Préparation des échantillons pour

microscopie électronique

Preparation des échantillons

1. Fixation

Fixation chimique:– glutaraldéhyde – tétraoxyde de osmium

Fixation physique:Cryofixation - avec azote liquide

– avec le développement de la cryo-microscopie électronique de sections vitreuses (CEMOVIS), il est maintenant possible d'observer des échantillons de pratiquement tous les spécimens biologiques à proche de son état naturel.

Preparation des échantillons

3. Déhydration, ou le remplacement de l'eau avec des solvants organiques comme l‘éthanol ou l‘acétone, suivie de la phase critique de séchage ou d'infiltration de résines d'enrobage

4. Intégration des matériaux - après incorporation dans la résine, le spécimen est habituellement poli au fini de type miroir en utilisant des produits abrasifs ultra-fins. Le processus de polissage doit être effectué avec soin afin de réduire au minimum le polissage les rayures et autres artefacts qui réduisent la qualité de l'image.

Inclusion dans la résine (Epon) • Cette technique se pratique directement sur l’échantillon parfaitement

propre et sec

• Elle consiste à placer l’échantillon de petite taille, de 0.1 à 1mm3 selon le matériau, dans un moule ou une gélule que l’on remplit d’une solution de résine liquide

Souvent un dégazage préalable de l’échantillon ainsi qu’un enrobage sous vide sont nécessaires pour une bonne adhérence résine-échantillon

• On peut, selon les cas, inclure dans:– des résines époxy - les résines époxy sont apolaires et polymérisables

à chaud (50°C à 120°C)– des résines acryliques - les résines acryliques sont le plus souvent

polaires et polymérisables à chaud ou aux UV (à température ambiante ou à +4°C)

• Le choix de la résine dépend des propriétés du matériaux et de la technique de préparation choisie

Enrobage

• C'est une étape préparatoire à la réalisation de coupes ultrafines

• Est obtenue après une imprégnation progressive du matériel dans une résine époxy type Epon

Préparation de l'échantillon• Préparation de l'échantillon

pour adapter sa taille à celle du mandrin du porte objet de l'ultramicrotome

•  Façonnage de la surface qui sera coupée (à l'aide d'une lame de rasoir et/ou d'une lame diamant : cryotrim)

  

ULTRAMICROTOMIE• L'ultramicrotomie donne accès à

l'ultrastructure des tissus grâce à la réalisation de coupes ultrafines (50-100 nm). C'est une étape clé qui précède l'observation.

• Les coupes sont effectuées à l'aide d'un couteau diamant ou de verre.

• Les coupes semi-fines ont une épaisseur de l'ordre de 1m. Elles sont déposées sur une lame en verre.

• Les coupes ultrafines ont une épaisseur entre 50 et 100 nm et elles sont récupérées sur une grille métallique (Cu, Ni, Au) de 3 mm de diamètre.

• Les coupes sont ensuite contrastées avec l'acétate d'uranyl et le citrate de plomb.

Sectionnement• Produit de fines tranches du

spécimen, semi transparent aux électrons.

• Ultramicrotome avec un tranchant de diamant pour produire des tranches sur 60-90 nm d'épaisseur.

• Des tranchants jetables en verre sont également utilisés car ils peuvent être faits en laboratoire et sont beaucoup moins chers.

• Récuperation des coupes se faire avec un anneau special

Types de grilles

• Préparation de grilles recouvertes d'une membrane de carbone ou de formvar.

Types de grilles

• Grilles standard

• Grilles d'identification: les margines sont solides et présente les spécifications de référence à l'intérieur de la grille

• Grilles double: deux grilles sont recouvertes et reliées

Coloration des coupes• Coloration négative

- Est est utilisé une solution contenant un agent contrastant, acétate d'uranyl. Il se va fixer préférentiellement au bord des particules adsorbées- De par sa forte masse atomique, le contrastant dévie les électrons dans le diaphragme objectif. Ainsi l'échantillon biologique apparaît plus clair que ce qui l'entoure. - L'échantillon apparaît blanc sur un fond sombre sur les photographies.

• Coloration positive- C’est une technique rapide de renforcement du contraste pour des échantillons transparents aux électrons.

Coloration des coupes• Métallisation - utilisation de

métaux lourds comme le plomb, l'uranium ou de tungstène pour disperser les électrons d'imagerie et donc donner du contraste entre différentes structures, étant donné que de nombreux matériaux (notamment les biologiques), sont à peu près «transparents» aux électrons (objets à faible phase)

• par pulvérisation cathodique (palladium-or) ou par dépôt de carbone.

Les types de sectionsCoupes semi-fines

- coloration au bleu de toluidine- observations sont fait en microscopie optique.

Coupes ultra-fines- observation sont fait en microscopie électronique en transmission.