PRODUCCION DE ACIDO L (+) LÁCTICO A PARTIR DE … · PRODUCCION DE ACIDO L ... legal y científica de las ideas, conceptos y ... biotecnológicos permite obtener sustancias con interesantes

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PRODUCCION DE ACIDO L (+) LÁCTICO A PARTIR DE LACTOSUERO

UTILIZANDO Lactobacillus casei EN UN CULTIVO BATCH

CARLOS ALBERTO GARCIA MOGOLLON

UNIVERSIDAD DE CORDOBA

FACULTAD DE INGENIERÍAS

MAESTRIA EN CIENCIAS AGROALIMENTARIAS

BERASTEGUI

2011

ii





FACULTAD DE INGENIERIAS


BERASTEGUI

2011

iii




PhD. GUILLERMO ARRAZOLA PATERNINA

Director


FACULTAD DE INGENIERIAS


BERASTEGUI

2011

iv

La responsabilidad ética, legal y científica de las ideas, conceptos y resultados del

proyecto, serán responsabilidad de los autores.

Artículo 61, acuerdo N° 093 del 26 de noviembre de 2002 del consejo superior.

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Nota de aceptación

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_______________________________

________________________________

Firma del jurado

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Firma del jurado

________________________________

Firma del jurado

vi

Dedicatoria

"La Fuerza que nos da la energía para alcanzar el conocimiento"

¡Es menester ir encendiendo la LUZ en el túnel que nos toca revelar!

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Agradecimientos a:

La Universidad de Córdoba y al Programa de Ingeniería de Alimentos

Mi director Guillermo Arrazola, por su valioso apoyo y colaboración

Mis socios experimentales Yeinner Peluffo y Jorge Payares

Los auxiliares de laboratorios Yira Cogollo.

Todas aquellas personas que de una u otra forma, colaboraron o participaron en la

realización de esta investigación.

viii

TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCION .................................................................................................. 14

2. REVISIÓN DE LITERATURA ............................................................................ 17

2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO POR VÍA BIOTECNOLÓGICA ...... 17

2.1.1. Microorganismos utilizados en la producción de ácido láctico ................... 19

2.2. MATERIAS PRIMAS PARA LA PRODUCCIÓN BIOTECNOLOGICA DE

ÁCIDO LÁCTICO ......................................................................................................... 24

2.2.1 El lactosuero como medio de cultivo ............................................................... 27

2.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO ............................................. 28

2.4. FERMENTACION ÁCIDO LACTICA ............................................................. 33

3. MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................. 36

3.1. TIPO DE INVESTIGACION ......................................................................... 36

3.2. LOCALIZACION ........................................................................................... 36

3.3. PROCEDIMIENTOS ............................................................................................ 36

3.3.1. Caracterización del lactosuero. .................................................................. 36

3.3.2. Preparación del lactosuero. ......................................................................... 37

3.3.3. Activación del Lactobacillus casei ATCC 393. .......................................... 37

3.3.4. Adaptación del microorganismo................................................................. 37

3.3.5. Fermentación acido láctica. ......................................................................... 37

3.3.6. Cinética de crecimiento. .............................................................................. 38

3.3.4. Diseño experimental. ................................................................................... 38

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................ 40

4.1. COMPOSICIÓN DEL LACTOSUERO ....................................................... 40

4.2. FERMENTACIÓN DE LACTOSUERO ...................................................... 40

4.3. MODELOS CINETICOS ............................................................................... 46

4.3.1. Parámetros estequiométricos ....................................................................... 46

4.3.2. Parámetros cinéticos. .................................................................................... 47

ix

4.4. PRODUCTIVIDAD DE LA FERMENTACIÓN ............................................... 55

4.5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO .......... 56

5. CONCLUSIONES .................................................................................................. 63

6. RECOMENDACIONES ........................................................................................ 65

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 66

ANEXOS ......................................................................................................................... 73

x

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Propiedades físico-químicas del ácido láctico. 18

Tabla 2. Microorganismos utilizados en producción biotecnológica de ácido láctico. 20 Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homo y heterofermentativas 22

Tabla 4. Producción de ácido láctico a partir de sustratos puros glucosa y lactosa. 26 Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir sustratos diferentes complejos. 26

Tabla 6. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero suplementado 45 Tabla 7. Coeficientes estequiométricos Yx/s y Yp/s. 46

Tabla 8. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico. 47 Tabla 9. Parámetros cinético fase exponencial. 48 Tabla 10. Parámetros de los modelos. 53

Tabla 11. Parámetros cinéticos. 54 Tabla 12. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero. 56

Tabla 13. Análisis de varianza para ácido láctico. 57 Tabla 14. Estimación de los coeficientes de regresión cubica 58

Tabla 15. Especificadores del Lactobacillus casei ATCC 393 74 Tabla 16. Modelos cinéticos basados en Monod 76

Tabla 17. Modelos no basados en Monod 77 Tabla 18. Niveles experimentales de las variables independientes. 78 Tabla 19. Matriz del diseño Central Compuesto 78

Tabla 20. Ajuste de modelos cinéticos 81 Tabla 21. Parámetros cinéticos en estudios previos 82

xi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Revisión de dos métodos de manufactura de ácido láctico; síntesis química (a) y

fermentación microbiana (b). SSF, representa Simultánea Sacarificación y

Fermentación. 19

Figura 2. Curva de crecimiento microbiano. Los parámetros representan: λ el tiempo lag,

μmax la velocidad máxima específica de crecimiento y As el valor de la asíntota. 33

Figure 3. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),

ácido láctico () y recuento de L. casei (▲) a 47,9 g L-1

inicial de lactosa. 41 Figure 4. . Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),


inicial de lactosa. 41 Figure 5. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□),






inicial de lactosa. 44 Figure 8. Cinética de la fermentación con 47,9 g L

-1 inicial de sustrato para los datos

experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico

modificado (∆). 50 Figure 9. Cinética de la fermentación con 55,88 g L



modificado (∆). 51 Figure 10. Cinética de la fermentación con 67,75 g L



modificado (∆). 51

Figure 11. Cinética de la fermentación con 79,63 g L-1

inicial de sustrato para los datos


modificado (∆). 52

Figura 12. Cinética de la fermentación con 87,72 g L-1



modificado (∆). 52 Figura 13. Productividad de ácido láctico a las 8h(□) y 21h (♦) de fermentación. 55 Figura 14. Superficie de respuesta representando el efecto de la concentración de lactosa

y sulfato de amonio sobre la producción de ácido láctico. 59

xii

LISTA DE ANEXOS

Anexo A. ATCC catálogo. 74

Anexo B. Curvas de calibración 75 Anexo C. Modelos cinéticos. 76 Anexo D. Combinación de tratamientos DCC 78 Anexo E. Análisis estadístico diseño factorial 79

Anexo F. Ajustes de modelos. 81 Anexo G. Parámetros cinéticos reportados de estudios previos. 82

Anexo H. Evaluación estadística del Diseño Central Compuesto. 83

xiii

RESUMEN

La producción microbiana de ácido L(+) láctico tiene un gran interés en los últimos años

y el uso de lactosuero como sustrato para producir ácido láctico por fermentación es

favorable por el bajo costo y alto contenido de materia orgánica. El objetivo de este

estudio fue desarrollar un modelo cinético para la producción de ácido láctico a partir de

lactosuero utilizando Lactobacillus casei en cultivo batch. El lactosuero pasteurizado y

desproteinizado, se suplementó con lactosa y sulfato de amonio 1,28:2,62; 9,38:5;

21,25:8,5; 33,13:11,99 y 41,22:14,37 g L-1

, inoculando con 10% de cultivo adaptado y

fermentando a 37 ºC, 150 rpm y pH 6,5 durante 21 h. Se obtuvo una productividad

máxima de 1,1 g L-1

h-1

en ácido láctico, un rendimiento Yp/s de 0,5306 - 0,2488 g g -1

para 47,9 g L-1

y 87,72g L-1

de lactosa inicial. Se ajustaron los modelos reparametrizados

Logístico, Gompertz y Baranyi y la formación de producto se modelo con Luedeking-

Piret. Los parámetros cinéticos del L. casei fueron la max de 0.264 h-1

, α de 2,075 g

ácido láctico UFC-1

y β de 0,759 g ácido láctico UFC-1

h-1

. La forma modificada de la

ecuación logística y Gompertz describieron la mayoría de los experimentos de

fermentación con alta precisión (0.03< SSE <0.06 y 0,99 < Bf < 1,00) y las condiciones

óptimas de 17,69 g L-1

de lactosa y 6,34 g L-1

de sulfato de amonio maximizaron la

producción de ácido láctico. El lactosuero como materia prima permitió obtener buenos

resultados en la producción de ácido láctico.

xiv

ABSTRACT

Microbial production of acid L (+) lactic has a great interest in recent years and the use

of whey as a substrate to produce lactic acid by fermentation is favorable because of the

low cost and its high content of organic matter. The objective of this study was to

develop a kinetic model for the production of lactic acid from whey using Lactobacillus

casei in batch culture. Whey was pasteurize, desproteinized and suplemented with

lactose and ammonium sulfate, 28:2,62; 9,38:5; 21,25:8,5; 33,13:11,99 and 41,22:15, 37

g L-1

, inoculating with 10% of adapted crop and fermenting to 37 °C, 150 rpm and pH

6.5 for 21 hours. We collected a maximum output of 1,1 g L-1

h-1

lactic acid, a Yp/s

performance of 0,5306 - 0,2488 g g - 1

for 47,9 g L-1

and 87, 72 g L-1

initial lactose. The

kinetic parameters were obtained by adjusting Baranyi, Gompertz and logistics

reparametrizados models and product training model with Luedeking-Piret. The kinetic

parameters of L. casei were the max of 0.264 h-1

, α of 2,075 lactic acid g UFC-1

and β

0,759 lactic acid g UFC-1

h-1

. The modified form of the logistic equation and Gompertz

described most of the experiments of fermentation with high accuracy (0.03< SSE <0.06

y 0,99 < Bf < 1,00) and optimum conditions of 17,69 g L-1

, lactose and 6.34 g L-1

ammonium sulfate maximize the production of lactic acid during the fermentation of

whey by Lactobacillus casei for 21 h. Whey as a raw material allowed to obtain good

results in the production of lactic acid.

14

1. INTRODUCCION

El lactosuero es un líquido claro de color amarillo verdoso subproducto del

procesamiento de leche en la elaboración de quesos, con una producción mundial de 82

millones de toneladas métricas (Oreopoulou y Russ 2007). Se ha constituido en el

principal residuo de la industria láctea, donde una parte de éste es usado para

alimentación animal, y el resto tratado como un desecho vertido directamente en los

cursos de agua naturales. El vertimiento directo del lactosuero a los cursos de agua sin

un tratamiento previo genera un problema de contaminación ambiental debido a la

materia orgánica constituida por 4,8% de lactosa, 0,75% de proteínas y 6,2% de materia

seca (Oreopoulou y Russ 2007), nutrientes valiosos al momento de aprovecharlos como

alimento y medio de cultivo para fermentaciones industriales. La aplicación de procesos

biotecnológicos permite obtener sustancias con interesantes aplicaciones en la industria

de alimentos, química y farmacéutica; como es el caso del ácido L(+) láctico cuya

demanda mundial ascendió en el 2007 a 130-150 TM/año y se espera un crecimiento del

10 al 15% anual (Araya et al. 2010). En Colombia todo el producto se importa y

equivale a mil millones de pesos anuales (Serrato y Caicedo 2005). La producción de

leche en Colombia, para el año 2009 fue de 5.730 millones de litros (ENA 2009), de los

cuales, aproximadamente, un 18% se destinó a la producción de quesos y un 9% a

leches fermentadas (Agrocadenas 2008; Parra 2009), lo que quiere decir que la

15

producción nacional de lactosuero, correspondió a 876.766 millones de litros. En el

departamento de Córdoba la producción industrial de la leche y los derivados generó

cerca de 300 empleos y una producción bruta industrial de $ 109.000 millones,

equivalente a 25% de la producción láctea de la región Caribe y a 5,58% del total

nacional. Estas condiciones de disponibilidad y oportunidades del mercado hace

necesaria la búsqueda de mecanismos para lograr un aprovechamiento del lactosuero

mediante la extracción de nutrientes o su transformación en insumos o aditivos

alimentarios y plantear alternativas de producción limpia, útil para el medio ambiente y

que genere valor al lactosuero mediante su potencial uso como medio para la obtención

de ácido L (+) láctico en un cultivo batch de Lactobacillus casei.

El objetivo de este estudio fue desarrollar un modelo cinético para la producción de

ácido láctico a partir de lactosuero utilizando Lactobacillus casei en cultivo batch. Las

fermentaciones se realizaron usando Lactobacillus casei ATCC 393 homofermentativo,

suplementando el medio con lactosa (1,28; 9,38; 21,25; 33,13 y 41,22 g L-1

) y sulfato de

amonio (2,62; 5; 8,5; 11,99 y 14,37 g L-1

) como fuente de carbono y nitrógeno

respectivamente para la producción del ácido láctico. La fermentación batch se llevó a

cabo manteniendo la temperatura en 37°C a 150rpm, un pH inicial de 6,5 y condiciones

de anaerobiosis; durante un periodo de 21 horas donde se evaluó la concentración del

microorganismo (Log UFC mL-1

), ácido láctico (g L-1

) y lactosa (g L-1

), y se

relacionaron con modelos cinéticos para entender su comportamiento a través de

parámetros cinéticos de crecimiento (max, Yp/s, Yx/s, α, β) y las productividades (Pr).

Se aplicó una metodología de superficie de respuesta a través de un diseño central

16

compuesto para conocer las condiciones óptimas de suplementación del medio para

maximizar la concentración de ácido láctico.

17

2. REVISIÓN DE LITERATURA

2.1. PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO POR VÍA BIOTECNOLÓGICA

El ácido láctico se denomina acido 2-hidroxipropanoico y está formado por los grupos

funcionales alcohol y carboxilo, conformando un carbono asimétrico que le confiere su

actividad óptica. Existen dos isómeros ópticos, el D(-) láctico y el L(+) láctico y una

forma racémica constituidas por fracciones equimolares de las formas L(+) y D(-). A

diferencia del isómero D(-), la configuración L(+) es metabolizada por el organismo

humano. Tanto las dos formas ópticamente activas como la racémica se encuentran en

forma líquida, siendo incoloros y solubles en agua. En estado puro son sólidos

altamente higroscópicos de punto de fusión bajo. Las formas isoméricas del ácido

láctico pueden ser polimerizadas y producir polímeros con diferentes propiedades

dependiendo de la composición. Las propiedades fisicoquímicas del ácido láctico se

muestran en la tabla 1 (Serna y Rodríguez 2005a).

El L(+) ácido láctico es clasificado por la FDA (Food and Drug Administration) como

una sustancia generalmente reconocida como segura (GRAS) para uso como aditivo

alimenticio, pero el ácido D(–) láctico afecta la salud de los consumidores generando

acidosis y descalcificación.

18

Tabla 1. Propiedades físico-químicas del ácido láctico. Formula C3H6O3

Peso molecular 90.08

Índice de refracción 1.4414

Punto de fusión L(+) y D(-): 52.8 a 54°C

DL(según composición): 16.8 a 33°C Punto de ebullición 125-140°C

Gravedad especifica 1206

Calor de combustión 3616cal/g

Viscosidad 40.33mNsm-2

Densidad 1,249

Constante dieléctrica 22

Fuente: Serna y Rodríguez 2005. Produccion biotecnologica de ácido láctico: estado del arte

La producción de ácido láctico puede ser por vía química o biotecnológica (Figura 1).

El proceso por síntesis química está basado en el lactonitrilo, donde el ácido cianhídrico

es adicionado al acetaldehído en presencia de una base para dar lactonitrilo que es

recuperado y purificado por destilación. Esta reacción ocurre en fase líquida y a altas

presiones. El lactonitrilo es hidrolizado hasta ácido láctico, usando HCl o H2SO4

concentrado para producir la correspondiente sal de amonio y ácido láctico.

Esterificando con metanol para producir metil lactato, el cual es recuperado y purificado

por destilación e hidrolizado en agua bajo catálisis ácida para producir ácido láctico y

metanol, el cual es reciclado (Narayanan et al. 2004).

Aunque la forma racémica es siempre producido por vía química, los isómeros puros

L(+) o ácido D(–) láctico pueden ser obtenidos por fermentación microbiana de una

fuente renovable cuando el microorganismo es seleccionado apropiadamente. La

producción biotecnológica de ácido láctico ha generado un gran interés, porque ofrece

19

una alternativa a la contaminación ambiental causada por la industria petroquímica y el

limitado suministro de los recursos (Wee et al. 2006).

Recurso petroquimico

Acetaldehido (CH3CHO)

Lactonitrilo (CH3CHOHCN)

Solo DL - Ácido Láctico

Adición de HCN y catalisis

Hidrólisis por H2SO4

Recurso renovable

Carbohidratos fermentables

Masa fermentada

Isómero puro L(+) o D(-)-

Ácido Láctico

Pretratamiento (hidrólisis ácida o enzimática)

Fermentación microbiana

Recuperación y purificación

SSF

(a) Síntesis Química (b) Fermentación microbiana

Figura 1. Revisión de dos métodos de manufactura de ácido láctico; síntesis química (a)

y fermentación microbiana (b). SSF, representa Simultánea Sacarificación y

Fermentación (Vijayakumar et al. 2008)

La producción biotecnológica está basada en la fermentación de sustratos ricos en

carbohidratos por medio de bacterias u hongos para formar los enantiómeros

ópticamente activos y depende del tipo de microorganismo utilizado, la inmovilización o

recirculación del microorganismo, pH, temperatura, la fuente de carbono, la fuente de

nitrógeno, el modo de fermentación empleado y la formación de subproductos

(Hofvendahl y Hagerdal 2000).

2.1.1. Microorganismos utilizados en la producción de ácido láctico

Los microorganismos seleccionados en las recientes investigaciones de producción

biotecnológica de ácido láctico están listados en la tabla 2. La mayoría de las

20

investigaciones se han llevado a cabo con bacterias acido lácticas; aunque también los

hongos filamentosos como Rhizopus utilizan la glucosa en condiciones aeróbicas para

producir ácido láctico, especies de Rhizopus tales como R. oryzae y R. arrhizus tienen

actividad amilolítica para convertir directamente el almidón a ácido L (+) láctico. La

fermentación fúngica tiene la ventaja de requerir un medio simple para producir ácido

láctico, pero también tiene requerimientos elevados de aireación puesto que R. oryzae es

un aerobio obligado (Tay y Yang 2002).

Tabla 2. Microorganismos utilizados en producción biotecnológica de ácido láctico.

Organismo g ácido láctico L-1

Y

g g-1

Pr (g L-1 h-1)

Fuente

Rhizopus oryzae

ATCC 52311

83,0 0,88 2,6 Zhou et al. 1999

Enterococcus faecalis

RKY1

144,0 0,96 5,1 Wee et al. 2006

Lactobacillus rhamnosus

ATCC 10863

67,0 0,84 2,5 Berry et al.,1999

Lactobacillus helveticus

ATCC 15009

65,5 0,66 2,7 Schepers et al. 2002

Lactobacillus bulgaricus

NRRL B-548

38,7 0,90 3,5 Burgos et al. 2000

Lactobacillus delbrueckii

Mutant Uc-3

90 0,9 2,25 Adsul et al. 2007

Lactobacillus casei

NRRL B-441

0,91 5,.6 Altiok, 2004

Tay y Yang (2002) inmovilizaron R. oryzae en un lecho fibrosa para producir ácido

láctico a partir de glucosa y almidón. Kosakai et al. (1999) cultivaron células de R.

oryzae con el uso de floculos “mycelial flocs”, formados por la adición de soporte

mineral y polímero, donde observaron que los micelios con forma de algodón tuvieron

una óptima morfología en el cultivo. Park et al. (1998) reportaron que la producción de

ácido láctico fue mejorada en el cultivo de R. oryzae, cuando fue inducida la forma

21

micelial. Esos resultados también sugieren que la forma de algodón micelar fue la

morfología óptima para el uso en un bioreactor air-lift. Aunque se ha persistido en

producir ácido láctico a través de fermentación fúngica, las bacterias ácido lácticas han

sido comúnmente usadas para producir ácido láctico debido a las desventajas de la

fermentación fúngica.

Cuando se utilizan bacterias en la fermentación, se busca que estas sean preferiblemente

termófilas, que fermenten rápida y completamente sustratos baratos, con adición mínima

de nutrientes nitrogenados, que crezcan en valores bajos de pH, que presenten poca

producción de biomasa y una despreciable cantidad de subproductos (Akerberg et al.

1998). Las bacterias ácido lácticas (BAL) pueden ser clasificadas en dos grupos:

homofermentativas y heterofermentativas. Mientras las homofermentativas convierten

la glucosa casi exclusivamente en ácido láctico, las heterofermentativas catabolizan la

glucosa en ácido láctico, además, de etanol y CO2. Las homofermentativas usualmente

metabolizan la glucosa vía Embden-Meyerhof dando como resultado dos moléculas de

ácido láctico de cada molécula de glucosa con un rendimiento mayor a 0,9 g g-1

.

Solamente las bacterias acido lácticas homofermentativas son utilizadas para la

producción comercial de ácido láctico (Hofvendahl y Hagerdal 2000).

Las bacterias ácido lácticas carecen de la habilidad de sintetizar citocromos y porfirinas

(componentes de la cadena respiratoria) y por lo tanto no pueden generar ATP por la

creación de un gradiente de protones. De tal manera, que no usan oxígeno para

producir energía. Éstas crecen en condiciones anaerobias, pero también pueden crecer

en presencia de oxígeno, al estar protegidas de subproductos del oxígeno (H2O2) por

22

peroxidasas en su sistema (Vijayakumar et al. 2008). La mayoría de las BAL producen

únicamente una forma isomérica de ácido láctico; las formas isoméricas de lactato

deshidrogenasa presente en las BAL determinan el isómero de ácido láctico producido,

ya que la deshidrogenasa láctica es esteroespecífica; las especies de los géneros

Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Vagococcus y Tetragenococcus producen

únicamente isómeros D (Tabla 3). Sin embargo, algunas BAL producen formas

racémica donde el isómero predominante depende de los cambios en la aireación,

cantidad de NaCl, tipo de fermentación, incrementos de pH y concentración de sustrato.

Tabla 3. Bacterias ácido lácticas homo y heterofermentativas

Genero y especie Homofermentativo Heterofermentativo Configuración del ácido láctico

Lactobacillus

L. delbrueckii + – D(–)

L. lactis + – D(–)

L. bulgaricus + – D(–)

L. casei + – L(+)

L. plantarum + – DL

L. curvatus + – DL

L. brevis – + DL

L. fermentum – + DL

Sporolactobacillus

S. inulinus + – D(–)

Streptococcus

S. cremoris + – L(+)

S. lactis + – L(+)

Leuconostoc

L. mesenteroides – + D(–)

Fuente: Vijayakumar et al. 2008.

Las especies del genero Lactobacillus por ejemplo, producen además de las formas

isoméricas L(+) y D(-), una mezcla racémica de ambos isómeros.

23

Las homofermentativas fermentan la glucosa hasta 2 moles de ácido láctico, generando 2

ATP por mol de glucosa metabolizada; mientras, las heterofermentativas fermentan 1

mol de glucosa hasta 1 mol de ácido láctico, 1 mol de etanol y 1 mol de CO2. Una mol

de ATP es generada por mol de glucosa, resultando en un menor crecimiento. Debido a

los bajos rendimientos en energía, las bacterias ácido lácticas crecen más lentamente y

producen colonias pequeñas de 2 a 3mm (Vijayakumar et al. 2008).

Lactobacillus: son bacilos microaerófilos, Gram positivos y catalasa negativos, estos

organismos forman ácido láctico como producto principal de la fermentación de los

azúcares. Dentro del género Lactobacillus, existen bacterias homofermentativas

obligadas y facultativas, dando lugar a ácido láctico como producto principal de la

fermentación. Este grupo está integrado por Lb. caucasicus, Lb. bulgaricus, Lb. Lactis,

Lb. helveticus Lb acidophilus y Lb. delbrueckii. La mayoría de las especies

pertenecientes a estos géneros tienen alta tolerancia a pH por debajo de 5,0. Esta

tolerancia ácida les da la ventaja competitiva sobre otras bacterias; la temperatura

óptima de crecimiento varía entre géneros y está en un rango de 20°C a 40°C

(Hofvendahl y Hagerdal 2000). Son microorganismos de rápido crecimiento con

pequeños genomas, metabolismo simple y relevancia industrial.

Lactobacillus casei es un microorganismo facultativo productor de ácido láctico que se

emplea también en la industria láctea. Esta especie de Lactobacillus es particularmente

resistente a rangos amplios de pH (Aguirre et al. 2009) y en estudios recientes se ha

observado que un pH de 6,0 a 6,5 no tiene un efecto significativo en la producción de

24

ácido láctico (Panesar 2007b; Vijayakumar 2008). Prefiere temperaturas de 28–35°C,

reportándose 28°C como óptima (Nabi et al. 2004) y 37°C como la temperatura de

máxima producción de ácido láctico (Panesar 2007b). El Lactobacillus casei prefiere

lactosa como fuente de carbono para su crecimiento y producción de ácido láctico,

seguido de la glucosa y maltosa, mientras que la sacarosa es poco utilizada

(Vijayakumar 2008). Además, de ser usado como productor de ácido láctico, el

Lactobacillus casei es un probiotico, cuya ingestión regular reduce los niveles de

colesterol sérico, ayuda a prevenir ciertos tipos de cáncer y mejora las funciones

digestivas e intestinales, entre otras características (Londoño 2008).

2.2. MATERIAS PRIMAS PARA LA PRODUCCIÓN BIOTECNOLOGICA DE

ÁCIDO LÁCTICO

Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y

en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Para

que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo, éste debe reunir una

serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno

adecuado, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe

contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo

microorganismo contaminante.

La elección de un microorganismo depende del carbohidrato a ser fermentado:

Lactobacillus delbreuckii subspecies delbreuckii fermentan la sacarosa; Lactobacillus

delbreuckii subspecies bulgaricus usa la lactosa; Lactobacillus helveticus es capaz de

25

fermentar lactosa y galactosa; Lactobacillus amylophylus y Lactobacillus amylovirus

fermentan almidón. Lactobacillus lactis puede fermentar glucosa, sacarosa y galactosa

(Narayanan et al. 2004). El estudio de la producción de ácido láctico cultivando las

células en un medio con diferentes azúcares reveló que Lactobacillus casei prefiere

lactosa para su crecimiento y producción de ácido láctico, seguido por glucosa y

maltosa; mientras la sacarosa fue poco usada (Senthuran et al. 1999).

Diferentes sustratos han sido usados para la producción fermentativa de ácido láctico

con Lactobacillus. El producto más puro ha sido obtenido cuando es fermentado un

medio simple o azúcar puro (Tabla 4), resultando en menores costos de purificación;

pero esto es desfavorable, dado lo costoso de los medios puros y el ácido láctico es un

producto económico, siendo más útil el uso de medios complejos o productos derivados

de desechos orgánicos de industrias agroindustriales (Tabla 5).

Las BAL típicamente tienen requerimientos nutricionales complejos, debido a su

limitada habilidad para sintetizar sus propios factores de crecimiento tales como

vitaminas B y aminoácidos. Ellas requieren algunos elementos para el crecimiento, tales

como fuentes de carbono y nitrógeno, en la forma de carbohidratos, aminoácidos,

vitaminas y minerales (Amrane 2000).

26

Tabla 4. Producción de ácido láctico a partir de sustratos puros glucosa y lactosa.

E.L. Extracto de Levadura; B: Batch; F-B: Fed Batch; C: Continuo; LE: lecho empaquetado; NR: no

reportado

Tabla 5. Producción de ácido láctico a partir sustratos diferentes complejos.

Sustrato Microorganismo Suplemento Condiciones

Ác.

Láctico (g L-1)

Yp/s (g g-1)

Pr (g L-1h-1) Sistema Fuente

Melazas Lb. delbrueckkii ATCC 10241

Extracto de

malta, Sulfato de

amonio

45-46°C 300rpm

1,78 0,63; NR

B Laverde y Muñoz, 1990

Almidón de

maíz Lb. Amylophilus 37°C/pH6,5 46-76,2

0,96;

1,05 B

Vishnu, et al.,

2000

Salvado de trigo

(10g)

L. amylophilus

GV6

Peptona (1-9%); E.L. (1-0,88%);

ACM (2%)

37°C/pH

6,75/5-9d

0,187-

0,23

0,36;

NR

Fase

sólida

Naveena et al.,

2005a,b

Banano rechazo

Lactobacillus

casei rhamnosus

(ATCC 11443)

Diluido en 3

partes de agua

con sales y E.L.

0,88; 1.14

B R. Lopez, 2005

Jugos de

cogollo y hojas

+ jugo de caña de azúcar

Lactococcus lactis subsp.

lactis

3% p/v E.L. 32°C/pH 6,0 >70,19 0,88;

0,97 B

(Serna Cock &

Rodríguez de

Stouvenel, 2005)

Desperdicios

(Almidón 55-88%/CHOS)

Lb.

manihotivorans LMG18011

0.2M MnSO4 pH5.0-5.5 48,7 a

31,2

19,5g g-1 B Y. Ohkouchi,

2005

E.L. Extracto de Levadura; B: Batch; F-B: Fed Batch; C: Continuo

Sustrato Microorganismo Suplemento Condiciones Ácido

Láctico Yp/s (g g-1)

Pr ( g L-1 h-1) Sistema Fuente

Lactosa

(60g/L)

Lb. Plantarum

ATCC 21023

37°C/pH 5-6 150rpm/36h

41g L-1 0,95;

1,05 B

Fu et al.,

1999

Lactosa

(100g/L)

Lb. Helveticus

ATCC 15009 10g E.L.

42°C/pH 5,5

150rpm/18h 0,88; 3,9 C, LE

Tango y

Ghaly, 2002

Glucosa (100g/L)

L. rhamnosus 350h 0,68; 8,18 C Min-tian et al. 2005

Glucosa (30g/L)

Lb. delbrueckkii, casei y salivarius

MRS+ acetato y citrato

35°C/pH 6,0 26,8-27,8 g L-1

0,89-0,99 g L-1 B Siebold et al. 1995

Sacarosa de melaza de caña (cepa C y D sin

identificar)

37-39°C/pH

5,6/150rpm

0,77;0,069-

0,145 B Gómez, 2000

MRS+20g/L

glucosa

Mezcla Lb. casei; Lb.

delbrueckkii subsp

lactis/Lb. helveticus, Lb. delbrueckii

Agua de cocido de maíz

50g L-1

42°C/pH

5,5/120rpm/62h 110 g L-1

NR;

1,48 B Lee, 2004

27

Hay varios factores que estimulan el crecimiento y que tienen considerable efecto sobre

la producción de ácido láctico. La mezcla de aminoácidos, péptidos y aminoácidos, y

amidas usualmente estimulan el crecimiento de las BAL y resultan en velocidades de

crecimiento mucho más altas que en un medio libre de aminoácidos. Los ácidos grasos

también influyen en el crecimiento, y los fosfatos son la sal más importante en la

fermentación ácido láctica.

2.2.1 El lactosuero como medio de cultivo

El lactosuero o suero de queso es un excelente medio de cultivo y por esto se utiliza

como sustrato para la obtención de un buen número de productos a través de la

fermentación. Al ser la lactosa la principal fuente de carbono, parecería que solo

puede emplearse microorganismos capaces de emplear este disacárido como fuente de

carbono. Pero se le puede dar muchas más aplicaciones dado que el azúcar del

lactosuero se puede hidrolizar a través de una vía enzimática o a través de una vía

ácida y de esta manera poder aprovechar el azúcar utilizando microorganismos que

utilicen como fuente de carbono la glucosa y la galactosa en un sin número de procesos

fermentativos.

El lactosuero es el mayor sub-producto de la industria láctea y es útil en procesos

comerciales por contener 50g de lactosa por litro y 4%p/p de nitrógeno (McNeil y

Harvey, 2008); además, grasa y sales minerales. Amrane et al. (2000) reportaron la

producción de ácido láctico a partir de lactosuero y explicó la influencia de la

deficiencia en péptidos (fuente de nitrógeno). La lactosa se utilizará para la obtención

28

de ácido láctico sin necesidad de hidrolizar el azúcar del lactosuero debido a que los

microorganismos utilizan la lactosa como fuente de carbono. Por otra parte, el

contenido de proteínas es alto y es un excelente medio para los microorganismos que

requieren aminoácidos y son capaces de hidrolizar las proteínas. Recientemente se

utiliza el lactosuero para la obtención de ácido láctico utilizando Lactobacillus

helveticus, esta fermentación se realiza y se obtiene una conversión de un 80 – 90%

de lactosa en ácido láctico en un tiempo de 24 horas.

2.3. CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO

Durante un cultivo batch el medio nutritivo es inoculado con un cultivo semilla; donde

los microorganismos toman selectivamente los nutrientes disueltos en el medio y los

convierten en biomasa y/o productos. Un cultivo típico por lotes incluye diversas fases:

(1) fase lag, ocurre inmediatamente después de la inoculación y es un período de

adaptación de las células a su nuevo ambiente. Durante este período la biomasa se

incrementa muy poco, y no existe reproducción celular. La duración de la fase lag puede

verse afectada por la baja concentración de algunos nutrientes y/o factores de

crecimiento, tales como: concentración de Mg+2

, concentración de CO2, edad del

inocúlo, composición del medio de cultivo, tamaño del cultivo y viabilidad del cultivo;

(2) fase de crecimiento exponencial, logarítmico o de crecimiento balanceado, las

células ya adaptadas a su nuevo ambiente, crecen y se reproducen rápidamente

dividiéndose en forma constante, la actividad metabólica: respiración celular, la síntesis

de proteínas es máxima y el tiempo generacional es mínimo y constante. El número de

células vivas en reproducción es mucho mayor que las células vivas de la población que

29

comienzan a morir. En el momento final de esta fase y como resultado de la alta tasa de

reproducción, comienzan a escasear los nutrientes y el ambiente se torna tóxico por el

exceso de productos de desecho. Es el momento en el cual las células son más sensibles

a los antimicrobianos o a las radiaciones que pueden intervenir negativamente en su

crecimiento. Esta fase se representa por una línea recta ascendente; (3) fase de

desaceleración, en esta se disminuye el crecimiento debido al agotamiento de uno o más

nutrientes esenciales o a la acumulación de subproductos tóxicos del crecimiento,

resultando en un crecimiento desbalanceado; (4) fase estacionaria, inicia al final de la

fase de desaceleración cuando la velocidad neta de crecimiento es cero (no hay división

celular) o cuando la velocidad de crecimiento es igual a la velocidad de muerte. En esta

etapa, las células aún son metabólicamente activas y se estimula la producción de

metabolitos secundarios; (5) fase de muerte o declive, es causada por agotamiento de

nutrientes o sobreacumulación de productos, las células muertas suelen lisarse liberando

sustancias intracelulares al medio de cultivo (Altiok 2004).

Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que

la concentración de microorganismos (X) influye en la velocidad con que aumenta la

población (rx), la cual para un tipo de microorganismo depende principalmente de la

composición y concentración del medio de cultivo, presencia de inhibidores,

temperatura y pH. Existen diversos modelos de crecimiento (Anexo A) que representan

un proceso dado, con un microorganismo y en una fase del proceso fermentativo. El más

difundido es la ecuación de Monod, que relaciona el valor de μ con la concentración de

un componente del medio de cultivo, representado por:

30

Donde S es la concentración de sustrato limitante, μm es la velocidad de crecimiento

específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El valor de Ks está

inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando S

» Ks, μ toma el valor de μm y rx sólo depende de X.

En general, Ks tiene valore muy bajos, del orden de los mg L-1

, por tanto

concentraciones relativamente bajas de S son suficientes para hacer que μ=μm. En

promedio las bacterias poseen valores de μm cercanos a 0,9 h-1

, las levaduras 0,45 h-1

y

los hongos filamentosos 0,25 h-1

; de todos modos μm debe ser determinado

experimentalmente para cada caso en particular.

La presencia de inhibidores del crecimiento en el medio de cultivo causa disminución en

el valor de μ. La substancia inhibidora puede ser algún componente del medio de cultivo

o algún producto formado por los microorganismos. El tipo de inhibición, al igual que

en cinética enzimática, puede ser competitiva o no competitiva.

Los productos formados del metabolismo microbiano pueden ser clasificados en tres

categorías:

1. Productos asociados al crecimiento, donde la velocidad especifica de formación del

producto (qp) y crecimiento (μ) son proporcionales:

31

2. Productos no asociados al crecimiento, formados durante la fase estacionaria cuando

la velocidad de crecimiento es cero. La velocidad específica de formación del producto

es constante:

Metabolitos secundarios como los antibióticos pertenecen a este grupo.

3. Los productos asociados y no asociados al crecimiento, donde la velocidad de

formación es representada por la ecuación de Luedeking – Piret (1959):

El consumo de sustrato sólo es posible cuando hay crecimiento; sin embargo, cuando el

sustrato considerado es la fuente de carbono y energía, puede darse el caso en que el

crecimiento es nulo (r x = 0) y el consumo de sustrato no. A este consumo de sustrato

que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia con el mantenimiento de funciones

vitales tales como recambio de material celular, mantenimiento de gradientes de

concentración y movilidad.

La velocidad de consumo de la fuente de carbono y energía:

msX

xY'

xr sr

Donde ms es el coeficiente de mantenimiento e Y'x/s es el rendimiento que se obtendría

si el mantenimiento fuese nulo. El valor de Yx/s es, obviamente, inferior al de Y'x/s.

Valores de ms de 0,01 a 0,04 g h-1

son frecuentes de hallar, pero se incrementan con la

temperatura y con la presión osmótica del medio de cultivo. Por ejemplo, para

Saccharomyces cerevisiae creciendo en anaerobiosis se encuentra un valor de ms =0,036

32

g h-1

, mientras que es diez veces superior si el medio contiene una concentración de

NaCl 1 M, lo cual da cuenta del trabajo osmótico que deben realizar las células. De este

modo el mantenimiento celular posee una implicancia tecnológica directa, ya que un

proceso destinado a la producción de biomasa debe conducirse de modo tal que el valor

de ms sea pequeño.

Otros modelos no basados en Monod buscan describir la cinética del proceso con pocos

parámetros, mientras puedan definir con exactitud las distintas etapas de crecimiento.

Entre estos modelos encontramos el Logístico, Logístico modificado, Gompertz que

describen una función sigmoidal de crecimiento considerados modelos mecanísticos y

sus formas “re-parametrizadas” empíricas que le dan un significado físico a sus

parámetros. En la última década, una nueva generación de modelos de crecimiento se

han desarrollado con el propósito de tener una base mecanistica, por ejemplo, el modelo

de Baranyi, Hills, Buchanan, entre otros (McKellar y Lu, 2004).

Se puede expresar el crecimiento microbiano como el cambio en el tamaño de la

población N o como el logaritmo del tamaño relativo de la población ln(N/No) (Van

Boekel 2009). La velocidad de crecimiento es por definición dN/dt (incremento

absoluto de la población por unidad de tiempo). El incremento de la concentración

celular por unidad de tiempo por célula es:

33

Usualmente, la curva de crecimiento microbiano es de naturaleza sigmoidal (Figura 2) y

el modelo debe ajustarse a esa forma.

Figura 2. Curva de crecimiento microbiano. Los parámetros representan: λ el tiempo lag,

μmax la velocidad máxima específica de crecimiento y As el valor de la asíntota.

Por lo expuesto hasta aquí es evidente que el crecimiento puede ser caracterizado

mediante los parámetros: α, β, μmax, λ, As, Yp/s y Yx/s. Estos dependen tanto del

microorganismo como del medio de cultivo empleado, por lo que su evaluación debe

realizarse para cada caso en particular.

2.4. FERMENTACION ÁCIDO LACTICA

La fermentación batch, fed-batch y continua han sido usadas para producir ácido láctico.

En el cultivo continuo se han alcanzado altas productividades, mientras que en el bath y

fed-batch se han logrado altas concentraciones de ácido. Se han hecho varios intentos

para producir ácido láctico a partir de lactosuero en cultivos batch utilizando

Lactobacillus casei. Schepers et al. (2002) reportaron la producción de ácido láctico a

pH controlado durante un cultivo batch en un medio con permeado de

Fase

Lag

Fase

Exponencial

Fase

Estacionaria

Punto de inflexión

ln (

N/N

o)

Tiempo λ

As=ln(N/Nmax)

34

lactosuero/extracto de levadura. Senthuran et al. (1999) reportó la producción de ácido

láctico a través de un cultivo continuo de Lactobacillus casei inmovilizado en

polietilenamina. Para conocer la cinética de producción de ácido láctico es necesario

determinar los parámetros cinéticos que determinan el desarrollo de la fermentación a

las condiciones propias de cada microorganismo, es decir, oxígeno, temperatura, pH,

densidad celular y requerimientos nutricionales.

Entre los parámetros que influyen en el proceso de fermentación están las condiciones

anaerobias preferidas por las LAB (Hofvendahl y Hagerdal, 2000). El efecto de la

temperatura sobre la concentración másica y productividad del ácido láctico fue

estudiada para varios microorganismos. Por ejemplo, para Lactobacillus casei y

Lactobacillus paracasei la temperatura óptima fue reportada entre 37°C y 44°C. De tal

forma que las mayores productividades son en algunos casos menor a la temperatura que

resulta en el mayor rendimiento y concentración, mientras que en otros casos se obtienen

los mismos resultados en todas las categorías. En cuanto al pH en la fermentación, éste

es ajustado al inicio y va decreciendo debido a la producción de ácido o es controlado

por la titulación con base, o por extracción, adsorción o diálisis del ácido láctico. El pH

óptimo para la producción varía entre 5 y 7 (Vijayakumar et al. 2008). Senthuran et al.

(1999) investigaron la producción de ácido láctico por Lactobacillus casei a diferentes

valores de pH mostrando que la productividad fue la más alta a pH 6,0 con células libres

y a un pH 6,5 cuando las inmovilizó. La productividad tanto como la densidad celular

decreció a los más bajos y altos valores de pH. En cuanto a la densidad celular, las más

altas densidades (48 - 108g células L-1

) han sido logradas con recirculación, pero en

35

fermentaciones sin recirculación se han alcanzado entre 60 y 77 g células L-1

. La

fermentación de las BAL, está acompañada de un incremento de la masa celular, lo que

constituye un subproducto indeseado si el objetivo del proceso es la producción de ácido

láctico. Pero, al obtener altas concentraciones de microorganismos, estos pueden ser

usados como materias primas principales en la producción de probióticos (Hofvendahl y

Hagerdal 2000).

36

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. TIPO DE INVESTIGACION

La investigación será de tipo experimental.

3.2. LOCALIZACION

Esta investigación se llevó a cabo en los laboratorios de biotecnología de alimentos y en

la planta de tecnología de frutas que hace parte del programa de ingeniería de alimentos

de la Universidad de Córdoba con sede en el corregimiento de Berasategui, municipio de

Ciénaga de Oro, departamento de Córdoba, Colombia; con una temperatura promedio de

27°C, humedad relativa 80% y 20 m.s.n.m, situada geográficamente en las coordenadas

8º 40` 26“ de latitud oeste con respecto al meridiano de Greenwich.

3.3. PROCEDIMIENTOS

3.3.1. Caracterización del lactosuero.

El Lactosuero fue suministrado por la empresa Empresa PROCAMP Ltda. Vía Cereté –

Ciénaga de Oro, Córdoba – Colombia. Se utilizó lactosuero fresco, proveniente de la

producción de queso costeño. Se evaluó la composición del lactosuero en lactosa por el

método espectrofotométrico (A.O.A.C. 160.51), el contenido de nitrógeno se determinó

37

por el método de Kjeldahl (A.O.A.C. 976.06), ácido láctico por titulometría (A.O.A.C.

947.05) y pH por potenciómetría (A.O.A.C. 973.41).

3.3.2. Preparación del lactosuero.

El lactosuero pasteurizado se desproteinizo por filtración y se suplementó con lactosa y

sulfato de amonio (Lo:So) 1,28:2,62; 9,38:5; 21,25:8,5; 33,13:11,99 y 41,22:14,37 g L-1

,

ajustando el pH a 6,5 utilizando carbonato de sodio 2,5 N y adicionando 5 g L-1

de

hexametafosfato para 500 mL de lactosuero.

3.3.3. Activación del Lactobacillus casei ATCC 393.

Se activó el Lactobacillus casei ATCC 393 (Anexo A) en 10 mL de caldo MRS

incubando a 37°C durante 24 h, periodo después del cual se tomó 1 mL y se agregó a 9

mL de caldo MRS e incubó a 37°C durante 6 h. Del caldo se tomó 1 mL y se realizaron

siembras en profundidad en Agar MRS y se incubaron a 37°C durante 48 h. Se

realizaron 3 repeticiones en cada etapa.

3.3.4. Adaptación del microorganismo.

Se adaptó inoculando con 10 mL de Lactobacillus casei activado en 500 mL de

lactosuero e incubando a 37°C durante 12 h.

3.3.5. Fermentación acido láctica.

Se llevó a cabo en un Fermentador Tecferm 1L con un volumen de trabajo de 500ml. Se

inoculó 10% del cultivo con el microorganismo adaptado, garantizando una población

mínima de 106 UFC mL

-1. Las condiciones de trabajo fueron a presión atmosférica, 37

°C y 150 rpm de agitación magnética. Se monitoreo la fermentación durante 21h a 37°C

ajustando el pH a 6.5, determinando concentración de lactosa (g L-1

) y Lactobacillus

38

casei (LogUFC mL-1

) a través de la densidad óptica (DO) medida en un Spectronic +20

a 610 nm tomando 10 mL de muestra y centrifugando a 6,000 rpm por 15 min. Para

relacionar la DO con la concentración de biomasa se elaboró una curva de calibración

DO vs logUFC mL-1

(Anexo B) acorde a Altiok 2004.

3.3.6. Cinética de crecimiento.

Las variables respuesta como la concentración de Lactobacillus casei (LogUFC mL-1

),

de ácido láctico (g L-1

), lactosa, la velocidad especifica de crecimiento (μ) y los

parámetros de producción α y β, fueron estimados para modelar el crecimiento y la

producción de ácido láctico. La velocidad de producción de ácido láctico fue descrita

por el modelo de Luedeking y Piret (LP): dP/dt = αdN/dt + βN. Los valores de los

parámetros del modelo fueron ajustados minimizando la función objetivo:

La ecuación (SSE) es la suma del cuadrado del error, donde N es el número de

observaciones en la fermentación de cada tratamiento, “exp” representa el dato

experimental y “cal” el dato calculado por el modelo (Anexo C).

3.3.4. Diseño experimental.

Se estableció un diseño completamente al azar con arreglo factorial completo 22 con sus

factores concentración de lactosa y sulfato de amonio suplementado. Aplicando la

metodología de superficie de respuesta a través de un diseño central compuesto (Tabla

6) con 5 repeticiones en el punto central, 4 en los puntos factoriales y 8 en los puntos

estrella, esto es, los puntos que tienen una distancia axial al centro de (±1.68179) para el

factor concentración de lactosa y en total 21 unidades experimentales (Anexo D). Las

39

condiciones óptimas se estimaron por el análisis de los datos y la gráfica de superficie de

respuesta generada por el paquete Design Expert 6.0, maximizando la respuesta de

concentración de ácido láctico.

40

4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1. COMPOSICIÓN DEL LACTOSUERO

La caracterización del lactosuero pasteurizado tiene una composición en lactosa de

46,5%±0,02 y la desproteinización redujo el nitrógeno a 0,154±0,005%N. El pH del

suero (6,2) lo define como un suero dulce y se ajustó a 6,5 correspondiente al pH en la

fermentación. Los valores obtenidos están dentro de los rangos aceptables para suero de

leche rango (Urríbarrí 2006) y es similar al usado en otros estudios (Schepers et al.

2002; Nabi y Ardalan 2004; Panesar et al. 2007; Ustaríz, et al. 2008; Panesar et al.

2010).

4.2. FERMENTACIÓN DE LACTOSUERO

El medio con lactosa inicial (Lo) de 47,9 g L-1

alcanzo una concentración de lactosa de

6 g L-1

al final de la fermentación (Figura 3) correspondiente a una conversión a 22,23 g

L-1

de ácido láctico y una población microbiana de 7,69 logUFC mL-1

de Lactobacillus

casei. Para la concentración inicial de 55,88 g L-1

se obtuvo un consumo de 87,4% de

lactosa, 22,05 g L-1

de ácido láctico y 7,68 logUFC mL-1

del microorganismo hasta el

final de la fermentación (Figura 4).

41

Figure 3. Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido

láctico () y recuento de L. casei (▲) a 47,9 g L-1

inicial de lactosa.

Figure 4. . Efecto del tiempo de fermentación en la concentración de lactosa (□), ácido


inicial de lactosa.

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LogU

FC/

mL

Lac

tosa

, ác

ido

lác

tico

(g.L

-1)

Tiempo (h)

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

0

10

20

30

40

50

60

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Lo

gU

FC

/ m

L

Lac

tosa

, ác

ido

lác

tico

(g.L

-1)

Tiempo (h)

42

Con 67,75 g L-1

de lactosa, se alcanzó una conversión del 84,00% y una producción de

ácido láctico de 18,69 g L-1

y 7,61 logUFC mL-1

de L. casei a las 21 horas de

fermentación (Figura 5). Plessas et al. (2008) reportaron que a concentraciones iniciales

de lactosa de 36 g L-1

y 52 g L-1

se alcanzó un azúcar residual de 8,5 g L-1

y 7,5 g L-1

utilizando L. helveticus y cuando usaron L. bulgaricus un residual de 11,5 g L-1

y 19,4 g

L-1

respectivamente. Chronopoulos et al. (2002) obtuvieron producciones de ácido

láctico de 13,1, 17,2 y 19,1 g L-1

a temperaturas de 32, 37 y 43ºC respectivamente,

utilizando 50 g L-1

de lactosa en un medio suplementado con minerales y 5 g de extracto

de levadura.



inicial de lactosa.

En la fermentación con 79,63 g L-1

de lactosa inicial se convirtió el 79,10% con un

residual de 16,6 g L-1

de lactosa, una producción de ácido láctico 13,76 g L-1

y

6,0

6,5

7,0

7,5

8,0

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LogU

FC/

mL

Lac

tosa

, ác

ido

lác

tico

(g.L

-1)

Tiempo (h)

43

7,62 logUFC mL-1

(Figura 6). Al igual que la concentración de lactosa anterior la

conversión fue (77,40%) la más baja para la fermentación con Lo de 87,72 g L-1

;

además, se obtuvo una concentración de ácido láctico de 16,89 g L-1

y 7,61 logUFC mL-

1 del microorganismo (Figura 7).



inicial de lactosa.

La alta concentración inicial de lactosa causo una reducción de su conversión durante el

tiempo de fermentación y una más baja producción de ácido láctico. En cuanto al

crecimiento no hubo un efecto importante en la concentración final de Lactobacillus

casei que fue de 7,64 ±0,04 logUFC mL-1

, excepto para una concentración inicial de

lactosa de 67,75 g L-1

. En el tiempo total de las fermentaciones no se observa una fase

estacionaria y de adaptación bien definida, si una fase exponencial, con asociación de la

formación de producto al crecimiento microbiano.

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LogU

FC/

mL

Lac

tosa

, ác

ido

lác

tico

(g.L

-1)

Tiempo (h)

44



inicial de lactosa.

La tabla 6 muestra los tratamientos evaluados para producir ácido láctico a partir de

lactosuero y los valores medios de concentración de ácido láctico (P) y la concentración

de L. casei (N) y consumo de lactosa (%) a las 21 horas de fermentación. Estos

resultados muestran que L. casei fue capaz de producir ácido láctico al suplementar con

lactosa y sulfato de amonio. La variable sulfato de amonio tienen un efecto significativo

(p<0,05) sobre la producción de ácido láctico y la concentración de lactosa tiene un

efecto significativo (p<0,05) sobre la concentración del L. casei al final de la

fermentación (Anexo E). El tratamiento 2 y 5 presentaron la mayor producción de

ácido láctico y el 4 la menor, con una composición del medio de 5 g L-1

de sulfato de

amonio y 9,38 g L-1

de lactosa para una producción de 21,46 g L-1

de ácido láctico. La

6,00

6,50

7,00

7,50

8,00

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LogU

FC/

mL

Lac

tosa

, ác

ido

lác

tico

(g.L

-1)

Tiempo (h)

45

producción más baja (13,76 g L-1

) de ácido láctico fue obtenida con una concentración

de 11,99 g L-1

de sulfato de amonio y 79,63 g L-1

de lactosa inicial.

Tabla 6. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero suplementado Suplemento

Tratamientos So(g L-1

) L(g L-1

) Lo (g L-1

) P (g L-1

) N (logUFC mL-1

) Consumo

Lactosa

(%)

1 2,62 1,27 47,9 17,89 ab 5,42 a 87,5

2 5 9,38 55,88 21,46 b 7,32 b 87,4

3 8,5 21,25 67,75 17,87 ab 7,61 c 84,0

4 11,99 33,13 79,63 13,76 a 7,62 c 79,1

5 14,37 41,22 87,72 20,86 b 8,39 d 77,4

Las medias con las mismas letras no difieren entre si al nivel de significancia del 5% por test de Duncan.

El crecimiento del L. casei en el cultivo estuvo directamente relacionado con la

concentración de lactosa; es decir, el mayor crecimiento de 8,39 log UFC mL-1

se

obtuvo a 87,72 g L-1

de lactosa, aunque fue la menor conversión de ésta, lo cual sugiere

una mayor predisposición del medio para el crecimiento del L. casei que para la

formación de ácido láctico. En consecuencia, los resultados obtenidos confirman el

efecto de la suplementación con sulfato de amonio y su balance con la lactosa sobre la

bioconversión a ácido láctico; tal como lo muestran los estudios cuando al suplementar

con una fuente de nitrógeno se mejoró la velocidad de bioconversión y se duplico el

ácido láctico producido (Arasaratnam et al. 1996; Nancib et al. 2005; Ohkouchi y Inoue

2006; De Lima et al. 2009).

46

4.3. MODELOS CINETICOS

4.3.1. Parámetros estequiométricos

Basado en los datos experimentales de concentración de lactosa, ácido láctico y recuento

de Lactobacillus casei los coeficientes estequiométricos fueron determinados para

formación de producto y biomasa (Tabla 7) en cada una de las concentraciones iniciales

de lactosa.

Tabla 7. Coeficientes estequiométricos Yx/s y Yp/s.

Suplemento

L(g L-1

) So(g L-1

) Lo (g L-1

) Yx/s (LogUFC g-1

) Yp/s

1,4 2,62 47,9 0,255a 0,5306a

9,38 5,0

55,88 0,218b 0,4511b

21,25 8,5 67,75 0,173c 0,3284c

33,13 11,99 79,63 0,168d 0,2781d

41,22 14,37

87,72 0,156e 0,2488e

El rendimiento de producto por sustrato (Yp/s) decrece con el aumento de la

concentración de lactosa. Mirdamadi et al. (2008) reportaron rendimientos de 0,47 a

0,33 (g ácido láctico / g lactosa) cuando suplementaron con glucosa, Plessas et al. (2008)

reportaron 0,15 y 0,23 en lactosuero diluido (36 g L-1

) y no diluido (52 g L-1

)

respectivamente, usando L. helveticus. Aguirre et, al. (2009) reportaron rendimientos

Yx/s de 0,36 LogUFC g-1

de L. casei y Yp/s de 0,52 g g-1

en suero de leche de cabra en

un cultivo batch con un consumo de lactosa de 28,36 g L-1

después de 40 h de

fermentación. Los resultados muestran la asociación existente entre la producción de

biomasa y de ácido láctico; además, de que altas concentraciones de lactosa no

favorecen directamente el crecimiento microbiano o la formación de producto.

47

4.3.2. Parámetros cinéticos.

La velocidad de formación de ácido láctico está directamente relacionada a la velocidad

de crecimiento, comportamiento característico de un metabolito primario de formación

asociada al crecimiento, definida por los parámetros α y β del modelo Luedeking-Piret.

El valor α es el parámetro asociado al crecimiento del microorganismo en la etapa

exponencial calculándose mediante los datos experimentales de ácido láctico y UFC

mL-1 del Lactobacillus casei correspondiente a:

Los resultados muestran que no es función de la concentración inicial de lactosa (Tabla

8) y hay un ajuste a los parámetros α (g ácido láctico UFC-1

) y β (g ácido láctico UFC-1

h-1

).

Tabla 8. Parámetros cinético α de formación de ácido láctico.

Modelo Básico Modelo Luedeking-Piret

So α SSE R2 α SSE R2

47,9 2,075 0,561 0,973 2,075 0,759 0,168 0,902

55,88 2,075 0,683 0,968 2,075 0,759 0,100 0,962 67,75 2,075 0,242 0,985 2,075 0,758 0,019 0,794

79,63 2,075 0,225 0,985 2,075 0,759 0,002 0,929

87,72 2,075 0,331 0,981 2,075 0,759 0,051 0,918

Quedando:

La formación de ácido láctico es descrita por la cinética de Luedeking-Piret asociado y

no asociado al crecimiento del Lactobacillus casei en el rango de concentraciones

evaluado.

La velocidad específica máxima de crecimiento (μmax) fue determinada ajustando los

modelos de crecimiento en cada concentración inicial de lactosa, basados en la

48

aplicación de la ecuación en fase exponencial, Monod, Monod con Inhibición, Modelo

Logístico, Mosser, Tessier y los modelos de Gompertz, Logistico modificado y Baranyi

integrado.

Los modelos aplicables en la fase logarítmica consideran que la velocidad de

crecimiento específica es constante y los efectos inhibitorios por concentración de

sustrato o producto no juegan un papel importante. El modelo en la fase exponencial

que relaciona la concentración de microorganismo con el tiempo tiene un buen ajuste en

esta fase a las diferentes Lo (Tabla 9); sin embargo, el modelo es solo función del

tiempo, no revela el comportamiento durante todas las fases de crecimiento y los efectos

de otros factores.

Tabla 9. Parámetros cinético fase exponencial.

Lo μmax(h-1

) td (h) SSE R2

47,900 0,057 12,124 0,081 0,957

55,880 0,049 14,079 0,083 0,972

67,750 0,074 9,362 0,001 0,995

79,630 0,033 20,956 0,145 0,755

87,720 0,027 25,500 0,269 0,757

El modelo de Monod se aplicó considerando que el rango de concentración inicial de

lactosa era el único factor limitante del crecimiento y no hay efecto toxico de la

formación del ácido láctico dado el ajuste de pH a 6,5. La ecuación de Monod no

presentó ajustes individuales satisfactorios (rango de SSE 0,08 a 0,15) para cada

condición inicial de sustrato; por lo tanto, no permitió obtener una buena representación

de los datos de crecimiento (Anexo F).

49

Los modelos con inhibición, Mosser y Tessier basados en Monod dan buen ajuste (SSE

0,015 a 0,052), excepto a 79,63 g L-1

cuyo SSE de 0,008 en el modelo de Mosser

mostro el mejor ajuste (Anexo F). El crecimiento del microorganismo está gobernado

por una relación hiperbólica y hay un límite a la máxima concentración celular

alcanzable; sin embargo, los modelos de Monod y los basados en éste solo representan

una relación exponencial y no describen las fases de crecimiento durante las 21 horas de

fermentación. Los modelos logístico, logístico modificado, Gompertz y Baranyi

pretenden describir tal cinética de crecimiento representan las fases lag, exponencial y

estacionaria.

Usualmente, la curva de crecimiento es de naturaleza sigmoidal y por ende el modelo

debe ajustarse a esta forma (Van Boekel, 2009). El modelo logístico describe

apropiadamente este comportamiento basándose en la proporcionalidad de la velocidad

de crecimiento al tamaño de la población microbiana y a los recursos disponibles para la

población existente. Desde el punto de vista del ajuste a los datos experimentales la

función logística arrojo valores menores de SSE a los modelos previos con Lo de 79,63

g L-1

y 87,72 g L-1

(SSE < 0,008). Para las otras concentraciones (47,9 g L-1

, 55,88 g

L-1

, 67,75 g L-1

) el ajuste no fue mejor.

El modelo logístico modificado es una reparametrización a parámetros microbianos de

fácil interpretación como son μmax, λ y As; al igual que los modelos de Gompertz y

Baranyi. Cuando se representa el crecimiento microbiano como el logaritmo del tamaño

50

de la población (ln(N/No)) versus el tiempo, el parámetro λ representa el tiempo lag,

periodo después del cual la fase exponencial se caracteriza por la velocidad máxima de

crecimiento μmax, parámetro común a los anteriores modelos. Cuando aparece la fase

estacionaria el valor de la asíntota del parámetro As es alcanzado (ln(Nmax/No)).

El uso de estos modelos es más ventajoso que los anteriores modelos aplicados. Sin

embargo, hay una buena predicción entre los datos simulados del modelo y los

experimentales en los modelos logístico modificado y Gompertz durante las 21 horas de

fermentación, pero no en Baranyi. Los resultados de la simulación se representan en

Figuras 8 a 12.



experimentales (♦), modelos de Baranyi (□), Gompertz () y Logístico modificado (∆).

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LnN

/No

Tiempo (h)

51







0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

4,00

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Ln N

/No

Tiempo (h)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LnN

/No

Tiempo(h)

52

Figure 11. Cinética de la fermentación con 79,63 g L



Figura 12. Cinética de la fermentación con 87,72 g L



Cabe destacar que la reparametrización de los datos experimentales (ln(N/No)) permite

observar que se presenta una fase lag bien definida a 67,75 g L-1

y en menor grado a

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

LnN

/No

Tiempo (h)

0,00

0,50

1,00

1,50

2,00

2,50

3,00

3,50

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Ln N

/No

Tiempo (h)

53

87,72 g L-1

, en las otras concentraciones no se presenta. En el caso de la fase

estacionaria (asíntota superior) solo a 67,75 g L-1

no se presenta (Figura 10).

Los modelos empíricos de Gompertz y modificado Logístico describen mejor los datos

experimentales que el modelo de Baranyi integrado, el cual incluye un enfoque más

mecanistico presentando la fase exponencial característica y una fase lag determinada

por la función de ajuste (A(t)), por lo que describe mejor el comportamiento cuando So

es igual a 67,75 g L-1

y 87,72 g L-1

.

Se describen bien los datos experimentales, siendo Gompertz y Logístico modificado los

que mejor ajuste presentaron (Tabla 10) para las fermentaciones, arrojando velocidades

específicas de crecimiento máximas (μmax) similares y tiempos lag (λ) diferentes.

Baranyi arroja μmax inferiores.

Tabla 10. Parámetros de los modelos.

So Modelo μmax(h-1

) As λ(h) SSE Bf

47,90 Gompertz 0,267 3,532 0,073 0,031 0,999

Logístico modificado 0,265 0,279 0,279 0,061 1,000

Baranyi integrado 0,406

0,732 1,488 0,977

55,880 Gompertz 0,269 3,487 -0,010 0,047 0,999



-5,121 1,452 0,982

67,750 Gompertz 0,124 1,807 2,275 0,031 0,998



-7,257 0,230 0,996

79,630 Gompertz 0,263 3,336 0,559 0,009 1,000



-5,446 1,124 0,990

87,720 Gompertz 0,306 3,268 1,801 0,066 1,000



-5,964 0,588 0,990

54

La medida cuantitativa (Bf) para el desempeño de los modelos Gompertz y Logístico

modificado y Baranyi están dentro del rango (0,9 – 1,05) interpretado como un buen

ajuste (Mellefont et al. 2003).

Los parámetros cinéticos max, YP/S, YX/S, α y β son dados en la tabla 11. Para los

coeficientes estequiométricos Yp/s y Yx/s se tomó el rango obtenido de las cinco

fermentaciones. Con respecto a μmax es común a las So excepto a 67.75 g L-1

que fue de

0,125 h-1

, tomada de los modelos que mejor describieron el comportamiento del L. casei.

Tabla 11. Parámetros cinéticos.

Parámetros Valor experimental

μmax (h-1

) 0,26

YP/S (g ácido láctico /g lactosa) 0,5306 - 0,2488

YX/S (Log UFC /g lactosa) 0,255 - 0,156

α (g ácido láctico UFC-1

) 2,075

β (g ácido láctico (UFC h)-1

) 0,759

Estos parámetros cinéticos concuerdan con los reportados por la literatura (Anexo G) y

Altiok (2004) cuando evaluó la producción de ácido láctico en lactosuero suplementando

con lactosa (9 a 95 g L-1

) alcanzando coeficientes YP/S y α superiores y β inferior

comparado con los reportados en este estudio.

55

4.4. PRODUCTIVIDAD DE LA FERMENTACIÓN

La productividad fue calculada con los datos experimentales a las 21 horas de la

fermentación (Pr) y graficada con respecto a So (Figura 13) y en la fase exponencial

(Prexp) de las 4 a las 12 horas de fermentación (8horas).

Figura 13. Productividad de ácido láctico a las 8h(□) y 21h (♦) de fermentación.

Se observa que la productividad se mantiene constante a cierta concentración inicial de

sustrato y se puede asociar al consumo de sustrato de 87% en 47,9 y 55,88 g L-1

; de

84%, 79% y 77% para 67,75, 79,63 y 87,72 g L-1

respectivamente.

La suplementación con una fuente de nitrógeno (extracto de levadura, peptona o licor de

maíz (CSL) mejora la productividad con respecto al lactosuero no suplementado (Tabla

12). En este estudio al suplementar con sulfato de amonio de 2,62 a 14,37 g L-1

se

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,09

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

40 50 60 70 80 90

Pr

exp

(g L

-1 h

-1)

Pro

duct

ivid

ad (

g L

-1 h

-1)

Lactosa inicial (g L-1 )

56

alcanzaron productividades de 0,8 a 1,1 g L-1

h-1

resultando buenas considerando el alto

costo que representa el extracto de levadura en la producción industrial.

Tabla 12. Producción de ácido láctico a partir de lactosuero.

Lactosuero Microorganismo Suplemento Condiciones

Ác.

Láctico

g L-1

Pr

g L-1 h-1

Sistem

a Fuente

50 g L-1 lactosa Lactobacillus sp E.L. 35°C, pH6,5,

250 rpm,22 h 18,7-33,4 NR B, C

Zayed y Winter,

1995

Desproteinizado Lb. lactis y casei 48 h 41 NR B Roukas y Kotzekidon,1991

Desproteinizado

(100 g L-1) Lb. lactis y casei NR 46 NR B

Roukas y

Kotzekidon, 1998

Lactosuero Lb. helveticus R211

E.L. NR 66 1,4 B A.W. Schepers et al., 2002

Lactosuero Lb. casei

NRRL B-441 46 4,0 B

A.O. Büyükkilci,

2004

Desproteinizado Lb. helveticus

ATCC 8018

20 g L-1

E.L.;10 g L-1

peptona

tripsica de

caseína

pH 5,9, 40°C,

100 rpm, 7 h

13,02;

2,17 B

Lauris Urribarrí

et al., 2004

Lactosuero

Lactobacillus

casei subsp. casei ATCC 39392

CSL, Glucose

(80 g L-1)

42ºC, 180

rpm, pH 4.8-5

0.375FC

0.625 y 0.425 IC

B Mirdamadi et al.

2008

Diluido 36 g L-1 helveticus y

bulgaricus

37ºC,

150rpm, pH inicial 6,6

4,1 y 3,9 4,1 y 3,8

g.l.dia-1 B

Plessas et al.

2008

52 g L-1 lactosa helveticus y bulgaricus

37ºC,

150rpm, pH

inicial 6,6

10,1 y 9,6 5,1 y 4,8 g.l.dia-1

B Plessas et al. 2008

E.L. Extracto de Levadura; CSL: Corn Steep Licuor; B: Batch; F-B: Fed Batch; C: Continuo; FC: células libres; IC: células inmovilizadas

4.5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO

La metodología de superficie de respuesta fue usada para determinar la concentración

óptima de lactosa y sulfato de amonio para maximizar la producción de ácido láctico. El

efecto de las dos variables anteriores y su interacción ha sido determinado usando un

diseño central compuesto.

57

El analisis de varianza para la concentración de ácido láctico se presenta en la tabla 13.

La superficie de respuesta lineal, interaccion de 2 factores (2FI) y el modelo cúbico son

significativos(P<0,05), no lo es el cuadratico. La falta de ajuste de los modelos lineal,

2FI es significativa (Anexo H) y no significativa para el modelo cúbico (P>0,05).

Tabla 13. Análisis de varianza para ácido láctico.

FV SC GL CM F P> F

Media 6702,57284 1 6702,57284

Lineal 118,473907 2 59,2369534 5,73981032 0.0118

2FI 56,3463341 1 56,3463341 7,401372 0.0145

Cuadrático 31,7024498 2 15,8512249 2,43321367 0.1216

Cubico 94,04202 2 47,02101 166,295905 < 0.0001

Residual 3,6758159 13 0,28275507

Total 7006,81336 21 333,657779

El ajuste del modelo cubico fue evaluado por medio del coeficiente de regresión (R2) y

la significancia de los coeficientes (Tabla 14). En este caso el valor del R2

ajustado

(0,981) indica que el modelo explica el 98,1% de la variabilidad en la concentración de

ácido láctico y demuestra el ajuste de las observaciones experimentales con los valores

predichos. Esta correlación es validada por la gráfica de valores predichos versus

observados, cuando todos los puntos se arreglan alrededor de la línea diagonal (Anexo

F), lo cual significa que no se encontraron violaciones significativas del modelo.

Estos resultados muestran que el modelo elegido explica satisfactoriamente el efecto de

la concentración inicial de sustrato y sulfato de amonio en la producción de ácido láctico

por Lactobacillus casei ATCC 393.

58

Tabla 14. Estimación de los coeficientes de regresión cúbica

FV SC DF CM F Pr> F

Modelo 300,564711 7 42,9378158 151,855158 < 0.0001

A 0,125 1 0,125 0,44207872 0.5177

B 4,41045 1 4,41045 15,5981288 0.0017

A2 29,4120117 1 29,4120117 104,019397 < 0.0001

B2 0,09255881 1 0,09255881 0,32734626 0.5770

AB 56,3463341 1 56,3463341 199,276123 < 0.0001

A2B 86,1186832 1 86,1186832 304,5699 < 0.0001

AB2 7,92333684 1 7,92333684 28,0219091 0.0001

A3

7,92 1 7,92 28,02 0,0001

B3

86,12 1 86,12 304,57 < 0.0001

Residual 3,6758159 13 0,28275507

Falta de ajuste 0,0188611 1 0,0188611 0,06189117 0.8077

Error 3,6569548 12 0,30474623

Total 304,240527 20

A: (g.l-1) lactosa; B: (g.l-1) sulfato de amonio.

El siguiente modelo fue ajustado para la concentración de acido láctico:

El efecto de los variables independientes y su interacción en la formación de ácido

láctico es ilustrado en el análisis de superficie de respuesta (Figura 14) a partir de la

ecuación. Para altas concentraciones de sulfato, hay una reducción de la respuesta,

debido al exceso de nitrógeno en el medio de fermentación. Los Lactobacillus tienen

requerimientos nutricionales complejos y la síntesis de ácido láctico es asociada al

crecimiento microbiano. Además, no hay formación de producto si el medio no tiene la

adecuada concentración de nitrógeno. Por otro lado, las altas concentraciones de

59

nitrógeno pueden conducir a la muerte celular e inhibir por ende la formación de

producto (De lima et al. 2009).

Figura 14. Superficie de respuesta representando el efecto de la concentración de

lactosa y sulfato de amonio sobre la producción de ácido láctico.

Se determinaron los valores óptimos de los factores por medio de Design-Expert 6.0

basado en la optimización numérica sobre una función objetivo llamada Deseabilidad

(D). Cuando se evaluaron los factores en el rango experimental y las respuesta en las

condiciones de frontera se establecen 10 posibles soluciones, donde la concentración

mayor de ácido láctico (21.9 g L-1

) corresponden a 19,57 g L-1

de lactosa y 6.65 g L-1

de

Áci

do

lác

tico

(g

L-1

)

Sulfato de

Amonio (g L-1

)

Lactosa (g L-1

)

60

sulfato de amonio con una D de 1.0; al minimizar la concentración de biomasa

(7.36LogUFC L-1

) el medio optimo es 9,38 g L-1

lactosa y 5,0 g L-1

de sulfato de amonio

para producir 22.07 g L-1

de ácido láctico (D=0,63). La combinación de 17,69 g L-1

de

lactosa y 6,34g l-1 de sulfato de amonio, maximizando la concentración de biomasa

(7,81LogUFC L-1

) y ácido láctico (22,05 g L-1

) arrojan una D igual a 0,907; de igual

forma, cuando se maximiza la concentración de ácido láctico y no se considera biomasa,

la respuesta optima es 20,07 g L-1

de lactosa, 5,25 g L-1

de sulfato de amonio y una D

de 1,0. Las óptimas para maximizar biomasa (7,54LogUFC L-1

) y minimizar ácido

láctico (17,07 g L-1

) son de 11,03 g L-1

sulfato de amonio y 33,12 g L-1

de lactosa con

una D de 0,523.

La fermentación de lactosuero por Lactobacillus casei ATCC 393 suplementando con

lactosa y sulfato de amonio como fuentes de carbono y nitrógeno respectivamente arrojo

una significativa producción de ácido (L+)láctico (21.5 a 23,08 g L-1

) en 21 h de

fermentación. Teniendo en cuenta que las Lactobacillus tienen requerimientos

nutricionales complejos y que la síntesis de ácido láctico está asociada al crecimiento

microbiano, no hay formación de producto si el medio no tiene la adecuada

concentración de nitrógeno. Por otro lado, las altas concentraciones de nitrógeno pueden

conducir a la muerte celular e inhibir por ende la formación de producto (De Lima et al.

2009). Los resultados de este estudio mostraron que altas concentraciones de nitrógeno

no favorecieron la producción de biomasa y ácido láctico y que se requirió suplementar

mas con la fuente de nitrógeno (5 a 6,34 g L-1

) que con la fuente de carbono (9,38 a

20,07 g L-1

) con respecto a la composición inicial del lactosuero (46,5%±0,02 de lactosa

61

y 0,154±0,005% N) para maximizar la producción de ácido láctico, esto muestra la

dependencia de la síntesis de ácido láctico al crecimiento del Lactobacillus casei.

Utilizando otras fuentes de nitrógeno suplementando el medio con 100 g L-1

de glucosa,

licor de maiz (CSL) 40 g L-1

y extracto levadura (EL) 5 g L-1

(Korbekandi et al. 2007)

para maximizar a 21,55 g L-1

el ácido láctico producido; con EL, CSL y glucosa de

0,697%, 1,708% y 2,215% respectiviamente y una productividad de 0,697 g L-1

h-1

en

24 h de fermentación (Mi-Young et al. 2003); con 60 g L-1

CSL en 36 h de fermentación

produjeron 48,6 g L-1

de ácido lactico (Wee et al. 2006); con 5 g L-1

de CSL, 3,6 g L-1

de

EL y 10 g L-1

de peptona obtuvieron un maximo de 58,9 g L-1

de ácido lactico ( Bustos et

al. 2004); utilizando la metodologia de superficie de respuesta determinaron las

maximas concentraciones formulando melaza de caña de azucar 100 g L-1

, 20 g L-1

de

EL y 4 g L-1

de peptona como el mejor medio para producir ácido láctico (Hauly et al.

2003), reportando que los incrementos en melaza y CSL proveen una mayor producción

de ácido en un menor tiempo de fermentación (Yu et al. 2007). La principal fuente de

nitrogeno usada en la producción de ácido láctico es EL por ser una excelente fuente de

complejo B y factores requeridos por las Lactobacillus para obtener una rapida

velocidad de crecimiento y producción; sin embargo, el alto costo de EL es un factor

negativo cuendo se usa a nivel industrial (Hurok et al. 2005). Al evaluar la influencia

de fuentes alternativas de nitrógeno reemplazando peptona y EL por Lenteja rojo y

levadura de panadería lograron incrementar un 40% la producción de ácido láctico

usando almidón como fuente de carbono (Altaf et al. 2007). El sulfato de amonio es una

fuente pura de nitrogeno que no ofrece los complementos asociados al EL; sin embargo,

62

se obtuvieron resultados importantes considerando el tiempo de fermentación y el uso de

otras fuentes de nitrogeno con respecto a los estudios anteriormente citados.

Estos resultados muestran que el modelo elegido explica satisfactoriamente el efecto de

suplementar con lactosa y sulfato de amonio en la producción de ácido láctico por

Lactobacillus casei ATCC 393 y la importancia de formular medios con fuentes de

carbono y nitrogeno balanceadas. Los resultados a partir de la deseabilidad indican que

las condiciones optimas del medio son deseables para producir ácido láctico más que

Lactobacillus casei; aunque, es importante la asociación entre crecimiento y formación

de producto.

63

5. CONCLUSIONES

El lactosuero es una materia prima favorable para producir ácido láctico mediante el

proceso de fermentación por lactobacillus casei a las condiciones de 37°C y pH 6,5.

El L. casei creció con un alto rendimiento en ácido láctico, que se redujo al

incrementarse la concentración inicial de lactosa (fuente de carbono) y de sulfato de

amonio (fuente de nitrógeno) en el medio; de tal forma, que el lactosuero requiere una

mayor suplementación con fuentes de nitrógeno que de carbono.

Los modelos cinéticos basados en Monod no logran describir las etapas de crecimiento

del L. casei y no se ajustan tanto como los modelos reparametrizados Logístico,

Gompertz y Baranyi. Las ecuaciones logística modificada y Gompertz son las que

mejor ajuste tienen para describir las etapas lag, exponencial y estacionaria del L. casei

en los medios suplementados con lactosa y sulfato de amonio. Para la formación de

producto el modelo de Luedeking y Piret asociado y no asociado al crecimiento se ajusto

apropiadamente a los datos experimentales.

64

Los parámetros cinéticos de crecimiento (µmax de 0.26 h-1

) y de formación de producto

(α de 2,075 g ácido láctico UFC-1

y de 0,759 g ácido láctico (UFC h)-1

) de la

fermentación del lactosuero suplementado con lactosa y sulfato de amonio inicial

representan la asociación de la producción de ácido láctico al crecimiento del L.casei

más que a la masa total de éste.

El modelo elegido explica satisfactoriamente el efecto de suplementar con lactosa y

sulfato de amonio en la producción de ácido láctico por Lactobacillus casei ATCC 393

y la importancia de formular medios con fuentes de carbono y nitrogeno balanceadas.

Los resultados a partir de la deseabilidad indican que las condiciones optimas del medio

son deseables para producir ácido láctico más que Lactobacillus casei; aunque, es

importante la asociación entre crecimiento y formación de producto.

65

6. RECOMENDACIONES

Complementar el estudio suplementando con fuente de minerales específicos como

Magnesio y Fosforo para optimizar un medio más completo en cuanto a requerimientos

nutricionales y desarrollar modelos estructurados complementarios.

Estudiar la cinética de fermentación y suplementación del lactosuero direccionada a la

producción de biomasa del L. casei, reconocido como un microorganismo probiótico.

Escalar la producción de ácido láctico y asociarlo a métodos de purificación económicos

que faciliten la implementación de este proceso biotecnológico y aprovechar la oferta de

lactosuero y otros fuentes disponibles de nutrientes.

66

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73

ANEXOS

74

Anexo A. ATCC catálogo.

Tabla 15. Especificadores del Lactobacillus casei ATCC 393

ATCC

® Number: 393™

Organism: Lactobacillus casei (Orla-Jensen) Hansen and Lessel

deposited as Lactobacillus casei subsp. casei (Orla-Jensen)

Hansen and Lessel

Designations: 03 [7, IAM 12473, Orland L-323, R.P. Tittsler 303]

Isolation: dairy products (cheese)

Depositor: GJ Hucker

Biosafety Level: 1

Shipped: freeze-dried

Growth

Conditions:

ATCC medium416: Lactobacilli MRS broth

Temperature: 37.0°C

Permits/Forms: In addition to the MTA mentioned above, other ATCC

and/or regulatory permits may be required for the transfer of

this ATCC material. Anyone purchasing ATCC material is

ultimately responsible for obtaining the permits. Please click

here for information regarding the specific requirements for

shipment to your location.

References: Nucleotide (GenBank) : AF129168 Lactobacillus casei

sorbose operon, partial sequence.

Nucleotide (GenBank) : Z75478 L.casei rrn operon, 16S-

23S rRNA spacer (long), tRNA-Ile and tRNA-Ala genes.

Nucleotide (GenBank) : Z80834 L.casei lacT gene.

http://www.atcc.org/BiosafetyLevels/tabid/660/Default.aspx

http://www.ncbi.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=nucleotide&cmd=search&term=Z80834

75

Anexo B. Curvas de calibración

Figura B.1. Curva de calibración lactosa

Figura BA.2. Curva de calibración microorganismo

y = 0,0006x R² = 0,9916

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0 200 400 600 800

Ab

sorb

anci

a

Lactosa (ppm)

y = 466,4x + 36,754 R² = 0,9868

0

50

100

150

200

250

300

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6

UFC

/ml

DO

76

Anexo C. Modelos cinéticos.

Tabla 16. Modelos cinéticos basados en Monod

Referencia Modelo Cinético biomasa

Monod sK

s

S

max

Teissier Ks/s

max e1

Moser n

S

n

maxsK

s

Referencia Modelo Cinético consumo sustrato

Moser y Steiner

Monod X

Xcresc

Y

r

dt

dS

Hanson y Tsao

Aborhey y

Williamson mX

dt

dP

Y

1

dt

dX

Y

1

dt

dS

PX

Referencia Modelo Cinético Producto

Gaden

xkr

xsK

sqr rYr

Y

YY com Yqou rYr

PP

S

maxPPSS/PP

S/X

S/P

P/XX/PPxX/PP

Luedecking-Piret Xdt

dX

dt

dP

Giona et al 2L1P kkq

Gaden pX/PP kYq

sx

X

sm

Y

1

77

Tabla 17. Modelos no basados en Monod

Logistico

Gompertz

Logistico modificado

Modelo de Baranyi integrado

78

Anexo D. Combinación de tratamientos DCC

Tabla 18. Niveles experimentales de las variables independientes.

Variable

independiente

Niveles

-α -1 0 +1 +α

Lactosa (L) 1,28 9,38 21,25 33,13 41,22

Sulfato de

Amonio (SA) 2,62 5 8,5 11,99 14,37

Tabla 19. Matriz del diseño Central Compuesto

Lactosa Inicial (g.l-

1)

Sulfato amonio (g.l-1)

Ácido Láctico (g.l-

1)

Biomasa (logUFC.l-1)

33,13 11,99 9,38 5,00 21,25 14,37 41,22 8,50 33,13 11,99 9,38 11,99 33,13 11,99 9,38 11,99 21,25 8,50 33,13 5,00 21,25 8,50 21,25 8,50 1,28 8,50 21,25 8,50 33,13 5,00 21,25 2,62 33,13 5,00 9,38 5,00 21,25 8,50 9,38 5,00 9,38 11,99

79

Anexo E. Análisis estadístico Diseño factorial

Análisis de Varianza para Ácido Láctico - Suma de Cuadrados Tipo III

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

COVARIABLES

SulAmonio 96,198 1 96,198 9,87 0,0067

EFECTOS PRINCIPALES

A:Lactosa 61,8576 4 15,4644 1,59 0,2290

RESIDUOS 146,188 15 9,74586

TOTAL (CORREGIDO) 304,241 20

Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual

Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Lactosa

Método: 95,0 porcentaje Tukey HSD

Lactosa Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

1,27 1 14,5522 3,12184 X

41,22 1 15,0522 3,12184 X

9,38 6 16,0257 1,27448 X

21,25 7 19,1783 1,17994 X

33,13 6 19,1942 1,27448 X

Análisis de Varianza para Aclactico - Suma de Cuadrados Tipo III


COVARIABLES

Lactosa 22,3233 1 22,3233 3,55 0,0791

EFECTOS PRINCIPALES

A:SulAmonio 187,61 4 46,9024 7,46 0,0016

RESIDUOS 94,3104 15 6,28736



Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Sulfato de Amonio

Método: 95,0 porcentaje Duncan

SulAmonio Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

11,99 6 13,7609 1,02367 X

8,5 7 17,8702 0,947731 XX

2,62 1 17,8902 2,50746 XX

14,37 1 20,8602 2,50746 X

5 6 21,4608 1,02367 X

Pruebas de Múltiple Rangos para Ácido Láctico por Sulfato de Amonio

Método: 95,0 porcentaje Duncan

SulAmonio Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

11,99 6 13,7609 1,02367 X

8,5 7 17,8702 0,947731 XX

2,62 1 17,8902 2,50746 XX

14,37 1 20,8602 2,50746 X

5 6 21,4608 1,02367 X

80

Contraste Sig. Diferencia

2,62 - 5 -3,57053

2,62 - 8,5 0,0200076

2,62 - 11,99 4,12931

2,62 - 14,37 -2,97

5 - 8,5 3,59053

5 - 11,99 * 7,69983

5 - 14,37 0,600527

8,5 - 11,99 4,1093

8,5 - 14,37 -2,99001

11,99 - 14,37 * -7,09931

* indica una diferencia significativa.

Análisis de Varianza para Biomasa - Suma de Cuadrados Tipo III


COVARIABLES

SulAmonio 0,00560539 1 0,00560539 0,09 0,7660

EFECTOS PRINCIPALES

A:Lactosa 5,44516 4 1,36129 22,30 0,0000

RESIDUOS 0,915633 15 0,0610422



Pruebas de Múltiple Rangos para Biomasa por Lactosa

Método: 95,0 porcentaje LSD

Lactosa Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

1,27 1 5,42998 0,247067 X

9,38 6 7,32334 0,100865 X

21,25 7 7,6157 0,0933826 X

33,13 6 7,62334 0,100865 X

41,22 1 8,39998 0,247067 X

Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

1,27 - 9,38 * -1,89336 0,475361

1,27 - 21,25 * -2,18572 0,65289

1,27 - 33,13 * -2,19336 0,645765

1,27 - 41,22 * -2,97 0,65289

9,38 - 21,25 * -0,292363 0,237654

9,38 - 33,13 * -0,3 0,229187

9,38 - 41,22 * -1,07664 0,237654

21,25 - 33,13 -0,00763726 0,29298

21,25 - 41,22 * -0,784278 0,30404

33,13 - 41,22 * -0,776641 0,29298

* indica una diferencia significativa.

81

Anexo F. Ajustes de modelos.

Tabla 20. Ajuste de modelos cinéticos

Inhibición Tratamiento So Umaxh-1 Ks Ki SSE

T-α 47,900 55,614 10169,012 1583,355 0,022 T-1 55,880 56,722 10169,004 1583,355 0,046 T0 67,750 22,500 10169,033 1,212 0,052 T+1 79,630 31,661 10169,131 1583,355 0,014 T+α 87,720 29,275 10169,139 1583,355 0,025

Tessier Tratamiento So Umaxh-1 Ks SSE

T-α 47,900 39221858,677 5990948670,027 0,027 T-1 55,880 7711404,596 1408040879,396 0,043 T0 67,750 0,200 86,271 0,057 T+1 79,630 11247654,691 2981743508,243 0,037

T+α 87,720 9788955,503 3220116259,528 0,026

Mosser Tratamiento So Umaxh-1 Ks lamda SSE

T-α 47,900 0,798 1056,416 1,636 0,018 T-1 55,880 0,893 1056,416 1,531 0,023

T0 67,750 0,097 359224838,34

3 6,388 0,043 T+1 79,630 0,822 1056,417 1,406 0,008 T+α 87,720 20230,449 35971328,231 1,402 0,010

Logístico Tratamiento So Umaxh-1 SSE

T-α 47,900 0,122 0,114 T-1 55,880 0,291 0,021 T0 67,750 0,162 0,069 T+1 79,630 0,291 0,005 T+α 87,720 0,320 0,008

82

Anexo G. Parámetros cinéticos reportados de estudios previos.

Tabla 21. Parámetros cinéticos en estudios previos

Referencia μmax Ks α β ms Yx/s Yp/s

Schepers et al. (2002) L. helveticus 0,7 0,22 - - - - -

Amrane and Prigent (1997) L. helveticus 0,76 - 2,69 0,71 - - -

Kulozik and Wilde (1999) L. helveticus - - 4,26 0,5 - - -

Boonmee et al. (2003) Lactococcus

lactis

1.1 1.32 0.932 3.02 - - 0.93

Biazar et al. (2003) L. helveticus 0,25 0,9 4,6 0,23 2,65 0,064 0,61

Kwon et al. (2001) L. rhamnosus 0,633 0.3 6,6 0,33 - 1 1

Amrane (2001) L. helveticus 0,49 -

2,56 0,76 - - 0,84

Schepers et al. (2002) L. helveticus 0,82 0,22 4,5 1,62 - - 0,95

Messens et al. (2002) L. curvatus - - - - - 0,23 1

Tango and Ghaly (1999) L. helveticus 0,21 - - - - 0,08 0,71

Luedeking and Piret (1959) L. helveticus - - 2,2 0,55 - - -

Akarberg et al. (1998) Lactococcus

lactis

0,403 0,79 13,2 0,064 - - -

Monteagudo et al. (1997) L. delbrueckii 0,831 - 0,235 0,087 - 0,27 0,91

Dutta et al. (1996) L. delbrueckii 0,069 0,096 0,385 0,003 0,00

014

- -

Fu and Mathews (1999) L. plantarum 0,364 44,4 - - - - 1,02

Fuente: Altiok 2004

83

Anexo H. Evaluación estadística del Diseño Central Compuesto.

Falta de ajuste de los modelos

Sum of

Mean F

Source Squares DF Square Value Prob > F Linear 182,109665 6 30,3516108 99,5963445 < 0.0001 2FI 125,763331 5 25,1526662 82,5364301 < 0.0001 Quadratic 94,0608811 3 31,353627 102,884379 < 0.0001 Cubic 0,0188611 1 0,0188611 0,06189117 0.8077 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623

Ajuste R2

Std.

Adjusted Predicted

Source Dev. R-Squared R-Squared R-Squared PRESS Linear 3,21253292 0,3894087 0,32156522 0,09480579 275,396762 2FI 2,75915893 0,57461195 0,49954347 0,3241894 205,608973

Quadratic 2,55235624 0,67881387 0,57175183 -

0,11189482 338,283465 Cubic 0,53174719 0,98791806 0,9814124 0,97993449 6,10474169

Modelo lineal

Sum of

Mean F

Source Squares DF Square Value Prob > F Model 118,473907 2 59,2369534 5,73981032 0.0118 A 22,3198399 1 22,3198399 2,16269811 0.1587 B 96,1540669 1 96,1540669 9,31692252 0.0069 Residual 185,76662 18 10,3203678

Lack of Fit 182,109665 6 30,3516108 99,5963445 < 0.0001 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623

Cor Total 304,240527 20

Modelo 2FI

Sum of

Mean F

Source Squares DF Square Value Prob > F Model 174,820241 3 58,2734136 7,65450351 0.0019 A 22,3198399 1 22,3198399 2,93182229 0.1050 B 96,1540669 1 96,1540669 12,6303162 0.0024 AB 56,3463341 1 56,3463341 7,401372 0.0145 Residual 129,420286 17 7,61295799

Lack of Fit 125,763331 5 25,1526662 82,5364301 < 0.0001 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623

Cor Total 304,240527 20

84

Modelo cubico modificado

Sum of

Mean F

Source Squares DF Square Value Prob > F Model 300,564711 7 42,9378158 151,855158 < 0.0001 A 0,125 1 0,125 0,44207872 0.5177 B 4,41045 1 4,41045 15,5981288 0.0017 A2 29,4120117 1 29,4120117 104,019397 < 0.0001 B2 0,09255881 1 0,09255881 0,32734626 0.5770 AB 56,3463341 1 56,3463341 199,276123 < 0.0001 A2B 86,1186832 1 86,1186832 304,5699 < 0.0001

AB2 7,92333684 1 7,92333684 28,0219091 0.0001 Residual 3,6758159 13 0,28275507

Lack of Fit 0,0188611 1 0,0188611 0,06189117 0.8077 Pure Error 3,6569548 12 0,30474623

Cor Total 304,240527 20

Diagnóstico del modelo

DESIGN-EXPERT Plot

Ac.lactico

Studentized Residuals

Norm

al % pr

obabili

ty

Normal plot of residuals

-0.92 0.20 1.32 2.44 3.56

1

5

10

20

30

50

70

80

90

95

99

85

Grafica de predichos versus observados

DESIGN-EXPERT Plot

Ac.lactico22

22

22

Actual

Pred

icte

d

Predicted vs. Actual

9.88

12.93

15.97

19.02

22.07

9.88 12.93 15.97 19.02 22.07

DESIGN-EXPERT Plot

Ac.lactico

Lambda

Current = 1

Best = 0.81

Low C.I. = 0.01

High C.I. = 1.78

Recommend transform:

None

(Lambda = 1)

Lambda

Ln(R

esidu

alSS)

Box-Cox Plot for Power Transforms

1.29

2.09

2.89

3.69

4.50

-3 -2 -1 0 1 2 3

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PRODUCCION DE ACIDO L (+) LÁCTICO A PARTIR DE … · PRODUCCION DE ACIDO L ... legal y científica de las ideas, conceptos y ... biotecnológicos permite obtener sustancias con interesantes