HBoD, Zagreb, 27. studenog 2014.

Pridružujuće kartiranje od Q do K:Studija slučaja hrvatskih endemičnih kadulja

Jerko GunjačaSveučilište u Zagrebu, Agronomski fakultete-mail: jgunjaca@agr.hr

(A) Oplemenjivanje bilja i QTL-i

(B) Pridružujuće kartiranje

(C) Studija slučaja: Ljekovita kadulja

Pridružujuće kartiranje od Q do K:Studija slučaja hrvatskih endemičnih kadulja

(A) Oplemenjivanje bilja i QTL-i

udomaćenje – proces kultiviranja divljih biljnih vrsta odabirom na temelju svojstava koja ih čine pogodnima za uzgoj i iskorištavanje

suvremeno oplemenjivanje – (post) Mendelovo doba, primjena genetike i drugih znanstvenih disciplina

lokusi za kvantitativna svojstva (QTL) – većina svojstava čije se poboljšanje nastoji postići oplemenjivanjem karakterizira kontinuirana varijabilnost koja je posljedica poligenog nasljeđivanja

Udomaćenje

Proces koji je započeo prije 9.000 – 11.000 godina, itrajao nekoliko tisuća godina.

Usporedno s odabirom pogodnih biljnih vrsta,morali su se razviti i poljoprivredni alati.

Plodni polumjesec –udomaćenje žitarica iz porodice trava: pšenice, ječma

Ječam

Prvobitni odabir tri svojstva važna za udomaćenje:

1. (ne)lomljivi klas (Bt1 i Bt2)

2. dva reda – šest redova (vrs1)

3. golo zrno

Suvremeno oplemenjivanje – II Zelena revolucija

Norman Borlaug(1914-2009)

Nobelova nagrada za mir 1970. godine

CIMMYT

Pšenica:– dvije žetve – fotoperiodizam

– patuljasti rast – višelinijska otpornost

grah – 131 primka iz HBBG

boja cvijeta

širina liske

Kvalitativna i kvanitativna svojstva

Potraga za QTL-ima…(1)

0

500

1000

1500

2000

2500

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

106

111

116

121

126

131

136

141

146

151

156

161

166

171

176

181

186

191

196

201

206

211

216

221

226

1/P

1/P adj

veliki broj gena relativno malog učinka

kartiranje lokusa uz pomoć molekularnih biljega i genskih karata

za izradu karata nužan razvoj specifičnih populacija (biparentalna križanja)

Potraga za QTL-ima…(2)

0

500

1000

1500

2000

2500

1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81 86 91 96 101

106

111

116

121

126

131

136

141

146

151

156

161

166

171

176

181

186

191

196

201

206

211

216

221

226

1/P

1/P adj

cilj: geni s relativno velikim učinkom!

glavni nedostatak analize QTL-a na temelju populacija za kartiranje je slaba razlučivost uslijed premalog broja rekombinacijskih događaja tijekom razvoja populacija

zbog toga čak i dijelovi kromosoma koji su međusobno vrlo udaljeni ostaju povezani, tj. nasljeđuju se zajedno

povećanje preciznosti može se postići pridružujućim kartiranjem

Potraga za QTL-ima…(3)

(B) Pridružujuće kartiranje

ne zahtjeva razvoj posebnih populacija za kartiranje

nužna visoka razina zasićenosti genoma molekularnim biljezima, odnosno gustoće njihovog smještaja unutar genoma

potrebni intenzitet gustoće može se procijeniti prema stupnju opadanja neravnoteže vezanosti

Neravnoteža vezanosti (LD)

nasljeđivanje alela sa različitih lokusa koje nije nezavisno

Lokus A

Lokus B P(A)=pA P(a)=qA

P(B)=pB P(AB)=pApB+D P(aB)=qApB-D

P(b)=qB P(Ab)=pAqB-D P(ab)=qAqB+D

Statistički model

krajnje pojednostavnjeno, fenotip je zbroj djelovanja genotipa i okoline:

P = G + E

kod kvantitativnih svojstava, genotipski učinak je zbroj djelovanja velikog broja gena malog pojedinačnog učinka (QTL-a)

stoga se ukupni genotipski učinak može rastaviti na niz učinaka pojedinačnih gena

Model jednog biljega

…je mješoviti model oblika:

Yi = Mki + Gi + eij

Mk je učinak pretpostavljenog QTL-a povezanog s molekularnim biljegom (fiksni efekt), a Gi učinak ostalih gena, odnosno genetsko zaleđe (slučajni efekt)

modeliranje se provodi zasebno za svaki biljeg, primjenom standardnih statističkih programa s paketima ili modulima za mješovite modele – R/ASREML, SAS...

Lažne asocijacije

genetski uzroci: strukturiranost eksperimentalne populacije – razlike u alelnim

frekvencijama između subpopulacija

različiti stupanj srodnosti genotipova – različite korelacije/kovarijance fenotipova

uklanjanje lažnih asocijacija – modifikacija modela daljnjim raščlanjivanjem genotipskog učinka vodeći računa o strukturi i srodnosti

Struktura populacije ječma (PCA, SNP)

-40 -30 -20 -10

-20

-10

010

20

pcal$PC1

pcal

$PC

2

06AB-36

06AB-45

06AB-1206AB-0706AB-02

06AB-2506AB-28

06AB-08

06AB-4206AB-43

06AB-2406AB-27

06AB-05

06AB-0406AB-01

06AB-10

06AB-1606AB-13

06AB-21

06AB-37

06AB-22

06AB-4406AB-26

06AB-35

06AB-20

06AB-3106AB-23

06AB-38

06AB-34

06AB-33

06AB-1706AB-14

06AB-15

06AB-30

06AB-29

06AB-11

06AB-06

06AB-46 06AB-09

06AB-3206AB-19

06AB-41

06AB-4006AB-39

06AB-47

06AB-18

06AB-03

METCALFE

BARONESSE

CONLON

CONRAD

DRUMMOND

ESLICK

HARRINGTON

HAXBY

LACEY

MERIT

MOREX

06MT-01

06MT-0206MT-0306MT-0406MT-9506MT-0506MT-0606MT-0706MT-08

06MT-09

06MT-10

06MT-11

06MT-12

06MT-1306MT-14

06MT-15

06MT-16

06MT-17

06MT-18

06MT-1906MT-20

06MT-21

06MT-22

06MT-2306MT-24

06MT-25

06MT-26

06MT-96

06MT-27

06MT-28

06MT-29

06MT-3006MT-3106MT-3206MT-33

06MT-34

06MT-35

06MT-3606MT-37

06MT-3806MT-3906MT-40

06MT-41

06MT-4206MT-43

06MT-44

06MT-45

06MT-46

06MT-47

06MT-4806MT-49

06MT-50

06MT-51

06MT-5206MT-53

06MT-54

06MT-55

06MT-56

06MT-57

06MT-5806MT-59

06MT-6006MT-61

06MT-62

06MT-63

06MT-64

06MT-6506MT-66

06MT-67

06MT-68

06MT-69

06MT-70

06MT-7106MT-72

06MT-73

06MT-7406MT-75

06MT-7606MT-77

06MT-78

06MT-79

06MT-80

06MT-81

06MT-82

06MT-8306MT-84

06MT-85

06MT-86

06MT-87

06MT-88

06MT-89

06MT-90

06MT-91

06MT-92

06MT-93

06MT-94

06N2-01

06N2-02

ND21863

06N2-0306N2-04

06N2-05

06N2-06

06N2-07

06N2-08

06N2-0906N2-10

06N2-1106N2-12

06N2-13

06N2-1406N2-15

06N2-16

06N2-17

06N2-18

06N2-19

06N2-2006N2-21

06N2-2206N2-23

06N2-24

06N2-25

06N2-26

06N2-27

06N2-2806N2-29

06N2-30

06N2-3106N2-32

06N2-33

06N2-34

06N2-35

06N2-36

06N2-37

06N2-38

06N2-39

06N2-40

06N2-4106N2-42

06N2-43

06N2-44

06N2-45 06N2-46

06N2-4706N2-48 06N2-49

06N2-50

06N2-51

06N2-52

06N2-5306N2-54

06N2-5506N2-56

06N2-57

06N2-58

06N2-59

06N2-60

06N2-6106N2-62

06N2-63

06N2-64

06N2-65

06N2-66

06N2-6706N2-68

06N2-69

06N2-7006N2-7106N2-7206N2-73

06N2-7406N2-75

06N2-76

06N2-77

06N2-78 06N2-79

06N2-80

06N2-81

06N2-82

06N2-83

06N2-8406N2-85

06N2-86

06N2-8706N2-88

06N2-89

06N2-90

06N2-91 06N2-92

06N2-93

06N2-94

06N2-9506N2-96

RAWSON

ROBUST

TRADITION

Model jednog biljega + Q

…uključuje i (fiksni) efekt strukture populacije Q:

Yi = Mki + Qi + Gi + eij

struktura populacije Q može se definirati pomoću molekularnih biljega: Bayesovskim pristupom – program STRUCTURE

(Pritchard et al. 2000)

analizom glavnih komponenti (Price et al. 2006)

Q + K model (Yu et al. 2006)

…uključuje i matricu srodnosti K:

Yi = Mki + Qi + GiK + eij

K se koristi kao matrica varijanci-kovarijanci slučajnog učinka genotipa i može se definirati: pomoću molekularnih biljega:

izračunavanjem koeficijenta srodnosti (SpaGeDi – Hardy i Vekemans, 2007)

izračunavanjem genetskih udaljenosti (Stich et al. 2008)

pomoću pedigrea

Statistički pristup uklanjanju lažnih asocijacija

statistički uzrok: 1 biljeg = 1 model – provođenje velikog broja testova koji nisu međusobno nezavisni

uklanjanje lažnih asocijacija: Bonferronijeva korekcija

stopa lažnih otkrića (FDR): Benjamini and Hochberg (1995)

Storey (2002)

FDR (Benjamini i Yekutieli, 2005)Biljeg P k Padj = *k/m diff = P - Padj

168 0,00042 1 0,00044 -0,00003

217 0,00049 2 0,00088 -0,00040

218 0,00049 3 0,00133 -0,00084

172 0,00104 4 0,00177 -0,00073

190 0,00110 5 0,00221 -0,00112

165 0,00133 6 0,00265 -0,00132

220 0,00195 7 0,00310 -0,00114

221 0,00229 8 0,00354 -0,00125

77 0,00235 9 0,00398 -0,00163

80 0,00235 10 0,00442 -0,00207

75 0,00357 11 0,00487 -0,00130

79 0,00357 12 0,00531 -0,00174

167 0,00392 13 0,00575 -0,00183

175 0,00503 14 0,00619 -0,00116

170 0,00629 15 0,00664 -0,00035

169 0,00654 16 0,00708 -0,00054

88 0,00811 17 0,00752 0,00059

219 0,01089 18 0,00796 0,00292

117 0,01254 19 0,00841 0,00413

F-test za učinak biljega, korigiran na FDR od α = 0,1

(C) Studija slučaja: Ljekovita kadulja

25 populacija

4/559 AFLP

8/161 SSR

62/8 komponente ulja

Struktura populacije kadulja

P01

CROATIA

HungarySlovenia

P02

P03 P04

P05

P06

P07

P08

P09

P10

P11

P12

P13

P14P16

P15P17

P18P19

P20P21

P22 P23

P24P25

Bosnia and Herzegovina

A: North AdriaticB: Middle AdriaticC: South Adriatic

Cluster:

Kemotipovi

camphene

1,8-cineole

camphorP01P02

P04

P05

P06

P07

P08P09

P10

P11

P12

P13

P14

P16

P17

P18

P19

P20

P21

P22

P23

P24

P25-pinen

cis-thujone

trans-thujone

borneolbornyl acetate

P03

P15

-1.0

-0.5

0.5

1.0

1.5

-2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.5 1.0 1.5

PC1 (46.78%)

PC2

(18.

09%

)

A: cis-thujoneB: trans-thujoneC: camphor

Chemotype:

Povezanost biljega i lokusa za komponente ulja

Tab. 1. The eight main essenital-oil compounds in 25 Dalmatian sage populations and the number of significantly associated AFLP markers identified by the simple model and K+Q model

No Compound Average Range

No. of significant AFLP markers(P < 0.01)

Simple model K+Q model

1 cis-thujone 26.29 10.34-49.65 50 12 (8)*

2 camphor 19.53 5.16-36.54 122 11 (5)

3 trans-thujone 11.94 1.50-44.91 81 19 (14)

4 1,8-cineole 9.78 5.04-15.69 56 13 (9)

5 β-pinene 5.97 1.23-11.92 79 11 (3)

6 camphene 5.09 0.97-9.89 48 9 (4)

7 borneol 2.81 0.90-6.27 50 4 (2)

8 bornyl acetate 1.91 0.34-5.98 39 4 (2)

*Number of markers unique for the compound is given in parenthesis

Što dalje?

odrediti sadržaj ulja

jedinki u populacijama,

pa potvrditi postojanje

veza

istražiti metaboličke

puteve?

Pridružujuće kartiranje od Q do K:Studija slučaja hrvatskih endemičnih kadulja

Zlatko LiberToni NikolićIvana RešetnikIvan Radosavljević

Vlatka ZoldošVedrana Vičić

Marija Jug-DujakovićZlatko ŠatovićKlaudija Carović-StankoMartina GrdišaIvan Biruš

Jerko GunjačaSandro Bogdanović

Projektni tim

Projekt financira Hrvatska zaklada za znanosti