Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov

UNIVERZITA KOMENSKÉHO V BRATISLAVE

Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov

ITMS: 26240220048

Podporujeme výskumné aktivity na Slovensku/ Projekt je spolufinancovaný zo zdrojov EÚ

Týždeň vedy a techniky 5. - 11. novembra 2012



o Druh projektu: žiadateľský projekt v rámci „Prenos poznatkov a technológií získaných výskumom a vývojom do praxe v Bratislavskom kraji“

o Žiadateľ projektu: PriFUK, Katedra molekulárnej biológie

o Zodpovedný riešiteľ projektu za partnera a názov príslušnej fakulty:Prof. RNDr. Ján Turňa, CSc.Prírodovedecká fakulta UK



Stručná anotácia projektu:Základom realizácie projektu je dobudovaniu výskumnej infraštruktúry žiadateľa prostredníctvom vybudovania špičkového pracoviska:

o zvýšeniu potenciálu žiadateľa využiť výskum v oblasti biomedicíny s dopadom aj na ďalšie strategické oblasti a prioritné smeru výskumu a vývoja (biotechnológie, ochrana zdravia, nové materiály a technológie), výrazným spôsobom zlepší podmienky vzdelávacieho procesu a prípravy novej generácie vedeckých pracovníkov, ako aj vysokokvalifikovaných pracovníkov pre súvisiace high-tech priemyselné odvetvia,

o zvýšenie kvality ľudského potenciálu regiónu, projekt vytvorí priaznivé podmienky na bezprostrednú spoluprácu priemyslu s akademickou výskumno-vývojovou základňou, čo umožní súčasne zvýšiť potenciál efektívneho prenos vedeckých poznatkov do praxe, výrazným spôsobom skvalitní a uľahčí už prebiehajúci výskum tak pre potreby praxe, ako aj už prebiehajúcich domácich a medzinárodných projektov, umožní vstup vedeckých tímov podieľajúcich sa na projekte do medzinárodných sietí a zvýši ich konkurencieschopnosť pri súťaži o zdroje 7. RP EÚ pre výskum a vývoj ako aj ďalších medzinárodných zdrojov, realizácia projektu umožní zlepšenie situácie v oblasti komercializácie poznatkov.



Hlavný zámer/ciele projektu:o Realizácia špičkového biomedicínskeho výskumu a

zvýšenie potenciálu spolupráce Prírodovedeckej fakulty UK s priemyselnou praxou

o Špecifický cieľ 1: Skvalitnenie výskumnej infraštruktúry a zefektívnenie vedecko – vzdelávacích činností

o Špecifický cieľ 2: Aplikovaný výskum v oblasti expresie a purifikácie rekombinantných proteínov a diseminácia výsledkov výskumu



Aplikovaný výskum v oblasti rekombinantných proteínov

o Cieľom aktivity je vývoj nových produkčných kmeňov a zavedenie nových postupov pri expresii a purifikácii rekombinantných proteínov, výskum ich funkcie a biologických vlastností

o Aplikovaný výskum smeruje k využitiu získaných poznatkov v humánnej medicíne



Spôsob riešenia projektu:o Vybudovanie špičkového pracoviska pre výskum a vývoj

rekombinantných proteínovo Výskum biologických vlastností rekombinantného proteínu

a definovanie podmienok jeho dlhodobého uchovávaniao Sledovanie analytických parametrov pripravených

rekombinantných proteínov o Návrh postupov pre kultiváciu produkčného kmeňa

a produkciu rekombinantných proteínov



Dosiahnuté výsledky v projekte:o Riadne ukončenie verejnej súťaže na predmet zákazky:

Prístrojové vybavenie pre výskum rekombinantných nukleových kyselín a proteínových biomakromolekúl rekombinantného pôvodu

o Vyhlásenie verejnej súťaže na predmet zákazky: Chemikálie a spotrebný materiál pre biomedicínsky výskum



Dosiahnuté výsledky v projekte:

rekombinantný hGH (rHGH) – proteín zložený zo 191 aminokyselín – stabilizovaný 2 disulfidovými väzbami, bez posttranslačných modifikáciíProdukt s vysokou hodnotouPožiadavka pre zlepšenú, účinnú a nízkonákladovú produkciu rhGH Aplikácia racionálneho designu – dve stratégie:

- Produkcia inklúznych teliesok- Produkcia rozpustného produktu

Príprava rekombinantného ľudského rastového hormónu - hGH



Design expresného vektoramalá veľkosť (~3,5 kbp), vysokokópiový plazmidantibiotiková rezistencia s účinným toxin/antidote systémom zaisťuje stabilituvýhodný fúzny partner

phGH3511 bp

hG H

Fus ion partne r

a tbR

T7 prom ote r

P rote a se c lea v a ge s ite

O rigin

6 x His





Expresia induková arabinózou v E.coli: Tvorba inklúznych teliesok počas kultivácie pri 37°CRozpustný produkt počas kultivácie pri 29°CV oboch prípadoch úroveň expresie dosahuje asi 35% celkových bunkových proteínovLaboratórna „batch“ fermentácia výťažok ~150mg/l rekombinantnéhoproduktu pri OD600=40-50

FP-rHGH

L 0h 1h 2h 3h 4h





Purifikácia fúzneho proteínu pomocou FPLC-IMACInklúzne telieska + 2-8M močovina Rozpustný proteín

Následná dialýza– reagregácia ~30-40% produktu

Produkt ostáva plne rozpustný po dialýze proti vode





Produkcia ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy (L-LEK) v bunkách Pichia pastoris

Enterokináza (EC 3.4.21.9) - je serín proteáza produkovaná enterocytmi v tenkom čreve u stavovcov, ktorá aktivuje natívny substrát trypsinogén na trypsín odštiepením N-koncovej časti peptidu.Enterokináza má vysoko špecifickú rozoznávaciu schopnosť a odštepuje N-koncový proteín od C-koncového tesne za týmito aminokyselinami, bez bez zostatku nežiadúcich aminokyselinových zvyškov na N-terminálnom konci, preto je enterokináza ideálna proteázapre štiepenie fúznych proteínov . Prekurzorom je jednovláknový polypeptid zložený z ťažkého (82-140 kDa) a ľahkého (35-62 kDa) reťazca. Ľahký reťazec je katalytická podjednotka enteropeptidázy a obsahuje doménu podobnú serínovej proteáze chymotrypsínu.

pGZ-LLEK3820 bp

inducibilný promótor

AF

L-LEK

Atb R

Ori




Stanovenie aktivity L-LEK

Stanovenie aktivity ľahkého reťazca ľudskej enterokinázy L-LEK (1µl enterokinázy a 5 µl substrátu) 1. dráha štandard molekulových hmotností 2. dráha: Trx-DCD1 (substrát; 2,4 mg/ml); 3. dráha: substrát štiepený L-LEK riedenou 1/3; 4. dráha: substrát štiepený L-LEK riedenou 1/10; 5. dráha: substrát štiepený L-LEK riedenou 1/30; 6. Dráha: substrát štiepený L-LEK riedenou 1/100

Purifikácia L-LEK

Chromatogram z purifikácie L-LEK pomocou anexovej chromatografie na HiTrap HP kolóne s objemom 1 ml. 1. až 3. frakcia obsahovala L-LEK

Chromatogram z purifikácie L-LEK pomocou IMAC, kedy boli použitá HiTrap kolóna s objemom 5 ml.





24 28 30 40 48 510

50100150200250300350400450 Priebeh kultivácie vo fermentore

hmotnosť vlhkej hmoty (g/l)hmotnosť suchej hmoty (g/l)

Čas, hod.

hmot

nosť

bio

mas

y, g

/l





Príprava hostiteľského kmeňa E. coli s dvojitou reguláciou expresie rekombinantných proteínov

Kontrola počtu kópií plazmidového vektora:Nízky počet kópií – inhibícia bazálnej expresieVysoký počet kópií – indukcia expresie s vysokou úrovňou

Bazálna expresia toxických proteínov potlačený rast a expresia (čo sú nežiaduce javy)




Integrácia trans-elementov do chromozómu





Konštrukcia expresného plazmidu

A – Agarózová gél. elektroforéza s 2-nás. riedením celkovej DNA extrahovanej z buniek kultivovaných pri 27°CB - Agarózová gél. elektroforéza s 2-nás. riedením celkovej DNA extrahovanej z buniek kultivovaných pri 37°CC – Fyzikálna mapa expresného plazmidu





Identifikácia miesta interakcie medzi Rep20 proteínom a oblasťou replikácie plazmidu pAG20


pAG 202954 bp

Re p pr ote ín

EcoRI (523)

Bgl II (1536)

EcoRV (2463)

Sal I (1)Sph I (172)

BspEI (931)

BspEI (2115)

Pvu II (724)

Pvu II (2794)

Xho II (1536)

Xho II (1575)

Xho II (2118)

Ava II (308)

Ava II (880)

Ava II (929)Ava II (1762)

Rep proteíny interagujú s regulačnou oblasťou DNA molekuly pomocou sekundárnej štruktúry zloženej z intermitentných alfa-helixov (HTH motív). Rep proteíny niektorých replikónov majú dôležitú druhú funkciu - rozpoznávajú opačne opakované sekvencie (operátory) ktoré prekrývajú promótor ich vlastných kódujúcich génov, a pôsobia ako vlastné represory.




Rep20Rep20/1

Rep20/2Rep20/3

Rep20/4Rep20/5

Identifikácia miesta interakcie medzi Rep20 proteínom a oblasťou replikácie plazmidu pAG20

Pripravili sme niekoľko mutantov HTH oblasti a identifikovali DNA-väzbové miesto a jeho polohu v treťom α-helixe

1. Pripravili sme súbor delečných derivátov replikačného proteínu Rep20 v Helix-turn-Helix motíve.2. Všetky proteíny sme purifikovali s využitím IMAC FPLC.3. Identifikovali sme tretí α-helix ako väzbové miesto proteínu k DNA molekule.4. Identifikovali sme pravdepodobné väzbové miestov rep géne, ktoré pravdepodobne hrá úlohu v regulačnom mechanizme replikácie plazmidu

Electromobility shift assay: mutantný Rep20/1; Vzorky sme delili v 4% w/v polyakrylamidovom géli pri laboratórnej teplote 20 ± 2°C) v tlmivom roztoku 45 mM Tris-borát , 2.5 mM EDTA, pH 7.81. dráha – 421 nt/ 0,1 μl substr. DNA2. dráha - DNA + 1 ng Rep20 proteín3. dráha – DNA + 2 ng Rep20 proteín4. dráha –DNA + 5 ng Rep20 proteín5. dráha – DNA + 10 ng Rep20 proteín

1 2 3 4 5



Fágy:- infikujú všetky baktérie- ľahko sa izolujú a množia- self-replicating- sú špecifické pre bakteriálne ciele- netoxické pre ľudí a zvieratá- nízka cena

Dosiahnuté výsledky v projekte:Aplikácia fágov a fágových proteínov

pri bezpečnosti potravín




Druh KmeňEOP [%]

Morfológiaplaku

Cronobacter turicensis 290708/7 100 veľký, číry, s „halo“Cronobacter turicensis LMG 23827 2 malý, turbídnyCronobacter turicensis NTU 9 0.01 malý, čírySalmonella Enteritidis 5028 0.7 veľký, čírySalmonella Typhimurium LT2 13 veľký, čírySalmonella Dublin 4515 33 malý, číryE. coli BL21 DE3 0.0003 malý, turbídny

Baktériofág Dev2 sme izolovali z čističky odpadových vôd v Bratislave jeho namnožením na indikátorovom kmeni C. turicensis 290708/7Je schopný infikovať kmene Cronobacter turicensis, Salmonella enterica (serotypy Enteritidis, Typhimurium a Dublin) a E. coliKmene C. sakazakii, C. malonaticus a C. muytjensii boli citlivé na Dev2

Elektrónový mikrograf fága Dev2

Aplikácia fágov a fágových proteínov pri bezpečnosti potravín




Inhibícia rastu C. turicensis fágom Dev2

- vysoká počiatočná MOI (100 CFU/ml baktérií a 108 PFU/ml fágov) spôsobila úplné zabitie baktérií - pri nízkej MOI boli baktérie zredukované pod hranicu detekčného limitu po 2-8 hodinách kultivácie- prerastenie baktérií sme pozorovali po dlhšej perióde s použitím nízkej počiatočnej MOI- zabitie baktérií bolo efektívnejšie v LB pôde ako v sušenom mlieku

Aplikácia fágov a fágových proteínov pri bezpečnosti potravín



Dosiahnuté výsledky v projekte:Aplikácia fágov a fágových proteínov

pri bezpečnosti potravín

18.5

1913 14 15 16 176 7 8 109 1254.5

43.5

32.5

1.7

1.06

1.3

10.7

0.3

skoré gény stredné gény neskoré gény

Dev2 genóm

Veľkosť GC pomer Počet génov Čeľaď Skupina Príbuzné fágy

39 kp 52,6 % 42 Podoviridae T7-like K1F, EcoDS1

- klonovanie a expresia Dev2 gp17 (tail fiber proteín) vo vektore pET28b - využitie biologicky aktívneho proteínu s polysacharid hydrolázovou aktivitou (degraduje LPS)



Diseminácia dosiahnutých výsledkov

o Diseminácia výsledkov výskumu na medzinárodných odborných konferenciách:

o 11th Central European Forum of Biotechnology and Innovative BioEconomy, ČR, Brno, 2012

o Kongres IUMBM a FEBS, Španielsko, Seville, 2012o Konferencia EMBO Viruses of Microbes, Belgicko, Brusel, 2012o XXIII. Biochemický zjazd, ČR, Brno, 2012



Kolektív riešiteľov z Katedry molekulárnej biológie PriFUK

Doktorandi a diplomanti:Zdeno LevarskiKristína JiríčkováDiana HopkováMichal KajsíkMária OrieškováLucia OslanecováMartin BabičNina NoskovičováPeter WetzlerMaroš Pleška

Výskumí pracovníci:Ján TurňaStanislav StuchlíkJán KrahulecHana DrahovskáJozef GronesMarcela BielikováPavol Koiš

Documents

Príprava biologicky aktívnych látok na báze rekombinantných proteínov