equipos y materiales presentes en el laboratorio, los métodos que se

llevan a cabo a la hora de Preparación De Medio De Cultivo, Técnicas De Siembra De Microrganismos

y Técnicas de Tinción.

Es importante Mantener la limpieza del ambiente (uso de mechero) donde se realizó la técnica de

siembra y también de nuestras manos para reducir la probabilidad de ingreso de microorganismos del

ambiente.

La siembra triple estría fue la que mejor presento resultados y se obtuvo colonias aisladas.

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