ISBN 978-88-08-18626-3 XI

PRESENTAZIONE

Nata come scienza circa un secolo e mezzo fa, la Microbiologia (Biologia dei microrganismi) ha conosciuto negli ultimi sessanta anni una spe�acolare evo-luzione che ha contribuito in modo determinante a sviluppare l’a�uale visio-ne globale del mondo vivente e la comprensione, specialmente a livello mo-lecolare, di processi biologici fondamentali. Utilizzando microrganismi come principale modello di studio, sono state poste le basi di importanti discipline biologiche, quali la biochimica, la biologia molecolare e la genetica molecola-re; è stata decifrata la natura di DNA, RNA e proteine e sono state sviluppate le tecnologie che stanno alla base dell’ingegneria genetica e delle biotecnologie molecolari. Tappa �nale di questo percorso che ha a�raversato quasi tu�o il ventesimo secolo e che ha aperto nuovi orizzonti alla ricerca biologica è stato il sequenziamento del DNA e lo sviluppo degli approcci genomici allo studio dei sistemi biologici. La Microbiologia ha quindi via via assunto un ruolo sempre più rilevante tra le discipline biologiche, sia come disciplina specialistica, sia per la visione globa-le e uni�cante che riesce fornire del mondo vivente.

Questo libro tra�a fondamentalmente di microrganismi procarioti (ba�eri e archei), pur facendo continui richiami al mondo eucariote, e in particolare ai microrganismi eucarioti, per quanto riguarda le di�erenze nella stru�ura e nelle funzioni a livello cellulare, l’evoluzione molecolare e i rapporti �logene-tici fra i tre gruppi di microrganismi. Il testo è stato pensato in particolare per gli studenti dei corsi di Laurea triennali e magistrali in Scienze Biologiche e Biotecnologie avendo come riferimento gli insegnamenti di Microbiologia ge-nerale, Microbiologia cellulare e Microbiologia molecolare, ma la parte più ge-nerale del libro può essere utilizzabile anche da studenti di altri corsi di laurea scienti�ci.

Per venire incontro alle diverse esigenze dida�iche, il testo è suddiviso in quat-tro Sezioni di cui le prime due (Stru�ura e funzioni della cellula ba�erica e Crescita microbica e metabolismo) rappresentano la parte di base della Micro-biologia, mentre le altre due Sezioni (Genetica microbica e microbiologia mo-lecolare e Interazioni tra microrganismi e altri organismi) a�rontano aspe�i propri della microbiologia molecolare e cellulare. Questo tipo di organizzazio-ne vuole o�rire al docente e allo studente la possibilità di conoscere il mondo

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dei microrganismi ai due livelli stru�urale e funzionale da un lato e cellulare-molecolare dall’altro. In questo modo il docente può scegliere gli argomenti più ada�i agli insegnamenti della laurea triennale o magistrale, seguendo per-corsi diversi a seconda del tipo e del livello di insegnamento. Il testo si cara�erizza inoltre anche per altri aspe�i: •illivellodiaggiornamentoeapprofondimentodeivariaspettidellamicrobio-

logia al passo con i più recenti risultati delle ricerche microbiologiche, con un ampio materiale iconogra�co;

•la trattazionedi argomenti più specifici in apposite schededi approfondi-mento. Per alleggerire il testo, alcune di queste schede sono disponibili in una sezione on line sul sito della casa editrice [www.ceaedizioni.it] che in futuro potrà essere aggiornata e ampliata.

La stesura del testo si è avvalsa del prezioso contributo di numerosi docenti di discipline microbiologiche, che hanno messo a disposizione la propria compe-tenza nella tra�azione dei vari aspe�i della Microbiologia. A loro va un sentito ringraziamento per la pro�cua collaborazione. Ai Colleghi docenti che sceglieranno di ado�are questo testo e suggerirlo agli studenti come strumento di studio, chiediamo di farci avere commenti e sug-gerimenti che saranno utili in una futura revisione.

Gianni Dehò,Enrica Galli

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ORGANIZZAZIONE DEL VOLUME

Il volume è organizzato in qua�ro Sezioni

Sezione A – Stru�ura e funzioni della cellula ba�erica

Sezione B – Crescita microbica e metabolismo

Sezione C - Genetica ba�erica e biologia molecolare

Sezione D - Interazioni tra microrganismi e con altri organismi

Alcuni capitoli sono a loro volta suddivisi il parti, ad esempio il capitolo 2 è articolato cinque parti per meglio rappresentare la complessità dell’argomento.

2. STRUTTURA E FUNZIONI DELLE CELLULE PROCARIOTE

LA CELLULA BIOGENESI DEI RIVESTIMENTI BATTERICI E SECREZIONE DI MACROMOLECOLE APPENDICI ESTERNE IL PROTOPLASTO DIFFERENZIAMENTO CELLULARE NEI BATTERI

In ogni capitolo sono presentati argomenti di approfondimen-to so�o forma di schede autonome, fruibili dal le�ore anche separatamente e presentate in formato gra�co diverso per di-stinguerla facilmente dal testo corrente.Le schede di approfondimento possono essere di tre tipi, di-stinguibili anche gra�camente per il bordo colorato:

IL GENOMA DI BORRELIA BURGDORFERI

perdere i plasmidi dalle cellule. Questa perdita non sembra modificare la capacità del batterio di crescere in vitro, ma l’eliminazione di alcuni plasmidi riduce l’infettività sperimentale in se-guito a inoculazione del batterio in topolini. È possibile riprodurre in laboratorio le condizioni che incontrano i batteri quando vengono iniet-tati dall’insetto vettore in un mammifero. Nelle zecche e in vitro il batterio vive, infatti, a 23 °C,

Alcune specie del genere Borrelia (famiglia delle Spirochete) sono responsabili di malattie infetti-ve, note con il termine di borreliosi, trasmesse dagli animali all’uomo tramite insetti vettori. La Borrelia burgdorferi è l’agente eziologico della malattia di Lyme, un’affezione che colpisce pri-mariamente la pelle in seguito a una puntura di zecche (del genere Ixodes) infettate da questo batterio. La malattia si manifesta da 2 a 40 gior-ni dopo l’infezione con un eritema che tende a ingrandirsi e con sintomi di tipo influenzale. L’in-fezione può regredire spontaneamente mentre la diagnosi e il trattamento antibiotico ne per-mettono la guarigione. Il progredire dell’infezio-ne in persone non trattate con l’antibiotico può avere gravi conseguenze. L’infezione può pro-gressivamente colpire vari organi (cuore, artico-lazioni, encefalo, nervi periferici) per invasione diretta del batterio, che in alcuni individui può produrre una grave reazione autoimmune. Il serbatoio naturale della Borrelia burgdorferi sono gli animali selvatici (lepri, volpi, ungulati e uccelli), mentre la trasmissione all’uomo passa attraverso punture di zecche (del genere Ixodes) che a loro volta si sono infettate succhiando il sangue degli animali portatori.Per il biologo molecolare Borrelia burgdorferi è un batterio particolarmente interessante per l’insolita struttura e complessità del suo geno-ma. Questo è infatti costituito da un cromosoma lineare di circa una megabase e 21 plasmidi di cui 12 lineari e 9 circolari (fig. 8.10). Si tratta probabilmente del numero più alto di plasmidi diversi riscontrato finora in una cellula batte-rica. Lo studio del ruolo di questi plasmidi è stato facilitato dall’osservazione che la crescita continua dei batteri in terreni ricchi tende a fare

pH 8,0, mentre nel mammifero vive a 35 °C, pH 7,0. In seguito a transizioni termiche e di pH di colture batteriche in vitro, è stata osservata l’induzione di molte proteine che normalmente sono prodotte nell’ospite mammifero. La carat-terizzazione dei geni corrispondenti ha eviden-ziato che questi sono portati da plasmidi e che alcuni sono essenziali per la sopravvivenza del batterio durante il ciclo nell’ospite infettato.

Figura 8.10 IL GENOMA DI BORRELIA BURGDORFERI. La figura mostra il cromosoma lineare di 910 kb e i vari plasmidi lineari (lp) e circolari (cp).

Cromosoma lineare di 910 Kb

Plasmidi circolari

cp9 cp26 cp32 (1-9)

Plasmidi lineari

lp5

lp17

lp21

lp21

lp28-1 lp28-2lp28-2 lp28-3 lp28-4

lp36

lp39

lp54

lp56

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• leschedediapprofondimento generale, che si presentano con un bordo beige

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bactoprenolo pirofosfato, impedendo la trasloca-zione delle subunità disaccaridiche legate al pen-tapeptide dal citoplasma all’esterno della mem-brana citoplasmatica. Infatti il bactoprenolo, nella forma pirofosfato, non è più in grado di traslocare le subunità del peptidoglicano in quanto la forma attiva è solo quella monofosfato.Meccanismi di resistenza. La presenza della membrana esterna rende i batteri Gram negativi

meno sensibili a queste molecole. I principali mecca-nismi noti di resistenza alla bacitracina sono rappre-sentati da un sistema di estrusione dell’antibiotico (BcrABC) e da una undecaprenolo chinasi (BacA) che genera de novo l’undecaprenolo monofosfato. Nel sistema BcrABC le proteine BcrB e BcrC forma-no un canale transmembrana, mentre due proteine BcrA funzionano da ATPasi e forniscono energia per il trasporto.

Gli antibiotici che inibiscono la sintesi del peptidogli-cano agiscono a livello dei diversi stadi del processo di biogenesi che si svolgono come descritto nel pa-ragrafo 2.3.3.

Primo stadio Tra gli inibitori delle reazioni del primo stadio, due an-tibiotici sono stati particolarmente studiati: la fosfo-micina e la cicloserina. La fosfomicina (fig. 2.23a), analogo strutturale del fosfoenolpiruvato, si lega co-valentemente all’enzima piruviltransferasi che cata-lizza la reazione di condensazione del fosfoenolpiru-vato con l’UDP-N-acetilglucosamina con formazione di enoil-N-acetilglucosamina, precursore dell’acido N-acetilmuramico. La cicloserina (fig. 2.23b), analogo strutturale della D-alanina, interferisce con la sintesi del dimero D-alanil-D-alanina, inibendo l’enzima alanil racemasi che converte la L-alanina in D-alanina, e l’enzima D-alanil-D-alanina sintetasi che catalizza la formazione del legame peptidico tra due molecole di D-alanina. La mancata sintesi di questo dimero impedisce il completamento della catena pentapeptidica dell’acido N-acetilmuramico.

Secondo stadioLa bacitracina (fig. 2.23c) è un antibiotico polipep-tidico isolato da alcuni ceppi di Bacillus licheniformis nel 1945. La bacitracina si lega al suo bersaglio, il C

55-isoprenil pirofosfato o bactoprenolo, che funge

da carrier lipidico delle componenti della parete cellulare durante la sintesi del peptidoglicano. La bacitracina interferisce con la defosforilazione del

ANTIBIOTICI INIBITORI DELLA SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO – 1° E 2° STADIO

Figura 2.23 STRUTTURA DI TRE INIBITORI DELLA SINTESI DEL PEPTIDOGLICANO. a) Fosfomicina, b) cicloserina, c) bacitracina.

O

NH2HN

O

b) Cicloserina

PO

OHHO

O

CH3

a) Fosfomicina

H2N

O

N O

O

HNN

H

O

HNO

O

HNN

H

O

NH

O

HNO NH

OHN

O

O

O

OHO

H2N

NH2

N

NHHN

HN

S

OH

c) Bacitracina

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ISBN 978-88-08-18626-3504 GENETICA BATTERICA E MICROBIOLOGIA MOLECOLARE • CAP. 17 – TASSONOMIA, SISTEMATICA, FILOGENESI, EVOLUZIONE

STORIA DELLA CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI

vegetale, un nuovo regno che avesse pari dignità e uguale importanza. In quel periodo (1962) Roger J. Stanier e C.B. van Niel, che erano fra i pionieri nello studio dei batteri, scrissero, in un articolo intitolato “The con-cept of a bacterium”, quanto fosse «intellettual-mente frustrante, per un biologo, dedicare la sua vita allo studio di un gruppo di organismi che non può neppure essere descritto, in termini biologici, in modo chiaro e soddisfacente.»Questo segnò l’inizio di un importante lavoro di descrizione dei “batteri” come microrganismi dalle caratteristiche uniche rispetto agli altri organismi conosciuti e portò all’inclusione dei cianobatteri in questo nuovo regno che fu definito dei Procarioti.Si era tuttavia abbastanza lontani dalla visione che oggi si ha del mondo batterico, perché le tecnolo-gie esistenti al tempo non davano la possibilità di svolgere studi filogenetici e di attuare una classi-ficazione filogenetica.Van Niel, a un certo punto della sua vita, rinunciò a determinare una filogenesi microbica, optando per il sistema di classificazione determinativo che aveva, più che altro, lo scopo di aiutare gli studiosi a riconoscere le specie. Si mise da parte momentaneamente la classifica-zione filogenetica rivolgendosi a una tassonomia (noiosa e poco affascinante) che si basava sull’os-servazione e l’enumerazione di caratteristiche morfologiche e funzionali comuni. Era un sistema

Figura 17.5 PHYLA BATTERICI COME RIPORTATI DALLA SECONDA EDIZIONE DEL BERGEY’S MANUAL OF SYSTEMATIC BACTERIOLOGY. Il sito http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy riporta alcuni nuovi phyla che comprendono po-chi isolati ancora scarsamente caratterizzati (Elusimicrobia, Fusobacteria, Gemmatimonadetes, Synergistetes).

Per molti anni dopo la loro scoperta, i batteri sono sfuggiti alla tassonomia di tipo filogenetico che era stata sviluppata per gli organismi più complessi.Per studiosi come Martinus W. Beijerinck, Al-bert Kluyver e Cornelis B. van Niel, della scuola olandese di microbiologia (la più autorevole nella prima metà del XX secolo), la principale preoc-cupazione era stata la ricerca di queste relazioni naturali, che permettessero, per i batteri, come già avveniva per le piante e gli animali, di determinare relazioni evolutive.All’inizio del XX secolo si iniziò a sentire la necessità di strumenti adatti a classificare e identificare i bat-teri e fu allora che nacque il progetto del Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Sin dalla sua prima compilazione, che risale al 1923, lo scopo principale di questo manuale era quello di aiutare i ricercatori nell’identificazione di questi semplici microrganismi e nella definizione di nuove specie. Fin dalle prime pubblicazioni, il manuale rappresen-tò una grande opera di collaborazione internaziona-le che vide la pubblicazione di numerose edizioni, sempre più aggiornate e ampie (fig. 17.5). Per renderci conto di quanto sia stata grande e fa-ticosa quest’opera, pensiamo solo che, al tempo in cui ebbe inizio il progetto, la natura della cellula bat-terica non era neppure riconosciuta e che, fino alla preparazione della settima edizione (1957), non si era ancora fatta strada l’idea che i batteri potessero costituire un regno separato da piante e animali. I batteriologi (cioè gli studiosi dei batteri) si riunivano ai congressi botanici e i batteri erano classificati, in base alle regole del Botanical Code of Nomen-clature (un codice botanico di nomenclatura), come Schizomycetes. Inoltre nessuno pensava che le Cyanophyceae potessero essere dei batteri. Venivano considerate una famiglia di alghe (le Schyzophycieae) ed erano classificate nel regno delle piante. Nell’introduzione alla settima edizione del Ber-gey’s Manual of Determinative Bacteriology, si cominciarono, però, a riportare opinioni piuttosto innovative sulla natura di questi organismi micro-scopici, per i quali i criteri tassonomici classici erano difficili da applicare. Secondo Everitt G.D. Murray la cosa più corretta sarebbe stata clas-sificarli in un regno diverso dai regni animale e

del quale nessuno era più convinto anche se fu l’unica via percorribile fino alla comparsa delle nuove tecnologie del DNA ricombinante.Anche per gli studiosi di evoluzione era un compito difficile lavorare sui batteri, ma i ricercatori erano con-sapevoli che, determinando le relazioni filogenetiche fra i batteri, non solo si sarebbe completato il “pro-gramma darwiniano”, estendendo le conoscenze a tutte le forme di vita della terra, ma considerando che i batteri sono presenti sulla terra da miliardi di anni, si sarebbe aperto un enorme “serbatoio di conoscenze” che conteneva in sé la chiave per comprendere l’origine della cellula eucariotica.I metodi di analisi erano ancora poco sviluppati e so-lamente le conoscenze sulla fisiologia, il metabolismo e la morfologia dei batteri potevano venire in aiuto.In questa prospettiva si iniziò a lavorare a una nuova edizione del Manuale in cui fossero ampliate le infor-mazioni sui vari batteri con note sul loro isolamento e mantenimento in coltura, con descrizioni più ap-profondite sulla morfologia e sul metabolismo. Questo nuovo manuale fu chiamato Bergey’s Ma-nual of Systematic Bacteriology e fu stampato in 4 volumi nei quali i taxa batterici erano divisi in modo rispondente a caratteristiche fenotipiche e genotipiche, ma erano ancora ignorati i criteri di classificazione filogenetica che cominciarono ad essere applicati solo con la seconda edizione, al momento solo in parte pubblicata.

1. Aquificae

2. Thermotogae

3. Thermodesulfobacteria

4. Deinococcus-Thermus

5. Chrysiogenetes

6. Chloroflexi

7. Thermomicrobia

8. Nitrospirae

9. Deferribacteres

10. Cyanobacteria

11. Chlorobi

12. Proteobacteria

13. Firmicutes

14. Actinobacteria

15. Planctomycetes

16. Chlamydiae/Verrucomicrobia group

17. Spirochaete

18. Fibrobacteres

19. Acidobacteria

20. Bacteroidetes

21. Fusobacteria

22. Verrucomicrobia

23. Dictyoglomi

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Per non appesantire eccessivamente il volume, alcuni appro-fondimenti [schede e alcune tabelle del capitolo 17] sono di-sponibili on line sul sito microbiologia.tes�ube.itIn�ne nel testo si trovano riferimenti al sito microbiologia.tes�ube.it indicati con una freccia → o semplicemente l’in-dicazione www in rosso. Nelle pagine dedicate a questo libro si trovano, oltre agli approfondimenti citati, news dal mondo scienti�co e veri e propri esercizi di Laboratorio simulati.

• leschededitipo tassonomico, che si presentano con un bordo azzurro chiaro

• leschederelativeagliantibiotici, di colore rosa.

Per accedere al sito e usufruire dei contenuti:1. digitare h�p:/microbiologia.tes�ube.it

2. registrarsi a questa sezione del sito, se già non l’hai fa�o in precedenza, cliccando su “accedi all’area riservata”, quin-di “nuovo utente” e compilando il form relativo

3. una volta registrati, ripetere il passo 1. e andare in “tuo pro-�lo”; inserire nell’apposito campo la chiave alfanumerica, qui so�o riportata, e seguire le istruzioni

4. rientrare nel sito per accedere ai contenuti collegati a questo libro, al laboratorio o alle news

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