Dr. Martina Galatola

3° Congresso Nazionale AIC

“CELIACHIA E TERAPIA»

Roma, 7 Novembre 2014

PREVENZIONE DELLA CELIACHIA: IDENTIFICAZIONE DEI FATTORI DI

RISCHIO

L’ HLA è una condizione necessaria ma non sufficiente per la suscettibilità alla celiachia

Il 95% dei celiaci è portatore di almeno una molecola a rischio DQ2 e/o DQ8, tali molecole sonopresenti anche nel 30-35% della popolazione generale.

1. RISCHIO GENETICO: IDENTIFICAZIONE DEI GENI CHE PREDISPONGONO ALLA CELIACHIA

GENI NON-HLA:

LPP , RGS1, REL

1) Studi associazioneCASO-CONTROLLO (GWAs)

43 geni

2) Studio di associazione familiare-Sono stati analizzati 11 SNPs

-maggiormante replicati-funzionalmete plausibili

Procedura: L’utilizzo dell’approccio Bayesiano per calcolare sulla base dell’HLA e del

genotipo dei tre SNP , uno score di rischio per ogni soggetto

Predizione: i soggetti che hanno uno score arbitrario di rischio più alto hanno

maggiore probabilità di sviluppare la celiachia.

Risultato:Riclassificazione dei soggetti

Score di Bayes per le possibili combinazioni aplotipiche (HLA + 3 SNPs) presenti nella coorte

di studio

0,00

50,00

100,00

150,00

200,00

250,00

300,00

350,00

2 3 3 3,5 3,75 4 4,25 4,5 4,75 5 5,5 6

DQ22

DQ2T

DQ2

DQ8

NODQ

No Dq2 or DQ8

Double DQB1*02

DQ8

N° di alleli di rischio “A”

Aumento del rischio a priori per classe HLA sommando gli alleli di rischio “A” per i 3 SNP analizzati

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

0,35

2,00 3,00 3,00 3,50 3,75 4,00 4,25 4,50 4,75 5,00 5,50 6,00

Sco

re

N° di alleli di rischio “A”

DQ22

DQ2T

DQ2

DQ8

DQ--

Rischio a posteriori per classe HLA sommando gli alleli di rischio “A”

•DQ2 omozigote: 21% � 30%

•DQ2 in trans: 17% � 26%

•DQ2 eterozigote: 6% � 17%

•DQ8: 5% � 13%

•DQ negativi: 0.6% � 5%

Percentuali di rischio in baseall’HLA rispetto all’aggiuntadegli alleli di rischio per i treSNP associati.

Tre geni non-HLA: LPP, cREL, RGS1 hanno costituito un modello predittivo per la stimadel rischio di sviluppare la malattia celiaca

Obiettivo: validare in una nuova coorte il modello predittivosviluppato nel nostro precedente studio

WORK IN PROGRESS…

PROGETTO BIOCEL

194FAMIGLIE

155 che rispettano i criteri:o Un figlio celiacoo Entrambi i genitorio Almeno un fratello

128o Genotipizzazione HLAo Genotipizzazione dei tre SNPs non-

HLA • LPP• RGS1• cREL

71 analizzate 293soggetti

102Celiaci

191 Sanio Valutazione del rischio Bayesiano per la costituzione del modello

predittivo

COORTE BIOCEL

71 Probandi

31 Familiari

MODELLO DI RISCHIO

Fratello di un celiaco

HLA

BASSO RISCHIOALTO RISCHIO

HLA DQ2 eterozigote; DQ8;

DQ negativi

HLA DQ2 omozigoteo DQ2 in trans 2

Fratello di un celiaco

HLA

SB LPP,

RGS1, REL

ALTO RISCHIO BASSO RISCHIO

SB ≥ mediana SB < mediana

HLA DQ2 omozigoteo DQ2 in trans 2 HLA DQ negativi

HLA DQ2 in trans; DQ2 eterozigote; DQ8;

Soggetti in esame

Rischio HLA

Rischio NON-HLA

Combinazione rischio

HLA + NON-HLA

101 fratelli

BASSOClasse G5

20

INTERMEDIOClassi G3-G4

48

ALTOClasse G1-G2

33

ALTO

Score bayes ≥ mediana

26

ALTO33+26=

59

BASSO20+22=

42

BASSO

Score bayes < mediana

22

RISULTATI

H L A Gruppo di appartenenza predetto

Sani Malati

Gruppo di reale appartenenza

Sani 151 (79%) 40 (21%) 191

Malati 15 (48%) 16 (52%) 31

H L A +3 SNP

Gruppo di appartenenza predetto

Sani Malati

Gruppo di reale appartenenza

Sani 114 (60%) 77 (40%) 191

Malati 5 (16%) 26 (84%) 31

CONCLUSIONI

� Il modello predittivo dai noi proposto ha dimostrato un piùalta sensibilità rispetto al solo HLA e quindi una migliorecapacità di individuare i soggetti affetti (26Vs 16)

� Più elevato potere predittivo negativo rispetto al solo HLA(96% Vs 90%) e quindi la capacità di individuare i soggettimeno predisposti nonostante abbiano un fratello celiaco

� Questo approccio lascia ben sperare nel suo potenzialeidentificativo dei soggetti non a rischio, che verrebbero cosìeliminati dal follow-up.

2. ESPRESSIONE DI GENI IDENTIFICATI DASTUDI DI ASSOCIAZIONE

I Step:Analisi dell’espressione genica dei geni candidati in pazienti celiaci e controlli sani in diversitessuti umani:

•Mucosa intestinale•Monociti isolati da sangue periferico

La genomica da sola è in grado di spiegare solouna quota della componente genetica dellaceliachia, la rimanente percentuale èattribuibile a meccanismi di epigenetica:

•Regolazione dell’espressione genica

•Metilazione del DNA

•Azione di micro-RNA

IL NOSTRO STUDIO

Esplorare i livelli di espressione genica in un set di geni candidati in:

• Mucosa Intestinale: di 9 controlli, 9 CD and 6 CD a GFD

• Monociti di sangue periferico: di 18 controlli, 17 CD, 5 CD a GFD, e11 pazienti affetti dal morbo di Crohn.

ANALISI DISCRIMINANTE IN MUCOSA INTESTINALE

Lo scopo dell’analisi discriminante è quello di “pesare” la capacità di ogni singolo gene, didiscriminare tra due gruppi di individui (es. CD e CTR)

Predicted Group MembershipTotal

STATUS Control CeliacCount Control 19 (95%) 1 (5%) 20

Celiac 2 (10%) 20 (90%) 22

92,9% DEI GRUPPI ORIGINALI

E’ CLASSIFICATA CORRETTAMENTE!

CTR

CD

Step

Candidate

genes

Wilks’

Lambda

Exact F

Statistic p value

1 TNFAIP3 0.404 59.002 <0.001

2 IL-21 0.300 45.521 <0.001

3 c-REL 0.261 35.809 <0.001

4 RGS1 0.235 30.143 <0.001

5 LPP 0.222 25.272 <0.001

ANALISI DISCRIMINANTE IN MONOCITI DI SANGUE PERIFERICO

Abbiamo sviluppato una analisi discriminate simile alla precedente per i monociti di sangue periferico

IL 95.5% DEI PAZIENTI (91% DEI CONTROLLI E IL 100%

DEI PAZIENTI CELIACI) SONO CLASSIFICATI CORRETTAMENTE!

StepCandidate

genes

Wilks’

Lambda

Exact F

Statistic p value

1 c-REL 0.138 68.711 <0.001

2 LPP 0.090 50.848 <0.001

3 TNFAIP3 0.062 45.461 <0.001

4 KIAA1109 0.048 39.597 <0.001

Predicted Group

Membership

Control Celiac Total

Real Group

Membership

Control 10 (91%) 1 (9%) 11

Celiac 0 (0%) 9 (100%) 9

Total 10 10 20

Il D-Score per i pazienti celiaci assume valori negativi, mentre per tutti i reastanti gruppi di soggetti(CTR, GFD-CD e pazienti Crohn) presenta valori positivi e nettamente clustrizzati.

ANALISI DISCRIMINANTE IN MONOCITI DI SANGUE PERIFERICO

Celiac

CONCLUSIONI

• Abbiamo ottenuto un’interessante evidenza, circa la possibile relazione che intercorretra l’espressione dei geni candidati nella mucosa duodenale e nei monociti di sangueperiferico.

•L’analisi di espressione su singolo gene non permette di evere una visione d’insieme suimeccanismi patyogenetici alla base della CD. Mentre con un’approccio basato sull’analisidiscriminante è stato possibile mettere in evidenza il coinvolgimento di diversi pathwaycellulari nell’alterata risposta al glutine.

• Noi suggeriamo che l’anlisi di un piccolo numero di geni, (senza considerare HLA e daticlinici) possa contribuire alla corretta identificazione dei soggetti a rischio, gettando lebasi per una futura diagnosi molecolare di CD.

• Identificare il potenziale ruolo diagnostico dei geni candidati dellamalattia celiaca utilizzando cellule mononucleate di sangue periferico

• Analizzare le variazioni di espressione longitudinalmente nel singolosoggetto

• Cercare di individuare eventuali correlazioni genotipo/fenotipo

WORK IN PROGRESS…ESPRESSIONE LONGITUDINALE DI GENI CANDIDATI NELLA MALATTIA CELIACA

TIMING

10 PAZIENTI CD

� T1= 3-12 mesi (pre-diagnosi)

� T2= 12-24mesi (età della diagnosi)

� T3= >24 mesi (dieta senza glutine da almeno 12 mesi)

T1 T2 T3

12 CONTROLLI• T1= 3-12 mesi• T2= 12-24 mesi• T3= >24 mesi

• Livelli di espressione dei geni candidati• Genotipo degli SNP associati• Parametri Clinici

ANALISI DISCRIMINANTE PER GLI APLOTIPI DEI GENI CANDIDATI + HLA

Passo Inserite

Lambda di Wilks

Statistica df3 Statistica Sig.1 SH2B3_Genotype ,524 20,000 18,182 ,0002 RGS1 _Genotype ,354 20,000 17,307 ,0003 TNFRSF14_ Genotype ,278 20,000 15,552 ,000

Risultati della classificazione

Staus

Gruppo di appartenenza previsto

TotaliCD ControlOriginale Conteggio CD 9 (90%) 1 (10%) 10 (100%)

Control 1 (8.3%) 11 (91.7%) 12(100%)

90,9% DI CASI RAGGRUPPATI ORIGINALI CLASSIFICATI

CORRETTAMENTE.

ANALISI DI ESPRESSIONE GENICA PRIMA DELLA DIAGNOSI

ANALISI DISCRIMINANTE PER L’ESPRESSIONE AL TIME PRE-DIAGNOSIDEI GENI CANDIDATI

95,5% DI CASI SONO STATI CLASSIFICATI CORRETTAMENTE.

StepVariables

Wilks’

Lambda

Exact F

Statistic p value

1 SH2B3_ T1 ,773 5,882 ,025

2 TAGAP_ T1 ,559 7,506 ,004

3 TNFSF14_T1 ,453 7,253 ,002

4 RGS1_T1 ,369 7,279 ,001

Predicted Group

MembershipCD Control Total

Real Group

Membership

CD 10 (100%) 0 (0%) 10

Control 1 (8.3%) 11 (91.7%) 12

Total 11 11 22

ANALISI DISCRIMINANTE JACKKNIFE PER TUTTE LE VARIABILI STUDIATE

100,0% DI CASI SONO STATI CLASSIFICATI CORRETTAMENTE.86,4% DI CASI RAGGRUPPATI CROSS-VALIDATI CLASSIFICATI CORRETTAMENTE

StepVariables

Wilks’

Lambda

Exact F

Statistic p value1 SH2B3_Genotype ,524 18,182 ,0002 RGS1_Genotype ,354 17,307 ,0003 TNFRSF14_Genotype ,278 15,552 ,0004 SH2B3_T1 ,261 12,064 ,0005 cREL_T1 ,224 11,112 ,0006 cREL_Genotype ,191 10,589 ,0007 RGS1_T1 ,161 10,443 ,0008 TAGAP_T1 ,146 9,487 ,000

Predicted Group

MembershipCD Control Total

Real Group

Membership

CD 10 (100%) 0 (0%) 10Control 1 (8.3%) 11 (91.7%) 12

Total 11 11 22

Cross-validated

CD 9 (90%) 1 (10%) 10Control 2 (16.7%) 10 (83.3%) 12

Total 11 11 22

CONCLUSIONI…

• L’analisi di espressione longitudinale ha parzialmente confermato lostudio dei monociti

• L’analisi discriminante ha permesso di discriminare i pazienti celiacigià al T1 e quindi almeno 6 mesi prima la comparsa della sierologiae della sintomatologia!

GRAZIE PER L’ATTENZIONE!

MUCOSA INTESTINALE

P<0.05P<0.05

P<0.05

• SH2B3• TAGAP• TNFSF14

• TNFRSF14• TNFAIP3• RGS1

Confermando quanto già presente in letteratura…•IL-21 è up-regolata nei pazienti CD•IL-2, KIAA1109 non mostrano variazioni di espressione significative•cREL è down-regolata nei pazienti CD

P<0.05

P<0.05

MUCOSA INTESTINALE

MONOCITI DI SANGUE PERIFERICO

The expression of candidate genes in monocytes:

• KIAA1109 gene was over-expressed in CD, Crohn and CD-GFD vs controls• c-REL was lower in CD monocytes• SH2B3 was lower in CD monocytes• LPP expression was lower in CD monocytes• TNFAI3 mRNA showed a modest diminution in CD patient among control and CD-GFD• RGS1 was lower in CD monocytes

P<0.05

cREL

TNFAIP3

IL21

RGS1

LPP

KIAA1109

GENI COINVOLTI NELLA REGOLAZIONEDEL PATHWAY NFKB

CRUCIALE NELL’ATTIVAZIONE DELLARISPOSTA GLUTINE-INDOTTA DELLECELLULE –T CD4+

COINVOLTO NELLA REGOLAZIONEDELL’ADESIONE E NELLA MORFOLOGIACELLULARE

CONTROLLO DELL’HOMING DELLINFOCITI INTRAEPITELIALI

COINVOLTO NEL DIFFERENZIAMENTODELLE CELLULE-T CD4+ NAÏVE IN CELLULETH17

•NFkB PATHWAY

•ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI NK

•ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI INTRAEPITELIALI

•REGOLAZIONE DELL’ADESIONE CELLULARE

•DIFFERENZIAMENTO DELLE CELLULE T

QUAL’E’ LA “NOSTRA” IPOTESI BIOLOGICA?

DIFFERENTI PATHWAYS

PATOGENETICI

cREL AND TNFAIP3…REGULATORS OF NFkB

TNFAIP3

cREL

•Just 6 hours after gluten exposure the NF-kB complex is fully activated.

•cREL is one of the subunit of the complex

•TNFAIP3 acts in a negativefeedback loop to control NF-kB-dependent geneexpression

RGS1: REGULATOR OF THE HOMING IEL

RGS1

•Elevated RGS1 levels profoundly reduce T cell migration to lymphoid-homingchemokines, whereas RGS-1 depletion selectively enhances such hemotaxis ingut T cells.

•Its capacity to limit egress of inflammatory and/or autoimmune cells could clearlypromote immunopathology.

LPP: AN INTEGRAL COMPONENT OF CELL

MIGRATION.

•LPP gene appears to have arelevant activityas celladhesion strength is an integralcomponent of cell migration.

•Regulation of LPP expressionresults in a increase ordecrease, respectively, in cellmigration.

IL-21: A CRUCIAL ROLE IN THE ACTIVATION OF THE

GLUTEN-INDUCED CD4 CELLS

IL-21

IL-21

IL-21

KIAA1109: TH17 CELLS DIFFERENTIATION

• The KIAA1109 gene islocated in the regionencompassingKIAA1109/Tenr/IL2/IL21 inchromosome 4q27, manytimes replicated inassociation studies OF CD.

• This cluster region isinvolved differentiation ofnaïve human CD4+ T cellsinto Th17 cells, whichproduce a variety ofcytokines including IL-17A,IL-17F, IL-21 and IL-22.

• Genetic alterations in the4q27 locus could results innon-functional IL-21 andhence lack of IL-17A or vice

KIAA1109/Tenr/IL2/IL21

APOC3

CYP3A3

OCLN

MAD2L1

MKI67

CXCL11

IL17A

CTLA4

MARKERS FOR VILLOUS ATROPHY

ASSOCIATED WITH CELLPROLIFERATION, MARKERS OF CDWITH MORPHOLOGIC CHANGE

TRANSMEMBRANE TIGHT JUNCTIONPROTEIN, CONTRIBUTES TO THEEPITHELIAL BARRIER

ASSOCIATED CHRONIC INFLAMMATORY AND AUTOIMMUNE DISEASES

PARTICIPATES IN THE REGULATION OF T-LYMPHOCYTE MEDIATED INFLAMMATORY RESPONSES,

CHEMOKINE ANTAGONIST OF THE CCR3 RECEPTOR

PREVIOUS RESULTS….

INFLAMMATION!!!

INFLAMMED MUCOSAVS

NORMAL MUCOSA

Bradge H et al. 2011

ANALISI DEI GENOTIPI DEI GENI CANDIDATI

SNP Locus Alleles M.A.F. FREQ CD FREQ CTR χ2 p value

rs2816316 RGS1 C/A 0.160 AA 0% (0) AC 60% (6) CC 40% (4)AA 16,7% (2) AC 75% (9) CC 8,3%

(1)1,691 0,193

rs3748816 TNFRSF14 C/A 0.477 AA 30% (3) AC 70% (7) CC 0% (0)AA76,9% (10) AC 22,2% (2) CC 0%

(0)6,418 0,011

rs842647 REL A/G 0.482 AA 90% (9) AG 0% (0) GG 10% (1)AA 66,7% (8) AG 33,3% (4) GG 0%

(0)4,918 0,086

rs1464510 LPP C/A 0.453 AA 30% (3) AC 50% (5) CC 20% (2)AA 25% (3) AC 58,3% (7) CC 16,7%

(2)0,153 0,926

rs1315196

1KIAA1109 A/G 0.066 AA 60% (6) AG 40% (4) GG 0% (0)

AA 62,5% (10) AG 33,3% (2) GG 0%

(0)1,497 0,221

rs2327832 OLIG-TNFAIP3 A/G 0.102 AA 70% (7) AG 30% (3) GG 0% (0)AA 83,3% (10) AG 8,3% (1) GG

8,3% (1)2,367 0,306

rs1738074 TAGAP A/G 0.441 AA 90% (9) AG 10% (1) GG 0% (0)AA 66,7% (8) AG 33,7% (4) GG 0%

(0)4,253 0,119

rs3184504 SH2B3 G/A 0.218 AA 100% (10) AG 0% (0) GG 0% (0)AA 33,3% (4) AG 66,7% (8) GG 0%

(0)10,476 0,001

rs2279627 TNFSF14 C/G 0.295 CC 30% (3) CG 40% (4) GG 30% (3)CC 50% (6) CG 33,3% (4) GG 16,7%

(2)1,027 0,598