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Produção de proteínas Produção de proteínas recombinantes em microrganismosrecombinantes em microrganismos
Prof. Fabricio Rochedo Conceiçã[email protected]
05 de abril de 2011
Graduação em BiotecnologiaDisciplina de Biotecnologia Microbiana II
Proteína recombinante
Proteína produzida a partir da expressão de uma moléculade DNA recombinante em um sistema
de expressão adequado.
DNA recombinante
Molécula de DNA produzida a partir da combinação de seqüências de DNA provenientes de diferentes fontes.
Por que produzir e purificar proteínas recombinantes?
Estudos bioquímicos
Determinação da estrutura 3D
Aplicações biotecnológicas - Terapia - Vacinas - Diagnóstico...
Alternativa para as seguintes limitações:
Quantidade
Dificuldade de purificação a partir do tecido original
Contaminação (príons, vírus, oncogenes...)
Estabilidade: proteínas recombinantes podem ser engenheiradas
Processo completamente controlado
Alguns microrganismos não são cultiváveis in vitro ou são fastidiosos
Mycoplasma hyopneumoniae
Pneumonia Micoplásmica Suína
Clostridium sp.
Botulismo
Enterite necrótica das aves
Enterite suína
Toxina botulínica
Sistemas de expressão heteróloga
***Animais e plantas
Produção de proteínas recombinantes em bactérias
Depois do Homo sapiens, a bactéria E. coli é o organismo mais estudado!
Escherichia coli Bacillus subtilis
Relação volume meio – capacidade do frasco
0,2 (20%)
Inóculo – 5 a 10%
Algumas companhias que comercializam vetores de expressão
http://www.promega.com
http://www.neb.com
http://www.stratagene.com
http://www.invitrogen.com
Vantagens Desvantagens
Genética e fisiologia bem conhecidas Não faz certas modificações pós-traducionais
Enorme variedade de vetores disponíveis
Atividade biológica pode diferir da proteína natural
Fácil controle da expressão gênica A bactéria apresenta alto conteúdo de endotoxinas
Facilidade de manutenção em laboratório Falta de um mecanismo de secreção
Alta produção de proteínas heterólogas Formação de corpos de inclusão
Expressão heteróloga em E. coli
*** Alternativas
-Minimizar a proteólise-Maximizar a expressão-Minimizar “vazamento” de expressão (importante para expressão de proteínas tóxicas)-Facilitar o folding-Solubilidade
Vantagens Desvantagens
Não patogênico (sem LPS); GRAS Proteases extracelulares
Codon usage adequado Plasmídeos instáveis
Possibilidade de secreção da proteína Expressão geralmente menor que E. coli
Biologia Molecular e Fisiologia conhecidas
Alta produção de proteínas heterólogas
Expressão heteróloga em B. subtilis
*** Alternativas
LEVEDURASLEVEDURAS
Multiplicação rápida
Manipulação simplificada
Altas densidades celulares
Unicelulares
Não Patogênicas (GRAS)
Fisiologia e genética bem conhecida
Realiza modificações pós-traducionais
Promotores “fortes” (constitutivos ou induzíveis)
PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS
PRINCIPAIS ESPÉCIES UTILIZADAS
Saccharomyces cerevisiae Pichia pastoris Pichia methanolica Hansenula polymorpha (Pichia augusta) Kluyveromyces lactis Schizosaccharomyces pombe Schwanniomyces occidentalis Yarrowia lipolytica
DESVANTAGENSDESVANTAGENS
Hiperglicosilação – mais de 100 resíduos de manose
Alteração da antigenicidade da proteína
Alteração da estrutura 3D
Produção de Etanol – tóxico
Falha na secreção de proteínas
Alternativa: outras espécies de leveduras
PROTEÍNAS EXPRESSASPROTEÍNAS EXPRESSAS
Vacinas Antígeno do vírus da Hepatite B (1986)Proteína de envelope do HIV-1
Diagnóstico Proteína do vírus da Hepatite CAntígenos do HIV-1
Agentes terapêuticos humanos
InsulinaGM-CSFFator de crescimentoSoro albumina humana
Metilotrófica – metanol como fonte única de
carbono
Glicosilação mais estável e semelhante a de
mamíferos
Fermentação pobre – não produz etanol e atinge
altas densidades celulares
Alta produtividade: até 12g de proteína
recombinante por litro de cultivo!
Desvantagens
Proteólise de proteínas secretadas
Poucos vetores disponíveis (Invitrogen)
Necessita o uso de fermentadores para atingir
alta densidade celular – no entanto não realiza
fermentação. Precisa de oxigênio!
METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL
Álcool Oxidase
Dois genes: AOX1 e AOX2
AOX1 é mais expresso e altamente induzido na
presença de metanol
Enzima tem baixa afinidade por metanol,
formando formaldeído. Compensa produzindo
grande quantidade de AOX (~30% do total de prot)
METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL
METABOLISMO DO METANOLMETABOLISMO DO METANOL
Vantagem
Fonte de carbono de custo reduzido
Só passa a ser utilizado quando já há alta
densidade celular
Desvantagem
Inflamável e tóxico
Controle rígido dos níveis de oxigênio (~30%)
FENÓTIPOSFENÓTIPOS
Mut = Metanol Utilization
Mut+ - crescimento rápido em metanol
MutS – crescimento lento em metanol
CEPASCEPAS
CLONAGEM - INTEGRAÇÃOCLONAGEM - INTEGRAÇÃO
PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA
PROTEÍNAS EXPRESSAS EM PICHIA