Produção de etanol a partir de xilose por fermentação contínua

8/16/2019 Produção de etanol a partir de xilose por fermentação contínua

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Seminário em Biotecnologia I

Victor Teixeira Noronha

Docente: Benildo Cavada

Junho - 2015



Introdução

Aumento da viabilidadeeconômica: fermentaçãode hexoses e pentoses

Microrganismos

Problemas de aplicaçãoà escala industrial

Desvantagens damodificação genética

Composição dabiomassa de materiais

lignocelulósicos

celulose hemicelulose

lignina outros



Fermentaçãoindustrial:•pH – 4-5•T – 30-35°C

GI:•pH – 7-8•T – 70°C

Introdução

Glicose

Isomerase(EC.5.3.1.5)

Aplicações

Características

Deslocamento do

equilíbrio

Estrutura de raios-X em temperatura ambiente de D-xiloseisomerase em complexo com iõns 2Mg2 + xilitol e a pH 7,7.Kovalevsky, et al., 2012,

D-xilose D-xilulose

5:1

Xylose SIF : pH~temperatura~taxa enzima/levedura



Introdução

Imobilização

Recuperação e

reutilização Quitosana

Glutaraldeído

Aumento da estabilidade

térmica Imobilização estável:

altas taxas de enzima no

reator

Sistema imobilização-estabilização: ligação covalente amino (enzima)-aldeído (suporte). Vieira, 2009.

Estrutura química de quitosana reticulada comglutaraldeído. Vieira, 2009.

Estrutura da quitosana. Disponivel em: http://quitosana.zip.net/images/Chitosan-chemie.jpg

http://quitosana.zip.net/images/Chitosan-chemie.jpg







Objetivo

Imobilizar GI em quitosana, utilizando glutaraldeído

como ativador, caraterizando este derivado no que diz

respeito às suas propriedades catalíticas e potencial

para ser utilizados no processo de SIF da xilose, bem

como co-imobilizar o derivado com S. cerevisiae em gel

de alginato de cálcio, a fim de avaliar a produção de

etanol a partir de xilose em uma isomerização

simultânea com um processo de fermentação.



Métodos

Preparação de grânulos de quitosana-glutaraldeído

1) Quitosana em pó (2%) + sol. Ác. Acético 2% (v/v)

Δ a 50ºC Solução

+ KOH0,5M

(3:2) emagitação

por 30min

Solução

+Glutaraldeído

0,8% (v/v);

Agitação a50ºC por30min

Sol. +Quitosanacoagulada

Filtração sobvácuo elavagem

Suporte



Imobilização de glicose-isomerase

Extrato de enzima +tampão

Retirada de amostrapara controle

Adição de suporte naproporção m/v 1:10,sob agitação a 150

rpm

Testes: Tempo deimobilização→ 3, 24

e 43h; Carga deenzimas → 30, 50 e70 mgenzima·g-1

suporte

Determinação daatividade enzimática

e concentraçãoproteica

Adição de hidroboratode sódio (1 mg·mL-1)

por 30min

Filtração à vácuo elavagem dos derivados

Armazenagem dosderivados em tampãoTRIS-maleato 50mM,

pH 7



Eletroforese

O extrato enzimático de glicose isomerase (GENSWEET® SGI) foi analisada por SDS-PAGE

Isomerização de xilose

• Xilose (60 g × L-1)• Níveis de xilose e xilulose

determinados

Catalisada por GI solúvel eimobilizada a 30 ◦ C e pH 5.0



Co-imobilização de derivado IGI-Ch e leveduraem gel de alginato

Levedura comercial +sol. 20 gglicose·L-1 +

nutrientes =LEVEDURA DE

INÓCULO

Centrifugação;filtração;

determinação do teorde umidade

Levedura +quitosana-

glutaraldeídocontendo glicose

isomeraseimobilizada (IGI-Ch)

Sol. 1% Alginatode sódio

Sol. 5% Alginatode sódio

Sol. 13%Alginato de

sódio

Suspensão + 0.25 MCaCl2/0.25 M MgCl2

Partículas esféricas

(φ=1-1,5mm)

Partículas curadas emrefrigerador por 18-20h



Isomerização e fermentaçãosimultânea da xilose

1 g catalisador × ml-1 meio, a 35 ◦ C, o pH inicial

de 5,3 e 150 rpm.



Atividade da glicose isomerase:

Medição da Vo da isomerização da frutose em glicose; Concentração de proteína:

Abumina de soro bovino (BSA) como padrão;

Análise do substrato e dos produtos do ensaio SIF:

Xilose, xilulose, xilitol, glicerol, etanol e ácido acético;

Refratometria e HPLC;



Imobilização da glicose isomerase

Cinética da GI imobilizada em quitosana ativada comglutaraldeído

30 mg proteína/g suporte



• Extrato apresenta outras enzimas.




SDS - PAGE

Proteínas de menorpeso molecular




• Concentração máxima de proteína após 20h: 47 mg prot/gder.

• Concentração máxima de proteína após 43h: 68 mg prot/gder.

• Atividade recuperada > 90%

• Atividade da enzima imobilizada da melhor variação doexperimento: 1700 IU/gder.



Influência do pH e da temperatura sobre a atividade de GI:

SGI e IGI-Ch; Para pH fixo de 7,0 – T de 30 a 90 ºC;

Para T fixo de 60 ºC – pH de 5 a 9;

% de atividade máxima obtida.

Estabilidade da GI:

SGI e IGI-Ch a 80 ºC;

Determinação da atividade enzimática residual.

Influência da concentração de etanol na atividade GI:

SGI e IGI-Ch em diferentes concentrações de etanol;

0 a 70 g/L.

pH 5, 35 ºC, 150 rpm



Determinação da atividade: ensaios de reciclagem de IGI-Ch:

IGI-Gh avaliada em 3 bateladas;

Estabilidade de GI em condições de operação da SIF de xilose:

GI solúvel e imobilizada;

pH 5, composição do ensaio da isomerização da xilose;

Condições padrões a diferentes tempos de incubação;

% de atividade inicial.



Influencia do pH e da temperatura na actividade daglicose isomerase

Temperatura pH

• pH 5, temperatura ~ 30ºC• Alta carga de enzimas.•

Suporte extremamente ativado.



Inativação térmica

• Imobilização confere estabilidade.• Imobilização branda.



Influência da concentração de etanol sobre aactividade da glicose isomerase (GI), nas condições

de operação da SIF da xilose

• Etanol: deslocamento do equilíbrio.• Baixa atividade em pH 5 a 30ºC.



Estabilidade da GI nas condições de operação doprocesso de SIF da xilose

• Dessociação das subunidades.• Etanol e outros nutrientes não interferem na atividade enzimática.



• Confirmar a existência de ligações covalentes entreenzima e suporte – baixa perda de atividade.

• Avaliação da atividade residual depois de cada batelada

de isomerização de frutose.

Ensaio de reciclagem utilizando GI imobilizada



Isomerização de xilose a xilulose em pH 5 a 30ºC

GI solúvel

GI imobilizadacom levedura

GI imobilizada

Processo conduzido nas condições de fermentação.4 h: equilíbrio químico



Isomerização e fermentação simultânea da xilose

xilitol

etanol

xilulose

Produtividade = 0,25 getanol /L x hConversão de xilose = 75,4 %Seletividade etanol/xilitol = 1,26



• Processo SIF – controlado pela isomerização.

• Inibição da isomerização por xilitol, glicerol e ácido acético.

• Baixo pH: desativação da GI.

• pH <= 5: dissocição de subunidades de GI e agregação

irreversível de enzimas

Isomerização e fermentação simultânea da

xilose



Optimização do processo

• Aumento da concentração de enzimas no biocatalisadorfinal.

• Controle de pH.

• Utilização de tetraborato de sódio (deslocamento doequilíbrio).



Conclusões

Derivado de IGI-Ch catalisa a isomerizaçãoxilose/xilulose (pH=5, T= 30-35ºC) ao contrário da GIsolúvel.

Sucesso no processo simultâneo de isomerização efermentação alcoólica de xilose.(pH=5,3 , T=35ºC)

Alta atividade enzimática = “beads” (pequenas) dequitosana.



Conclusões

Viabilidade industrial:

Elevado potencial para produção continua de etanol apartir de xilose por S. cerevisiae.

Necessita de estudos para otimizar o processo da SIF

xilose.



Obrigado.

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