1

Lowery and Sive, Mech. Dev. 2004

Primær og sekundær neurulation revisited

Saitsu et al., Anat. Rec., 2007

Neuralrør dannes mellem 21. og 23. dag. Den kraniale neuropore lukkes først, og primær neurulation er komplet på 26. dagen, når den caudale neuropore lukkes.

Sekundær neurulation og dannelse af tail bud starter før primær neurulation er færdig.Tail bud har maksimal længde i 5. uge, og er normalt helt væk i 7. uge.

Kondenseret mesenkym indbygges under normale omstændigheder i den ventrale del af det primære neuralrør.

2

Donovan and Pedersen, Pediatr. Neurosurg. 2005

”Haler” hos mennesket (1-20 cm), ofte associeret med abnormiteter i hud, her hypertrichosis.

Flere forklaringsmodeller på haler: Én er, at sekundær neurulation er defekt, så lukning af neuro-poren påvirkes, og der opstår lipom, og tail bud ikke tilbagedannes som normalt.

Stamceller

3

StamcellerDefinition:

Stamceller kan forny sig selv, d. v. s. give ophav til nye stamceller.

Stamceller kan give ophav til højt specialiserede celler gennem deling efterfulgt af en modningsproces.

Der findes grundlæggende 2 typer stamceller:

Pluripotente stamceller: f. eks. embryonale stamceller.

Adulte/somatiske stamceller: f. eks. stamceller i hårsækken.

4

Embryonale stamceller

Karakteristika:

Embryonale stamceller er pluripotente, d. v. s. har potentiale til at danne alle celletyper i en given organisme.

Embryonale stamceller kan anvendes til at fremstille transgene mus, d.v.s. individer, som helt mangler et givent gen (knock out mus) eller overudtrykker et givent gen.

Der forskes desuden i embryonale stamceller i grundvidenskabelig og terapeutisk øjemed.

Vaezi et al. Developmental Cell 3:367-381, 2002

GFP-tagged murin β-aktin under kontrol af K14 promoter, som er funktionel i mitotisk aktive epidermale celler.

ES kan anvendes til fremstilling af transgene mus

5

Kloning

• Terapeutisk kloning

• Reproduktiv kloning

21_41_cloning.jpg

Kloning

6

Kilder til humane pluripotente stamceller

Terapeutisk potentiale: indtil videre relativt begrænset

Embryonale stamceller giver ophav til teratomer (tumorer, som indeholder differentierede derivater af alle tre kimlag), hvis indsat i andet end blastocyst.

7

Teratocarcinoma

Terapeutisk potentiale: indtil videre relativt begrænset

Embryonale stamceller giver ophav til teratomer (tumorer, som indeholder differentierede derivater af alle tre kimlag), hvis indsat i andet end blastocyst.

Udifferentierede embryonale stamceller fremkalder immunrespons.

Etiske problemer: Stamceller som”overskudsprodukter” fra reagensglasbehandling for barnløshed eller fra aborterede fostre.

Anvendelige i drug discovery (måske som erstatning for eller forud for dyreforsøg).

8

Etablering af stamcellelinier: Historie

1981: ES fra preimplantationsembryoner (mus)

(1997: Dolly by SCNT)

1998: Isolering af hES fra blastocyster opnået ved In VitroFertilisering

2007: Over 120 hES cellelinier rapporteret verden over,heraf kun 7 alment tilgængelige (NIH)

Embryonal stamcelleterapi

9

Begrænsning: Museforsøg er baseret på indavlede stammer. Mennesker er ikke indavlede..

ES til terapi kan opnås ved somatic cell nuclear transfer

10

11

Terapeutisk kloning: Status

• 2004: Generering af hES ved somatic cell nucleartransfer, kerne- og ægcelledonor samme individ (Science)

• 2005: Kloning af hunde (Nature)

12

Kloning af hunde hidtil ikke opnået bl. a. p. g. a. vanskelig opsamling af oocyter modnet in vivo.

Terapeutisk kloning: Status

• 2004: Generering af hES ved somatic cell nucleartransfer, kerne- og ægcelledonor samme individ

• 2005: Kloning af hunde

• 2005: Generering af patient-specifikke hES fra humane SCNT blastocyster (Science)

Årskiftet 2005-2006: Hwang et al. bag ovenstående anklaget for videnskabelig uredelighed. Guilty as charged.

13

1/1095 kloner implanteret i 123 tæverFibroblastkerne fra hanhundDNA karakteristika som kernedonormtDNA identisk med ægdonor mtDNA

3/167 kloner implanteret i 12 tæver

Fremskridt pr. nov. 2007:

• Induktion af pluripotens i humane somatiske celler.• Retroviral introduktion af OCT3/4, SOX2, KLF4 og

c-MYC (Takahashi et al. Cell) eller OCT3, SOX2, NANOG og LIN28 (Yu et al. Science).

14

The Cleavage of a Single Mouse Embryo In Vitro

Blastocyst: Organisering med ICM i den ene side af ”ring” af trofoblastceller er et karakteristikum for pattedyr. ICM udtrykker Oct4, Stat3 og Nanog.

Fremskridt pr. nov. 2007:

• Induktion af pluripotens i humane somatiske celler, ”induced pluripotent stem (iPS) cells”.

• Retroviral introduktion af OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC (Takahashi et al. Cell) eller OCT3, SOX2, NANOG og LIN28 (Yu et al. Science).

• Immunrespons undgås.• Mest alvorlige etiske problemer omgås.• Problem: Retrovira er tumorigene.

15

Status 2008Eksempel: ”Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionallyintegrate into fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson´sdisease” PNAS, 105: 5856-5861, 2008.

Fibroblaster, der udtrykker ”stamcelle-gener” dyrkes initialt som ES.

Dernæst afprøves potentiale til at differentiere til neuroner og gliaceller i kultur.

Transplantation til hjerne fører til integration.

Funktionel recovery af Parkinson´s rotter efter transplantation (8/9).

Ups! 16 ud af 36 iPS kimerer døde indenfor 8 mdr. med tumorer.

Fremskridt á nov. 2007:

• Induktion af pluripotens i humane somatiske celler, ”induced pluripotent stem (iPS) cells”.

• Retroviral introduktion af OCT3/4, SOX2, KLF4 og c-MYC (Takahashi et al. Cell) eller OCT3, SOX2, NANOG og LIN28 (Yu et al. Science).

• Immunrespons undgås.• Mest alvorlige etiske problemer omgås.• Problem: Retrovira er tumorigene.• Løsning: Tænde eksisterende gener fremfor at

introducere nye kopier.

16

Somatisk celle med induceret pluripotens (iPS)

Adulte stamcellerAdulte stamceller er fundet i mange organer, og kan som oftest give ophav til et begrænset antal celle-/vævstyper, typisk de celler/væv, organet består af.

Anvendelse af adulte stamceller kræver:Letgenkendelig markørprofil, dvs. kendskab til gener/proteiner specifikke for stamceller i det pågældende væv.

Veletableret oprensningsprocedure.

Kendskab til stamcelleniche (opretholdelse af stamcelle-egenskab).

17

Hematopoietic stem cells (HSC) give rise to all the types of blood cells: red blood cells, B lymphocytes, T lymphocytes, natural killer cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes, macrophages, and platelets.

Bone marrow stromal cells (mesenchymal stem cells, MSC) give rise to a variety of celltypes: bone cells (osteocytes), cartilage cells (chondrocytes), fat cells (adipocytes), and other kinds of connective tissue cells such as those in tendons.

Neural stem cells in the brain give rise to its three major cell types: nerve cells(neurons) and two categories of non-neuronal cells—astrocytes and oligodendrocytes.

Epithelial stem cells in the lining of the digestive tract occur in deep crypts and give riseto several cell types: absorptive cells, goblet cells, Paneth cells, and enteroendocrinecells.

Skin stem cells occur in the basal layer of the epidermis and at the base of hair follicles. The epidermal stem cells give rise to keratinocytes, which migrate to the surface of the skin and form a protective layer. The follicular stem cells can give rise to both the hairfollicle and to the epidermis. (Kilde: NIH, 2008)

Adult stem cells

Stem cellNiche cell

ECM

Differentiatedcell

Progenitorcell

Out of Eden: Stem cells and their niches. Watt & Hogan, Science, 2000

Adulte/somatiske stamceller

18

Stamceller i hud & Ektoderms derivater: Epidermis og kutane strukturer

19

Lanugo: prenatal behåringVellus: ”dun” (pande, øjenlåg)TerminalhårVellus erstattes af terminalhår (f. eks. armhuler)Terminalhår erstattes af vellus (isse ved skaldethed)

20

WNT signals are required for the initiation of hair follicle development, Andl et al. Dev. Cell, 2002

Ito et al., Nature 447:316-320, 2007

Tidligere er epidermale SC og follikel SC regnet for separate enheder.I mus:Follikel SC fra bulge-regionen bidrager til heling (re-epitelialisering), om end forbigående.

Epidermis can regenerere hårsække under heling: Wounding aktiverer Wnt-pathway, som er essentiel for normal udvikling af hår og dets cyklus. Om helt tilsvarende gælder i mennesket vides (endnu) ikke.

21

Generel hypertrichose, X-bundet dominant mutation (Figuera et al. 1995)

X-linked anhidrotic ectodermal dysplasi/Christ-Siemens-Touraines syndrom

Kobielak et al. Am. J. Med. Gen. 100:191, 2001

22

Stamceller i knoglemarv: Hematopoietiske stamceller (HSC) og mesenkymale stamceller (MSC)

HSC repræsenterer den mest udbredte og succesfulde anvendelse af stamceller.

Relativt nemt tilgængelige (lette at oprense).

HSC vender tilbage til deres niche, knoglemarven, efter transplantation.

NIH 2008

(HSC)

(MSC)

23

Stamceller i knoglemarv: Hematopoietiske stamceller (HSC) og mesenkymale stamceller (MSC)

HSC repræsenterer den mest udbredte og succesfulde anvendelse af stamceller. Oprindeligt baseret på empiri.

Relativt nemt tilgængelige (lette at oprense).

HSC vender tilbage til deres niche, knoglemarven, efter transplantation.

MSC afsløres i 2002: Transplanteret knoglemarv giver ikke kun ophav til blodets celler, men også neurale celler, endodermale celler og muskelceller (LaBarge & Blau, 2002).

MSC• Kan oprenses fra bl. a. knoglemarv eller fedtvæv samt

navlestrengsblod. (Samme slags?).• Er adhærente i modsætning til HSC.• Opretholder stamcellepotentiale i kultur (?).• Anvendes til autolog transplantation til behandling af f. eks.

iskæmisk hjertesygdom og heling af knoglebrud.• Viden om stamtræ mangler, men behandlingspotentialet er

formentlig betydeligt.• Er en fraktion af adulte stamceller pluripotente, eller kan

multipotente organ-specifikke stamceller genetablere pluripotens ved et givent stimulus?

• Er adulte stamceller ”maskerede” embryonale stamceller?

24

NIH 2008

Stamceller fra fostertilstand

• Navlestrengsblod (HSC (blod) og MSC (blod/endotel)).

• Placenta (MSC fra aminon eller chorion).• Amnionvæske (AFS udgør 1% celler i AF).

25

Copyright ©2008 AlphaMed Press

Human amniotic mesenchymal stromal cells: isolation protocols, phenotype, and in vitro differentiation

Copyright ©2008 AlphaMed Press

Parolini, O. et al. Stem Cells 2008;26:300-311

Human chorionic mesenchymal stromal cells: isolation protocols, phenotype, and in vitro differentiation

26

Stamceller fra fostertilstand• Navlestrengsblod (HSC (blod) og MSC

(blod/endotel)).• Placenta (MSC fra aminon eller chorion).• Amnionvæske (AFS 1% celler i AF).

For alle 3 kilder gælder, at det fulde potentiale ikke kendes.

Fordele omfatter omgåelse af etiske problemstillinger, non-invasiv opsamlingsprocedure (ej AFs), og mulighed for autolog transplantation samt mindsket risiko (ingen teratomer).Banking kunne muliggøre allogen transplantation.

Potentialet er ”bevist”, idet MSC bidrager til sårheling, og foster overfører SC til moderen, og disse indgår i vævsregeneration.

God jul