PRIMEIRO RELATÓRIO DE LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E METABOLISMO DE

PLANTAS

ERICO CASTRO, GIANDRÉ TORREZAN, HILTON MORBECK E PATRÍCIA

2002

1

ÍNDICE

INTRODUÇÃO.............................................................................3

REFERENCIAL TEÓRICO.............................................................4

Colorimetria e Espectrofotometria...............................4

Proteínas e Aminoácidos..............................................5

Carboidratos.................................................................7

Métodos de Quantificação de Aminoácidos.................9

Métodos de Quantificação de Proteínas......................11

Considerações sobre os métodos.....................13

Métodos de Quantificação de AR...............................14

Métodos de Quantificação de AST.............................15

MATERIAL E MÉTODOS...........................................................17

Determinação de AA pelo Método da Ninidrina:.......17

Determinação de Proteína Método de Bradford..........18

Determinação de AR pelo Método do DNS...............20

Determinação de AST pelo Método da Antrona.........21

Análise.........................................................................22

RESULTADOS E

DISCUSSÃO......................................................23

Gráficos curva padrão de AA (A570 ηm)...................24

Gráficos curva padrão de Proteínas. (A595 ηm).........25

Gráficos curva padrão de AR (A540 ηm)...................26

Gráficos curva padrão de AST (A620 ηm).................27

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...............................................28

QUESTIONÁRIO...................................................................29

2

INTRODUÇÃO

As plantas geralmente produzem uma grande variedade de

compostos orgânicos que exercem funções vitais em seu organismo.

Além desses compostos, outros são formados através do

direcionamento de uma pequena parte da matéria seca total produzida

pela planta, durante o processo fotossintético. Os tecidos vegetais

possuem diversas substâncias que são classificadas em dois grupos: as

macromoléculas (proteínas, ácidos nucléicos, polissacarídeos e

lipídeos) e as micromoléculas (aminoácidos, nucleotídeos e

oligossacarídeos).

Para identificar ou quantificar essas substâncias são usados

métodos baseados em reações químicas, nas quais o reagente interage

com a estrutura da substância a ser quantificada. A quantificação pode

ser realizada por vários métodos, porém os mais utilizados são a

colorimetria e a espectrofotometria, que são técnicas cuja

concentração é determinada pela quantidade de luz absorvida pelo

meio de reação.

A determinação da concentração de uma dada substância em

um tecido vegetal através desses métodos necessita da comparação

com uma concentração já conhecida. Para isso, o mesmo método que

quantifica a substância do tecido é aplicado a uma variação de

concentrações gradativas conhecidas, cujos resultados são

denominados de curva padrão.

3

REFERENCIAL TEÓRICO

COLORIMETRIA E ESPECTROFOTOMETRIA:

As soluções de alguns compostos químicos são coloridas

porque absorvem mais certos comprimentos de onda da radiação do

visível, enquanto outros são transmitidos ou refletidos. Medições de

absorção de luz são usadas para detectar e identificar moléculas e

determinar sua concentração na solução.

Existem dois métodos de análise por absorção de luz: a

colorimetria e a espectrofotometria.

A análise colorimétrica consiste na variação de cor de um

sistema pela modificação da concentração de um certo componente. A

cor pode ser provocada pela formação de um composto corado,

resultante da adição de um reagente apropriado, ou pode ser intrínseca

ao constituinte analisado. A intensidade da cor pode ser comparada

com a que se obtém pelo tratamento idêntico de uma quantidade

conhecida da substância (Jeffery, 1992). Esta comparação é feita pela

medida da absorção relativa da luz entre uma concentração conhecida

da substância e aquela que se quer analisar. Na colorimetria visual

usa-se, em geral, como fonte de luz, uma fonte natural ou artificial de

luz branca. As determinações são feitas num instrumento simples,

denominado colorímetro, ou comparador de cores. Quando a vista for

substituída por uma célula fotoelétrica, o instrumento é um

colorímetro fotoelétrico.

Em análises espectrofotométricas a fonte de radiação emitida

atinge até a região ultravioleta do espectro. Desta radiação

selecionam-se comprimentos de onda definidos que constituem

4

bandas, com largura menor que 1nm. Este procedimento necessita de

um instrumento mais complexo, o espectrofotômetro, cujas análises

também, são por variação de cor.

A principal vantagem dos métodos colorimétricos e

espectrofotométricos é a de proporcionarem um meio simples para

determinar quantidades diminutas de substâncias.

A dependência da absorção de luz, em função da variação de

concentração da substância colorida constitui a base para os métodos

de dosagem colorimétricos. Esta dependência é expressa

quantitativamente pela equação de Lambert-Beer.

Na espectrofotometria, a fração de luz absorvida por uma

solução está relacionada com o comprimento de onda da espessura da

camada em absorção, ou seja, no espaço que a luz tem que percorrer

dentro da solução e da concentração das substâncias em absorção.

Essas duas relações correspondem à Lei de Lambert-Beer, que tem a

seguinte fórmula:

Log I0/I = є cl

onde I0 é a intensidade da luz incidente, I, é a intensidade de

transmissão de luz, є, é o coeficiente de extensão molar (unidade de

litros por mol-centímetro), c, é a concentração da substância em

absorção (em moles/L) e l, é o percurso da onda dentro da amostra em

absorção. Essa lei assume que a incidência da luz é paralela e

monocromática (um simples comprimento de onda) e que as

moléculas de solvente e soluto estão orientadas aleatoriamente. A

expressão log I0/I é chamada absorbância (A) (Nelson & Cox, 2000).

PROTEÍNAS E AMINOÁCIDOS

5

As proteínas são os componentes básicos mais importantes de

toda célula viva, apresentando uma variedade de funções biológicas.

São polímeros desidratados de aminoácidos sintetizados

biologicamente, constituídos, na maioria, por um grupo de vinte

aminoácidos, covalentemente ligados linearmente (Nelson & Cox,

2000).

Os aminoácidos comuns variam quimicamente, mas todos

apresentam um grupamento ácido carboxílico e um grupamento amino

ambos ligados a um simples átomo de carbono (carbono ). Eles

servem como subunidades na síntese de proteínas, as quais são longos

polímeros lineares de aminoácidos unidos cabeça a cauda por ligações

peptídicas entre o grupo caboxílico de um e o grupo amino do outro.

Neste carbono estão ligadas as cadeias laterais, as quais proporcionam

as diferenças entre um aminoácido e outro. Todos os aminoácidos,

com exceção da glicina, apresentam ligados a seu carbono α

grupamentos distintos. As cadeias laterais ou grupamentos R diferem

em estrutura, tamanho e carga elétrica, portanto, lhes conferem

características diferentes influenciando em sua solubilidade na água e

reatividade química. Essas características também conferem

propriedades diferentes à molécula protéica que integram. Podem ser

agrupados em aminoácidos básicos, ácidos ou neutros (Nelson & Cox,

2000).

Além dos vinte aminoácidos padrões, existem alguns formados

a partir de modificações deles, os quais podem fazer parte de

estruturas celulares como a parede celular ou alguns tipos de tecido,

exemplos: 4-hidroxiprolina, derivado da prolina e 5-hidroxiglicina,

derivado da glicina (Nelson & Cox, 2000).

Os aminoácidos são moléculas anfóteras, isso quer dizer que

eles podem agir como tampões em soluções, porém cada aminoácido

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difere em sua propriedade ácido-base, possuindo pK1 (– COOH), pK2

(– NH3+) e pKR (grupo R) distintos (Nelson & Cox, 2000).

A união de aminoácidos forma os polipeptídeos com peso

molecular abaixo de 10.000 daltons e as proteínas. Esta união ocorre

por desidratação, formando a ligação peptídica entre o grupo amino de

um aminoácido e o grupo carboxil de outro.

A ionização de polipeptídeos depende de seus grupos α-amino

e α-carboxil livre em cada extremidade e do número de seus grupos R

ionizáveis.

As proteínas são formadas por uma ou mais cadeias

polipeptídicas e podem adquirir conformações diferentes

proporcionadas por interações (pontes de hidrogênio, ligações

dissulfídicas, entre outros), formando as estruturas secundária e

terciária. Quando a conformação ocorre entre duas ou mais cadeias

polipeptídicas forma-se a estrutura quaternária. A estrutura primária é

apenas a união dos aminoácidos pelas ligações peptídicas.

Assim como os aminoácidos, os peptídeos e as proteínas

possuem características anfóteras.

CARBOIDRATOS

Os carboidratos ou sacarídeos são moléculas biológicas mais

abundantes. Eles são quimicamente mais simples do que os

nucleotídeos e os aminoácidos, contendo apenas três elementos

(carbono, hidrogênio e oxigênio; possuindo em sua molécula um

grupo cetona ou um grupo aldeído) combinados de acordo com a

formula (CH2 O)n em que n é ≥ 3. as unidades básicas de um

carboidrato são denominadas monossacarídeos. Existem muitos tipos

diferentes de monossacarídeos, o quais, diferem no numero de átomos

7

de carbono e na organização dos átomos de H e O ligados a esses

carbonos. Alem disso, os monossacarídeos podem ser enfileirados de

infinitas maneiras para formar polissacarídeo.

Até 1960, acreditava-se que os carboidratos desempenavam

apenas funções passivas como fontes de energia e como materiais

estruturais. Os carboidratos não catalisam reações químicas

complexas nem se replicam como os ácidos nucléicos. Devido ao fato

de os polissacarídeos não serem construídos de acordo com um molde

genético como as proteínas e os ácidos nucléicos, eles tendem a ser

muito mais heterogêneos (tanto em tamanho quanto em composição)

do que as outras moléculas biológicas.

Entretanto, tornou-se claro que a variação estrutural inata dos

carboidratos é fundamental para a sua atividade biológica. As

organizações aparentemente casuais dos carboidratos nas proteínas e

na superfície das células são a chave para muitos eventos de

reconhecimento entre as proteínas e entre as células (Voet, Voet e

Pratt, 2000).

As ligações entre monossacarídeos são denominadas ligações

glicosídicas, e ocorrem entre o grupo hidroxil de um e o carbono

anomérico de outro com a liberação de uma molécula de água.

Na produção de energia são utilizados os açúcares redutores

(por exemplo: glicose e frutose). Esses açúcares são capazes de reagir

como agentes redutores, devido à presença em sua molécula de grupos

aldeído ou cetona livres, cujas propriedades redutoras podem ser

comprovadas pela sua capacidade de reduzir diversos íons metálicos,

como íon ferro (Fe3+) ou íon cobre (Cu2+), onde o grupo carbonil é

oxidado a grupo carboxil.

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Essa propriedade é a base para métodos quantitativos (Reação

de Fehling). A medida do reagente oxidante reduzido por uma solução

de açúcar pode estimar a concentração deste.

Os açúcares redutores podem unir-se e formar dissacarídeos

como a sacarose e vice-versa. Quando o carbono anomérico participa

de uma ligação, o açúcar não pode reduzir íons, então se a ligação

entre dois monossacarídeos envolve os carbonos anoméricos de cada

um, o dissacarídeo produzido não é redutor (Sacarose). Por isso, a

sacarose é o açúcar de transporte da planta.

São denominados açúcares solúveis totais aqueles que são

solúveis em água. Esses açúcares representam a reserva de energia

prontamente disponível para crescimento. Os açúcares solúveis totais

são representados por glicose e frutose (ac. Redutores) e sacarose (ac.

Não redutor).

Métodos de quantificação de aminoácidos

É de fundamental importância a realização de análise

quantitativa de aminoácidos para a determinação da estrutura das

proteínas e dos complexos peptídicos similares, que são elementares

para a determinação química de amostras de moléculas orgânicas

(Spackamn, Stein e Moore, 1958).

Nesta atividade o grupo quantificará do aminoácidos pelo

método da Ninhidrina (Hidrato de tricetohidrindeno):

A ninhidrina (Figura 1) ocasiona a reação de desaminação

oxidativa dos aminoácidos, produzindo amônia (NH3) e a redução da

ninhidrina a hidrindantina. Esta reage com a amônia liberada,

formando um complexo azul, com absorção máxima em luz de

comprimento de onda de 570 nm. A intensidade da cor azul produzida

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em condições padronizadas serve de base para um teste quantitativo

para aminoácidos, podendo detectar até 1g de aminoácido. Outras

aminas além dos aminoácidos, também reagem com a ninhidrina,

formando uma cor azul, mas sem ocorrer liberação de CO2, a qual é

indicativa de um aminoácido. A amônia (NH3) e peptídeos também

reagem, porém, mais lentamente que os -aminoácidos. A prolina e a

4-hidroxiprolina produzem um complexo de cor amarela quando

reagem com a ninidrina.

Pode-se também utilizar-se de outros métodos, como o método

da fluorescamina. A fluorescamina é um reagente mais sensível que a

ninhidrina, sendo capaz de detectar nanogramas de aminoácidos.

Semelhante a ninhidrina, a fluorescamina forma um complexo com

outras aminas que não aminoácidos (Murray, 1994).

Entretanto existem outros métodos utilizados (menos comuns)

para determinação de aminoácidos:

Reação de Pauly: O ácido sulfônico reage com o aminoácido histidina

produzindo um composto de coloração vermelha;

Reação de Sakuguchi: O -naftil e Hipoclorito de Sódio reagem com

a arginina, produzindo um composto avermelhado;

Reação de Folin-Ciocalteau e Millon: Específica para o aminoácido

tirosina;

Reação de Holkins-Call: Específica para o aminoácido triptofano;

Reação do Nitroprusiato: Específica para o aminoácido cisteína

(Oliveira, 1992).

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Figura 1. Molécula de Ninidrina

Métodos de quantificação de proteínas

Atualmente existem em utilização várias técnicas

colorimétricas para analisar proteínas, entretanto nenhuma é

totalmente satisfatória. Ao se fazer a determinação protéica de uma

substância é preciso levar em conta sua constituição, a natureza dos

outros componentes da amostra, como também no tempo e precisão

desejados e na sensibilidade do método de análise.

Dentre os métodos desenvolvidos para a quantificação de

proteínas, temos:

Método do biureto:

Peptídeos reagem com o biureto em solução alcalina e em

presença de solução de sulfato de cobre diluída, formando um

composto de cor púrpura-violeta. A cor deve-se à ligação do átomo de

Cu a quatro átomos de N das cadeias peptídicas. Este método é

simples para a quantificação da proteína total, mas requer de 20 a 40

mg de proteínas.

Método de Kjeldhal (1880):

Consiste na queima total do material orgânico das amostras

pela adição de ácidos oxidantes fortes, sob temperaturas relativamente

elevadas. Após completa transformação dos compostos nitrogenados

em sais de amônio, a mistura é fortemente alcalinizada com NaOH,

sendo a amônia recolhida com um volume conhecido de ácido bórico

(NH4H2BO3) e titulada com ácido clorídrico (HCl). A quantidade

calculada de nitrogênio encontrada por essa titulação é multiplicada

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por um fator médio de 6,25 para fornecer a quantidade de proteína

total presente na amostra.

Método turbidimétrico:

Baseia-se na precipitação de proteínas em presença de um

ácido. É o mais rápido, levando em torno de 10-15 minutos. Porém

nem todas as proteínas precipitam da mesma forma em presença de

ácidos e substâncias como ácidos nucléicos também podem precipitar.

Método de Folin – Ciocalteau (1969):

Este método é uma modificação do método de biureto, onde o

cobre em meio alcalino reage com a proteína formando um complexo

(reação de Piotrowsky ou biureto). Este complexo apresenta

aminoácidos fenólicos que reduz o reagente de Folin-Ciocalteau,

dando uma cor azul. A intensidade da cor é máxima em pH 10 e é

medida espectrofotométricamente a 660 nm, após 30-120 minutos.

Trata-se de um método muito sensível, podendo analisar

amostras de 5 g de proteínas, mas a amostra não pode ter a presença

de fenóis.

Método de Lowry (1951):

Este método utiliza o soro humano diluído entre 100 a 1000

vezes, como padrão. Em baixas concentrações a leitura é efetuada a

750 nm. Sua utilização é sugerida como forma de eliminar fontes de

erro pela desnaturação superficial que ocorre com o BSA.

Método de Bradford (1976):

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O método é baseado na ligação da proteína ao corante. O

corante utilizado é o Coomassie Brilliant Blue G-250, onde este

reagente existe em duas formas coloridas diferentes, vermelha e azul.

A forma vermelha do reagente é convertida em azul após a ligação do

corante com a proteína, esta coloração ocorre em dois minutos após o

reagente ser adicionado e é estável por até uma hora (Bradford, 1976).

Considerações sobre os métodos

- O Biureto é cerca de 100 vezes menos sensível do que o Lowry;

- O Lowry é mais dependente no tipo de proteína utilizada no padrão;

- Ambos os métodos estão sujeitos à interferência por diversas

substâncias, causando variação entre determinações;

- Íons amoniacais causam interferência na reação do biureto e o NaOH

pode não neutralizar todo o sulfato de amônio;

- Para diferentes proteínas, a intensidade de cor do biureto não é

diretamente proporcional ao incremento de coloração causado pelo

cobre na reação com o reagente de Folin. Com o Folin, uma

quantidade muito pequena de cobre é suficiente para proporcionar

quase que a coloração final, enquanto, no biureto as constantes de

dissociação da reação cobre + proteína Ö cobre – proteína são em

geral, dez vezes maiores do que na reação do Folin;

- Eze & Dumbroff (1982) compararam os métodos de Bradford e

Lowry. Verificaram que a adição de clorofila aos padrões protéicos

comprometeu a precisão de ambas as técnicas, causando aumentos de

20% (Bradford) e de 400% (Lowry). A precipitação de proteínas com

TCA eliminou a interferência da clorofila. Melhor resultado foi obtido

tratando o tecido com acetona, antes da extração com TCA;

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- Uma vez removida a interferência, ambos os métodos são confiáveis.

O Bradford é mais rápido, simples e sensível, mas o Lowry propicia

maior linearidade sob altas concentrações de proteína e maior

estabilidade da coloração desenvolvida. Nesta atividade, utilizaremos

o Método de Bradford para determinação de proteínas, por ser o mais

rápido, simples e sensível.

Métodos de quantificação de açúcares redutores

A reação de Benedict- A solução é um reagente comumente

usado na detecção de açúcares redutores; nesse reagente íons de Cu2+

são mantidos em solução, como um complexo alcalino de citrato.

Quando o Cu2+ é reduzido, o Cu+ resultante é menos solúvel e

precipita-se da solução alcalina sob forma de Cu2O, um sólido

amarelo ou vermelho. O açúcar redutor, por sua vez, é oxidado,

quebrado e polimerizado na solução alcalina de Benedict, (Conn e

Stumph, 1983).

Oliveira (1992) e Southgate (1991) citam que os açúcares

redutores também podem ser detectados pelos métodos: Redução da

ferricianida, reação com ácido para-hidroxibenzóicohidrazida

(PHBAH), e 3, 4 dinitrobenzóico. reação com trifenil tetrazolium e os

métodos do ácido pícrico, do fenol sulfúrico, do Ferro reduzido, e

metileno azul.

O método do ácido dinitrosalicílico (DNS) é o mais

empregado. Este reagente é composto de ácido dinitrosalicílico, sais

de Rochele, fenóis, bissulfito de sódio e hidróxido de sódio. A

química do ácido DNS foi muito discutida durante vários anos. O

ácido 3,5 dinitrosalicílico é reduzido para ácido 3- amino-5

nitrosálico, um produto de coloração laranja, enquanto que o grupo

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aldeído dos açúcares redutores são oxidados para grupos carboxílicos

(Figura 2) (Miller, 1959).

Métodos de quantificação de açúcares solúveis totais

Há vários métodos de determinação de açúcares em tecidos,

sendo os mais conhecidos o Método de Somogy- Nélson que consiste

em reações de redução detectadas pelo reagente de Fehling e o

Método da Antrona que consiste em reações de condensação que

utilizam reagentes ácidos pra desenvolvimento de cor.

O método de Somogy e Nelson (1952) é baseado na redução

de um reagente cúprico em meio alcalino pelos açúcares redutores,

sendo a reação quantificada por colorimetria. Os métodos

redutométricos utilizam o licor de Fehling original ou com

modificações tais como ocorre nos métodos de Bennedict, Somogy,

Hagedor-Hensen, Lane-Enyon, porém, todos se baseiam no mesmo

princípio, ou seja: O licor de Felhing consiste de uma solução alcalina

de sulfato de cobre em tampão de tartarato duplo de sódio e potássio.

O íon cúprico (Cu2+) do licor, na presença de açúcares redutores em

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Figura 2. Reação do DNS com o açúcar redutor.

meio alcalino a quente é reduzido a cuproso (Cu+) formando um

precipitado vermelho de óxido cuproso, conforme esquema:

Açúcar redutor enediol (redutona) 2OH + 2Cu+ + mistura

açúcar-ácido 2CuOH Cu2O + H2O (ppt vermelho).

Para a determinação dos açúcares solúveis totais, o método

mais adequado é o da antrona (Ashewell, 1957). Essa substância é um

hidroxiantraceno, de forma estável, sólido e incolor. A reação da

antrona com os açúcares ocorre em meio fortemente ácido, havendo

hidrólise e desidratação dos açúcares, produzindo hidroxifurfural e

furfural, os quais reagem com a antrona e formam um produto de

coloração azul-esverdeada (Figura 3).

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Figura 3. Reação da antrona com ácido sulfúrico e depois com o açúcar solúvel.

MATERIAL E MÉTODOS

As atividades foram realizadas no Laboratório de Nutrição e

Metabolismo de Plantas, Departamento de Biologia da UFLA /Setor

de Fisiologia Vegetal.

Para a determinação das curvas padrões seguiu-se os

protocolos descritos abaixo.

DETERMINAÇÃO DE AMINOÁCIDOS (-NH2) PELO

MÉTODO DA NINIDRINA:

Preparo dos Reagentes:

A) Tampão citrato de sódio 0,2 M – pH 5,0

B) Reagente ninhidrina 5% dissolvida em Metil Celosolve (2,5g

de ninidrina em 50ml de Metil Celosolve)

C) KCN (2% em Metil Celosolve) – 2ml de KCN 0,01M (65mg

KCN/ 100ml de água destilada) em 100ml de Metil Celosolve

D) Etanol 60% (v/v)

Observação: quando guardados separadamente e de modo adequado

podem ser armazenados por até 30 dias.

Procedimento para obtenção da curva padrão de

aminoácidos (aa) à partir de uma solução de glicina (0,1mol/ml):

- Pode ser utilizado outro aminoácido ou oura mistura de

aminoácidos, desde que nesta concentração final***.

Após a adição do padrão de aminoácidos e dos reagentes A, B e C,

agitar e levar ao banho-maria à 100ºC por 20 minutos para

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desenvolver a coloração. Posteriormente, completar com etanol 60% e

agitar novamente (o volume final da reação e 4,0 ml).

Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos

Tubos

GLY (0,1mol/ml)

(ml)

Água

(ml) mol de aa

Reagentes

A+B+C

(ml)**

Etanol 60%

(ml)***

01 0,0 1,0 0,00 1,7 1,3

02 0,2 0,8 0,02 1,7 1,3

03 0,4 0,6 0,04 1,7 1,3

04 0,6 0,4 0,06 1,7 1,3

05 0,8 0,2 0,06 1,7 1,3

06 1,0 0,0 0,10 1,7 1,3

** 0,5ml de A + 0,2ml de B + 1,0ml de C

Fazer a leitura a 570nm após o resfriamento.

Para quantificar os aminoácidos em tecidos vegetais seguir o

procedimento de extração mais indicado para cada tecido e

posteriormente usar até 1,0ml de extrato (máximo), adicionando os

reagentes.

DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS PELO

MÉTODO DE BRADFORD (COMASSIE BLUE G-250):

Preparo do reagente:

A – Comassie blue G-250 – dissolver 100mg de Comassie em 50ml

de etanol 95%. A esta solução adicionar 100ml de ácido fosfórico

85%. A solução resultante é diluída para 1 litro com água. As

concentrações finais sao: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico

e 4,7% de etanol.

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Atenção:

- O ácido fosfórico tem que ser adicionado ao Comassie

dissolvido em etanol, nunca o contrário.

- O reagente de Comassie deve ser filtrado antes de ser usado.

Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas

à partir de uma solução de Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/ml

ou 10g/0,1ml):

Tabela 2. Procedimento para obtenção da curva padrão de proteínas

Tubos

Glicose (60mg/ml)

(ml)

Água

(ml) g/ml de AST

ANTRONA

(ml)

01 0,00 0,10 0 5,0

02 0,02 0,08 20 5,0

03 0,04 0,06 40 5,0

04 0,06 0,04 60 5,0

05 0,08 0,02 80 5,0

06 0,10 0,00 100 5,0

Observação: para minimizar os erros de pipetagem pode-se preparar

soluções de 20, 40, 60, 80 e 100g de BSA/0,1ml e retirar uma

alíquota de 0,1ml de cada uma.

A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser

feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) resultando

em uma concentração final de TCA igual a 5%.

Este extrato deve ser centrifugado e o precipitado

ressuspendido com NaOH 0,1N. Posteriormente, retirar uma alíquota

de 0,1 ml da proteína ressuspendida, adicionar 5ml do reagente de

Comassie, agitar e fazer a leitura a 595nm.

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DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO

DO ÁCIDO DINITROSALICÍLICO (DNS)

Preparo dos reagentes:

A – DNS (Dissolver 2,5g de ácido dinitrosalicílico (DNS) e

adicionar 50ml de NaOH 2N)

B - Disssolver 75g de Tartarato duplo de Sódio e Potássio (Sal

de Rochelle), adicionar 125ml de água e agitar sob aquecimento até a

dissolução total.

Posteriormente, adicionar o reagente B sobre o A, misturando-

o sob aquecimento até dissolver completamente. Depois de resfriada,

completar o volume da solução para 250ml.

Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares

redutores (AR) a partir de uma solução de glicose (10mM):

- Pode ser utilizada uma mistura de frutose e glicose desde que

dêem a mesma concentração final.

Tabela 3. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores

Tubos

Glicose (10mM)

(ml)

Água

(ml) moles de AR

DNS (A+B)

(ml)

01 0,0 1,5 0,0 1,0

02 0,2 1,3 2,0 1,0

03 0,4 1,1 4,0 1,0

04 0,6 0,9 6,0 1,0

Após adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os

tubos para banho-maria à 100ºC por 5 minutos. Deixar esfriar à

temperatura ambiente e completar o volume para 10ml com água

destilada ou não (conforme o caso). Fazer a leitura a 540nm.

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Para quantificar os AR de um estrato de tecidos

convenientemente preparados, pode-se usar até 1,5 mL de alíquota e

adicionar o reagente de DNS e posteriormente seguir as mesmas

recomendações para a obtenção da curva padrão.

DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS

PELO MÉTODO DA ANTRONA:

Preparo do reagente:

Pesar 40mg de Antrona, colocar em um béquer e adicionar 1,0

ml de água destilada e depois 20ml de ácido sulfúrico concentrado

(H2SO4). Este reagente deve ser preparado na hora do uso.

Antes de colocar a antrona, manter os tubos de ensaio em gelo.

Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares

solúveis totais (AST) à partir de uma solução de glicose (60g/ml

ou 0,333 mM de glicose):

Tabela 4. Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares solúveis totais.

Tubos

Glicose (60mg/ml)

(ml)

Água

(ml) g/ml de AST

ANTRONA

(ml)

01 0,0 1,0 0,0 2,0

02 0,1 0,9 6,0 2,0

03 0,2 0,8 12,0 2,0

04 0,4 0,6 24,0 2,0

05 0,6 0,4 36,0 2,0

06 0,8 0,2 48,0 2,0

07 1,0 0,0 60,0 2,0

21

Depois de adicionar o reagente Antrona, agitar os tubos e leva-

los ao banho-maria à 100ºC por 3 minutos. Resfriar à temperatura

ambiente ou no gelo e fazer a leitura a 620nm.

Para quantificação de AST em extrato de tecidos vegetais

pode-se usar alíquotas de até 1,0ml.

ANÁLISE

Nos trabalhos realizados, cada participante do grupo era

responsável por duas repetições de cada ponto das curvas.

As curvas padrões foram determinadas no Windows Exel com

o uso do gráfico de dispersão, sobre o qual aplicou-se regressão linear,

cujo modelo é y = ax + b. Como critério de qualidade de ajuste foi

utilizado o R2.

22

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para se estudar o teor das biomoléculas (aminoácidos,

proteínas, açúcares redutores e açúcares solúveis totais) dos tecidos

vegetais necessita-se de uma curva padrão. Esta, por possuir

quantidades conhecidas da molécula em questão, permite estimar a

quantidade dela no tecido vegetal.

Cada ponto das curvas padrões foi obtido com uma

concentração conhecida da substância desejada, ou seja, para

aminoácidos usou-se glicina, para proteínas, soro albumina bovina

(BSA) e para açúcares redutores e solúveis, glicose. Aplicou-se, então,

regressão linear, sendo que a fórmula y = ax + b serve para determinar

a concentração das substâncias extraídas de um tecido vegetal, onde y

é o valor da absorbância e x é a concentração a ser determinada. O R 2

avalia a variação dos resultados obtidos na curva. Quanto menor a

variação, o resultado de R2 estará mais próximo de 1 (resultado ideal),

que pode ser alcançado se a variação for uniforme. Sendo assim,

quanto mais próximo de 1, mais precisas serão as determinações do

teor da substância no tecido vegetal.

Os resultados obtidos nas atividades realizadas por cada

membro do grupo estão apresentados nos gráficos abaixo.

23

24

Figura 4. Gráficos curva padrão de aminoácidos (A570 ηm) de cada participante do

grupo.

25

Figura 5. Gráficos curva padrão de proteínas (A595 ηm) de cada participante do

grupo.

26

27

Figura 6. Gráficos curva padrão de açúcares redutores (A540 ηm) de cada

participante do grupo.

28

Figura 7. Curva padrão de açúcares solúveis totais (A620 ηm) de cada um dos

participantes do grupo em cada ponto da curva e sua média.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ASHEWELL 1957.

BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72, 248-254, 1976.

CONN & STUMPH. Introdução à Bioquímia. 1983.

JEFFERY, G.H. et al. Análise química quantitativa. Vogel, 1992. 712p.

MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic reagent for determination of reducing sugar. Analytical Chemistry, 31: 426-428, 1959.

MURRAY, R.K.; GRANNER, D.K.; MAYES, P.A.; RODWELL, V.W. Harper: Bioquímica. 7.ed. São Paulo: Ateneu editora, 1994. 763p.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth Publishers, 2000. 1152p.

OLIVEIRA, L.E.M. Utilização de laboratórios e preparo de soluções e reagentes para análise bioquímicas (apostila). 1992.

Relatório de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de Plantas. UFLA. Roteiros de aulas práticas de Laboratório de Bioquímica e Metabolismo de

Plantas. Curvas padrões. Lavras, UFLA.

29

SOMOGY, M. & NELSON. Notes on sugar determination. 1952.

SOUTHGATE, D.A.T. Determination of food carbohydrates. 2.ed. London: Elsevier Applied Science, 1991. 232p.

SPACKAMN, D.; STEIN, W.; MOORE, S. Automat recording apparatus for use in the chromatography of amino acids. Analytical Chemistry, 30 (7), p. 1190-1206, 1958.

VOET, D; VOET, J.G.; PRATT, C.W. Fundamentos de Bioquímica. Porto Alegre: Artes Medicas, 2000. 931p.

30

Questionário

Relatório de Curvas Padrões

1) Quais os critérios e cuidados a serem utilizados na

escolha de uma solução tampão?

É uma solução que resiste à variação de pH quando a ela são adicionadas pequenas quantidades de ácido ou base ou quando a solução é diluída.

Consiste de uma mistura de ácido fraco e sua base

conjugada (tampão ácido) ou de uma base fraca e seu ácido

conjugado (tampão básico).

A escolha de uma solução tampão deve ser estabelecida

buscando-se eficiência e maior capacidade tamponante da

mesma. Para tal, existem dois fatores determinantes:

Concentração do sistema = Concentração dos componentes do

sistema

Relação

inferindo pela equação de Henderson-Hasselbach:

Composição Química:

Ácido Fraco e sal derivado desse ácido:

Exemplo: Ácido Acético e Acetato de Sódio;

Base fraca e um Sal derivado desta base:

31

Exemplo: Hidróxi de Amônia e Cloreto de

Amônia;

H3CCOOH <---> H3CCOO- + H+  

- O deslocamento do equilíbrio mantém o pH;

- Se colocamos OH- , o equilíbrio desloca para direita;

- Se colocarmos  H+ , o equilíbrio desloca para esquerda;

Obs.: O calcário (CaCO3) é usado para fazer calagem

em solos ácidos. Corrige a acidez de solos ácidos, pois

o CaCO3 é um sal derivado de ácido fraco e base forte,

portanto seu ânion sofre hidrólise alcalina.

2) Qual é o princípio da “ação tamponante” de uma

solução tampão?

Os possíveis valores da concentração de H+ e OH-, em

uma solução aquosa, podem ser de várias ordens de

magnitude, variando de cerca de 101,3 a 10-15,3. Assim sendo, é

conveniente representá-los em uma escala logarítmica,

reduzida e de mais fácil manuseio. Por convenção é utilizada a

escala pH para representar a concentração de íons hidrogênio.

Esta notação foi delineada pelo químico sueco Sørensen em

1909. O “p” usado em pH, pOH, pKw etc. originou da palavra

alemã Potenz a qual significa força no sentido de expoente.

pH = - log [H+]

ou,

[H+] = 10-pH

Também podem ser definidos:

pOH = -log [OH-]

32

[OH-] = 10-pOH

e

pKw = -log Kw

onde Kw é o produto iônico da água na reação:

H2 (l) + H O(l) H O (aq) -

2 H + OH

Esta reação é chamada de autoionização ou dissociação

da água.

A figura abaixo representa de uma maneira esquemática

o que acontece com um ácido forte em solução em equilíbrio.

Por exemplo: Uma solução aquosa 0,10 M de um ácido

forte, ácido nítrico, HNO3, [H+] = 0,10 M e [NO3-] = 0,10 M; a

concentração de HNO3 é virtualmente zero. O pH desta solução

é: pH = - log [H+] = - log (0,10) = 1.

.....ANTES DA DISSOCIAÇÃO APÓS A DISSOCIAÇÃO “equilíbrio”

HA H+ A-

33

DISSOCIAÇÃO DE UM ÁCIDO FORTE

Em uma solução aquosa de ácidos e bases fracas existe o equilíbrio entre íons e espécies químicas dos ácidos ou bases. Representado por HA um ácido fraco tem-se a seguinte equação de ionização, com sua constante de dissociação ou ionização: HA + H2O H3O+ + A-

[H3O+] [A-] Ka = -------------------- [HA]

onde: Ka = constante de ionização do ácido fraco;

[A-] = concentração molar de íons A- presente no

equilíbrio;

[H3O+] = concentração molar de íons H3O+ presente no

equilíbrio;

34

[HA] = concentração molar de ácido fraco não dissociado

presente no equilíbrio.

De modo semelhante ao que foi feito com o ácido forte,

também pode ser feito uma representação esquemática da

dissociação de um ácido fraco, como na figura abaixo.

Deve ser destacado que o estado “antes da dissociação”

nunca existe realmente em solução, porque a solução está

sempre em equilíbrio. O lado esquerdo é apenas teórico.

ANTES DA DISSOCIAÇÃO APÓS A DISSOCIAÇÃO “equilibrio”

HA HA H+ A-

DISSOCIAÇÃO DE UM ÁCIDO FRACO

35

3) Explique o princípio do desenvolvimento de cor

resultante da reação do(s) reagente(s) específico(s)

utilizados para os métodos de determinação de

aminoácidos, proteínas, açucares redutores e totais.

Mostre as reações.

Relatório páginas 4 à 16.

4) Construa as figuras representativas das curvas padrões

determinando inclusive suas equações de regressão.

Relatório páginas 24 à 27

5) Compare os métodos de quantificação utilizados nesta

aula com os disponíveis na literatura.

Relatório página 13

6) Tem-se uma solução de 25 ppm de Ca na forma de

CaCl2. Qual o volume dessa solução é necessário para

preparar 100 mL de um padrão de Ca 0,3 mM.?

25 V = 0,3 x 0,1 L

V = 0,0012 L = 1,2 mL

7) Transformar para ppm os seguintes valores:

a) 0,0015%;

b) 22,3 mg/L

36

c) 40 mg/100 mL

d) 125 g/ 5 L;

e) 0,025%;

f) 1000ppb;

37

g) 312 mg/ L;

h) 312 g/m3;

i) 3 g/T;

j) 5 mg/ mL;

k) 0,07 g/1000 mL;

m) (NH4)2SO4 - 5 mM. Quantos ppm de N, S, H e O?

38

n) MgHPO4 – 10 mM. Quantos ppm de Mg, P, H e O?

8) Uma solução de KNO3 tem 140 ppm de N. Quantos ppm

tem de K?

39

9) Para obtermos 10 litros de uma solução de Ca 160 ppm,

quanto de Ca(NO3)2 .4H2O é preciso?

10) Preparar uma solução de 1 M em K, a partir de K2SO4.

11) Preparar 1 litro de solução que contenha 195 ppm de K

e tendo como solução estoque KNO3 1 M.

12) O que é normalidade, molaridade, molalidade e ppm?

Normalidade (N): nº de equivalente-grama do soluto

dissolvido em um litro de solução.

40

onde Nº eq = nº de equivalente-grama;

V = volume expressa em mol L-1

onde,

eq g = equivalente-grama;

N º ionizáveis = Ácido = nº de H+ ionizáveis

Base = nº de OH- ionizáveis

Sal = nº do elemento de maior Nox

Concentração molar ou molaridade (M): nº de mols de

soluto dissolvidos em um litro de solução, ou seja:

expressa em mol L-1 ou g L-1 ou g cm-3.

onde n = nº de mols; V = volume da

solução.

Se onde m = massa do soluto; PM = peso

molecular do soluto.

Então, molaridade pode também ser definida por:

Concentração molalidade (): nº de mols de soluto

dissolvido em um quilograma de solvente.

onde = molalidade; n = nº de mols; m = massa da

solução.expressa em mol Kg-1 ou g Kg-1

41

Partes por milhão (ppm): indica o nº de partes de soluto em

um milhão de partes de solução.

1ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou

mg g-1

1ppm (v/v) = expressa em mg L-1

1ppm (p/v) = expressa em mg L -1 ou mg

mL-1

Obs. É interessante ressaltar que os termos molalidade e

molaridade estão sendo substituídos por ppm (molalidade está

completamente abolido) visto que a tendência atual é somente

trabalhar em termos de massa/massa.

Fazendo correlações encontra-se:

1 ppm (p/p) = expressa em mg Kg-1 ou g g-1

1 ppm (v/v) = expressa em L L-1

1 ppm (p/v) = expressa em mg L-1 ou g mL-1

1 M = 1000 ppm então 1 ppm = 1 mM

13) Como são divididos quimicamente os aminoácidos?

Os aminoácidos são divididos em quatro grupos de acordo com

a polaridade do seus grupamento R lateral. São eles:

Aminoácidos com R = grupos apolares (hidrofóbicos)

42

43

Aminoácidos com R = grupos polares neutros (hidrofílicos)

Aminoácidos com R = grupos polares ácidos

Aminoácidos com R = grupos polares básicos

44

14) O que é precisão, exatidão e sensibilidade do método?

A exatidão é a concordância entre o resultado

determinado e o verdadeiro ou em outras palavras, exprime a

correção de uma medida. A precisão é a concordância de uma

ou mais medidas de uma mesma variável, ou seja, exprime a

reprodutibilidade de uma análise.

Sensibilidade é a capacidade de aparelhos ou

instrumentos ou análises, de reagir à mínima ação ou variação

de influências físicas externas, tais como peso, pressão,

temperatura, concentração, etc.

45