PRODUCCIÓN DE INVERTASA DE Cellulomonas flavigena Y ...€¦ · UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA UPIBI DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA

Munguía Verdi Lorena Página 1

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA UPIBI

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA CINVESTAV

PRODUCCIÓN DE INVERTASA DE Cellulomonas flavigena Y AVANCES EN

LA SINTESIS QUIMICA ENZIMATICA DE IMINOAZÚCARES

Tesis que presenta:

Munguía Verdi Lorena

Para obtener el grado de:

“MAESTRO EN CIENCIAS EN BIOPROCESOS”

Director interno:

Dr.Marco Augusto Brito Arias

Director Externo:

Dr. Maria del Carmen Montes Horcasitas

México DF Septiembre del 2010


ÍNDICE

RESUMEN

1. INTRODUCCIÓN

1.1 INHIBIDORES DE α-GLICOSIDASA

1.2 MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LAS GLICOSIDASAS

1.3 PREPARACIÓN DE IMINOAZUCARES

1.4 SINTESIS QUÍMICO ENZIMÁTICA CABOHIDRATOS

1.5 SACAROSA E INVERTASA

1.6 FUENTES DE AISLAMIENTO DE LA INVERTASA

1.7 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LA INVERTASA

1.8 MECANISMOS DE HIDRÓLISIS DEL ENLACE O-GLICOSIDICO

2. JUSTIFICACIÓN

3. HIPÓTESIS

4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

5. MATERIALES Y MÉTODOS

6. METODOLOGÍA

6.1 MICROORGANISMO

6.1.2 PREPARACION DEL INOCULO

6.1.3 OBTENCION DE LA ENZIMA

6.1.4 AISLAMIENTO DE LA ENZIMA

6.1.5 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

1

3

3

5

7

8

10

11

12

14

17

18

19

19

19 20

21 21

21

22

22

23


6.2 CARACTERIZACIÓN ENZIMÁTICA

6.2.1 EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA DE INCUBACION SOBRE LA

ACTIVIDAD ENZIMATICA

6.2.3 DETERMINACION DE LOS PARÁMETROS CINÉTICOS (KM Y VMAX

6.2.4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIDRÓLITICA DE LA INVERTASA DE

C.FLAVIGENA SOBRE EL INTERMEDIARIO.

)

6.2.5 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD HIDRÓLITICA DE LA INVERTASA

COMERCIAL DE SACHAROMYCES CEREVISAE SOBRE LOS INTERMEDIARIOS

OBTENIDOS EN LA RUTA SINTÉTICA.

6.2.4 TERMO ESTABILIDAD

6.3 OBTENCIÓN DE LOS AMINO AZÚCARES

7. DESARROLLO EXPERIMENTAL

8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1 PRODUCCIÓN

8.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA

8.2.1 PH Y TEMPERATURA ÓPTIMA

8.3 TERMO ESTABILIDAD

8.4 PARAMÉTROS CINÉTICOS

8.5 OBTENCIÓN DE LOS IMINOAZÚCARES

9. EVALUACIÓN ENZIMÁTICA

10.CONCLUSIONES

12. BIBLIOGRAFÍA

23 23

24

24

24

25

25

31

35

35

37

41

43

44

42

59

63

65


ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Figura 2. Figura 3. Figura 4. Figura 5. Figura 6. Figura 7. Figura 8. Figura 9. Figura 10. Figura 11. Figura 12. Figura 13. Figura 14. Figura 15. Figura 16. Figura 17.

Algunas glicoresinas aisladas de plantas del género Ipomoea tricolor

Desconexión entre la subunidad disacárida macrocíclica de la Tricolorina A

I.- Representación ORTEP de una de las conformaciones de la tricolorina

A en estado sólido; II.-Representación gráfica de la celda unitaria. Las

moléculas de la tricolorina A se indican como Mol1-Mol4 y las de agua

como W1-W18

Método de Michael

Método de Fischer

Método de Koenigs-Knorr

Síntesis de O-glicosil-α-tricloroacetimidato

Estrategia general para inducir la formación de enlaces O-glicosídicos

Esquema de la secuencia de la metodología.

Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-6)

lactonizado y condiciones de reacción

Aproximación sintética para la obtención del disacárido D-Fuc-D-Glc (1-4)

lactonizado y condiciones de reacción

Espectro de RMN de 1H en cloroformo deuterado (CDCl3

Espectro de RMN de

) de penta-

acetato de glucosa. 1

Espectro de RMN de

H en cloroformo deuterado del intermediario 1 1

Espectro de RMN de


Espectro de RMN de


Espectro de RMN de


C del intermediario 7


1. RESUMEN

La diabetes es una enfermedad que representa un problema de salud de alto

impacto debido a su incidencia y mortandad. Aunque existen diversas estrategias

terapéuticas que permiten controlar este padecimiento, se observan

complicaciones como la falta de respuesta en la producción de insulina por parte

del páncreas, o bien efectos indeseables asociados a tratamientos con estos

agentes hipoglucemiantes. En la búsqueda de alternativas terapéuticas más

eficientes y con mínimos efectos indeseables se plantea la obtención de

iminoazúcares empleando una aproximación quimioenzimática. Este proyecto

plantea en su primera etapa la obtención de la enzima invertasa a partir de una

cepa diferente a las ya reportadas de Cellulomona flavigena que será empleada

en el paso crítico de hidrólisis de los derivados de aminosacarosa 7, 17 para

generar los iminoazúcares 10 y 20 de potencial actividad hipoglucemiante.

La primera etapa del proyecto consistió en obtener invertasa de una fuente

diferente a las ya reportadas (cepa de Cellulomona flavigena) mediante un cultivo

por lote en un reactor tipo tanque agitado, caracterizando la enzima (pH,

Temperatura, parámetros cinéticos y termo estabilidad), seguido del desarrollo de

intermediarios de iminoazucares a partir de sacarosa planteados en tres diferentes

esquemas, los cuales difieren en que el primero y tercero plantean la

incorporación de un grupo amino a la posición 4’ de fructosa y la segunda a la

posición 6 de glucosa de la sacarosa. La estrategia general propone la protección

selectiva de algunas posiciones hidroxílicas del disacárido y posterior secuencia

de tosilación, intercambio por azida y posterior reducción y desprotección para

generar los correspondientes derivados de sacarosa 7 y 17. Una vez instalado el


grupo amino en las posiciones antes mencionadas se propone la hidrólisis

enzimática de los derivados de sacarosa modificados para lo cual se emplea

invertasa comercial y aislada de Cellulomona flavigena.

1. INTRODUCCIÓN


1.1 SACAROSA E INVERTASA

Todos los organismos vivos (desde microorganismos hasta el hombre) dependen

de miles de diferentes enzimas que catalizan gran cantidad de diferentes

reacciones en las células, su uso ha nivel industrial se ha incrementado durante

los últimos 20 años aplicándose en alimentos, detergentes, métodos analíticos,

medicina,etc.

Las enzimas son catalizadores naturales que al desnaturalizarlas provoca perdida

de sus propiedades catalíticas cuando se exponen a altas temperaturas, alta

acidez o alcalinidad o a solventes orgánicos .

Las fuentes de aislamiento pueden ser de origen vegetal, animal o de algún

microorganismo y actualmente se procura producir enzimas de microorganismos

por disponibilidad, flexibilidad y economía

La sacarosa es un disacárido abundante y accesible que se obtiene de la caña de

azúcar y México ocupa el sexto lugar como productor a nivel mundial y de donde

se extrae del 8 al 15% de sacarosa a partir de la zafra de la caña de azúcar

(www.perafan.com).

La sacarosa es hidrolizada enzimáticamente por la invertasa. El nombre oficial de

la invertasa es β-fructofuranosidasa fructohidrolasa (E.C. 3.2.1.26) también

conocida como beta-fructosidasa o sacarasa. Actúa sobre el enlace 0 - glicosídico

de la sacarosa produciendo una mezcla equimolar de los monosacáridos

α-D-glucopiranosa y α-D-fructofuranosa en cantidades equivalentes (figura 3). Su

nombre se debe a que producto de su hidrólisis cambia su rotación óptica de la


sacarosa [+ 66.5] a una rotación negativa, que es promedio de la rotación de la

glucosa [+52.7] y de la fructosa [-92.4].

O O

O OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

OHInvertasa O

OH

HO OH

OH

OH

O OH

HO

HO

OH

OH

+

Sacarosa α-D-glucopiranosa α-D-fructofuranosa

Figura 4. Reacción de hidrólisis de sacarosa por la enzima invertasa.

1.2 FUENTES DE AISLAMIENTO DE LA INVERTASA

La invertasa puede ser extraída tanto de plantas como de microorganismos. En

plantas se ha estudiado en arroz (Oryza Sativa), Bamboo (Chia-Chen Liu, 2005),

pera (Hiroshi Hashizume, 2003), Durazno (Moriguchi, 1991), Papa (Burch, 1992) y

zanahoria (Isla, 1996).

Ha sido aislada de diferentes microorganismos como: Zymomonas mobillis,

Neuroespora crasa, Aspergillus nidulans, Aspergillus Níger, Aspergillus phicum,

Sacharomyces cerevisia, Candida utilis, Fusarium oxyporum, Cellulomonas

flavigena, entre otros.


1.3 CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS DE LA INVERTASA

La invertasa puede estar presente en diversas isoformas, las cuales desempeñan

la misma función de hidrólisis; pero, difieren en tamaño, propiedades bioquímicas

y localización celular. Por su localización subcelular, la invertasa puede

clasificarse en: extracelular; intracelular, peri plasmática ò vacuolar, en el caso de

plantas (www.brenda.unikoeln.de).

Las invertasas dependiendo de su pH óptimo se pueden clasificar en: acidas,

básicas o neutras. El rango de pH óptimo reportado en la literatura es de 3.5-7.8;

su temperatura óptima se encuentra entre 50-60ºC. (www.brenda.unikoeln.de).

Tanto en bacterias como hongos la invertasa puede ser intracelular o extracelular.

En Saccharomyces cerevisiae la enzima extracelular tiene un peso molecular

aproximado de 270 KDa y la intracelular es de 60 KDa (jee-Songy col. 1996).

La diferencia que existe en el peso molecular se debe a que la invertasa

extracelular es una glicoproteína que tiene asociada a su cadena polipeptídica

monosacáridos. El porcentaje de estos monosacáridos con respecto a la proteína

total se le conoce como grado de glicolisación que en el caso de la invertasa

puede variar entre 20 y 45%. El grado de glicolisación depende de la fuente de y

localización celular. Estos monosacáridos son generalmente galactosa, N-acetil

http://www.brenda.unikoeln.de/�



glucosamina, glucosa, manosa, este ultimo es el mas abundante en algunos tipos

de invertasa (jee-Song y col.1996).

En la siguiente tabla se muestran datos acerca del pH óptimo para las invertasas

provenientes de hongos, bacterias y plantas; su temperatura óptima, la afinidad

por el sustrato para sacarosa, (www.brenda.unikoeln.de).

Tabla 2. Características Bioquímicas de invertasas provenientes de bacterias, hongos

levaduras y plantas

Esta enzima presenta generalmente inhibición por metales pesados. El mercurio

tiene un fuerte efecto inhibitorio para muchas enzimas; sin embargo algunas son

menos sensibles, la invertasa proveniente de Aspergillus niger a concentración

1mM puede conservar entre un 62 a 72% de su actividad enzimática (Hocine y col.

2000)

1.4 MECANISMOS DE HIDRÓLISIS DEL ENLACE O-GLICOSIDICO

Bacterias Intracelulares y Extracelulares Hongos y Levaduras Plantas

Intracelular Extracelular Vac. y

Extarcelular Citosol

pH 3.5 - 5.5 4.5 - 5.5 4.5 - 5.5 4.5- 5 7 - 7.8

Temp(ºC) 40 - 60 50 - 60 50 - 60

Peso molecular 45 - 60 45 - 60 50 - 60 55 - 70 54 -65 Inhibición por metales pesados Si Si Si No



Las glicosilhidrolasas son definidas como (EC 3.2.1.x), donde los tres primeros

dígitos indican la propiedad de hidrolizar el enlace O-glicosídico, y el cuarto (x)

indica el tipo de substrato. La hidrólisis del enlace glicosídico catalizada por las

distintas variedades de glicosilhidrolasas está mediada por la acción de dos

residuos catalíticos presentes en el centro activo, uno de los cuales actúa como

donador de protones y el otro como nucleófilo o base. En la mayor parte de los

casos son dos residuos carboxílicos. El enlace glicosídico puede hidrolizarse de

dos formas distintas, atendiendo a cual sea la configuración del carbono

anomérico resultante de la hidrólisis. Una primera posibilidad es que la

configuración anomérica cambie. A la reacción hidrólitica que se desarrolla de esta

forma se la designa como mecanismo de inversión (Figura 2A). La posibilidad

alternativa es que la configuración anomérica se mantenga. Es lo que se

denomina mecanismo de retención (Figura 2B). En las glicosidasas que operan

mediante inversión, la distancia de separación de los dos carboxilos catalíticos es

de aproximadamente 10 Å, mientras que en las enzimas que retienen la

configuración del enlace, la separación es alrededor de 5 Å. El mecanismo de

inversión tiene lugar en una sola etapa, mediante un proceso catalítico ácido-base.

Uno de los dos residuos catalíticos opera como base, facilitando el ataque de una

molécula de agua al carbono anomérico y el otro, como ácido, asistiendo la

separación del oxígeno. El mecanismo de retención tiene lugar mediante un doble

desplazamiento. En este proceso tiene lugar el ataque del residuo nucleófilo al

carbono anomérico. Como resultado tiene lugar la formación transitoria de un

enlace covalente entre la enzima y el glicósido. Este enlace es lo suficientemente


estable como para permitir la separación del centro activo de la parte liberada y su

reemplazamiento por una molécula de agua, con asistencia de un segundo

residuo catalítico ácido/base que actúa en la primera etapa como ácido,

protonando el oxígeno glicosídico, y como base en la segunda, sustrayendo un

protón de una molécula de agua que deshace el enlace covalente transitorio y

regenera a la enzima (Flores, 2004).


Figura 5. Mecanismos de hidrólisis del enlace glicosídico. El esquema representa la

reacción que ocurre en el sitio catalítico de las glicosil hidrolasas que operan mediante: A,

mecanismo de inversión .B, Mecanismo de retención. Adaptado de Rye and Withers.


1.5 INHIBIDORES DE α-GLICOSIDASA

Los inhibidores de α-glicosidasa son compuestos de naturaleza glicosídica que

contienen en su estructura nitrógeno intra o extracíclico. Estos derivados han

cobrado una gran importancia en la terapéutica debido a que al inhibir α-

glicosidasa producen un efecto hipoglucemiante y por consiguiente son de gran

utilidad en el control de glucosa sanguínea en pacientes con diabetes mellitus.

Actualmente el pseudotetrasacárido Acarbosa y el iminoazúcar Miglitol el cual es

un derivado de 1-desoxynojirimicina, son 2 inhibidores de α -glicosidasa

aprobados para su uso en pacientes con diabetes tipo II (Jacob, 1995). Otros

candidatos que se encuentran en fase clínica avanzada son castanopermina,

swainsonina, kifunensina, y desoximanojirimicina entre otros representados en la

figura 1.

N

OH

HOHO

HO

castanospermina

NHOH

HOHO

HO

desoximannonojirimicina

NHO

NHO

HOOH

swainsonina

NH

OO

OHOH

HO

kifunensina


OHHOHO

OH

NH

O

OH

OHHO

O O

OH

OHHO

O O

OH

OHHO

OHAcarbosa

N

OH

OH

HO

OH

OH

Miglitol

Figura 1. Estructura de inhibidores de α-glicosidasa usados en el tratamiento de diabetes

mellitus tipo II.

1.6 MECANISMO DE INHIBICIÓN DE LAS GLICOSIDASAS

Las glicosidasas son enzimas que desempeñan un papel importante en el

procesamiento de varias glicoproteínas y glicolípidos, y se ha postulado que el

mecanismo de inhibición procede a través de un estado de transición de media

silla cargado positivamente que interactúa con los residuos de ión carboxilato y

GDP (Guanin Difosfato) en el sitio activo de la enzima como se observa en la

figura 2 (Ichikawa, 1992).

BH

O

NH2

OHHO

OHOH

PO

O

O

O P

O

O

O

O

G OH

OH

Figura 2. Mecanismo de inhibición de iminoazúcares en el sitio de acción de

α-glucosidasa.


Asimismo, como se observa en la figura 3 se han determinado las posiciones

dentro de la secuencia glicosídica sobre los cuales los inhibidores de α-

glucosidasa ejercen su actividad inhibitoria (Wong and Kajimoto, 1995).

Glc Glc Glc Man Man Man

Man

Man

ManMan

ManMan

GlcNAc GlcNAc Asn

castanosperminadesoxinojirimicina

N-metildesoxinojirimicina

glucosidasa I

desoxinojirimicinaglucosidasa II


mannosidase I


mannosidase Imannosidase II

swainsoninakifunensina

Figura 3. Sitios de acción de inhibidores de glicosidasa en la biosíntesis de proteínas.


1.7 PREPARACIÓN DE IMINOAZUCARES

El desarrollo de métodos de síntesis asimétrica tanto químicos como enzimáticos

para la obtención de iminoazúcares ha tenido un significativo desempeño y

potencial, generando una importante variedad de sustancias activas en el

tratamiénto del HIV, diabetes, enfermedad de Gaucher, y cáncer. (Brito-Arias,

2006). Algunas de las rutas sintéticas descritas con éxito incluyen aproximaciones

tipo azida a partir de monosacáridos (Ichikawa, 1998; Roy, 2006), así como por

síntesis enantioselectiva de tipo química y enzimática. Para el primer caso se ha

reportado la síntesis enantioselectiva en presencia de (S)-Prolina como

organocatalizador (Liao, 2006), y para el segundo de aldolasas (Gijsen, 1996) y

lipasas (Look, 1993) a partir de diversos sustratos donantes entre los que se

mencionan 2-azido aldehídos (Hung, 1991), epoxidos (Kanerva, 1993),

cinamaldehido (Wong, 1995), y dihidroxi acetona fosfato (DHAP), seguido por

aminación reductiva.


1.8 SINTESIS QUÍMICO ENZIMÁTICA DE CABOHIDRATOS

La síntesis químico enzimática de sustancias de potencial uso terapéutico es una

poderosa herramienta combinatoria ya que aprovecha los beneficios de ambas, es

decir a través de la síntesis orgánica se pueden preparar una amplia variedad de

precursores de manera accesible, y a través de la biocatálisis enzimática para

llevar a cabo

transformaciones con una elevada estéreo especificidad y estéreo selectividad. El

uso de enzimas para llevar transformaciones químicas ha tenido un desarrollo

notable principalmente en la síntesis asimétrica y la resolución cinética de mezclas

racémicas. Recientemente, la desimetrización entendiéndose como la

modificación enzimática que elimina uno o más elementos de simetría como

estrategia para obtener sustancias óptimamente puras, se revela como otra

estrategia de gran potencial (García-Urdiales, 2005).

La síntesis enzimática de carbohidratos requiere principalmente del uso de

aldolasas. Estas enzimas generan hexosas a partir de componentes de tres

carbonos a través de una condensación aldólica. Existen alrededor de 30

aldolasas identificadas y aisladas siendo estas clasificadas en aldolasas tipo 1 y

tipo 2 dependiendo del mecanismo involucrado. Desde el punto de vista sintético

las aldolasas se clasifican en 5 grupos dependiendo del donante y el producto

formado (H.M. Gijsen y colaboradores (1996): Dihidroxiacetona fosfato aldolasa,


Piruvato aldolasa, 2-Desoxiribosa 5-fosfato aldolasa, Glicina aldolasa y Otras

aldolasas.

Para el desarrollo de la alternativa química enzimática con la que se desarrollo

este proyecto, se produjo invertasa a partir de una bacteria llamada Cellulomonas

flavigena, la cual es una bacteria gram positiva, sus colonias son de color marfil y

tienen forma de bastón. Posteriormente se probo su actividad hidrólitica en los

intermediarios del sustrato modificado partiendo de sacarosa, que conducen a la

obtención de un iminoazúcar de posible potencial efecto inhibitorio.


Tabla 1. Substratos naturales para aldolasas


2. JUSTIFICACIÓN

Debido al papel central que tiene la invertasa en la liberación de fructosa y glucosa

a partir de sacarosa se buscan métodos alternativos de purificación de esta

enzima a partir de cepas alternativas a las ya reportadas. Asimismo, su

purificación servirá para llevar a cabo estudios de reconocimiento enzimático

empleando derivados de aminosacrosa los cuales son sintetizados y

caracterizados espectroscópicamente y serán a su vez evaluados como posibles

agentes hipoglucemiantes a través de la inhibición de alfa glucosidasa.


3. HIPÓTESIS

La invertasa obtenida de C. flavigena ejercerá su actividad hidrólitica sobre el

enlace O-glicosídico de los derivados de sacarosa modificada 7 (Esquema 1,

pagina 27), 17 (Esquema 2, pagina 29) y 26 (Esquema 3, pagina 30), los cuales

contienen un grupo amino en lugar de hidroxilo en las posiciones 4’ de fructosa y

6’ de glucosa. Esta actividad hidrólitica generará los intermediarios 9 (Esquema 1)

y 18 (Esquema 2), los cuales llevarán a cabo un cierre de anillo para generar los

iminoazúcares 10 y 20 respectivamente.


4. OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL

Producción de la invertasa de C.flavigena

Desarrollar intermediarios vía químico enzimática que conduzcan a un

iminoazúcar de potencial actividad inhibitoria de (-glucosidasa a partir de

sacarosa.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Caracterización cinética de la enzima

Obtención de los intermediarios de la ruta sintética empleada en la

transformaron de la sacarosa hasta el iminoazúcar.

Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre

los intermediarios 7,17 y 26.

Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de

Sacharomyces cerevisae sobre los intermediarios obtenidos en la ruta

sintética 7,17 y 26.


5. MATERIALES Y MÉTODOS

Los reactivos empleados son de grado analítico obtenidos comercialmente

(Sigma-Aldrich Co.) y los disolventes usados fueron destilados previos a su uso.

La purificación de los intermediarios fue llevada a cabo usando como fase

estacionaria silica gel 60 (Merck Co.) y el curso de las reacciones fue monitoreada

por cromatografía en capa fina usando cromatofolios de silica gel 60 y como

sistema revelador solución de sulfato cerico amoniacal seguido por calentamiento.

Los espectros de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (1H RMN) y carbono

(13

C RMN) fueron registrados en un espectrómetro Varían 300 Gemini usando

cloroformo deuterado como disolvente.

Para la producción del extracto enzimático se utilizo un reactor de 10 L en un

cultivo por lote, el sustrato fue sacarosa grado reactivo así como todos los

componentes del medio de cultivo. Para su caracterización también se utilizaron

reactivos de grado analítico.


6. METODOLOGÍA

6.1.1 Microorganismo

Cellulomonas flavigena CDBB 531, obtenida de la Colección microbiana del

CINVESTAV. La cepa de este microorganismo se resembró cada mes en tubos

de agar inclinados con un medio de conservación específico.

6.1.2 Preparación del inóculo

La producción del extracto enzimático, se realizó en un cultivo por lote. El

crecimiento de Cellulomonas flavigena de un tubo de agar, se resuspendió en 3.3

ml de regulador de fosfatos (1.22 M pH 7) y se transfirió a un matraz Erlenmeyer

nefelométrico de 500 ml con 100 ml de medio conteniendo: 10 g/L Glicerol, 3 g/L

(NH4)2SO4, 0.16 g/L MgSO47H2O, 0.075 g/L NaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O, 800

µg/L ZnSO47H2O, 21µg/L MnCl2 4H2O2

, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina, el

cual se incubó a 150 rpm, a 37ºC por 24 h. El crecimiento fue medido por

densidad óptica y se utilizó como inóculo


6.1.3 Obtención de la enzima

Se realizó un cultivo por lote, en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de

10 L, conteniendo 5 L con la siguiente composición: 10 g/L Sacarosa,3 g/L

(NH4)2SO4,0.16 g/L MgSO47H2O, 0.075 g/LNaCl, 0.019 g/L CaCl22H2O,800 µg/L

ZnSO47H2O,21µg/LMnCl2 4H2O2,120µg/L FeSO4 /H2O,120µg/L CoCl2 6H2O,

0.13µg/L Na2MoO4 2H2O,0.7µg/L CuCl2 H2O,1.1µg/L BaCl2 2H2O,1.25µg/L NiSo4

6H2O,0.75µg/L Na2B4O7 10H2

O,0.65µg/L Kl, 4mg/mL Tiamina, 0.13mg/mL Biotina

y Fosfatos 2 mMoles. El cultivo se incubó durante 32 h a 37°C. Las células se

separaron por centrifugación a 10000 revoluciones por minuto por 40 min a 4°C, y

se utilizaron para el aislamiento, caracterización de la enzima y su uso en la

obtención de los intermediarios de sacarosa modificados.

6.1.4 Aislamiento de la enzima

Como la enzima es intracelular, las células se lavaron con buffer de acetatos y se

adicionó un inhibidor de proteasas (PMSF (Fenilmetilsulfonil floruro) a 1mM).

Posteriormente se rompieron en una prensa francesa (French preassure cell

press. American Instrument.co.inc.) a una presión de 1500 psig (libras por pulgada

cuadrada) . Las células rotas fueron centrifugadas a 10000 revoluciones por

minuto y lavadas con buffer de acetatos, para su posterior caracterización y

utilización en los intermediarios de sacarosa modificada.


6.1.5 Determinación de la actividad enzimática

Se utilizó sacarosa al10% p/v, como sustrato en la determinación de la actividad

enzimática.

La actividad fue determinada incubando una cantidad apropiada del extracto

enzimático, sustrato y regulador de Tris HCl 0.1M pH 7, en un volumen final de

1750µL e incubando a 55ºC por 5 min. La liberación de azúcares reductores se

siguió por el método del ácido dinitrosalicílico (DNS) (Miller, 1959) usando una

mezcla equimolar de glucosa y fructosa como estándar. La actividad se expresó

en unidades internacionales (UI). Una unidad internacional (UI) de actividad se

definió como la cantidad de enzima necesaria para liberar 1 µmol de azúcares

reductores equivalentes a fructosa en las condiciones mencionadas. Todos los

ensayos fueron hechos por triplicado y se reportó el valor promedio.

6.2 Caracterización enzimática

6.2.1 Efecto del pH y de la temperatura de incubación sobre la actividad de

invertasa

Se observó el efecto del pH sobre la actividad de la enzima a valores de pH entre

5.5 y 8 en buffer de Tris - HCl 0.1M a la temperatura óptima previamente

determinada. Para la temperatura óptima para la actividad enzimática, se

determinó incubando la enzima en presencia del sustrato por 5 min a


temperaturas entre 50-65 ºC. en el buffer antes mencionado al pH que resulto

óptimo para la enzima.

6.2.3 Determinación de los parámetros cinéticos

Para la determinación del Km y Vmax

, se trabajo a los valores óptimos de pH y

temperatura utilizando concentraciones variables de sacarosa (5% al 40%) y para

el cálculo de las constantes, se empleo la representación de Lineaweaver- Burk.

6.2.4 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa de C.flavigena sobre el

intermediario.

A 1750 µL de buffer de Tris HCl 0.1M pH 7 conteniendo cada uno de los

intermediarios, disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v), se

adicionaron 250 µL del extracto enzimático de C. flavigena. La actividad de la

invertasa fue determinada por método de DNS (Miller, 1959).

6.2.5 Evaluación de la actividad hidrólitica de la invertasa comercial de

Sacharomyces cerevisae sobre los intermediarios obtenidos en la ruta sintética.

A 1750 µL de buffer de acetatos 0.1M pH 5.5 conteniendo cada uno de los

intermediarios disueltos previamente en di-metil-formamida (10% p/v) se le

adicionaron 250 µL de una solución enzimática de una invertasa comercial de


Sacharomyces cerevisae. La actividad de la invertasa fue determinada por

método de DNS (Miller, 1959).

6.2.4 Termo estabilidad

La estabilidad de la enzima con respecto al tiempo se midió incubando una

cantidad de enzima constante a 55°C tomando alícuotas a diferentes tiempos y

midiendo actividad enzimática por el método del DNS (Miller, 1959)

6.3 Obtención de los Amino azúcares

La metodología sintética para la obtención de los iminoazúcares objeto de nuestro

estudio se basa en los esquemas 1 y 2 que se describe a continuación.

El esquema 1 inicia con la protección selectiva de sacarosa 1 en las posiciones

hidroxílcas 6 y 4 de glucosa para los cual se utiliza benzaldehído dimetilacetal en

medio ácido (Garegg, 1995, Robyt, 1997), generando el intermediario protegido 2.

El siguiente paso consiste en la reacción de tosilación en piridina para incorporar

el ester sulfónico en la posición 4’ de fructosa conteniendo la posición hidroxílica

primaria (Rai, 2005), para generar el intermediario 3. Posterior peracetilación con

anhídrido acético en piridina conduce a la obtención del intermediario 4, este


último paso tiene la finalidad de permitir la separación de las señales de los

hidrógenos del disacárido en su espectro de resonancia magnética nuclear de

hidrógeno (1

subsecuente de este intermediario bajo condiciones de hidrogenación catalítica

conduce a la formación intermediario 6 el cual contiene una amina primaria en la

posición 4’ de la fracción de fructosa del disacárido. La remoción final de los

grupos protectores bencilinen y acetato se llevara a cabo con Yodo en metanol y

solución de metóxido de sodio respectivamente para generar el intermediario de

sacarosa isostérico 7.

H RMN) así como favorecer la purificación del disacárido en sistemas

no polares. El intermediario resultante se hace reaccionar con azida de sodio en

DMF para mediante una reacción de sustitución nucleofílica reemplazar el grupo

tosilo por el grupo azida y dar lugar a la formación del intermediario 5. La reacción

El siguiente paso es crítico y consiste en someter el intermediario 7 a la acción de

la enzima hidrólitica invertasa la cual presumiblemente debe reconocer el sustrato

modificado conteniendo el grupo amino en la posición 4’ de fructosa que es un

isóster clásico del alcohol primario del sustrato natural. Si el reconocimiento no es

posible se someterá el intermediario de sacarosa antes mencionado a condiciones

de hidrólisis ácida con la finalidad de separar los monómeros constitutivos,

aunque como se ha documentado existe el riesgo de modificación estructural de

los carbohidratos cuando están sujetos a condiciones ácidas (Brito-Arias, 2006).

Para esta ruta sintética la hidrólisis del disacárido modificado representa la


liberación del intermediario de fructosa 9 conteniendo el grupo amino el cual

llevara a cabo una reacción de adición nucleofílica intramolecular (Ichikawa, 1998)

dando lugar a la formación de la imina cíclica la cual por reducción catalítica

conducirá a la formación del imino azúcar 10 que constituye uno de los productos

de interés como sustancia activa de potencial actividad hipoglucemiante.

Esquema 1

OR1O

R1OR2O

OR2 O O

OR3

OR3

R4R3O

OR1O

R1OR2O

OR2 OH

O

OR3

OR3

OR4R3O

1 R1, R2, R3= H, R4 = OH

2 R1 = CH(Ph), R2, R3 = H, R4 = OHi

vii

4 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = OTs

5 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = N3

ii

iii

6 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = Ac, R4 = NH2

iv

HO+

7 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2

v

OHO

OH

H2NNHO

OH

HOH

HO

vii

8 9

10

3 R1 = CH(Ph), R2 , R3 = H, R4 = OTs

vi

i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.


El esquema 2 propone la protección inicial de sacarosa 1 con benzaldehído

dimetilacetal en medio ácido generando el intermediario 11 el cual es sometido a

condiciones de peracetilación dando lugar al intermediario 12. El siguiente paso

consiste en la remoción del grupo benciliden de las posiciones 4 y 6 de glucosa

para lo cual se emplea yodo en metanol a reflujo (Robyt, 1996) generando el

intermediario parcialmente protegido 13 el cual se hace reaccionar con cloruro de

tosilo en piridina con la finalidad de producir el intermediario 14, el cual contiene el

éster sulfónico en la posición 6 de glucosa. Posteriormente se sigue una

secuencia de pasos similares al esquema 1 consistentes en la reacción con azida

de sodio en DMF e hidrogenación catalítica para dar lugar a la obtención de los

intermediarios 6 y 7 respectivamente. La reacción de desacetilación para generar

el intermediario 15 será un paso previo para la reacción de hidrólisis enzimática

del disacárido modificado antes mencionado el cual contiene el grupo amino en la

posición 6 de glucosa. La acción hidrólitica de invertasa liberará el intermediario

aminado de glucosa 16 el cual llevara a cabo la ciclización intramolecular para

conducir a la imina cíclica que generara después de ser sometida a hidrogenación

catalítica a la formación del iminoazúcar 17 siendo este el producto de interés en

esta síntesis.


Esquema 2

OR1

R2R3O

OR3 O O

OR4

OR4

OR5R4O

OR1O

R1'OR2O

OR2 OH

O

OR3

OR3

OR4R3O

1 R1, R2 = OH, R3, R3, R4, R5 = H

11 R1, R2 = O2CH(Ph), R3, R4, R5 = Hi

viii

ii

iii

iv

HO+

v

ix

18 19

20

H

NH2

O

OH

OH

OH

N

OH

OH

HO

H12 R1, R2 = O2CH(Ph), R3, R4, R5 = Ac

13 R1, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac

14 R1 = OTs, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac

15 R1 = N3, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac

16 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = Ac

17 R1 = NH2, R2 = OH, R3, R4, R5 = H

vi

vii

i) PhCH(OMe)2, pTsOH, DMF, 50oC. ii) Ac2O, Py, t.a. iii) I2, MeOH reflujo iv) TsCl, Py, t.a., 7 h. v) NaN3, DMF, reflujo 6 h. vi) H2, Pd-C, EtOH. vii) MeONa, MeOH. viii) Invertasa. o H3O+. ix) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.


Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la

secuencia de reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como

grupo protector de las posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden.

Esquema 3

O

R1O

R1OR2O

OR2 O O

OR3

OR3

R4R3O

1 R1, R2, R3 = H, R4 = OH

21 R1 = CMe2, R2, R3=H, R4 = OHi

22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = OTs

24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3

ii

iii

25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2

iv

v

23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = OTs

26 R1 , R2 , R3 = H, R4 = NH2

i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.


7. DESARROLLO EXPERIMENTAL

Obtención de 4,6-O-Benciliden sacarosa (2).

OO

O

OO

OHOH

OH

OH

OHHO

OHO

HO

OO

OHOH

OH

OH

OHHO

En un matraz bola de 250 mL se mezclan en el siguiente orden sacarosa (grado

reactivo) (5 g, 14.6 mmol), benzaldehído dimetilacetal (6 mL, 39.4 mmol),

dimetilformamida (50 mL), y ácido paratoluensulfónico (0.5 g) y la reacción se

coloca en un evaporador rotatorio a una temperatura de 50o

C durante 1 hora,

monitoreando la reacción por cromatografía en capa fina. Se adiciona trietilamina

(2.4 mL) y se evapora usando una bomba de alto vacío. El residuo se purifica por

cromatografía en columna usando sílica gel 60 como fase estacionaria y un

sistema de elusión hexano-acetato de etilo-metanol (8:2:0.1) para generar el

intermediario 2 (5.0 g, 79.6 %) como melaza.


Obtención de 4,6-O-Benciliden-6’-tosil sacarosa (3).

OO

O

OO

OHOH

OH

OH

OHHO

PhO

OO

OO

OTsOH

OH

OH

OHHO

Ph

En un matraz bola de 250 mL se mezclan en el siguiente orden 4,6-O-Benciliden

sacarosa (5.00 g, 11.6 mmol), piridina (135 mL), cloruro de tosilo (6.79 g, 11.6

mmol), y la reacción se agita a temperatura ambiente durante 24 horas. El

producto de reacción se purifica por cromatografía en columna usando sílica gel

60 como fase estacionaria y como fase movil un gradiente de una mezcla hexano-

acetato de etilo, para generar el intermediario 3 (5.4 g, 80 %) como un sólido.


Obtención de 4,6-O-Benciliden-1’,3’,4’-tri-O-acetil-6’-tosil sacarosa (4).

OO

O

OO

OTsOH

OH

OH

OHHO

Ph OO

O

OO

OTsOAc

OAc

OAc

OAcAcO

Ph

En un matraz bola de 100 mL se mezclan el intermediario 3 (2.00 g, 5.84 mmol),

piridina (12.6 mL, 159.4 mmol), y anhídrido acético (10 mL, 97.9 mmol) y la

reacción se agita durante 24 horas a temperatura ambiente. El producto de

reacción se coevapora con tolueno (3 x 20 mL) y el residuo se purifica por

cromatografía en columna usando sílica gel como fase estacionaria y como

sistema de elusión un gradiente de hexano-acetato de etilo para generar el

intermediario 4 (2.1 g, 80 %) como sólido.


Obtención de 4,6-O-Benciliden-1’,3’,4’-tri-O-acetil-6’-azida sacarosa (5).

OO

O

OO

OTsOAc

OAc

OAc

OAcAcO

Ph OO

O

OO

N3OAc

OAc

OAc

OAcAcO

Ph

En un matraz bola de 100 mL se mezclan el intermediario 4 (2.00 g, 2.5 mmol),

dimetilformamida (13 mL), y azida de sodio (3.3 g, 5.0 mmol), llevando la

reacción a 80o

C durante 8 horas. El producto de reacción se diluye con acetato

de etilo (50 mL) se lava con agua (50 mL), se seca con sulfato de sodio anhidro y

se evapora en rotavapor. El residuo se purifica por cromatografía en columna

usando sílica gel como fase estacionaria y como sistema de elusión un gradiente

de hexano-acetato de etilo para generar el intermediario 5 (2.3 g, 70 %) como

sólido.


8. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

8.1 PRODUCCIÓN

La cinética de crecimiento para la producción de invertasa de C.flavigena se llevo

acabo en una fermentación por lote.

Figura 6. Cinética de crecimiento de Cellulomonas flavigena en sacarosa al 1%.

Actividad hidrólitica ( ), crecimiento ( )


Se puede observar en la figura 6 el crecimiento de Cellulomonas flavigena CDBB

531, obtenida de la Colección microbiana del CINVESTAV, realizada en un cultivo

por lote, en un reactor tipo tanque agitado con capacidad de 10 L.

Durante las primeras 22 h el crecimiento fue lineal. Posteriormente se presentó un

crecimiento exponencial de 22 a 37.5 h. A partir de las 37.5 h el crecimiento se

mantiene constante y aproximadamente a las 38 h empieza a decaer.

El máximo de actividad hidrólitica se obtuvo al inicio de la fase estacionaria de

crecimiento e inmediatamente empezó a decaer.

En la literatura es reportado que que la invertasa proveniente de Aspergillus Níger

presenta una fase exponencial de crecimiento en un rango de 35 a 48 horas

(Romero 2000).

La invertasa producida por fermentación de Penicillium chysogenum y

Saccharomyces cerevisae reporta que el crecimiento es lento hasta las 120 horas,

encontrando invertasa intracelular y extracelular (Poonawalla, 1965).

Esta reportado que tanto en hongos como bacterias, la invertasa puede ser

extracelular e intracelular (Jee-Song y col.1996), en esta bacteria fue intracelular,

por lo que se procedió a romper las células, en el sobrenadante se detectó

actividad y con este extracto se procedió a su caracterización.


8.2 CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA

8.2.1 pH y Temperatura óptima

Para la determinación de pH óptimo se hicieron ensayos con diferentes buffers:

acetatos 0.1 M, fosfatos 0.1 M, citratos fosfatos, maleato 0.1 M y tris HCl 0.1 M.

Los datos de pH óptimo que se encuentran reportados para las invertasas en la

literatura son en su mayoría en el rango ácido. Las invertasas dependiendo de su

pH se clasifican en: acidas, básicas y neutras. La invertasa producida por

Cellulomonas flavigena es una invertasa neutra. Esta mostró actividad a

diferentes pH, alcanzando su máxima actividad en un buffer de Tris HCl a pH

=7. En la siguiente tabla se muestran las máximas actividades en cada uno de los

buffers probados:

Tabla 3. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena en

buffers diferentes

Buffer Actividad UI/ml

Tris HCl 1.4

Tris Maleato 0.57

Fosfatos no presento actividad

Acetatos 0.734

Citratos Fosfatos no presento actividad


En la figura 7, se observa que a intervalos muy cerrados de pH la actividad

disminuye aproximadamente un 50%.

Figura 7. Gráfico de actividad hidrólitica en Buffer Tris HCl 0.1 M, 5 minutos

Para la determinación de la temperatura óptima se sometió la enzima a un rango

de entre 55°C y 65 °C de temperatura, en buffer de tris HCl 0.1 M. La máxima

actividad fue obtenida a la temperatura de 55°C. En la siguiente tabla se muestran

las actividades de la enzima a diferentes temperaturas. En la literatura se reporta

para una invertasa de Aspergillus Níger una temperatura optima de 50º C

(L’Hocine et al., 2000).

La invertasa obtenida de esta bacteria proveniente de una planta muestra las

caracteristicas de pH reportadas en la literatura (www.brenda.unikoeln).


Tabla 4. Actividades máximas de invertasa producida por Cellulomonas flavigena a

diferentes temperaturas

Temperatura °C Actividad UI / ml

50 No presento

55 1.388478582

60 0.437223043

65 No presento

El siguiente grafico muestra el rango de temperaturas probadas y las actividades

correspondientes cada una.

Figura 8. Gráfico de Temperatura óptima en Buffer Tris HCl 0.1 M, 5 minutos


La temperatura óptima se encuentra dentro del intervalo reportado para esta

enzima (www.brenda.unikoeln).

8.3 Termo estabilidad

Una característica deseable en las enzimas es que sean estables. La siguiente

grafica muestra el efecto de la temperatura sobre la actividad de la enzima con la

temperatura óptima (55oC) previamente analizada. Puede observarse que la

actividad disminuye significativamente a los 30 minutos.

Figura 9. Gráfico de Termo estabilidad


Se considera una alternativa para hacer más termoestable a una enzima

adicionar glicerol y manitol a diferentes concentraciones.

8.4 PARAMÉTROS CINÉTICOS

Km y Vmax

La cinética de sustrato contra velocidad muestra un comportamiento totalmente

hiperbólico. El valor de Km determinado mediante la representación Lineweaver-

Burk es de 62.5 mmoles / mL. Este valor es más alto a los ya reportados; en la

literatura se encuentra que la afinidad por el sustrato va desde 30 a 45 mmoles

para sacarosa. En cuanto a la Vmax el valor obtenido es de 1.6 mmoles / min

mg.


8.5 Obtención de los iminoazúcares

El desarrollo experimental para la obtención de los iminoazúcares inició con la ruta

propuesta en el esquema 1 y consistió en la reacción de protección selectiva de

las posiciones 4 y 6 de la glucosa con benzaldehído dimetilacetal para lo cual se

llevaron a cabo diferentes condiciones experimentales que se muestran en la

siguiente tabla:

Tabla 5. Condiciones experimentales

Ensayo 1 Ensayo 2 Ensayo 3

Reactivos Benzaldehído

dimetilacetal, ácido

paratoluensulfónico,

dimetilformamida

Benzaldehído,

cloruro de

zinc

Benzaldehído

dimetilacetal, ácido

paratoluensulfónico,

dimetilformamida

Condiciones Temperatura

ambiente, 24 horas

Temperatura

ambiente, 24

horas

1 hora, 60ºC

Referencia R. Khan, K.S. Mufti,

M.R. Jenner,

Carbohydrate

Research 65

(1978), 109-113

Lipták,

Carbohydrate.

Research 116

(1983) 217-

225

H.M.I. Osborn,

Carbohydrates, ed.

Academia Press,

2003, 62


Los resultados obtenidos mostraron similitud en sus espectros de RMN de

hidrógeno y en la cromatografía de capa fina. El espectro de 1H RMN del

intermediario 2 parcialmente purificado muestra señales en la región alifática,

vinílica y aromática. En la región entre 3.3 y 4.5 ppm se observa un patrón de

señales multiples sobrepuestas que corresponden a los hidrógenos de la

sacarosa. En 5.4 ppm una señal simple que corresponde al hidrógeno bencílico, y

en la región entre 7.2 y 7.6 una señal múltiple correspondiente a los hidrógenos

aromáticos (figura 1).

Figura 10.- Espectro de 1H RMN del intermediario 2 en CDCl3.


El siguiente paso consistió en la reacción de tosilación del intermediario 2

utilizando cloruro de tosilo y piridina a temperatura ambiente durante 24 horas

para generar el intermediario 3. El espectro de 1H RMN del intermediario 3

presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. En campo alto 2.42

ppm se observa una señal simple correspondiente al metilo del grupo tosilo. Entre

4.0 y 4.7 ppm se observa un sistema complejo de señales correspondientes a los

hidrógenos no intercambiables de la sacarosa, así como en 6.0 ppm una señal

simple para el hidrógeno bencílico, y en 6.06 ppm una señal doble (J= 8.4)

correspondiente al hidrógeno de la posición anomérica de glucosa. En 7.6 se

observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82 ppm una señal doble que

corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y a los hidrógenos del

grupo tosilo característico de un sistema A2X2

para-sustituido (espectro 2 ).


Figura 11.- Espectro de 1H RMN del intermediario 3 en CDCl3

.


El espectro de 13

C RMN del intermediario 3 muestra señales en la región vinílica

para los carbonos de los monosacáridos y en la región aromática (figura 3).

Figura 12.- Espectro de 13C RMN del intermediario 3 en CDCl3

.

La reacción de peracetilación se llevó a cabo bajo condiciones de anhídrido

acético en piridina a temperatura ambiente obteniéndose el intermediario 4 aunque

parcialmente acetilado. El espectro de 1

H RMN del intermediario 4 presenta

señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0 ppm de


Observan 2 señales simples que integran para 9 hidrógenos lo que supone que la

Protección se dio solo en posiciones hidroxílicas. En 2.42 ppm se observa una

señal simple correspondiente al metilo del grupo tosilo. De 4.2 a 4.6 ppm se

observa un sistema de señales múltiples correspondientes a 7 hidrógenos no

intercambiables de la sacarosa, en 5.1 ppm una señal múltiple, en 5.5 una señal

doble, en 6.0 una señal doble y en 6.1 ppm una señal simple para el hidrógeno

bencílico. En 7.2 se observa un patrón de señales doble y múltiple y en 7.82 ppm

una señal doble que corresponde al sistema monosustituído del grupo benciliden y

a los hidrógenos del grupo tosilo característico de un sistema A2X2

para-sustituido

(espectro 4).



.

El espectro de 13

C RMN del intermediario 4 muestra señales en la región alifática

para los grupos metilo de acetato y tosilo, en la región vinílica para los carbonos

de sacarosa y aromática para los carbonos del grupo benciliden y tosilo. En 170

ppm se observan señales características de carbonilos pertenecientes a los

grupos acetato. (figura 5).


Figura 14.- Espectro de 13C MN del intermediario 4 en CDCl3

.

El intermediario 4 se hace reaccionar con azida de sodio en dimetilformamida bajo

condiciones de reflujo generando el intermediario 5. El espectro de 1

H RMN

presenta señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto en 2.0

ppm de observa 1 señal simple que integra para 9 hidrógenos lo que supone que

la protección se dio solo en 3 posiciones hidroxílicas. Entre 3.4 y 3.8 ppm se

observan 2 señales doble de doble correspondiente a 2 hidrógenos. Entre 4.4 y

4.6 ppm una señal doble de doble y una señal doble que integran para 2


hidrógenos. En 5.16 ppm se observa una señal múltiple que integra para 1

hidrógeno. En 5.6 ppm, 6.1 ppm y 6.2 ppm se observan 2 señales dobles y 1

señal simple que integran para 3 hidrógenos. En campo bajo se observa en 7.4

ppm una señal múltiple que corresponde al anillo aromático del grupo benciliden,

no observándose las señales correspondientes al grupo tosilo lo cual demuestra la

sustitución por el grupo azida (figura 5).


.


Paralelamente se llevo a cabo la ruta descrita en el esquema 3 en donde la

secuencia de reacciones es la misma excepto la utilización de acetónido como

grupo protector de las posiciones 4 y 6 de glucosa en lugar del grupo benciliden.

Esquema 3

i) C3H6O, 2,2-DMP, pTsOH, t.a. ii) TsCl, Py, 25oC. iii) Ac2O, Py, t.a. iv) NaN3, DMF. reflujo v) H2, Pd-C, EtOH.vi) a) MeONa-MeOH. b) I2, MeOH. vii) Invertasa. o H3O+. viii) a) 1N HCl. b) H2, Pd-C 10%, EtOH.

iv

vi

O

R1O

R1OR2O

OR2 O O

OR3

OR3

OR4R3O

1 R1, R2, R3, R4 = H

21 R1 = CMe2, R2, R3, R4 = Hi

22 R1 = CMe2, R2 , R3 = H, R4 = Ts

24 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = N3

ii

iii

25 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = NH2

26 R1, R2 , R3 = H, R4 = NH2

v

23 R1 = CMe2, R2 , R3 = Ac, R4 = Ts


La ruta sintética consistió en la preparación inicial del intermediario 21 al hacer

reaccionar sacarosa comercial con acetona y 2,2- dimetoxipropano en medio

ácido. En el espectro de 1

H RMN se observan señales en la región alifática y

vinílica. A campo alto se observan 3 señales simples en 1.2 ppm y 2.7 y 2.8 ppm

que corresponden a los metilos del grupo acetónido y dimetilformamida

respectivamente. En la región de 3.6-4.2 se observa un sistema sobrepuesto de

señales correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa

(espectro 6).



El siguiente paso consistió en hacer reaccionar el intermediario 21 con cloruro de

tosilo y piridina a temperatura ambiente durante 24 horas para generar el

intermediario 22. El espectro de 1

H RMN presenta señales en la región alifática,

vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se observan 3 señales simples que

corresponden a los metilos del grupo acetónido y al grupo metilo unido al benceno.

Entre 3.4 y 4.2 ppm se observa el sistema complejo de señales correspondientes

a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la región aromática 7.2 y

8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a los hidrógenos unidos

al anillo aromático típicos de un sistema A2X2

para-sustituido.



El intermediario 22 se sometió a condiciones de acetilación bajo condiciones de

anhídrido acético y trietilamina para generar el intermediario 23 a temperatura

ambiente durante 24 horas. El espectro de 1

señales en la región alifática, vinílica y aromática. A campo alto 1.2 ppm se

observan 3 señales simples que corresponden a los metilos del grupo acetónido y

al grupo metilo unido al benceno. En 2.1 se observan señales asignables a los

grupos acetato. Entre 3.7 y 4.7 ppm se observa el sistema complejo de señales

H RMN del intermediario 23 presenta

correspondientes a los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa y en la

región aromática 7.2 y 8.0 ppm se observan 2 señales dobles que corresponden a

los hidrógenos unidos al anillo aromático típicos de un sistema A2X2

para-

sustituido.



.

El siguiente paso consistió en la reacción de sustitución nucleofílica del grupo

tosilo por el grupo azida seguido por una hidrogenación catalítica para generar el

intermediario reducido 25. El espectro de 1

H RMN muestra señales dobles que

corresponden al acetónido, en 2.0 ppm se observan 3 señales simples para los

grupo acetato, y de 3.2 a 5.0 ppm se muestra un sistema múltiple de señales para

los hidrógenos no intercambiables de la sacarosa (figura 7). Para verificar la

reducción del grupo azida al amino se obtuvo el espectro de infrarrojo

correspondiente, observándose la aparición de una banda ancha entre 3280 y


3460 cm-1, así como la ausencia de la banda característica del grupo azida entre

2080 y 2160 cm-1 (ver anexo).


.

Con la finalidad de explicar el porque no se llevaba a cabo la acetilación completa

del intermediario tosilado 3 se sometió a condiciones de peracetilación el

intermediario 2 obteniéndose en este caso el producto peracetilado 12 (esquema

2). El espectro de 1

H RMN de este intermediario muestra 6 señales simples que

integran para 18 hidrógenos lo cual demuestra la acetilación completa del


intermediario 2. Entre 3.6 4.4 ppm se observan 3 señales múltiples que integran

para 7 hidrógenos. Entre 5.0 y 5.6 ppm se muestran 3 señales múltiples que

integran para 4 hidrógenos. En 5.8 y 6.4 se muestran 2 señales dobles que

integran para 2 hidrógenos. En campo bajo entre 7.2 y 7.6 ppm se encuentra una

señal múltiple para los hidrógenos aromáticos (figura 8).


.

El correspondiente espectro de 13CRMN del intermediario 12 muestra señales de

carbono en la región alifática, vinílica y aromática, resaltando la presencia de

señales en 170 ppm asignables a los carbonilos de los grupos acetato (figura 9).


Figura 21.- Espectro de 13C RMN del intermediario 12 en CDCl3

.


9. Evaluación enzimática de los intermediarios

Se llevaron a cabo ensayos de evaluación enzimática de los intermediarios 2 y 21

los cuales contienen las posiciones 4 y 6 de glucosa protegidas con el grupo

benciliden e isopropiliden respectivamente con invertasa comercial y con el

extracto parcialmente puro de Invertasa aislada de Cellulomonas flavígena, como

parte del desarrollo de la primera etapa del proyecto.

Así, los intermediarios 2 y 21 fueron tratados por separado con ácido

dinitriosalicílico (DNS) por 5 min. A 55o

O O

O OH

OH

OH

HO

HO

OH

OH

OHInvertasa O

OH

HO OH

OH

OH

O OH

HO

HO

OH

OH

+

C y posteriormente enfriados con hielo. Los

ensayos fueron negativos, lo cual se observó por la ausencia en el cambio de

coloración. El fundamento de este método indirecto se basa en la capacidad de la

invertasa de reconocer e hidrólizar la sacarosa o algún derivado de esta,

liberando un equivalente de glucosa y fructosa siendo la primera un azúcar

reductor.

Sacarosa α-D-glucopiranosa (reductor) α-D-fructofuranosa


Una vez liberado el azúcar reductor (glucosa), este reacciona con ácido

dinitrosalicílico el cual se reduce al ácido 3-amino-5-nitro salicílico, observándose

un cambio de coloración de amarillo a rojo que se cuantifica colorimétricamente a

540-570 nm .

OH

HO

O2N NO2

O

Acido 3,5-dinitrosalicílico

+

CHO

OHH

HHO

OHH

OHH

CH2OH

D-Glucosa

OH

HO

O2N NH2

O

Acido 3,5-dinitrosalicílico

+

COOH

OHH

HHO

OHH

OHH

CH2OH

Acido glucónicoamarillo rojo

La figura muestra un primer vial que contiene el intermediario 2, conteniendo

invertasa comercial y DNS y el segundo glucosa, invertasa y DNS. La ausencia

del cambio de coloración en el primer vial muestra inequívocamente el resultado

negativo para los derivados 2 y 21 tanto con invertasa comercial así como del

extracto parcialmente puro.

Figura. Ensayo de hidrólisis de los intermediarios 2 y 21 por acción de invertasa.


A partir de este resultado podemos plantear que la enzima no llevo a cabo la

hidrólisis del enlace glucosídico en ninguno de los intermediarios evaluados

debido a un efecto de impedimento estérico, o bien a la imposibilidad de

interacción de los residuos de aminoácidos del sitio activo con las posiciones 4 y 6

del fragmento de glucosa

Generalmente las hidrolasas actúan mediante un mecanismo ácido – base, donde

el acido aspártico y glutámico actúan como acido y el OH como base. Se

encuentra reportado en la literatura los sitios de la molécula de sacarosa en los

que se da la unión con el sitio activo de la invertasa, estos sitios son: los oxígenos

4′ y 6 ′ de la fructosa y el oxigeno 4 de la glucosa.

Con lo anterior, se puede justificar el que la invertasa de Cellulomonas flavigena y

la invertasa comercial de S.cerevisae no reconocieron el enlace glucosídico para

los intermediarios 2 y 21 ; ya que las posiciones señaladas para la hidrólisis han

sido ocupadas por otras moléculas químicas, lo que ha obstruido el sitio de unión;

o bien ha roto con el mecanismo de ácido - base.

En la siguiente figura se muestran las posiciones de los oxígenos que participan

con el sitio activo.


Figura 22. Representación de una molécula de sacarosa por difracción de rayos X en la

que se representan los oxígenos en los que se lleva acabo la unión del sitio activo de la

enzima con la molécula de sacarosa ( ο glucosa y ο fructosa).

En la siguiente tabla se muestra los residuos de aminoácidos que conforman el

sitio catalítico de la invertasa de T.maritima.


Tabla 6. Cuerpos de hidrógenos y sitios de unión entre la sacarosa y los residuos de

aminoácidos del sitio activo de la invertasa de T.maritima


10. CONCLUSIONES

Se obtuvo una invertasa de una fuente diferente a las ya reportadas, donde

la caracterización de esta coincide con con lo ya reportado en la literatura

para esta enzima

Se obtuvieron avances substanciales en la producción de intermediarios vía

síntesis química, a partir de un sustrato accesible como es la sacarosa que

conducirán a la obtención de un iminoazúcar con posible efecto inhibitorio

de α-glucosidasa.

Se comprobó que los intermediarios 2 y 21 de sacarosa protegida en las

posiciones 4 y 6 de la fracción de glucosa no fueron hidrolizados vía

enzimática, debido a un impedimento esterico en los sitios de la sacarosa

donde encaja el sitio activo de la invertasa.


11. RECOMENDACIONES

Concluir con la síntesis química del inhibidor de α- glucosidasa, escalarlo y

caracterizarlo.

Plantear a futuro un estudio comparativo entre el reconocimiento enzimático

de invertasa hacia los aminoazúcares y la actividad hipoglucemiante de

estos hacia alfa-glucosidasa, y que esto permita determinar la correlación

entre reconocimiento y grado de inhibición.


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"http://en.wikipedia.org/wiki/Reducing_sugar

http://bq.unam.mx/mensajebioquimico

(http://bq.unam.mx/mensajebioquimico)

http://en.wikipedia.org/wiki/Reducing_sugar�

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