ELABORACIELABORACIN DE MEZCLA N DE MEZCLA PARA PCRPARA PCR

Raquel Asuncin Lima Cordn

PCR

Polymerase Chain reaction (reaccin en cadena de la polimerasa)

Sintetizar muchas veces un fragmento de ADN

PCR: simulacin de lo que sucede en la clula cuando se sintetiza el ADN

PCR

Ingredientes necesarios: Polimerasa ADNOligonucleotidos dNTPs (dinucleotidos)

PCR: ingredientes

Oligonucletidos:

Uno debe tener la misma secuencia del ADN

Segundo debe ser complementario a esa secuencia. Forward y reverse

De no ser as, no podra amplificarse el fragmento deseado.

PCR: aplicaciones

Gentica de poblaciones

Evolucin molecular

Genmica

Medicina forense

PCR: Cmo funciona?

Despus de haber preparado la mezcla maestra Se coloca en un termociclador Calienta o enfra los tubos a tres temperaturas distintas

(ciclos de reaccin) 95 (desnaturalizacin) 40 - 60 (alineamiento) 72 (extensin)

PCR: desnaturalizacin

Dobles cadenas de ADN se abren.

Se forman y se rompen constantemente los puentes de H entre los oligonucletidos y el ADN

Uniones ms estables durarn mas tiempo Polimerasa se une al fragmento de ADN de doble

cadena : 5 3

PCR: alineamiento

PCR: extensin

Polimerasa alcanza su mxima actividad Contina la sintesis de los fragmentos de

ADN

TIPOS DE TECNICAS

RAPDs, AFLPs, RFLPs Tener claro el tipo de informacin que necesitamos Las tcnicas se pueden dividir en dos categoras PCRs para la amplificacin de un solo sitio conocido del

genoma PCRs en los que no es necesario conocer la regin que

se est amplificando.

PCRs para la amplificacin de un solo sitio conocido del genoma

Requieren conocer la secuencia que se trabaja Con este tipo es posible hacer filogenias Los datos pueden obtenerse de:

Geles que detectan cambios hasta de una sola base SSCP Utilizando enzimas de restriccin

PCRs en los que no es necesario conocer la regin que se est

amplificando.

Se desconoce el tamao del fragmento (s) Se utilizan para determinar polimorfismo genmico Utiliza un solo oligonucleotido con 2 caractersticas

Pequeo a mediano (6 -18 pb) Secuencia est presente muchas veces en el ADN

Qu

se necesita para hacer un PCR?

Polimerasa comercial (acompaada de un buffer o amortiguador)

MgCl2 (cloruro de magnesio) Oligonucletidos Agua (debe tener pocas sales, bidestilada) Tubos (0.2 0.5 ml) y puntas (libres de ARNasas y

ADNasas) Termociclador

HACIENDO PCR

ANTES DE EMPEZAR Preparar todos los reactivos en alcuotas congeladas (-

20 C)

CONDICIONES DEL PCR Empezar con las mismas condiciones que se hayan

reportado para el oligonucletido que se estutilizando.

Realizar pruebas con pocas muestras antes de utilizar todas las muestras de estudio.

Concentracin inicial

Concentracin final en la reaccin

Cantidad para un tubo

Cantidad para 10 tubos

dNTPs 10 mM 200M vara de acuerdo al magnesio

1 l 10 l

Magnesio 25mM 1.5mM puede probarse de 1 a 4 mM

3 l 30 l

Oligo forward

10 M 1M puede probarse de 0.1 a 1 M

5 l 50 l

Oligo reverse

10 M 1M puede probarse de 0.1 a 1 M

5 l 50 l

Enzima 5U/l 1U 0.2 l 2 l

Buffer 10X 1X 5 l 50 l

Agua - - 29.8 l 298 l

ADN 0.1mg/ml 0.1 mg genmico 11 l -

TEMPERATURAS Y CICLOS

Buscar artculos que hayan trabajado con el organismo de inters.

Si no hay o bien no funciona se puede probar lo siguiente

Desnaturalizacin inicial: 95C por 5 10 mins 30 ciclos con desnaturalizacin a 95 C (30 s), alineamiento a 50 C

(30 s) y extensin a 72 C por tiempo variable. Extension final 72 C 10 mins 4 C

LA TEMPERATURA DE ALINEAMIENTO Puede modificarse si el PCR aun no funciona. Se puede calcular la Tm (melting temperature) de

cada oligo Varia de la cantidad de dobles o triples enlaces de H

http://insilico.ehu.es/tm.php

Qu

hacer cuando todo empieza a fallar?

Cul es la calidad del ADN que tenemos? ADN contaminado con

protenas que inhiben la reaccin de PCR

ADN est degradado: correr una pequea muestra de ADN en un gel.

En la extraccin ocurre lo siguiente

Rompe tejido: detergente (SDS o CTAB), si quedan restos de SDS la reaccin se inhibe. Puede neutralizarse utilizando 0.5% de Tween 20 o 40

Despus es necesario deshacerse de todos los componenetes celulares: se usan sales que precipitan protenas pero no el ADN.

Hacer curvas de cloruro de magnesio Revisar la concentracin y el manejo de los dNTPs. Revisar el buffer Algunos ya incluyen el MgCl2 e inhiben la reaccin

Revisar los oligonucletidos Podran estar degradados, defectuosos, mal diseados.

Contaminacin Trabajar con control negativo

GELES DE AGAROSAMtodos para visualizar el PCR

Principios bsicos de la electroforesis

Geles de agarosa o acrilamida (permiten separar fragmentos de acuerdo al tamao de cada uno)

Especie de red con agujeros de tamaos diferentes El ADN es corrido por corriente elctrica hacia el

polo positivo (ADN negativo)

Fragmentos de un mismo tamao se agruparan todos juntos formando bandas en el gel

Agarosa o acrilamida?

Acrilamida Redes con tamaos de poros uniformes Pequeos til si los tamaos de los fragmentos son pequeos Separacin fina Una sola base de diferencia

Son muy laboriosas La tincin con plata

Agarosa No forma redes tan uniformes Permite separar molculas de ADN en un

intervalo muy grande Sencillo

METODOS PARA GELES DE AGAROSA

EQUIPO Cmara de electroforesis Fuente de poder Transiluminador de luz UV Equipo de fotografa

Para empezar:

Preparar buffer de corrida Con pH requerido TBE (Tris Boratos EDTA): estable y reusable. TAE (Tris Acetatos EDTA): menos estable pero permite

obtener mejor separacin de bandas

La concentracin de agarosa depender de los tamaos de fragmentos Si se desconoce el tamao, se puede iniciar con

agarosa al 1%

Rango efectivo de separacion (Kb) Agarosa (%)

30 -

1 0.5

12 -

0.8 0.7

10

0.5 1.0

7

0.4 1.2

3

0.2 1.5

La agarosa se disuelve en el mismo buffer que se utiliza para la corrida

Se calienta hasta ebullicin (evitar derramar) Dejar enfriar aprox. 60C Aadir bromuro de etidio Se intercala en las bases del ADN Brilla con luz UV Es mutgeno y altamente txico

Verter en el contenedor de geles Colocar peines para formar pozos Dejar enfrar y solidificar Agregar el buffer necesario hasta cubrir el gel

CARGANDO EL GEL

Colorante de corrida: llevan sustancia espesa (glicerol o sacarosa) que permite que la muestra caiga hacia el fondo del pozo

Colorantes: nos dan una idea de cmo van migrando los fragmentos

Cuando el gel est listo, se conectan los cables Cable rojo: polo positivo. Cable negro: polo negativo.

El ADN migrar hacia el polo + Se recomienda utilizar 5 volts por cada cm que exista

entre los dos electrodos (fragmentos grandes) Fragmentos pequeos se recomienda 90-100 V. Una cmara de 30 cm se correr a 150 V

GRACIAS POR SU ATENCIN

Elaboracin de mezcla para PCRELABORACIN DE MEZCLA PARA PCRSlide Number 2PCRPCRPCR: ingredientesPCR: aplicacionesPCR: Cmo funciona?PCR: desnaturalizacin PCR: extensinSlide Number 10Slide Number 11TIPOS DE TECNICASSlide Number 13Slide Number 14Qu se necesita para hacer un PCR?HACIENDO PCRSlide Number 17Slide Number 18Slide Number 19Qu hacer cuando todo empieza a fallar?Slide Number 21Slide Number 22GELES DE AGAROSAPrincipios bsicos de la electroforesisSlide Number 25Agarosa o acrilamida?Slide Number 27METODOS PARA GELES DE AGAROSAPara empezar:Slide Number 30Slide Number 31Slide Number 32CARGANDO EL GEL Slide Number 34Slide Number 35GRACIAS POR SU ATENCIN