Problémy spojené s kultivací in vitro

rekalcitrance

Nežádoucí a většinou ireverzibilní stav nastávající u kultur in vitro, kdy

buňky, pletiva nebo orgány ustrnou ve vývoji i růstu a ač jsou živé, nereagují ani na– změněné kultivační podmínky (recalcitro =

přístup odpírám, vyhazuji – o koni).

Rekalcitrantní genotypy

Příčiny– jsou spatřovány v ekologické konstituci

rostlinného materiálu (donora), manipulacích invitro a stresorech in vitro.Vážný problém v biotechnologii.

Hypotéza: neexistují(jen zatím nevíme jak na to)

Symptomy in vitro

1. Atypická anatomie, morfologie a fyziologie - miniaturizace

• změna stavby listů a jejich funkce (uzavřený prostor), pokožka s nízkým obsahem pektinu a celulózy, s nedostatečně vyvinutou kutikulouNefunkční průduchy

• opuchlé výhony• listy bledě zelené nebo šedomodré

• listy podlouhlé nebo páskovité• křehké• krabacené nebo zkroucené

listy průsvitného (skelného) vzhledu - vitrifikace

• Sklovitý až průhledný vzhled

• Hyperhydricita pletiv a orgánů

• křehkost

http://www.hort.purdue.edu/hort/courses/HORT201/Lec/03-05-08TCProblems.pdf

Grigoriadou1, 2007

• Etylén• Oxid uhličitý• Vodní páry

• Komponenty média (cytokininy, sacharóza, dusík)

• Vysoká teplota

Jak překonat?

1. Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar)

2. Změnit poměr amonia: nitrátu

3. Snížit hladinu cytokininů na minimum

4. ventilovat

Srovnání atmosféry

Skleník in vitro kultura

• O2 21 % jen 4 %

• CO2 0.04 % až 20 %

• H2O 60-85 % 100 %

Jak překonat?

1. Zvýšit koncentraci agaru, případně změnit na Gelrit (event. šikmý agar)

2. Změnit poměr amonia: nitrátu

3. Snížit hladinu cytokininů na minimum

4. Ventilovat

5. Zvýšit intenzitu světla (fotosyntézu)

6. Snížit teplotu a vlhkost

2. Redukce apikální dominance

• Zkrácená internodia výhonků

• Růžicovitý růst

• shluky výhonů při mikropropagaci

Somaklonální variabilita

Rhododendron

Příčiny zvyšující SV:Dlouhá expozice fytohormony (!2,4-D)Dlouhé intervaly mezi subkulturamiVětší riziko při tvorbě adventivních než při množení z axilárních pupenů (a meristémů)

3. Narušení tvorby kořenů

• nadměrná produkce adventivních kořenů• špatná tvorba adventivních kořenů

4. Nežádoucí nadprodukce a oxidace fenolických látek

• Hnědnutí média

• Odumírání explantátu

Proč vzniká?

• Obranná reakce proti možnému vniknutí infekce

• Fytotoxické substance

Jak se nežádoucí nadprodukci fenolických látek bránit?

• časté pasážování (tekuté medium)

• počáteční kultivace v chladu, v klidu

• příměsi do media (AU – aktivní uhlí,

PVP - polyvinylpyrolidon…)

Jak se bránit nežádoucí oxidaci fenolických látek?

• Preparace pod hladinou vody nebo antioxidační směsi AOX (10% k.citronová a 15% k. ascorbová)

• inkubace explantátů (5-30 min v AOX směsi)

• počáteční kultivace v chladu, v klidu

• příměsi do media (AA – kyselina ascorbová)

Pupenové kultury dřevin

Hormonální regulace mikropropagace z pupenů

CK CK CK (AUX) AUX

AUX (AUX) (AUX) (bez RR)

(GA)

Postup - založení pupenové kultury dřevin

• 1/ důkladné promytí tekoucí vodou

• 2/ propláchnutí 70% ETOH

• 3/ povrchová sterilizace 15 min 20% SAVO na třepačce

• 4/ propláchnutí sterilní dest. vodou (3x)

• 5/ odstranění krycích šupin (* antioxydační směs kys. ascorbové 10% a citronové 15%)

• 6/ odříznutí pupenu s 2 mm lodyhy (*)

• 7/ přenesení do zkumavky - popis