� ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA AssayU.S. Nr patentu 5,270,184; 5,547,861; 5,648,211; 5,712,124; 5,744,311; 5,846,726; 5,851,767; 5,866,336; 5,919,630; 5,928,869; 5,958,700; 6,054,279; 6,090,552; 6,117,635; 6,251,609; 6,316,200; 6,656,680; 6,743,582.

Þr. informacinio lapelio pabaigoje pateikiamà simboliø glosarijø.

PRZEZNACZENIETest BD ProbeTec ET oparty na amplifikacji DNA (Amplified DNA Assay), wykrywaj¹cy bakterie Legionella pneumophila (LP), przeznaczony do u¿ytku wraz z Systemem BD ProbeTec ET, wykorzystuje technologiê amplifikacji z przesuniêciem ³añcucha (Strand Displacement Amplification, SDA) w celu bezpoœredniego, jakoœciowego wykrywania DNA bakterii Legionella pneumophila (grupy serologiczne 1-14) w próbkach plwociny pochodz¹cych od pacjentów z klinicznym podejrzeniem zapalenia p³uc. Niniejszy test, w po³¹czeniu z posiewem i innymi metodami, u³atwia postawienie wstêpnej diagnozy legionellozy.

STRESZCZENIE I OBJAŒNIENIE

Legionelloza mo¿e byæ wywo³ana inhalacj¹ aerozolu zawieraj¹cego bakteriê legionella lub w wyniku mikroaspiracji ska¿onej wody. Badania przeprowadzone w europie i ameryce pó³nocnej wykaza³y, ¿e Legionella by³a przyczyn¹ od 2 do 15% przypadków pozaszpitalnego zapalenia p³uc (cap) wymagaj¹cych hospitalizacji. Wspó³czynnik umieralnoœci pacjentów z legionelloz¹ wynosi od 5 do 30%. Ryzyko zgonu jest wy¿sze u pacjentów w podesz³ym wieku i z upoœledzon¹ odpornoœci¹.1 Zidentyfikowano czterdzieœci ró¿nych gatunków bakterii Legionella, z których po³owa jest chorobotwórcza dla ludzi. Legionella pneumophila jest przyczyn¹ 90% zdiagnozowanych przypadków legionellozy. Znanych jest czternaœcie grup serologicznych bakterii L. pneumophila, jednak 80% infekcji L. pneumophila wywo³ywanych jest przez grupê serologiczn¹ 1.2

Koniecznoœæ postawienia diagnozy i okreœlenia etiologii zapalenia p³uc staje siê bardziej istotna w œwietle zagadnienia nadu¿ywania antybiotyków. Wyniki testu diagnostycznego wykrywaj¹cego L. pneumophila powinny byæ szybko dostêpne dla lekarza, poniewa¿ wykazano, ¿e opóŸnienie w³¹czenia odpowiedniego leczenia skutkuje wzrostem œmiertelnoœci. Hodowla tradycyjnymi metodami, do uzyskania wzrostu bakterii Legionella z dodatnich próbek plwociny zajmuje minimum dwa dni, natomiast od siedmiu do dziesiêciu dni trwa potwierdzanie wyniku ujemnego. Dodatkowo do hodowli dostêpne s¹ komercyjne zestawy do analizy immunoenzymatycznej s³u¿¹ce wykrywaniu antygenu 1 grupy serologicznej bakterii L. pneumophila w próbkach moczu.3 Niewiele jest jednak testów diagnostycznych wykrywaj¹cych zaka¿enie bakteri¹ Legionella, zapewniaj¹cych szybkie wyniki oraz wysok¹ czu³oœæ i swoistoœæ.

ZASADY PROCEDURYW teœcie BD ProbeTec ET wykrywaj¹cym bakterie Legionella pneumophila (LP), opartym na amplifikacji DNA, wykorzystano jednoczesn¹ amplifikacjê i detekcjê docelowego DNA przy u¿yciu primerów i sondy detekcyjnej znakowanej zwi¹zkiem fluorescencyjnym. Odczynniki SDA liofilizuje siê w dwóch oddzielnych jednorazowych mikrostudzienkach. Przygotowan¹ próbkê dodaje siê do studzienki Priming Microwell zawieraj¹cej primery amplifikacyjne, znakowane fluorescencyjnie sondy detekcyjne i inne odczynniki niezbêdne w procesie amplifikacji. Primery amplifikuj¹ region sk³adaj¹cy siê z 68 par zasad, bêd¹cy genem macrophage infectivity potentiator (mip) L. pneumophila, wystêpuj¹cym u wszystkich grup serologicznych gatunków. Po zakoñczeniu inkubacji mieszaninê reakcyjn¹ przenosi siê do mikrostudzienki Amplification Microwell, zawieraj¹cej dwa enzymy (polimerazê DNA i endonukleazê restrykcyjn¹), konieczne do przeprowadzenia testu SDA. W celu unikniêcia zanieczyszczenia uszczelnia siê mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji, a nastêpnie inkubuje w sterowanym termicznie czytniku fluorescencyjnym, monitoruj¹cym reakcjê pod wzglêdem wytwarzania produktów amplifikacji. W przebiegu ka¿dej reakcji nastêpuje koamplifikacja i detekcja wewnêtrznej kontroli amplifikacji (IAC), której celem jest sprawdzanie, czy s¹ spe³nione wymagane warunki amplifikacji oraz obni¿enie ryzyka uzyskania fa³szywie ujemnych wyników spowodowanych obecnoœci¹ inhibitorów analizy. Obecnoœæ lub brak DNA w³aœciwego dla L. pneumophila oznacza siê przez obliczenie dla próbki wskaŸnika PAT (Passes After Threshold), opartego na znanych wartoœciach progowych. Urz¹dzenie automatycznie przedstawi zarówno wyniki pozytywne, negatywne, jak i nieokreœlone

ODCZYNNIKI I MATERIA£YKa¿dy zestaw odczynników Testu BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay zawiera nastêpuj¹ce elementy:Legionella pneumophila (LP) mikrostudzienki do zalewania cieczy (1 x 24) 6 Oligonukleotydów ≥ 7,5 pmol, dNTP ≥ 15,2 nmol, 2 sondy detektorowe ≥ 22,5 pmol, Syntetyczny oligonukleotyd ≥ 1500 kopiiLegionella pneumophila (LP) mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji (1 x 24)Enzym restrykcyjny: ≥ 33 jednostki, Polimeraza DNA ≥ 14 jednostek10 pokrywek Priming Covers, 16 uszczelek do amplifikacji (1/2), 8 torebek na odpady

80109602006/04

Polski�

2

BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a i zestaw kontrolny) (CF*/LP/MP**):Zawiera: Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a: Bicine, fosforan potasu, wodorotlenek potasu, dimetylosulfotlenek (DMSO) oraz Proclin; kontrole pozytywne 10 (CF/LP/MP): ≥ 1050 ng DNA nasienia ³ososia, ≥ 47,3 μg Tris, ≥ 9,0 μg EDTA, ≥ 3600 kopii plazmidu CF, ≥ 4800 kopii plazmidu LP, ≥ 5400 kopii plazmidu MP; 10 kontroli negatywnych (CF/LP/MP): ≥ 1050 ng DNA nasienia ³ososia, ≥ 47,3 μg Tris, ≥ 9,0 μg EDTA; 100 probówek o pojemnoœci 2 mL z przykrywk¹ zatrzaskow¹ * zob. test BD ProbeTec ET Chlamydiaceae Family (CF) Amplified DNA Assay** zob. test BD ProbeTec ET Mycoplasma pneumoniae (MP) Amplified DNA AssayAparatura, wyposa¿enie i zaopatrzenie: Aparat BD ProbeTec ET z p³yt¹, cieplarka lizuj¹ca BD ProbeTec ET, blok grzewczy BD ProbeTec ET, pipetor BD ProbeTec ET, podstawka oraz zasilacz, statyw na probówki o pojemnoœci 2 mL, zestaw akcesoriów BD ProbeTec ET, koñcówki pipet BD ProbeTec ET.Materia³y niezbêdne, ale niedostarczane: Komora bezpieczeñstwa biologicznego (Biological Safety Cabinet – BSC) klasy II, mieszad³o, ch³odziarka niskotemperaturowa -20°C i/lub -70°C (lub poni¿ej) „non-temperature cycling”, mikrowirówka osi¹gaj¹ca 16 000 x g, ³aŸnie wodne, termometr cyfrowy, stojak ³aŸni wodnej z przykrêcan¹ pokryw¹, inne odpowiednie stojaki na probówki, zestawy QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kits, 96–100% etanol, wymazówki BBL CultureSwab EZ, probówki i nakrêtki BD ProbeTec ET 2 mL, rêkawiczki jednorazowe, markery odporne na alkohol, mikropipety o pojemnoœci od 25 do 1000 μL, pipety z koñcówkami z barier¹ dla aerozolu, woda destylowana, L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1), albumina bydlêca (frakcja V) o stê¿eniu 0,2% (w/v) w roztworze soli fizjologicznej o stê¿eniu 0,85% (w/v), podchloryn sodu o stê¿eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox.** Rozpuœciæ 7,5 g preparatu Alconox w 1 L 1% (v/v) roztworu podchlorynu sodu i wymieszaæ. Codziennie przygotowywaæ œwie¿¹ mieszaninê.

Warunki przechowywania i u¿ytkowania: Zestawy odczynników BD ProbeTec ET LP mog¹ byæ przechowywane w temperaturze od 2 do 33°C. Nie stosowaæ nieotwartych zestawów odczynników po up³ywie daty wa¿noœci. Po otwarciu opakowania mikrostudzienki, o ile s¹ w³aœciwie uszczelnione, zachowuj¹ stabilnoœæ przez okres 12 tygodni lub do daty wa¿noœci w zale¿noœci od tego, który termin up³ywa wczeœniej. Nie zamra¿aæ.Zestaw BD ProbeTec ET Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a i zestaw kontrolny (CF/LP/MP) mo¿e byæ przechowywany w temperaturze od 2 do 33°C. Nie stosowaæ odczynników po up³ywie daty wa¿noœci. Nie zamra¿aæ.

Ostrze¿enia i œrodki ostro¿noœciDo stosowania w diagnostyce in vitro.1. W próbkach klinicznych mog¹ byæ obecne drobnoustroje chorobotwórcze, takie jak wirusy zapalenia

w¹troby i ludzki wirus upoœledzenia odpornoœci (HIV). Podczas pracy z materia³ami ska¿onymi krwi¹ i innymi p³ynami ustrojowymi nale¿y przestrzegaæ zaleceñ zawartych w „Standardowych œrodkach ostro¿noœci”4-7 oraz wytycznych obowi¹zuj¹cych w danym laboratorium.

2. Praca z próbkami z dolnych dróg oddechowych i ich przetwarzanie przed inkubacj¹ termiczn¹ w temperaturze 70°C powinna odbywaæ siê w kabinie bezpieczeñstwa mikrobiologicznego (Biological Safety Cabinet, BSC) klasy II.

3. Podczas inkubacji w temperaturze 70°C, w celu zapewnienia dodatkowego zabezpieczenia próbek pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych i stanowi¹cych potencjalne zagro¿enie biologiczne, nale¿y u¿ywaæ stojaka ³aŸni wodnej z przykrêcan¹ pokryw¹.

4. Rozcieñczalnik BD ProbeTec ET do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a zawiera dimetylosulfotlenek (DMSO). DMSO jest szkodliwy dla zdrowia – wdychanie, kontakt ze skór¹ lub po³kniêcie mo¿e byæ niebezpieczne. Nale¿y unikaæ kontaktu z oczami i podczas pracy zawsze u¿ywaæ rêkawiczek. W razie przedostania siê do oczu nale¿y natychmiast przep³ukaæ oczy du¿¹ iloœci¹ wody i zg³osiæ siê do lekarza. Je¿eli dojdzie do kontaktu ze skór¹, natychmiast sp³ukaæ du¿¹ iloœci¹ wody.

5. W celu uzyskania informacji o bezpieczeñstwie odczynników QIAGEN stosowanych w niniejszej procedurze zob. podrêcznik QIAamp DNA Stool Mini Kit. Nie nale¿y wyrzucaæ odczynników QIAGEN do roztworów dezynfekuj¹cych. Nie nara¿aæ odczynników QIAGEN na dzia³anie dezynfekuj¹ce.

6. Pojawi³y siê doniesienia, ¿e z powodu potencjalnego zanieczyszczenia odczynników przez DNA bakterii Legionella, zestawy QIAGEN do ekstrakcji DNA nie s¹ odpowiednie do PCR (reakcja ³añcuchowa polimerazy) Legionella.8,9 Mimo ¿e prawdopodobieñstwo jest ma³e, a w badaniach identyfikowano gatunki Legionella inne ni¿ L. pneumophila, przed zastosowaniem z próbkami pochodz¹cymi od pacjenta u¿ytkownik powinien sprawdziæ dzia³anie ka¿dej nowej serii odczynników.

7. System BD ProbeTec ET zaprojektowano tak, by zmniejszyæ do minimum mo¿liwoœæ zanieczyszczenia amplikonów; do pracy z systemem BD ProbeTec ET nie s¹ konieczne specjalne miejsca pracy. Niemniej jednak w razie koniecznoœci nale¿y stosowaæ inne œrodki ostro¿noœci maj¹ce na celu zapobieganie zanieczyszczeniu, a zw³aszcza zanieczyszczeniu próbek w czasie ich przygotowywania.

33

8. Otwarte opakowania z odczynnikami zawieraj¹ce niewykorzystane mikrostudzienki do zalewania cieczy i mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji MUSZ¥ byæ ponownie starannie uszczelnione. Przed ponownym uszczelnieniem nale¿y siê upewniæ, ¿e w opakowaniu odczynnikowym znajduje siê œrodek osuszaj¹cy.

9. Przed przeniesieniem p³ytki zawieraj¹cej mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji z bloku grzewczego BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater do aparatu BD ProbeTec ET, NALE¯Y j¹ starannie zakleiæ uszczelk¹ przeznaczon¹ do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji. Uszczelnienie zapewnia zamkniêt¹ reakcjê amplifikacji i detekcji oraz jest konieczne w celu unikniêcia zanieczyszczenia aparatu i miejsca pracy produktami amplifikacji. W ¿adnym wypadku nie wolno usuwaæ z mikrostudzienek materia³u uszczelniaj¹cego.

10. Mikrostudzienki do zalewania cieczy z pozosta³ym p³ynem (po przeniesieniu p³ynu z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji) mog¹ stanowiæ Ÿród³o zanieczyszczenia. Przed usuniêciem mikrostudzienek do zalewania cieczy nale¿y je starannie uszczelniæ.

11. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia œrodowiska pracy produktami amplifikacji, w celu usuniêcia zu¿ytych mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji nale¿y stosowaæ torebki na odpady dostarczone wraz z zestawem odczynników. Przed usuniêciem nale¿y upewniæ siê, ¿e torebki na odpady zosta³y prawid³owo zamkniête.

12. W celu unikniêcia krzy¿owego zanieczyszczenia próbek w trakcie poszczególnych etapów przetwarzania próbek i procedury testowej nale¿y ZMIENIAÆ RÊKAWICZKI. W przypadku kontaktu rêkawiczek z próbk¹ nale¿y je natychmiast zmieniæ, aby unikn¹æ zanieczyszczenia pozosta³ych próbek.

13. W przypadku zanieczyszczenia miejsca pracy lub aparatury z próbkami lub odczynnikami kontrolnymi nale¿y starannie przemyæ strefê zanieczyszczenia 1% (v/v) roztworem podchlorynu sodu z preparatem Alconox i sp³ukaæ dok³adnie wod¹. Przed przyst¹pieniem do dalszych etapów testu nale¿y odczekaæ, a¿ powierzchnia bêdzie ca³kowicie sucha. Przed czyszczeniem jakichkolwiek odczynników QIAGEN do przygotowywania próbek, nale¿y wytrzeæ zanieczyszczone powierzchnie wod¹, a nastêpnie zastosowaæ 1% roztwór (v/v) podchlorynu sodu zawieraj¹cy preparat Alconox.

14. Do przenoszenia przygotowanych próbek do mikrostudzienek do zalewania cieczy i przenoszenia próbek z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji u¿ywaæ wy³¹cznie pipetora BD ProbeTec ET i koñcówek BD ProbeTec ET.

15. Przestrzegaæ przyjêtych praktyk laboratoryjnych dotycz¹cych usuwania zu¿ytych koñcówek pipet, probówek na próbki, mikrostudzienek do zalewania cieczy i innych odpadów. Ostro¿nie wyrzucaæ produkty jednorazowego u¿ytku. Pojemniki na odpady nale¿y uszczelniæ i wyrzuciæ, gdy zostan¹ wype³nione w ¾ swojej pojemnoœci lub codziennie (w zale¿noœci od tego, co bêdzie pierwsze).

16. Nie zamieniaæ i nie mieszaæ mikrostudzienek, odczynników kontrolnych ani odczynników do przetwarzania próbek pochodz¹cych z zestawów o ró¿nych numerach seryjnych.

17. W przypadku wyst¹pienia niecodziennych sytuacji, takich jak wylanie siê p³ynu do wnêtrza aparatu BD ProbeTec ET lub zanieczyszczenie DNA, którego nie mo¿na usun¹æ myciem, nale¿y skontaktowaæ siê z obs³ug¹ techniczn¹.

POBIERANIE I TRANSPORT PRÓBEK1. Pobieranie próbek

Wszystkie próbki nale¿y pobieraæ zgodnie z zaleceniami zawartymi w podrêczniku Clinical Microbiology Procedures Handbook10 lub z podrêcznikiem procedur laboratoryjnych obowi¹zuj¹cym w laboratorium U¿ytkownika.

2. Przechowywanie i transport próbek • Próbki mog¹ byæ przechowywane/transportowane w temperaturze od 18 do 33°C nie d³u¿ej ni¿ przez 6 godz. • Próbki mog¹ byæ przechowywane w lodówce, w temperaturze od 2 do 8°C nie d³u¿ej ni¿ przez 3 dni. • Próbki mog¹ byæ przechowywane w temperaturze -20°C lub ni¿szej, nie d³u¿ej ni¿ przez 14 tygodni.

PROCEDURA TESTOWAAby uzyskaæ szczegó³owe instrukcje u¿ytkowania i obs³ugi sk³adników systemu, nale¿y zapoznaæ siê z podrêcznikiem u¿ytkownika systemu BD ProbeTec ET.

A. Przygotowanie aparatu:1. Przed rozpoczêciem testu w³¹czyæ aparat i odczekaæ, a¿ osi¹gnie temperaturê robocz¹. a. Blok grzewczy Priming and Warming Heater nagrzewa siê i stabilizuje przez oko³o 90 min. Wartoœæ nastawcza sk³adowej „Priming” bloku grzewczego Priming and Warming Heater wynosi 72,5°C.

Wartoœæ nastawcza sk³adowej „Warming” bloku grzewczego Priming and Warming Heater wynosi 54°C. b. Aparat BD ProbeTec ET jest sterowany programowo; czas osi¹gniêcia temperatury roboczej wynosi oko³o 30 min.

4

2. Przed rozpoczêciem testu nale¿y sprawdziæ temperatury podgrzewacza. Zapisaæ temperatury w systemie BD ProbeTec ET System Maintenance Log.

a. Blok grzewczy Priming and Warming Heater Termometr bloku grzewczego Priming Heater powinien wskazywaæ temperaturê od 72 do 73°C. Termometr bloku grzewczego Warming Heater powinien wskazywaæ temperaturê od 53,5 do 54,5°C.3. Sprawdziæ temperaturê wyœwietlan¹ na ekranie aparatu BD ProbeTec ET. Temperatura powinna wynosiæ

od 47,5 do 55,0°C. Zapisaæ temperatury w systemie BD ProbeTec ET System Maintenance Log.B. Pipetor:Aby uzyskaæ szczegó³owe wyjaœnienia funkcji klawiatury pipetora BD ProbeTec ET, nale¿y zapoznaæ siê z podrêcznikiem u¿ytkownika systemu BD ProbeTec ET. Dodatkowo, pipetor BD ProbeTec ET powinien byæ czyszczony po ka¿dym u¿yciu. W celu uzyskania wskazówek na temat prawid³owego czyszczenia i obs³ugi pipetora BD ProbeTec ET nale¿y skontaktowaæ siê z przedstawicielem obs³ugi technicznej.Do wykonania testu BD ProbeTec ET LP wymagane s¹ nastêpuj¹ce programy. Program 1 s³u¿y do przenoszenia p³ynu z przetworzonych próbek do mikrostudzienek LP do zalewania cieczy. Program 5 s³u¿y do przenoszenia p³ynu z mikrostudzienek LP do zalewania cieczy do mikrostudzienek LP przeznaczonych do amplifikacji. Pipetor nale¿y zaprogramowaæ w nastêpuj¹cy sposób:Program 1: 1. W£¥CZYÆ pipetor. Pipetor emituje pojedynczy sygna³ dŸwiêkowy, przez chwilê jest wyœwietlane „ZERO” i

„Software Version #” (wersja oprogramowania), a nastêpnie jest emitowany kolejny sygna³ dŸwiêkowy.2. Wcisn¹æ niebieski przycisk „Prog” (program). Aby wybraæ program 1, nale¿y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk

„Vol” (objêtoœæ), a¿ wyœwietli siê „1”. Wcisn¹æ przycisk „Enter”.3. Aby przejœæ do trybu programowania, nale¿y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk „Prog”. Przytrzymuj¹c

wciœniêty przycisk „Prog”, u¿ywaj¹c koñcówki pipety lub spinacza do papieru, wcisn¹æ specjalny przycisk funkcyjny (Special Function Key).

4. Wcisn¹æ przycisk „Fill”. Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a¿ wyœwietli siê 200. Wcisn¹æ przycisk „Enter”.5. Wcisn¹æ przycisk „Disp” (dozowanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a¿ zostanie wyœwietlone 150.

Wcisn¹æ przycisk „Enter”.6. W celu zapisania danych i zakoñczenia programu ponownie wcisn¹æ przycisk „Enter”. Pipetor powinien

emitowaæ sygna³ dŸwiêkowy potwierdzaj¹cy zakoñczenie programowania.7. Zweryfikowaæ program – wcisn¹æ przycisk spustowy, by przejrzeæ wszystkie etapy. Po zakoñczeniu

poszczególnych etapów nale¿y ustawiæ prêdkoœæ pobierania/dozowania za pomoc¹ przycisku „Vol” (objêtoœæ). Na ka¿dym etapie jest wyœwietlany wskaŸnik szybkoœci. Stosuj¹c przycisk „Vol”, nastawiæ wskaŸnik szybkoœci tak, aby wyœwietla³ 2 kwadraty dla kroków „Fill” (nape³nianie) i „Disp” (dozowanie).

Program 51. Wcisn¹æ przycisk „Prog” (program). Aby wybraæ program 5, nale¿y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk „Vol”,

a¿ zostanie wyœwietlone „5”. Wcisn¹æ przycisk „Enter”.2. Aby przejœæ do trybu programowania, nale¿y wcisn¹æ i przytrzymaæ przycisk „Prog”. Przytrzymuj¹c

wciœniêty przycisk „Prog”, u¿ywaj¹c koñcówki pipety lub spinacza do papieru, wcisn¹æ specjalny przycisk funkcyjny (Special Function Key).

3. Wcisn¹æ przycisk „Fill.” Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a¿ zostanie wyœwietlone 100. Wcisn¹æ przycisk „Enter.”

4. Wcisn¹æ przycisk „Disp.” Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a¿ zostanie wyœwietlone 100. Wcisn¹æ przycisk „Enter.”

5. Wcisn¹æ przycisk Mix.” (mieszanie). Wcisn¹æ przycisk strza³ki w górê, a¿ zostanie wyœwietlone 50. Wcisn¹æ przycisk „Enter.”

6. W celu zapisania danych i zakoñczenia programu ponownie wcisn¹æ przycisk „Enter”. Pipetor powinien emitowaæ sygna³ dŸwiêkowy potwierdzaj¹cy zakoñczenie programowania.

7. Zweryfikowaæ program – wcisn¹æ przycisk spustowy, by przejrzeæ wszystkie etapy. Po zakoñczeniu poszczególnych etapów nale¿y ustawiæ prêdkoœæ pobierania/dozowania/mieszania za pomoc¹ przycisku „Vol” (objêtoœæ). Na ka¿dym etapie pojawia siê wskaŸnik szybkoœci. Stosuj¹c przycisk „Vol”, nastawiæ wskaŸnik szybkoœci tak, aby wyœwietla³ 2 kwadraty dla etapów pobierania i dozowania. Stosuj¹c przycisk „Vol”, nastawiæ wskaŸnik szybkoœci tak, by wyœwietla³ 3 kwadraty.

5

Przegl¹d programówPrzed rozpoczêciem procedury nale¿y dokonaæ przegl¹du programów. W celu dokonania przegl¹du programów nale¿y W£¥CZYÆ pipetor. Wcisn¹æ niebieski przycisk „Prog” (program). Wcisn¹æ przycisk „Vol” (objêtoœæ), a¿ zostanie wyœwietlony numer w³aœciwego programu (1 lub 5). Wcisn¹æ przycisk „Enter”. Aby przejrzeæ program krok po kroku, nale¿y u¿ywaæ przycisku spustowego pipetora.Program 1: Program obejmuje pobranie 200 μL i dozowanie 150 μL do mikrostudzienki LP. Na wyœwietlaczu pipetora powinny byæ wyœwietlane nastêpuj¹ce dane:Fill 200 μL – S ▐▐

Dispense 150 μL – S ▐▐

Program 5: Program obejmuje pobranie 100 μL, dozowanie 100 μL i trzykrotne mieszanie 50 μL. Na wyœwietlaczu pipetora powinny byæ wyœwietlane nastêpuj¹ce dane:Fill 100 μL – S ▐▐

Dispense 100 μL – S ▐▐

Mix 50 μL – S ▐▐▐

Zero (wyœwietlane pulsacyjnie)C. Uk³ad p³ytki:Po wprowadzeniu do systemu rodzaju testu, danych identyfikacyjnych próbek, numerów seryjnych kontroli i numerów seryjnych zestawu aparat BD ProbeTec ET wyœwietla Raport o uk³adzie p³ytki. Raport o uk³adzie p³ytki przedstawia przestrzenne rozmieszczenie próbek badanych i kontrolnych na ka¿dej badanej p³ytce. Rozmieszczenie ma zastosowanie zarówno dla p³ytki Priming Microwell, jak i p³ytki Amplification Microwell. Mikrostudzienki do zalewania cieczy przeznaczone do testu LP maj¹ jednolicie szare paski. Mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji maj¹ szare pr¹¿kowane paski. D. Przetwarzanie próbek pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych:Uwagi odnoœnie do procedury:• Przed rozpoczêciem nale¿y zapoznaæ siê z istotnymi uwagami dotycz¹cymi procedury oraz œrodkami

ostro¿noœci zawartymi w podrêczniku QIAGEN QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook.• Przed rozpoczêciem przetwarzania próbki nale¿y wype³niæ ³aŸniê wodn¹ destylowan¹ wod¹ i podgrzaæ

do temperatury 70°C (± 5°C).• Do oznakowania pojemników i probówek nale¿y u¿yæ markerów odpornych na alkohol.• Miêdzy przenoszeniem wszystkich p³ynów nale¿y zmieniaæ koñcówki pipety. Zaleca siê u¿ywanie

koñcówek z barier¹ dla aerozolu.• Przed u¿yciem nale¿y odczekaæ, a¿ Rozcieñczalnik BD ProbeTec ET do próbek z uk³adu oddechowego i

pod³o¿a (CF/LP/MP) osi¹gnie temperaturê pokojow¹, a nastêpnie wymieszaæ, delikatnie go odwracaj¹c.• W czystym pojemniku umieœciæ odpowiedni¹ iloœæ Rozcieñczalnika BD ProbeTec ET do próbek z uk³adu

oddechowego i pod³o¿a (CF/LP/MP). Aby oszacowaæ wymagan¹ iloœæ, nale¿y u¿yæ 0,4 mL do ka¿dej próbki, a nastêpnie dodaæ kolejne 1–2 mL dla u³atwienia pipetowania. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia rozcieñczalnika – nie nale¿y wlewaæ jego pozosta³oœci z powrotem do butelki.

1. Przygotowaæ odczynniki QIAGEN (zob. „Przygotowanie odczynników” w podrêczniku QIAamp DNA Stool Mini Kit Handbook).

2. Nale¿y pozostawiæ fiolki do uzyskania temperatury pokojowej.3. Oznakowaæ 2 mL probówki z przykrywk¹ zatrzaskow¹ ka¿dej badanej próbki.Opisane poni¿ej kroki powinny byæ wykonywane w komorze bezpieczeñstwa biologicznego (BSC):4. ¯eby wymieszaæ próbki, nale¿y obracaæ nimi miarowo przez 5–15 sekund. 5. Za pomoc¹ pipety przenieœæ 350 μL próbki do oznakowanej probówki.UWAGA: Próbki plwociny mog¹ byæ trudne do precyzyjnego pobrania pipet¹. Jeœli taka sytuacja ma miejsce, aby upewniæ siê, ¿e w probówce jest odpowiednia iloœæ materia³u, nale¿y pomocniczo u¿yæ skali na powierzchni probówki. Alternatywnie, dla porównania, mo¿na u¿yæ probówki, w której umieszczono 350 μL wody.6. Po dodaniu próbek nale¿y ZMIENIÆ RÊKAWICZKI.7. Do ka¿dej probówki przenieœæ za pomoc¹ pipety 150 μL buforu QIAGEN ASL.8. Do ka¿dej probówki przenieœæ za pomoc¹ pipety 25 μL Proteinazy K QIAGEN.9. Do ka¿dej probówki przenieœæ za pomoc¹ pipety 500 μL buforu litycznego QIAGEN AL.10. Zamkn¹æ ka¿d¹ probówkê i obracaæ miarowo przez 5 sekund Umieœciæ probówki w stojaku ³aŸni wodnej

z przykrêcan¹ pokryw¹.

6

Opisane poni¿ej kroki mog¹ byæ wykonywane poza komor¹ bezpieczeñstwa biologicznego (BSC):11. Inkubowaæ probówki w ³aŸni wodnej w temperaturze 70°C (± 5°C) przez 15 minut. 12. Po up³ywie 15 minutach usun¹æ probówki z ³aŸni wodnej i wirowaæ (16 000 x g) przez oko³o 5 sekund. 13. Wyj¹æ probówki z wirówki. Otworzyæ ka¿d¹ probówkê i dodaæ 500 μL etanolu o stê¿eniu 96–100%.14. Zamkn¹æ ponownie ka¿d¹ probówkê i obracaæ miarowo przez 5 sekund.15. Wirowaæ próbki (16 000 x g) przez oko³o 5 sekund. 16. Oznakowaæ kolumnê QIAGEN i probówkê dla ka¿dej próbki.17. Przenieœæ 700 μL próbki do odpowiednio oznakowanej kolumny QIAGEN.18. Wirowaæ probówki (16 000 x g) przez 1 minutê. 19. Przenieœæ kolumny do nowych probówek QIAamp. Wyrzuciæ probówki zawieraj¹ce przes¹cz.20. Ostro¿nie przenieœæ dodatkowe 700 μL próbki do odpowiedniej kolumny.21. Wirowaæ probówki (16 000 x g) przez 1 minutê. 22. Przenieœæ kolumny do czystych probówek QIAamp. Wyrzuciæ probówki zawieraj¹ce przes¹cz.23. Otworzyæ kolumny QIAamp i do ka¿dej dodaæ 500 μL buforu p³ucz¹cego QIAGEN AW1.24. Wirowaæ probówki (16 000 x g) przez 1 minutê 25. Przenieœæ kolumny do nowych probówek QIAamp. Wyrzuciæ probówki zawieraj¹ce przes¹cz.26. Otworzyæ kolumny QIAamp i do ka¿dej dodaæ 500 μL buforu p³ucz¹cego QIAGEN AW2.27. Wirowaæ probówki (16 000 x g) przez 3 minuty 28. Przenieœæ kolumny do oznakowanych koñcowych probówek QIAamp. Wyrzuciæ probówki zawieraj¹ce

przes¹cz. UWAGA: Probówka powinna byæ oznakowana w tym miejscu.UWAGA: Nale¿y zachowaæ ostro¿noœæ i upewniæ siê, ¿e ¿aden p³yn nie przywar³ do podstawy kolumny. Przeniesienie pozosta³oœci po p³ukaniu do probówki mo¿e wp³yn¹æ na wyniki.29. Otworzyæ kolumny i do ka¿dej dodaæ 225 μL buforu elucyjnego QIAGEN AE.30. Inkubowaæ w temperaturze pokojowej przez 1 minutê.31. Wirowaæ probówki (16 000 x g) przez 1 minutê. 32. Wyrzuciæ kolumny.33. Oznakowaæ zakrêcane probówki o pojemnoœci 2 mL dla ka¿dej badanej próbki.34. Do ka¿dej zakrêcanej probówki przenieœæ 400 μL Rozcieñczalnika do próbek z uk³adu oddechowego i

pod³o¿a (CF/LP/MP). UWAGA: W celu u¿ycia ³aŸni wodnej w kroku 38 nape³niæ j¹ wod¹ destylowan¹ i doprowadziæ j¹ do wrzenia.35. Przenieœæ 200 μL eluatu do odpowiednio oznakowanej probówki zawieraj¹cej 400 μL Rozcieñczalnika

do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a (CF/LP/MP).36. Zamkn¹æ probówkê i obracaæ miarowo przez 5 sekund37. Przygotowaæ próbki kontrolne. Zob. Przygotowanie próbek kontrolnych pochodz¹cych z dolnych dróg

oddechowych (Rozdzia³ E). 38. Przenieœæ próbki badane i kontrolne do stojaka ³aŸni wodnej.39. Umieœciæ stojak ³aŸni wodnej we wrz¹cej wodzie na 5 minut.40. Po up³ywie 5 minut nale¿y wyj¹æ stojak ³aŸni wodnej i odczekaæ 15 minut, a¿ probówki osi¹gn¹

temperaturê pokojow¹.OSTRZE¯ENIE: Wrz¹ca woda, stojak i powierzchnie ³aŸni wodnej mog¹ byæ gor¹ce. Aby unikn¹æ oparzenia, nale¿y zachowaæ ostro¿noœæ.41. Po sch³odzeniu wirowaæ (16 000 x g) przez oko³o 5 sekund. UWAGA: Po doprowadzeniu próbek do wrzenia: a. Mo¿na je przechowywaæ w temperaturze 18–33°C nie d³u¿ej ni¿ 6 godzin i mog¹ byæ testowane bez

ponownego doprowadzania do wrzenia. b. Mo¿na je przechowywaæ w temperaturze 2–8°C nie d³u¿ej ni¿ 3 dni. Przed wykonaniem testu próbki

musz¹ zostaæ odwirowane i ponownie doprowadzone do wrzenia. c. Mo¿na je przechowywaæ w temperaturze ≤ -20°C nie d³u¿ej ni¿ 14 tygodni. Przed wykonaniem

testu próbki musz¹ zostaæ rozmro¿one w temperaturze pokojowej, odwirowane i ponownie doprowadzone do wrzenia.

42. Próbki s¹ gotowe do wykonania procedury testowej BD ProbeTec ET LP Assay (Rozdzia³ F).

7

E. Przygotowanie próbek kontrolnych pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych: 1. Dla ka¿dego planowanego cyklu testu (p³ytki) nale¿y przygotowaæ jedn¹ probówkê kontroln¹

negatywn¹ (CF/LP/MP) i jedn¹ pozytywn¹ (CF/LP/MP). Je¿eli p³ytka zawiera zestawy odczynników o wiêcej ni¿ jednym numerze seryjnym, próbki kontrolne powinny zostaæ przetestowane oddzielnie dla ka¿dej serii.

2. Przed u¿yciem delikatnie odwróciæ bufor QIAGEN AE i Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a.

3. Zdj¹æ nakrêtkê z probówki kontroli negatywnej (CF/LP/MP).4. Przy u¿yciu nowej koñcówki pipety dla ka¿dej probówki kontrolnej, dodaæ po 200 μL buforu QIAGEN AE.5. Przy u¿yciu nowej koñcówki pipety dla ka¿dej probówki kontrolnej, dodaæ po 400 μL Rozcieñczalnika do

próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a.6. Ponownie szczelnie zamkn¹æ probówkê.7. Zdj¹æ nakrêtkê z probówki kontroli pozytywnej (CF/LP/MP).8. Przy u¿yciu nowej koñcówki pipety dla ka¿dej probówki kontrolnej dodaæ po 200 μL buforu QIAGEN AE.9. Przy u¿yciu nowej koñcówki pipety dla ka¿dej probówki kontrolnej dodaæ po 400 μL Rozcieñczalnika do

próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a.10. Ponownie szczelnie zamkn¹æ probówkê.11. Mieszaæ zawartoœæ probówek przez 5 sekund.12. Probówki kontrolne s¹ teraz gotowe do doprowadzenia do wrzenia. Zob. Przetwarzanie próbek

pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych (Rozdzia³ D).F. Procedura testowa testu BD ProbeTec ET LP Assay:UWAGA: Przed przyst¹pieniem do procedury testowej próbki badane i kontrolne nale¿y ustawiæ na stojaku przystosowanym do probówek o pojemnoœci 2 mL, takim jak statyw BD ProbeTec ET na probówki o pojemnoœci 2 mL, kompatybilnymi z pipetorem BD ProbeTec ET.1. Zdj¹æ i wyrzuciæ nakrêtki ze sch³odzonych próbek i probówek kontrolnych.2. Aby unikn¹æ zanieczyszczenia, przed przyst¹pieniem do dalszej czêœci ZMIENIÆ RÊKAWICZKI.3. Pos³uguj¹c siê Raportem o uk³adzie p³ytki, przygotowaæ p³ytkê mikrostudzienek Priming Microwell –

zob. Uk³ad p³ytki (Rozdzia³ C).4. Ponownie uszczelniæ opakowania mikrostudzienek w nastêpuj¹cy sposób: a. Umieœciæ opakowanie na równej powierzchni. Jedn¹ rêk¹ trzymaæ otwarty koniec p³ytki. b. Naciskaj¹c p³ytkê, przesuwaæ palec wzd³u¿ zewnêtrznej strony uszczelnienia, poruszaj¹c siê od jednej

do drugiej krawêdzi opakowania. c. Sprawdziæ, czy opakowanie zosta³o uszczelnione.5. Wybraæ Program 1 na pipetorze BD ProbeTec ET.6. Pobraæ koñcówki do pipety. Rozwin¹æ pipetor BD ProbeTec ET przez ca³kowite wyci¹gniêcie pokrêt³a

regulacyjnego.UWAGA: Aby unikn¹æ przecieku, nale¿y siê upewniæ, ¿e koñcówki s¹ pewnie umocowane na pipetorze.

7. Pobraæ 200 μL z pierwszej kolumny próbek. 8. Naciskaj¹c delikatnie pipetor, dotkn¹æ koñcówkami pipety œcianek studzienek i wprowadziæ 150 μL do

kolumn odpowiadaj¹cych mikrostudzienkom do zalewania cieczy (1 A–H). UWAGA: Nie naley naciska pipetora nad próbkami ani mikrostudzienkami, poniewa moe to spowodowa zanieczyszczenie. Wykonywanie gwałtownych ruchów moe spowodowa powstawanie kropelek i aerozoli.

9. Wyrzuciæ koñcówki. Wcisn¹æ przycisk spustowy pipetowania w celu wyzerowania pipetora. UWAGA: Koñcówki nale¿y wyrzucaæ ostro¿nie, aby unikn¹æ powstawania kropelek i aerozoli mog¹cych

spowodowaæ zanieczyszczenie miejsca pracy.10. Pobraæ nowe koñcówki, rozwin¹æ pipetor i pobraæ 200 μL z drugiej kolumny próbek.11. Naciskaj¹c delikatnie pipetor, dotkn¹æ koñcówkami pipety œcianek studzienek i wprowadziæ 150 μL do

kolumn odpowiadaj¹cych mikrostudzienkom do zalewania cieczy (2 A–H).12. Wyrzuciæ koñcówki.13. Kontynuowaæ przenoszenie pozosta³ych próbek przeznaczonych do danego cyklu.14. Przykryæ p³ytkê Priming Microwell pokryw¹ Priming Cover i pozostawiæ do inkubacji w temperaturze pokojowej na

co najmniej 20 minut. (Maksymalnie do 6 godzin). UWAGA: Zamkn¹æ ponownie przygotowane próbki nowymi nakrêtkami. ZMIENIÆ RÊKAWICZKI.

15. Pod koniec inkubacji p³ytki Priming Microwell przygotowaæ p³ytkê Amplification Microwell. Rozmieœciæ mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji na p³ytce w sposób odpowiadaj¹cy Raportowi o uk³adzie p³ytki (podobnie jak w przypadku p³ytki priming). Ponownie uszczelniæ opakowanie mikrostudzienek zgodnie z procedur¹ opisan¹ w kroku 4.

8

16. Zdj¹æ pokrywê z p³ytki Priming Microwell i przenieœæ p³ytkê do bloku grzewczego Priming Heater. W celu wstêpnego ogrzania NATYCHMIAST umieœciæ p³ytkê Amplification Microwell w bloku grzewczym Warming Heater.

17. Ustawiæ minutnik na 10 minut. (UWAGA: Dla tego kroku czas ma zasadnicze znaczenie).18. Pod koniec 10-minutowej inkubacji (+/- 1 minuta) wybra na pipetorze Program 5.19. Pobraæ koñcówki do pipety i przenieœæ 100 μL z kolumny 1 p³ytki Priming Microwell do kolumny 1

p³ytki Amplification Microwell. Wprowadziæ p³yn, dotykaj¹c koñcówkami pipety œcianek studzienek. Po zakoñczeniu dozowania p³ynu odczekaæ, a¿ pipetor automatyczne zmiesza ciecz w studzienkach. Delikatnie przenieœæ pipetor poza p³ytkê. Unikaæ dotkniêcia innych studzienek.

20. Wyrzuciæ koñcówki. Pobraæ nowe koñcówki i kontynuowaæ przenoszenie mieszaniny reakcyjnej z mikrostudzienek do zalewania cieczy do mikrostudzienek przeznaczonych do amplifikacji, kolumna po kolumnie, u¿ywaj¹c nowych koñcówek dla ka¿dej z kolumn.

21. Po przeniesieniu wszystkich kolumn usun¹æ podklejkê z uszczelki Amplification sealer (Jedna uszczelka Amplification sealer (1/2) pozwala na pokrycie maksymalnie do 6 kolumn. Je¿eli stosuje siê wiêcej ni¿ 6 kolumn, KONIECZNE jest u¿ycie pe³nego arkusza uszczelek). Trzymaj¹c brzegi uszczelki, na³o¿yæ uszczelkê na mikrostudzienki. Przy nak³adaniu uszczelki nale¿y stosowaæ wskazówki dotycz¹ce bloku grzewczego. Docisn¹æ uszczelkê w celu zapewnienia ca³kowitego uszczelnienia wszystkich mikrostudzienek.

22. W interfejsie u¿ytkownika urz¹dzenia BD ProbeTec ET wysun¹æ stojak, otworzyæ drzwiczki i unieœæ pokrywê p³ytki. NATYCHMIAST (w ci¹gu 30 sekund) przenieœæ uszczelnion¹ p³ytkê Amplification Microwell do aparatu BD ProbeTec ET i rozpocz¹æ cykl. (Szczegó³owe instrukcje znajduj¹ siê w podrêczniku u¿ytkownika Systemu BD ProbeTec ET.)

23. Po rozpoczêciu cyklu nale¿y postêpowaæ zgodnie z nastêpuj¹cymi procedurami porz¹dkowymi: a. Uszczelniæ mikrostudzienki do zalewania cieczy uszczelk¹ Amplification sealer i wyj¹æ p³ytkê z

bloku grzewczego Priming and Warming Heater. OSTRZE¯ENIE: Temperatura przekracza 70°C. Do wyjmowania p³ytki nale¿y u¿ywaæ rêkawicy termoodpornej.

b. Odczekaæ 5 minut, pozostawiaj¹c p³ytkê na blacie do sch³odzenia. c. Usun¹æ uszczelnienie mikrostudzienek do zalewania cieczy z p³ytki, trzymaj¹c uszczelkê z obu stron i

unosz¹c studzienki w ca³oœci ku górze. Umieœciæ uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady i uszczelniæ.

d. Wyczyœciæ metalow¹ p³ytkê: Sp³ukaæ p³ytkê 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) – roztwór Alconox. Sp³ukaæ p³ytkê wod¹.

Przed ponownym u¿yciem nale¿y zawin¹æ p³ytkê w czysty papierowy rêcznik i pozostawiæ do ca³kowitego wyschniêcia.

24. Po zakoñczeniu cyklu zostanie utworzony wydruk zawieraj¹cy wyniki testu.25. Wysun¹æ stojak p³ytki, otworzyæ drzwiczki i wyj¹æ p³ytkê. Zamkn¹æ drzwiczki i ponownie umieœciæ p³ytkê

wewn¹trz aparatu.26. Usun¹æ z p³ytki uszczelnione mikrostudzienki przeznaczone do amplifikacji. PRZESTROGA: Nie usuwaæ

z mikrostudzienek materia³u uszczelniaj¹cego. Uszczelnione mikrostudzienki mo¿na ³atwo usun¹æ w ca³oœci, trzymaj¹c uszczelkê z góry i z do³u oraz podnosz¹c p³ytkê prosto do góry i na zewn¹trz. Umieœciæ uszczelnione mikrostudzienki w torebce na odpady. Uszczelniæ torebkê.

27. Wyczyœciæ metalow¹ p³ytkê: Sp³ukaæ p³ytkê 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) – roztwór Alconox. Sp³ukaæ p³ytkê wod¹.

Przed ponownym u¿yciem nale¿y zawin¹æ p³ytkê w czysty papierowy rêcznik i pozostawiæ do ca³kowitego wyschniêcia.

28. Po zakoñczeniu ostatniego cyklu danego dnia nale¿y wype³niæ nastêpuj¹ce procedury porz¹dkowe: a. Nas¹czyæ papierowe rêczniki lub gaziki 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z roztworem Alconox,

a nastêpnie zastosowaæ je do mycia blatów i zewnêtrznych powierzchni bloku grzewczego Priming and Warming Heater, stojaka na probówki o pojemnoœci 2 mL, ³aŸni wodnych, wirówki oraz aparatu BD ProbeTec ET. Pozostawiæ roztwór na powierzchniach przez 2–3 minuty. Nas¹czyæ wod¹ rêczniki papierowe lub gaziki i usun¹æ roztwór czyszcz¹cy. Podczas nak³adania roztworu myj¹cego i sp³ukiwania wod¹ nale¿y czêsto wymieniaæ rêczniki lub gaziki. Zwil¿yæ rêczniki papierowe lub gaziki 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox i wytrzeæ rêkojeœæ pipetora (JEDYNIE RÊKOJEŒÆ). Po 2–3 minutach wytrzeæ rêkojeœæ zwil¿onymi wod¹ rêcznikami papierowymi lub gazikami.

b. Na 1–2 minuty zanurzyæ stojak ³aŸni wodnej i p³ytki w 1% roztworze podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox. Dok³adnie sp³ukaæ wod¹ i wysuszyæ na powietrzu.

c. Na³adowaæ ponownie pipetor. d. Szczelnie zamkniête torebki na odpady i odpady ska¿one mikrobiologicznie nale¿y usuwaæ zgodnie z

przyjêtymi procedurami usuwania zanieczyszczonego materia³u odpadowego.

9

29. Co najmniej raz w tygodniu przeprowadzaæ nastêpuj¹ce procedury: a. Usuwaæ wodê z ³aŸni wodnych. b. Czyœciæ ³aŸnie wodne 1% roztworem podchlorynu sodu (v/v) z preparatem Alconox. Sp³ukaæ wod¹ i

wysuszyæ na powietrzu. c. Nape³niæ ponownie wod¹ destylowan¹.

Kontrola jakoœciNale¿y postêpowaæ zgodnie z obowi¹zuj¹cymi wymogami kontroli jakoœci, wynikaj¹cymi z przepisów miejscowych, krajowych lub federalnych, wymogami akredytacji i rutynowymi procedurami kontroli jakoœci w danym laboratorium. Zaleca siê, aby u¿ytkownik stosowa³ siê do odpowiednich wytycznych CLSI (dawniej NCCLS) i przepisów CLIA dotycz¹cych sposobów kontroli jakoœci.Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a i próbki kontrolne s¹ dostarczane ³¹cznie w zestawie Respiratory and Media Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a i zestaw kontrolny) (CF/LP/MP). W ramach ka¿dego cyklu testowego na p³ytce, a tak¿e dla ka¿dego nowego numeru seryjnego zestawu odczynników, nale¿y stosowaæ jedn¹ kontrolê pozytywn¹ i jedn¹ negatywn¹. Próbki kontrolne mo¿na umieszczaæ w sposób losowy. Kontrola pozytywna s³u¿y do monitorowania defektu odczynników. Kontrola negatywna s³u¿y do monitorowania zanieczyszczenia odczynnika i/lub otoczenia. Aby podawaæ wyniki próbek, konieczne jest uzyskanie dodatniego wyniku kontroli pozytywnej i ujemnego kontroli negatywnej. Je¿eli wyniki kontroli ró¿ni¹ siê od oczekiwanych, cykl oznaczania uwa¿a siê za niewa¿ny, a aparat nie przedstawi wyników testu próbek pochodz¹cych od pacjentów. Je¿eli cykl próbek kontrolnych nie osi¹gnie spodziewanych wyników, nale¿y powtórzyæ ca³y cykl z zastosowaniem nowego zestawu próbek kontrolnych, nowych mikrostudzienek i przetwarzanych próbek. Jeœli podczas powtórnego testu obecne s¹ resztki przetwarzanej próbki, nale¿y ponownie przeprowadziæ test przy u¿yciu innej porcji pochodz¹cej z poprzedniej próbki. Je¿eli powtórna kontrola jakoœci nie przyniesie spodziewanych wyników, nale¿y skontaktowaæ siê z obs³ug¹ techniczn¹ (zob. „Interpretacja wyników”).Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (Internal Amplification Control, IAC) jest wbudowana do mikrostudzienek Priming Microwell. Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (IAC) zawiera docelowy kwas nukleinowy, amplifikowany w obecnoœci macierzy próbki. Wewnêtrzna kontrola amplifikacji (IAC) jest przeznaczona do potwierdzania wiarygodnoœci reakcji amplifikacji oraz identyfikacji czynników hamuj¹cych amplifikacjê, zawartych w przetwarzanej próbce.

Kontrole przetwarzanych próbekKontrole przetwarzanych próbek mog¹ byæ testowane zgodnie z wymaganiami odpowiednich akredytowanych organizacji. Kontrola pozytywna powinna sprawdzaæ ca³y system testowy. W tym celu próbki o znanym wyniku dodatnim mog¹ s³u¿yæ jako kontrola w stosunku do poddawanych przetwarzaniu i testowaniu nieznanych próbek. Próbki s³u¿¹ce jako kontrola procesu przetwarzania musz¹ byæ przechowywane, przetwarzane i testowane zgodnie z wk³adk¹ produktu. Kontrole przetwarzanych próbek, naœladuj¹ce próbki pochodz¹ce z dolnych dróg oddechowych, mog¹ byæ przygotowane tak¿e w przedstawiony poni¿ej sposób:1. Wyj¹æ fiolkê liofilizowanego L. pneumophila ATCC 33152 (Philadelphia-1) z ch³odziarki, w której by³a

przechowywana w temperaturze -20°C lub ni¿szej.2. Nawodniæ 1 mL 0,85% (w/v) roztworu soli fizjologicznej zawieraj¹cego 0,2% (w/v) Albuminê bydlêc¹

(Frakcja V).3. Rozcieñczyæ nawodniony zapas L. pneumophila do 1:100 000 w 0,85% (w/v) roztworze soli fizjologicznej

zawieraj¹cym 0,2% (w/v) Albuminê bydlêc¹ (Frakcja V).4. Za pomoc¹ pipety przenieœæ 350 μL rozcieñczonego L. pneumophila do probówki z przykrywk¹

zatrzaskow¹.5. Przetworzyæ w sposób opisany w rozdziale Przetwarzanie próbek pochodz¹cych z dolnych dróg

oddechowych (Rozdzia³ D).

Monitorowanie w kierunku kontaminacji DNACo najmniej raz w miesi¹cu nale¿y przeprowadziæ nastêpuj¹c¹ procedurê testow¹, s³u¿¹c¹ do monitorowania miejsca pracy i powierzchni oprzyrz¹dowania pod k¹tem zanieczyszczenia DNA. Monitorowanie otoczenia ma podstawowe znaczenie dla wykrycia zanieczyszczenia, jeszcze przed wyst¹pieniem problemu. 1. W przypadku ka¿dej powierzchni* poddawanej testowi nale¿y stosowaæ wymazówki BBL CultureSwab EZ.2. Oznakowaæ zakrêcane probówki o pojemnoœci 2 mL ka¿dej badanej powierzchni. Za pomoc¹ pipety

przenieœæ 600 μL Rozcieñczalnika do próbek z uk³adu oddechowego i pod³o¿a do ka¿dej probówki, a nastêpnie dodaæ 300 μL buforu AE QIAGEN lub destylowanej wody do celów biologii molekularnej. Mieszaæ probówkê przez 5 sekund.

3. Zanurzyæ pierwsz¹ wymazówkê w rozcieñczalniku przygotowanym w kroku 2, a nastêpnie szerokim ruchem przetrzeæ pierwsz¹ badan¹ powierzchniê.

10

4. Zamieszaæ wymazówk¹ w rozcieñczalniku i wycisn¹æ, dotykaj¹c œcianek probówki. Ponownie zamkn¹æ probówkê i mieszaæ przez 5 sekund. Wyrzuciæ wymazówkê.

5. Powtórzyæ procedurê dla ka¿dej testowanej powierzchni.6. Umieœciæ probówki w stojaku ³aŸni wodnej i podgrzewaæ we wrz¹cej wodzie przez 5 minut. Wyj¹æ

stojak z wrz¹cej ³aŸni wodnej i przed kontynuowaniem odstawiæ próbki na 15 minut w temperaturze pokojowej do sch³odzenia.

7. Po sch³odzeniu wirowaæ (16 000 x g) przez oko³o 5 sekund.8. W trakcie podgrzewania probówek, za pomoc¹ czystych, nas¹czonych wod¹ rêczników, nale¿y

usun¹æ pozosta³oœci mieszaniny buforów z powierzchni, z których pobierano wymazy.9. Po sch³odzeniu próbek nale¿y postêpowaæ zgodnie z procedur¹ testow¹ testu BD ProbeTec ET LP

Assay (Rozdzia³ F).*Testowania wymagaj¹ nastêpuj¹ce obszary: Powierzchnie stojaka ³aŸni wodnej, mikrowirówka, powierzchnie bloku grzewczego Priming and Warming Heater, czarne p³ytki z mikrostudzienkami, rêkojeœæ pipetora, przyciski aparatu, klawiatura aparatu, suche powierzchnie ³aŸni wodnej, powierzchnie stojaka na próbki i blat sto³u doœwiadczalnego w³¹cznie z obszarem przetwarzania próbek.Je¿eli wynik danej powierzchni jest dodatni, nale¿y j¹ wyczyœciæ œwie¿ym roztworem podchlorynu sodu o stê¿eniu 1% (v/v) z preparatem Alconox. Dopilnowaæ, by ca³a powierzchnia zosta³a zwil¿ona roztworem czyszcz¹cym, nastêpnie pozostawiæ roztwór czyszcz¹cy na powierzchni przez co najmniej 2 minuty lub do czasu jego wyschniêcia. Je¿eli to konieczne, za pomoc¹ czystego rêcznika nale¿y usun¹æ nadmiar roztworu czyszcz¹cego. Wytrzeæ powierzchniê czystym rêcznikiem nas¹czonym wod¹ i pozostawiæ do wyschniêcia. Wykonaæ ponowny test danej powierzchni. Powtarzaæ a¿ do uzyskania ujemnego wyniku. Je¿eli nie udaje siê usun¹æ zanieczyszczenia, w celu uzyskania dodatkowych informacji nale¿y siê skontaktowaæ z obs³ug¹ techniczn¹.

INTERPRETACJA WYNIKÓWObecnoœæ lub brak DNA L. pneumophila oznacza siê przez obliczenie dla próbki punktacji PAT (Passes After Threshold) opartego na znanych wartoœciach progowych. Punktacja PAT jest systemem metrycznym stosowanym do oceny wielkoœci sygna³u bêd¹cego wynikiem reakcji. W tym systemie wiêksze liczby wskazuj¹, ¿e próg zosta³ osi¹gniêty we wczesnej fazie amplifikacji, natomiast mniejsze liczby oznaczaj¹ póŸniejsze osi¹gniêcie progu w przebiegu reakcji. Wielkoœæ punktacji PAT nie odzwierciedla iloœci materia³u DNA L. pneumophila zawartej w próbce.Je¿eli nie uzyskuje siê oczekiwanych wyników testu kontrolnego, nie nale¿y podawaæ wyników pacjentów. W celu zapoznania siê z prawid³owymi wartoœciami próbek kontrolnych zob. rozdzia³ Kontrola jakoœci. Wyniki podawane s¹ wyznaczane w nastêpuj¹cy sposób:

Punktacja PAT

Docelowe LP Docelowe IAC Wynik Interpretacja Raport

> 0 > 0 lub = 0 Pozytywny Przy zastosowaniu technologii SDA wykryto DNA L. pneumophila

Wynik pozytywny dla organizmów nale¿¹cych do grup serologicznych 1-14 L. pneumophila sugeruje aktualne zaka¿enie. Do identyfikacji grup serologicznych do celów epidemiologicznych niezbêdne s¹ dodatkowe testy.

= 0 > 0 Negatywny Przy zastosowaniu technologii SDA nie wykryto DNA L. pneumophila

Wynik przypuszczalnie negatywny dla grup serologicznych 1-14 L. pneumophila wskazuje na brak przebytego i aktualnego zaka¿enia. Nie mo¿na wykluczyæ zaka¿enia wywo³anego przez Legionella, poniewa¿: 1) chorobê mog¹ wywo³aæ grupy serologiczne inne ni¿ 1-14 oraz inne gatunki Legionella,2) stê¿enie DNA mo¿e byæ ni¿sze ni¿ wykrywane przez test.

= 0 = 0 Nieokreœlony Kontrola amplifikacji zatrzymana. Aby zinterpretowaæ wynik, wymagane jest wykonanie dodatkowych testów.a

11

a Powtórzyæ test BD ProbeTec ET LP z probówki przetwarzanej próbki. Je¿eli w probówce po przetworzeniu próbki pozosta³a niewystarczaj¹ca iloœæ materia³u, nale¿y powtórzyæ test, wykorzystuj¹c oryginaln¹ próbkê. Je¿eli wynik powtórnego badania jest pozytywny lub negatywny, nale¿y go interpretowaæ w sposób opisany powy¿ej. Jeœli wynik jest ponownie nieokreœlony, nale¿y zastosowaæ now¹ próbkê.

Okreœlanie progu LP i IAC:

Wartoœci progowe docelowego DNA L. pneumophila oraz IAC zosta³y okreœlone przy u¿yciu krzywej ROC (Receiver Operator Characteristic), analizuj¹cej otrzymane dane z kontroli pozytywnej i negatywnej. Niniejsze wartoœci progowe zosta³y zweryfikowane w badaniach klinicznych oraz retrospektywnych pozytywnych i negatywnych dla L. pneumophila próbek pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych. Wartoœci progowe zosta³y poddane walidacji w dodatkowych badaniach klinicznych.

OGRANICZENIA PROCEDURY1. Test BD ProbeTec ET LP Assay jest swoisty jedynie dla grup serologicznych 1-14 L. pneumophila. Nie

testowano innych grup serologicznych L. pneumophila.2. Test BD ProbeTec ET LP Assay nie wykrywa zaka¿eñ wywo³anych przez inne gatunki nale¿¹ce do rodzaju

Legionella.3. Charakterystyka wydajnoœciowa testu BD ProbeTec ET LP Assay zosta³a okreœlona jedynie w odniesieniu

do próbek plwociny. Nie oceniano wydajnoœci w odniesieniu do innych typów próbek. 4. Test BD ProbeTec ET LP Assay zosta³ zbadany jedynie dla pacjentów w wieku 13 lat i starszych.5. Podobnie jak w przypadku innych testów diagnostycznych, wyniki testu BD ProbeTec ET LP Assay nale¿y

interpretowaæ w po³¹czeniu z innymi danymi laboratoryjnymi i klinicznymi dostêpnymi dla lekarza.6. Wynik negatywny nie wyklucza rozpoznania zaka¿enia, poniewa¿ mo¿e byæ spowodowany

nieprawid³owym pobraniem próbki, b³êdem technicznym, pomyleniem próbki, jednoczesnym stosowaniem antybiotykoterapii lub obecnoœci¹ DNA L. pneumophila w iloœci mniejszej, ni¿ wynosi czu³oœæ analityczna testu.

7. Test BD ProbeTec ET LP Assay nie mo¿e byæ stosowany w celu kontroli skutecznoœci terapii przeciwbakteryjnej, poniewa¿ nawet po zastosowaniu skutecznego leczenia mog¹ byæ dalej obecne kwasy nukleinowe bakterii L. pneumophila.

8. Test BD ProbeTec ET LP Assay nie by³ oceniany przy u¿yciu próbek œrodowiskowych (np. woda pitna lub badanie jakoœci wody).

9. Osi¹gniêcie optymalnej wydajnoœci niniejszego testu wymaga odpowiedniego pobierania próbek i postêpowania z nimi.

10. Test BD ProbeTec ET LP Assay mo¿e byæ wykonywany jedynie przez personel przeszkolony w zakresie procedury testu i systemu BD ProbeTec ET.

11. Test BD ProbeTec ET LP Assay dostarcza wyników jakoœciowych. Nie istnieje zwi¹zek pomiêdzy wielkoœci¹ punktacji PAT a znajduj¹c¹ siê próbce iloœci¹ DNA L. pneumophila.

OCZEKIWANE WYNIKIA: ChorobowoœæLiczba wyników pozytywnych obserwowana w testach w kierunku L. pneumophila ró¿ni siê w zale¿noœci od zastosowanej metody, wieku pacjenta, obecnoœci podstawowych czynników ryzyka, lokalizacji geograficznej oraz, co najwa¿niejsze, chorobowoœci na danym obszarze, w³¹czaj¹c mo¿liwe sytuacje nadzwyczajne.B: Rozk³ad czêstoœci punktacji PATZ czterech oœrodków klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej, Europie i Kanadzie zebrano retrospektywnie 83 próbki plwociny i poddano testowi BD ProbeTec ET LP Assay. Rysunek 1 przedstawia rozk³ad czêstoœci punktacji LP PAT w porównaniu z wynikami hodowli.

12

Rysunek 1: Rozk³ad czêstoœci punktacji LP PAT w porównaniu z wynikami hodowli

Wynik hodowl 0 1 - 19 20 - 39 40 - 60 Razem

Negatywny

Pozytywny

52

2

0

0

4

2

4

19

60

23

Razem 54 0 6 23 83

04 42 0 2

19

0

10

20

30

40

50

60

0 1 - 19 20 - 39 40 - 60

Hodowla –

Hodowla +

(-) (+)

52

Czês

toϾ

Punktacja PAT LP

C. Próbki kontrolnePodczas badania klinicznego b³êdy kontroli testu BD ProbeTec ET LP Assay zosta³y zaobserwowane w jednym z 46 cykli (tj. w jednym cyklu wyst¹pi³ b³¹d procedury). Punktacja LP PAT dla pozosta³ych 45 cykli zosta³a zamieszczona w Tabeli 1.

Tabela 1: Rozk³ad punktacji PAT LP dla próbek kontrolnych Respiratory and Media Controls (Próbek kontrolnych z uk³adu oddechowego i pod³o¿a)

CHARAKTERYSTYKA WYDAJNOŒCIOWA

Badanie prospektywne

Test BD ProbeTec ET LP Assay zosta³ poddany w latach 2002–2003, w okresie zwiêkszonej zapadalnoœci na choroby uk³adu oddechowego, prospektywnemu badaniu w siedmiu oœrodkach klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej i Kanadzie. Od ka¿dego pacjenta zosta³y pobrane próbki plwociny i moczu. Próbki plwociny zosta³y zbadane przy u¿yciu testu BD ProbeTec ET LP Assay, metod¹ hodowli bakterii Legionella oraz metod¹ immunofluorescencji bezpoœredniej (Direct Fluorescent Antibody assay, DFA). Próbki moczu zosta³y zbadane przy u¿yciu komercyjnych testów wykrywaj¹cych antygeny L. pneumophila w moczu.Wszyscy spoœród 118 pacjentów spe³niali kryteria w³¹czenia do badania (tj. dowody radiologiczne zapalenia p³uc, wiek 13 lat lub powy¿ej, czas trwania antybiotykoterapii ≤ 14 dni, pobranie prawid³owych rodzajów próbek, w³aœciwe przeprowadzenie metod referencyjnych itp.). Spoœród 118 pacjentów wa¿ne wyniki testu BD ProbeTec ET LP Assay uzyskano u 114. Aby oszacowaæ charakterystykê wydajnoœciow¹, wyniki badania próbek plwociny porównano z wynikami hodowli. Próbkê uznawano za dodatni¹ w przypadku pozytywnego wyniku hodowli. Próbkê uznawano za ujemn¹ w przypadku negatywnego wyniku hodowli.

Kontrola N Zakres 5 percentyl Œrednia Mediana 95 percentyl

LP Negatywny 45 0 - 0 0 0 0 0

LP Pozytywny 45 29,4 - 50,7 40,1 46,7 47,6 49,7

13

Wszystkie próbki, które da³y wyniki nieokreœlone, zosta³y ponownie przebadane (korzystano z przetwarzanej lub oryginalnej próbki, jeœli iloœæ materia³u by³a zbyt ma³a). Próbki, które w pierwszym i powtórnym (tj. ostatecznym) badaniu da³y wynik nieokreœlony, nie zosta³y w³¹czone do charakterystyki wydajnoœciowej. Próbki, które w pierwszym badaniu da³y wynik nieokreœlony, a w powtórnym — pozytywny lub negatywny, zosta³y w³¹czone do charakterystyki wydajnoœciowej. Próbki, które w pierwszym badaniu da³y wynik nieokreœlony, a badanie nie mog³o byæ powtórzone z powodu niedostatecznej iloœci materia³u, pozosta³y „nieokreœlone” i nie zosta³y w³¹czone do charakterystyki wydajnoœciowej.

Porównanie wyników testu BD ProbeTec ET LP Assay z plwociny i wyników hodowli przedstawiono w Tabeli 2.

Tabela 2: Test BD ProbeTec ET CF Assay – Porównanie wyników testu plwociny z wynikami hodowli

Vs. Hodowla

Oœrodek Czu³oœæ (95% CI) Swoistoœæ (95% CI) NieokreœlonyPocz¹tkowy/Ostateczny

1 n. d. 100% (17/17)(80,5% -100%) 0/0

2 n. d. 100% (2/2)(15,8% -100%) 0/0

3 n. d. 100% (31/31)(88,8% -100%) 0/0

6 n. d. 100% (33/33)(89,4% -100%) 2/0b

7 n. d. 100% (31/31)(88,8% -100%) 3/2c

W sumie n. d. 100% (114/114)a

(96,8% -100%) 5/2

a Wyniki immunofluorescencji bezpoœredniej wszystkich 114 negatywnych hodowli próbek by³y negatywne. Próbki moczu 87 ze 114 pacjentów zbadano przy u¿yciu testu wykrywaj¹cego antygeny. Wyniki by³y negatywne.

b Jedna próbka w powtórnym badaniu by³a negatywna i zosta³a w³¹czona do obliczenia swoistoœci. Jedna próbka zawiera³a niedostateczn¹ iloœæ materia³u do przeprowadzenia powtórnego testu.

c Dwie próbki pozosta³y nieokreœlone po wykonaniu powtórnego testu. Jedna próbka zawiera³a niedostateczn¹ iloœæ materia³u do przeprowadzenia powtórnego testu.

n. d. = Nie dotyczy

Badanie retrospektywne

Test BD ProbeTec ET LP Assay by³ równie¿ oceniany w badaniu 83 retrospektywnych próbek plwociny pochodz¹cych z oœrodków klinicznych w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej, Europie i Kanadzie. Wspomniane próbki, pobrane retrospektywnie, przechowywane by³y w postaci zamro¿onej przez okres do szeœciu lat, wiêkszoœæ (65,1%; 54/83) przechowywano nie d³u¿ej ni¿ dwa lata.

Ka¿dy oœrodek rejestrowa³ oryginalny wynik hodowli dla ka¿dej retrospektywnej próbki. Ka¿dy oœrodek przy u¿yciu testu BD ProbeTec ET LP Assay bada³ próbki plwociny i porównywa³ z wynikami hodowli. Próbkê uznawano za dodatni¹ w przypadku pozytywnego wyniku hodowli. Próbkê uznawano za ujemn¹ w przypadku negatywnego wyniku hodowli. Porównanie wyników testu BD ProbeTec ET LP Assay z retrospektywnych próbek plwociny i wyników hodowli przedstawiono w Tabeli 3.

14

a Hodowla oœmiu próbek by³a negatywna, podczas gdy wynik testu BD ProbeTec ET LP Assay by³ pozytywny. Wyniki testów wszystkich oœmiu próbek moczu by³y pozytywne. Metod¹ PCR przebadano 6 z 8 próbek; wyniki wszystkich by³y pozytywne.

b Hodowla dwóch próbek da³a wynik pozytywny, podczas gdy wyniki testu BD ProbeTec ET LP Assay by³y negatywne. Wyniki badania próbek moczu w tym przypadku by³y negatywne. Obie próbki przebadano metod¹ PCR, wynik jednej próbki by³ pozytywny.

c Wœród 23 próbek, których wynik hodowli by³ pozytywny, podzia³ na grupy serologiczne by³ nastêpuj¹cy: 47,8% (11/23) – grupa serologiczna 1; 17,4% (4/23) – grupa serologiczna 3; 13,0% (3/23) – grupa serologiczna 4; 4,3% (1/23) – grupa serologiczna 5; 4,3% (1/23) – grupa serologiczna 6 i w 13,0% (3/23) informacja na temat grupy serologicznej nie jest dostêpna.

n. d. = Nie dotyczyUWAGA: Stosowanie metody PCR w przypadku niezgodnoœci wyniku hodowli i testu BD ProbeTec ET LP Assay nie zosta³o dopuszczone przez FDA.

Badania analityczne

Do przeprowadzenia reakcji amplifikacji za pomoc¹ testu BD ProbeTec ET LP Assay potrzeba 100 μL przetworzonej próbki.Czu³oœæ analityczna

O czu³oœci analitycznej testu BD ProbeTec ET LP Assay w stosunku do 14 ró¿nych grup serologicznych L. pneumophila decydowa³o rozcieñczenie zawiesin bakteryjnych do poziomu 0, 150, 300 i 450 jednostek tworz¹cych koloniê (colony-forming units, CFU) na reakcjê. Próbki zosta³y przetworzone i poddane testom trzykrotnie. Na podstawie wszystkich wyników pozytywnych wykazano, ¿e czu³oœæ analityczna w stosunku do grup serologicznych 2–10 i 12 wynosi³a 150 CFU/reakcjê, jednak rzeczywista granica wykrywalnoœci (Limit of Detection, LOD) mo¿e byæ ni¿sza od najni¿szego testowanego poziomu. Na podstawie wyników pozytywnych wykazano, ¿e czu³oœæ analityczna w stosunku do grup serologicznych 1 i 11 wynosi³a 300 CFU/reakcjê, w stosunku do grupy serologicznej 13-450 CFU/reakcjê a 14-700 CFU/reakcjê.

Hodowla Szacowany odsetek zgodnoœci (95% CI)

OœrodeK Wynik LP Pozytywny Negatywny Razem Pozytywny Negatywny W sumie

6 Pozytywny 1 0 1

Negatywny 0 0 0

Razem 1 0 1 100% (1/1)(2,5% - 100%) n. d. 100% (1/1)

(2,5% - 100%)

8 Pozytywny 16 5 21

Negatywny 1 24 25

Razem 17 29 46 94,1% (16/17)(71,3% - 99,9%)

82,8% (24/29)(64,2% - 94,2%)

87% (40/46)(73,7% - 95,1%)

9 Pozytywny 1 3 4

Negatywny 0 22 22

Razem 1 25 26 100% (1/1)(2,5% - 100%)

88% (22/25)(68,8% - 97,5%)

88,5% (23/26)(69,8% - 97,6%)

10 Pozytywny 3 0 3

Negatywny 1 6 7

Razem 4 6 10 75% (3/4)(19,4% - 99,4%)

100% (6/6)(54,1% - 100%)

90% (9/10)(55,5% - 99,7%)

W sumie Pozytywny 21 8a 29

Negatywny 2b 52 54

Razem 23c 60 83 91,3% (21/23)(72% - 98,9%)

86,7% (52/60)(75,4% - 94,1%)

88% (73/83)(79% - 94,1%)

Tabela 3: Test BD ProbeTec ET LP Assay – Retrospektywne wyniki badania plwociny w porównaniu do hodowli

15

O czu³oœci analitycznej testu BD ProbeTec ET LP Assay w obecnoœci macierzy próbki pochodz¹cej z dolnych dróg oddechowych decydowa³o dodanie grupy serologicznej 1 L. pneumophila „macrophage-infected” do plwociny do poziomu 0, 150, 300 and 450 CFU/reakcjê. Próbki zosta³y przetworzone i poddane testom trzykrotnie. Na podstawie wszystkich wyników pozytywnych wykazano, ¿e czu³oœæ analityczna dla wzbogaconych próbek pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych wynosi³a 150 CFU/reakcjê, jednak rzeczywista granica wykrywalnoœci (Limit of Detection, LOD) mo¿e byæ ni¿sza od najni¿szego testowanego poziomu.

SwoistoϾ analityczna

Wszystkie spoœród 79 mikroorganizmów (69 bakterii, jeden grzyb, dziewiêæ wirusów) badano za pomoc¹ testu BD ProbeTec ET LP Assay. Izolaty bakterii by³y testowane w stê¿eniach siêgaj¹cych od 1 x 106 CFU/mL do 1 x 108 CFU/mL. Wirusy by³y testowane w stê¿eniu 1 x 106 cz¹stek wirusa/mL. Coccidioides immitis przygotowano w postaci zawiesiny mycelialnej odpowiadaj¹cej wartoœci 5 wed³ug standardu McFarlanda. ¯aden z badanych mikroorganizmów nie da³ wyniku pozytywnego ani nie spowodowa³ zahamowania wewnêtrznej kontroli amplifikacji (IAC) (Tabela 4).

Tabela 4: Test BD ProbeTec ET LP Assay РSwoistoϾ analityczna

Acinetobacter calcoaceticus

Actinomyces israelii

Adenowirus-5

Aeromonas hydrophila

Blastomyces dermatitidis

Bordetella bronchiseptica

Bordetella parapertussis

Bordetella pertussis

Branhamella catarrhalis

Candida albicansChlamydia trachomatis, sero L2Chlamydophila pneumoniae, AR-39

Citrobacter freundii

Coccidioides immitisCorynebacterium diphtheriae

Corynebacterium jeikeium

Cryptococcus neoformans

Cytomegalowirus

Eikenella corrodens

Enterobacter aerogenes

Enterobacter cloacae

Enterococcus faecalis

Enterococcus faecium

Enterowirus (Echowirus)

Escherichia coli

Fusobacterium nucleatum

Haemophilus influenzae

Haemophilus parainfluenzae

Wirus Herpes simplex-1

Histoplasma capsulatum

Wirus Influenza typ A

Wirus Influenza typ B

Kingella kingaeKlebsiella pneumoniae subsp. ozaenae typ 4Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae

Lactobacillus acidophilus

Legionella anisa

Legionella bozemanii

Legionella cherrii

Legionella cincinnatiensis

Legionella dumoffii

Legionella erytha

Legionella fairfieldensis

Legionella feeleii

Legionella gormanii

Legionella hackeliae

Legionella jordanis

Legionella longbeachae

Legionella maceachernii

Legionella oakridgensis

Legionella sainthelensi

Legionella spiritensis

Legionella worsleiensis

Moraxella osloensisMycobacterium tuberculosis

Mycoplasma pneumoniae

Neisseria gonorrhoeae

Neisseria meningitidis

Neisseria mucosa

Wirus parainfluenza I

Peptostreptococcus anaerobiusPorphyromonas asaccharolytica

Prevotella oralis

Pseudomonas aeruginosaSyncytialny wirus oddechowy, odmiana d³uga

Rynowirus

Salmonella choleraesuis serotyp EnteritidisSalmonella choleraesuis serotyp Typhi

Serratia marcescensStaphylococcus aureus, szczep wytwarzaj¹cy bia³ko A

Staphylococcus aureus, szczep niewytwarzaj¹cy bia³ka AStaphylococcus epidermidisStenotrophomonas maltophilia

Streptococcus, grupa B

Streptococcus mutansStreptococcus pneumoniaeStreptococcus pyogenesTatlockia (Legionella) micdadei

Veillonella parvula

Substancje zak³ócaj¹ce

Potencjalne substancje zak³ócaj¹ce, które mog¹ wystêpowaæ w próbkach z dolnych dróg oddechowych, badano testem BD ProbeTec ET LP Assay przy braku docelowego drobnoustroju lub w obecnoœci L. pneumophila w stê¿eniu 750 CFU/reakcjê. Przy braku drobnoustroju docelowego ¿adna z badanych substancji, w stê¿eniach wymienionych w Tabeli 5, nie da³a wyniku pozytywnego ani nie spowodowa³a zahamowania wewnêtrznej kontroli amplifikacji (IAC). W przypadku obecnoœci drobnoustroju docelowego w stê¿eniu wymienionym w Tabeli 5, wszystkie badane próbki da³y wynik pozytywny.

16

Tabela 5: Test BD ProbeTec ET LP Assay – Substancje potencjalnie zak³ócaj¹ce

Próbki pochodz¹ce z dolnych dróg oddechowych

Badane substancje Stê¿enie

Krew pe³na (heparyna) 2,65%

Lidokaina 2% 0,21%

Roztwór plwociny indukowanej (3% NaCl) 0,32%

Azytromycyna 0,42 μg/mL

Penicylina G 17 μg/mL

Tetracyklina 2,3 μg/mL

Doksycyklina 26,5 μg/mL

Ciprofloksacyna 4,88 μg/mL

Mycoplasma pneumoniae 5 x 106 komórek/mL

Chlamydophila pneumoniae 1,06 x 107 EBs/mL

Mycoplasma pneumoniae i Chlamydophila pneumoniae odpowiednio 1,06 x 107 komórek/mL i 1,06 x 107 EBs/mL

PowtarzalnoœæPowtarzalnoœæ testu BD ProbeTec ET LP Assay zosta³a potwierdzona w trzech laboratoriach, za pomoc¹ panelów testowych sk³adaj¹cych siê z 24 próbek, przygotowanych w buforze PBS/BSA. Panel sk³ada³ siê z 12 próbek negatywnych dla L. pneumophila, trzech pozytywnych o ma³ym stê¿eniu (300 CFU/reakcjê) i trzech pozytywnych o du¿ym stê¿eniu L. pneumophila (500 CFU/reakcjê), trzech pozytywnych o ma³ym (odpowiednio 30 cia³ek elementarnych EB/reakcjê (Elementary Bodies, EB/reaction), 300 CFU/reakcjê, 900 komórek/reakcjê) i trzech pozytywnych o du¿ym (50 EB/reakcjê, 500 CFU/reakcjê, 1500 komórek/reakcjê, odpowiednio) stê¿eniu Chlamydophila pneumoniae (CP), L. pneumophila (LP) i Mycoplasma pneumoniae (MP). W ka¿dym z oœrodków testowano panel raz dziennie przez trzy dni. Wyniki przedstawiono w Tabeli 6. Tabela 6: Szacowana powtarzalnoœæ poziomu próbek pochodz¹cych z dolnych dróg oddechowych

Pomiêdzy dniamiW oœrodku Pomiêdzy oœrodkami

Pozycja panelu N % prawid³owych

Œrednia PAT SD % CV SD % CV

WYSOKIE LP 27 100,0% 47,2 0,94 2,00 1,42 3,02

NISKIE LP 27 100,0% 44,8 0,44 0,98 2,06 4,59

WYSOKIE CP/LP/MP 27 100,0% 46,2 1,13 2,45 1,79 3,88

NISKIE CP/LP/MP 26a 100,0% 43,0 0,00 0,00 2,59 6,01

Negatywny 108 100,0% 0,0 - - - -

IAC z próbkami negatywnymi dla LP 108 100,0% 47,8 0,43 0,91 0,34 0,70

a Jedna próbka zosta³a wy³¹czona z analizy z powodu b³êdu proceduralnego.DOSTÊPNOŒÆDostêpne s¹ nastêpuj¹ce produkty BD ProbeTec ET:Nr kat. Opis440728 BD ProbeTec ET Legionella pneumophila (LP) Amplified DNA Assay (Test wykorzystuj¹cy amplifikacjê DNA, wykrywaj¹cy bakterie Legionella pneumophila)440731 BD ProbeTec ET Respiratory and Media Diluent and Control Kit (Rozcieñczalnik materia³u z uk³adu oddechowego i pod³o¿y oraz zestaw kontrolny)440457 BD ProbeTec ET Accessories Kit (zestaw akcesoriów) (10 pokrywek mikrostudzienek, 16 uszczelek do amplifikacji 1/2 i 8 torebek na odpady)

17

440458 BD ProbeTec ET Pipette Tips (koñcówki pipet) 6 x 120440661 BD ProbeTec ET 2 mL Sample Tubes and Caps (probówki o pojemnoœci 2 mL i nakrêtki), 200 szt.440679 BD ProbeTec ET 2 mL Caps (Nakrêtki), 100 szt.440477 BD ProbeTec ET Instrument (aparat), przeznaczony na eksport poza Stany Zjednoczone Ameryki Pó³nocnej440478 BD ProbeTec ET Instrument (aparat), do u¿ytku w Stanach Zjednoczonych Ameryki Pó³nocnej i Kanadzie440479 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (blok grzewczy), 220 V440480 BD ProbeTec ET Priming and Warming Heater (blok grzewczy), 120V440487 BD ProbeTec ET Pipettor (pipetor)440502 BD ProbeTec ET Lysing Rack (statyw lityczny)

PIŒMIENNICTWO1. Cloud J.L., Carroll K.C., Pixton P., Erall M., Hillyard D.R. (2000) Detection of Legionella species in

respiratory specimens using PCR with sequencing confirmation. J Clin Micro 38:1709-17122. Stout, J.E., Yu, V.L. 2000. Legionellosis. N. Engl. J. Med. 337: 682-687.3. Bartlett, J.G., Dowell, S.F., Mandell, L.A., File, T.M., Musher, D.M., Fine, M.J. 2000. Guidelines from the

Infectious Diseases Society of America - Practice guidelines for the management of community-acquired pneumonia in adults. Clin.Infect. Dis. 31:347-82.

4. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.

5. Garner. J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17: 53-80.

6. U.S. Department of Health and Human Services. 1999. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C.

7. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.

8. Van der Zee, A., Peeters, M., de Jong, C., Verbakel, H., 2002. QIAGEN DNA extraction kits for sample preparation for Legionella PCR are not suitable for diagnostic purposes. J. Clin. Microbiol. 40 (3): 1126.

9. Evans, G.E. et al. 2003. Contamination of QIAGEN DNA extraction kits with Legionella DNA. J. Clin. Microbiol. 41 (7): 3452-3453.

10. Isenberg, H.D. (ed.) 1992. Clinical Microbiology Procedures Handbook. Vol. 1. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

� � Becton, Dickinson and Company7 Loveton CircleSparks, Maryland 21152 USA800-638-8663

�� BENEX LimitedBay K 1a/d, Shannon Industrial EstateShannon, County Clare, IrelandTel: 353-61-47-29-20Fax: 353-61-47-25-46

ATCC is a trademark of the American Type Culture Collection. Alconox is a trademark of Alconox, Inc.QIAamp is a trademark of QIAGEN Inc.CultureSwab is a trademark of Difco Laboratories, subsidiary of Becton, Dickinson and Company.BD, BD Logo, BBL and ProbeTec are trademarks of Becton, Dickinson and Company. © 2006 BD.