PRODUKSI GLUKOAMILASE DARI RHIZOPUS ORYZAESKALA FERMENTASI 2 LITER DAN 4 LITER

Unar Z. Udln, Ngadiman dan A.T. KarosslPuslitbang Kimia Terapan • LlPI

Jalan Cisitu-Sangkuriang Bandung 40135

INTISARIProduksi glukoamilase oleli Rhlzopus oryzae telahdilakukan

dalam skala erlenmeyer dengan menggunakan tepung sagusebagai sumber karbon dan tepung bungkil kedele sebagaisumber nitrogen. Diketahui bahwa tepung sagu 2 % dan tepungbungkll kedele 0,5% dalam medium fermen/asi dapat memberikanglukoamilase optimum. Pada penelitian ini dicoba mencarikondisi yang paling baik untuk menghasllkan glukoamilase dalamjumlah yang maksimal dan beraktifitas tinggi oleli R. oryzaedalam medium tepung sagu pada skala 2 liter dan 4 liter. Hasilyang diperoleli menunjukkan bahwa untuk percobaan fermentasidengan skala 600-1500 ml waktu inkubasi yang diperlukan untukproduksi glukoamilase adalah 8 (delapan) hari. Pada kondisi iniaktifitas spesifik enzim dapat mencapai 0,85 Uimg protein - 1,50Ulmg protein. Pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatanagitasi 300 rpm, aktifitas spesifik enzim maksimum sebesar 2,58Ulmg protein diperoleli pada hari ke-S, sedangkan untukkecepatan agitasi 500 rpm dan 700 rpm, aktiJitas spesiJik enzimmakslmum masing-masing sebesar 3,47 Ulmg protein dan 4.71U/mg protein didapatkan pada hari ke-6 dan ke-5 fermentasi.Pada kondisi makslmum ini penggunaan pati sagu dalam mediummencapai 94-98%. Biomasa yang dlhasilkan pada akhir prosesfermentasi berkisar antara 4,80 - 7,90 g keringfl. medium.

ABSTRACTProduction of glucoamylase by R. oryzae has been conducted

in erlenmeyer flasks using medium containing sago starch ascarbon source and soybean meal as nitrogen source. It wasknown that 2 % of sago starch and 0.5 % of soybean meal in themedium is the best composition for the production of glu-coamylase. At the present study, the optimal condition formaximal production of glucoamylase fermentation from R. oryzaewas investigated using sago starch medium in the 2L and 4Lscale. The results showed that the maximum production ofglucoamylase at 600-1500 ml fermentation scale was reached atday-S of incubation time. At this condition, the enzyme specificactivity was 0.85 Ulmg protein - 1.50 Ulm g protein. Forglucoamylase production within 4000 ml fermentation scale, themaximum enzyme specific activity, 2.58 Ulmg protein, wasobtained at day-S of fermentation with 300 rpm agitation, whilethe maximum activity of 3.47 Ulmg protein and 4.71 Ulmg proteinwere achieved at day-6 and day-S of fermentation process with500 rpm and 700 rpm agitation, respectively. At this maximumcondition, the use of sago starch reached 94 - 98 %, and biomassproduction at the end of fermentation process was 4.80 - 7.90 g[dry weight)/L medium.

JKTI, VOL. 4 - No.1, Juni, 1994

PENDAHULUANEnzim glukoamilase banyak digunakan dalam industri

makanan, terutama pada pembuatan sirup. Glukoamilaseadalah enzim yang menghidrolisa molckul pati menjadiglukosa dengan cara mcmutuskan ikatan glikosida -1,4 dariujung rantai non-pereduksi polimer pati. Glukoamilaseyang digunakan dalam bidang industri ini dihasilkan olehmikroorganisme dari golongan bakteri, ragi atau kapang.Jcnis kapang yang secara komersial digunakan untukproduksi glukoamilase umumnya dari genera Aspergillusdan Rhizopus (2). Bcberapa peneliti melaporkan bahwaspesies Rliizopus dan Aspergillus ini dapat menghasilkanbeberapa jenis glukoamilase (3, 4). Underkoflcr (5) danDavies (6), melaporkan bahwa enzim dari kapang Rhizopusoryzae merupakan salah satu enzim kapang yang sangatbaik untuk proses sakarifikasi. Produksi glukoamilase darikapang sangat dipengaruhi oleh faktor-faktor seperti kom-posisi medium, suhu, pH medium, tingkat acrasi dan waktuinkubasi. Untuk produksi enzim ini dipcrlukan mediumyang mengandung sumber karbon, nitrogen dan mineral(6). Riyanto (1), melaporkan bahwa tcpung sagu ataucampuran tepung sagu dengan "soluble starch" dapatdigunakan scbagai sumber karbon untuk produksi glu-koamilase oleb R. oryzae. Sclain itu juga dilaporkan me-ngenai penggunaan tepung bungkil kedc1e scbesar 0,5 %(kandungan nitrogen dalam medium 0,05 %) menghasilkanglukoamilase terbaik (1). Pcngaruh pH awal mediumtcrhadap produksi glukoamilase R. oryzae tclah dilaporkano1eb Prahastoeti (7). Diketabui bahwa produksi glu-koamilase optimum dipcrolch pada pH awal medium 4,5.

Pcnelitian yang dilaporkan disini bertujuan mencarikondisi agitasi yang paling baik untuk mendapatkan glu-koamilase dalam jumlah yang maksimal dan beraktifitastinggi dcngan menggunakan R. oryzae di dalam mediumIcrmcntasi yang mcngandung tcpung sagu pada skalafcrmcntor 21itcr dan 4litcr.

BAHAN DAN METODARliizopus oryzae L16 dipcrolch dari Laboratorium

Mikrobiologi ITB. Pati sagu dari jcnis metroxylon danbungkil kedclc, kcduanya, dipcroleh dipasaran dilokasiBandung.

19

Media fmnentasi yang digunakan untuk produksiglukoamilase mengandung (gIl) tepung sagu 20; tepungbungkil kedele 7,07; malt ekstrak 3% 30 (ml); KH2P04 1;MgS04. ?H20 0,5; KCI 0,05; FeS04' ?H20 0,01. pH;medium diatur sehingga mencapai 4,5. Media setelahdisterilisasi, diinokulasi dengan 2% (v/v) larutan suspensispora biakan murni R. oryzae yang berumur 7 (tujuh) hari(mengandung 106 spora/ml). Fermentasi dilakukan padasuhu 30 ± 1°C, aerasi 4,5 - 6 L/menit (1 vvm). Agitasidilakukan dengan menggunakan Corning Hot Plate Stirrerskala-6 (± 300 rpm). Volume fermentasi yang digunakanyaitu: 600 ml, 800 mI dan 1500 mI. Fermentor yangdigunakan berkapasitas 2L, dengan diameter 15 em. Per-cobaan pada skala fermentor 4L dilakukan pada kondisiyang sarna dengan percobaan pada skala 2L, hanya di-lakukan variasi agitasi 300 - 700 rpm, dan volume kerjafermentasi 4000 mI. Fermentor yang digunakan (LKB)mempunyai diameter 16 em, dengan lebar pengaduk 1,5em. Pengamatan dilakukan terbadap perubaban pH mediumselama fermentasi berlangsung, aktifitas glukoamilase yangdihasilkan, pati tersisa dalam medium fermentasi dan bio-masa pada akhir fermentasi.

Aktifitas glukoamilase ditentukan dengan menggunakanmetoda Ueda (3) yang telab dimodifikasi. Unit aktifitasditentukan sete1ab membandingkan dengan glukoamilasestandar (SIGMA). Unit aktifitas dinyatakan dalam unit/mlsupernatan, yaitu banyaknya enzim yang dapat melepaskan1 mg glukosa dari substrat pati-larut dalam waktu 10 menitpada pH 4,5 dan suhu 55°C. Kandungan protein enzimditentukan dengan metoda Lowry (8). Pati tersisa dalammedium ditentukan berdasarkan metoda Nelsen-Somogyisetelab dibidrolisa dengan asam (9). Pengukuran biomasadilakukan secara gravimetri setelah pencucian dengan airdan pengeringan pada 70°C (10).

HASIL DAN DISKUSIDari hasil pengamatan perubaban pH medium selama

proses fermentasi berlangsung, seperti yang diperlibatkanGambar 1 dan Gambar 2, dapat dilihat babwa pH mediummeningkat terus, dimulai bari ke-3 fermentasi. Dari skalafermentasi 600 ml, terlihat bahwa pH medium naikmencapai pH 3,49 setelah hari ke-5 fermentasi, Hal yangsama juga didapatkan untuk skala fennentasi 800 ml dan1500 ml yang diamati selama 10 bari. Pada keadaan inidapat dilibat babwa untuk skala fennentasi 800 ml, pHmedium naik mencapai pH 5,67 setelah sepuluh hari,bahkan untuk skala fennentasi 1500 mI pH medium dapatmeucapai 7,70. Pola yang sama tcrhadap perubahan· pHmedium juga tcramati untuk skala 4000 ml, terutama prosesfermentasi yang dilakukan dengan kecepatan agitasi 300rpm dan 500 rpm (Gambar 2). Untuk proses fermentasidengan kecepatan agitasi 700 rpm, pH medium sckitar 7,0sudah dicapai pada hari ke-S, Perubahan pH medium initergantung pada aktifitas metabolisme kapang. pH mediummemperlihatkan penurunan pada hari pcrtama inkubasi,

20

kemudian menunjukkan peningkatan terus mula; bari ke-3.Hal ini disebabkan karena basil utama metabo1isme kapangtahap awal pertumbuhannya adalab senyawa-senyawa asam(7). Akumulasi asam-asam ini dalam medium menyebab-kan pH medium turun. Selanjutnya asam-asam ini diguna-kan oleh kapang untuk keperluan pertumbuhannya se-hingga pH medium meningkat kembali. Dengan semakintinggi agitasi, pertumbuban kapang akan semakin cepatHal ini akan mengakibatkan peningkatan pH mediumsemakin cepat dicapai.

10r------------------------------------.

8

2 8 12106

WAKTU FERMENTASI (HAR I)

Gambar 1. Perubahan pH medium selama proses fermentasi olch R.oryzae L16 pada skala fermentasi 600 ml (0) 800 ml (_).1500ml(e).

-9.-------------------------------------,

<izsw~I0. 5

2 64 8 10 12WAKTU FERMENTASI (HARI)

Gambar 2. Perubahan pH medium selama proses fermentasi oleh R.oryzae L16 pada skala fermentasi 4000 ml dengan kecepatanagitasi 300 rpm ( _). 500 rpm (e). 700 rpm (0).

Aktifitas glukoamilase yang dihasilkan dapat dilihatdalam Gambar 3 sampai Gambar 6. Terlihat bahwa aktifitasglukoamilase meningkat dengan bertambahnya waktu inku-basi. Untuk skala Iermentasi 600 mI, aktifitas gIukoamiIasepada hari ke-5 baru mencapai 0,4102 U/mI (0,5583 U/mgprotein). Tetapi untuk skala 800 mI dan 1500 mI, aktifitasenzim masih terus meningkat, dan mencapai maksimumsetclah hari ke-S, yaitu masing-masing sebesar 1,1945 V/mIatau 0,8460 Uzmg protein dan 2, 3927 U/mI atau 1,5014Uzmg protein (Gambar 3 dan Gambar 5).

JKTI, VOL. 4 - No.1, Junl, 1994

3

E<,::>

2UJ~...J~~d0-:~

00 2 4 6 8 10 12

WAKTU FERMENTASI (HARI)

Gambar 3. Aktifitas glukoamilase hasil fermentasi R. oryzae L16 padaskala fermentasi 600 ml (D). 800 ml (.). 1500 ml (e).

4~----------------------------------~

E.•..•::>

WAKTU FERMENTASI (HARI)

Gambar 4. Aktifitas glukoamilase hasil fermentasi R. oryzae L16 padaskala fermentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 rpm(.).500 rpm (e). 700 rpm (0).

Aktifitas spesifik enzim maksimum basil fennentasi4000 mI, yaitu 2,58 U/ mg. protein, dicapai setelah bari ke-8inkubasi dengan kecepatan agitasi 300 rpm (Gambar 4 danGambar 6). Dengan menaikkan kecepatan agitasi terlihatbahwa aktifitas spesifik enzim yang dihasilkan meningkat,dan waktu fennentasi untuk mendapatkan aktifitas mak-simum semakirr cepat dicapai. Proses fennentasi yangdilakukan dengan kecepatan agitasi 500 rpm dan 700 rpm,memberikan aktifitas spesifik glukoamilase masing-masingsebesar 3,47 dan 4,70 U/mg protein yang diperoleh pada 6dan 5 hari inkubasi. Hal ini disebabkan karena kontakantara mikroorganisme dengan nutrisi dalam medium se-makin baik dengan adanya agitasi yang tinggi. Umumnyamikroorganisme memerlukan aerasi yang baik untuk ke-cepatan pertumbuhannya. Agitasi yang besar yang dapatmemberikan aerasi yang baik akan mempercepat per-tumbuhan kapang, yang berarti dapat mempercepat prosesmetabolisme kapang tersebut, sehingga waktu fermentasiuntuk mendapatkan basil maksimum akan semakin cepatdicapai. Aktifitas giukoamiiase maksimum yang dibasilkandari percobaan ini ada disekitar pH 5,0. Bcrarti babwa

JKTI, VOL 4 - No.1, Junl, 1994

enzim yang dihasilkan secara maksimum, berkisar padanilai pH medium yang sarna seperti pH untuk aktifitasmaksimum enzim tersebut.

2 6 8 12104

WAKTU FERMENTASI (HARI)

Gambar 5. Aktifitas spesifik glukoamilase R. oryzae L16 pada skalafermentasi 600 ml (0). 800 ml (.). 1500 ml (e).

12

5

~ 4N~ffi .s 3..::.:--0u, •.._0-

~

IIIUJ'" 2o..EIll'.::>>- ~::.:4:

0Q 2 4 6 8 10 12

WAKTU FERMENTASI (HARI )

Gambar 6. Aktifitas spesifik glukoamilase R. oryzae L16 pada skalafermentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi 300 rpm (.).500 rpm (e). 700 rpm (0).

Semakin tinggi kecepatan agitasi, semakin ban yak bio-masa kapang yang terjadi. Hal ini dapat terlihat dari jumlahbiomasa yang dihasilkan (Tabel 1 dan 2). Untuk prosesfermentasi dengan kecepatan agitasi tertinggi (700 rpm)memberikan jumlah biomasa yang paling banyak (7,88gkering/L medium), sedangkan proses fermentasi dengankecepatan agitasi 300 rpm dan 500 rpm, masing-masingmenghasilkan biomasa sebesar 4,85g kering/L medium dan4,52g kering/L medium. Tetapi agitasi yang terlalu tinggijuga dapat menyebabkan lisisnya sel-sel kapang tersebut.Keadaan ini dapat dilihat dari aktifitas glikoamilase basilfermentasi dengan kecepatan agitasi 700 rpm (Gambar 6),yang sudab mulai menurun di bari ke-8, bahkan diakbirfennentasi aktifitas enzim tersebut hampir tidak ada.

21

Tabel 1. Produksi biomasa oleh R. oryzae pada skalafennentasi 600 - 1500 ml.

Volumefennentasi (ml)

Biomasa(g kering/L medium)

6008001500

3,403,463,51

Tabel2. Produksi biomasa oleh R. oryzae pada skalafennentasi 4000 ml dengan kecepatan agitasi300 - 700 rpm.

Kecepatan agitasi(rpm)

Biomasa(g kering/L medium)

300500700

4,524,857,88

Gambar 7 dan Gambar 8 memperlihatkan kandunganpati sisa dalam medium. Kandungan pati sisa ini untuksemua taraf perlakuan fennentasi terlihat semakin menurundengan semakin lamanya waktu inkubasi. Dari Gambar 7terlihat bahwa penurunan kandungan pati sisa dalammedium fennentasi skala 600 - 1500 ml berfluktuasi setelahhari ke-6 fennentasi. Hal ini disebabkan karena pada per-cobaan digunakan magnetic stirrer (sebagai agitator) yangputarannya tidak terlalu kencang sehingga kecepatan putar-an tidak merata keseluruh isi fermentor dan gumpalan yangterjadi tidak dapat hancur. Keadaan ini memungkinkansampe1 yang diambil kurang mewakili keseluruhan isi. DariGambar 7 dan 8, juga teramati bahwa dalam keadaanmaksimum pati sagu yang terpakai untuk pertimbuhankapang mencapai 94 - 98 %.

100

80~~ 60V>Vi0:wI- 40;:::~

20

2 4 6 8 10WAKTU FERMENTASI (HARI)

Gambar 7. Kandungan pati sisa dalam medium selarna proses ferrnentasiberlangsung olch R. oryzae L16. pada skala fermentasi 600OIl (D). 800 OIl (.). 1500 OIl (e).

22

~L

~V> 60Vi0:wI-

;::: 40~

20

2 86 10 12WAKTU FERMEN1ASI (HARI)

Gambar8. Kandungan pati sisa dalam medium selama proses fermentasiberlangsung oleh R. oryzae L16. pada skala fermentasi 4000ml dengan kecepatanagitasi 300 rpm (e). 500 rpm (.), 700rpm(G·

KESIMPULANDari percobaan ini diperoleh hasil sebagai berikut:

waktu inkubasi (fennentasi) yang diperlukan untuk men-dapatkan glukoamilase yang maksimum dengan skala 600-1500 ml adalah 8 hari. Aktifitas spesifik enzim yangdihasilkan berkisar antara 0,85 U/mg protein - 1,50 U/mgprotein. Fennentasi dengan skala 4000 ml, memperlihatkanbahwa dengan meningkatnya kecepatan agitasi, aktifitasspesifik enzim meningkat dan waktu fennentasi untukmendapatkan aktifitas enzim maksimum semakin cepatdicapai. Aktifitas spesifik glukoamilase sebesar 2,58; 3,74dan 4,71 Uzmg protein, masing-masing diperoleh setelahinkubasi selama 8, 6, 5 hari dengan kecepatan agitasi 300,500 dan 700 rpm. Dengan meningkatnya kecepatan agitasi,se1ain dapat meningkatkan aktifitas enzim, juga dapatmeningkatkan produksi biomasa. Biomasa yang dihasilkandiakhir fennentasi adalah 4,52 - 7,88 g kering/L mediumdengan kecepatan agitasi 300 - 700 rpm. Penggunaan patisagu dalam medium mencapai 94 - 98 %.

PUSTAKA1. S. Riyanto. Skripsi S1. Fakultas Pertanian, Universitas

Padjadjaran, Bandung (1986).

2. Linar Z. Udin dan A.T. Karossi. Penggunaan EnzimPemecah Pati di Indonesia. Buletin Limbali Pangan,Vol. V, April: 484-497 (1990).

3. S. Ueda, Fukuoda, T. Mitsue and B.C. Saba. Glu-coamylase Produced by Submerged Culture of A.oryzae. Starke. 31(9) : 307-314 (1979).

4. W.M. Fogarty. Microbial Enzyme and Biotechnology.W.M. Fogarty (Ed). Applied Science Publ., London(1983).

12

JKTI, VOL. 4 - No.1, Junl, 1994

5. L.A. Underkofler. Microbial Enzyme. Industrial Micro-biology. Brinton, M and W. Litsky (Ed). Mc.Graw HillBook Co. New York (1976).

6. R. Davies.Microbial Extracellular Enzymes. Their Roleand Some Factors Affecting Their Formation, Bio-chemistry of Industrial Microorganisms. Rainbow, C.and A.H. Rose (Ed). University of London Press Ltd.London (1963).

7. R.D. Prahastoeti. Skripsi Sl. Fakultas Pertanian, Uni-versitas Padjadjaran, Bandung (1989).

8. S.P. Colowick and H.O. Kaplan. Methods in Enzymo-logy.Vol. 3. Acad Press Inc. New York (1957).

9. N. Nelson. A Photometric Adaption of the SomogyiMethod for Determination of Glucose. J. Bioi. Chem.153 : 375-380 (1944).

10.A.T. Karossi, C. Tjahjadi, R. Dyah and Linar Z. Udin.Food Science and Technology in Industrial Develop-ment. Proceedings Food Conference'88. Bangkok,Thailand, 24-26 October 1988 : 396-398.

Proceedings dan maj alah berikut ini dapat dipesan padaRosidin d/a HKI, Puslitbang Kimia Terapan-LIPI

DAFTAR HARGA PROCEEDINGS/MAJALAH DI UNION SHOP HKI

NO. NAMA HARGAJUAL

1. Proceedings of the ASEAN-EC workshop on the scale up, cost evaluation andtechnology transfer of biotechnological processes. Rp 12.500,-

2. Proceedings on the first ASEAN workshop on biochemical engineering Rp 12.500,-

3. Proceedings lokakarya pertama evaluasi biologi kimia dan fisika limbahlignosellulosa Rp 7.500,-

4. Proceedings of the first ASEAN workshop on the technology of animal feedproduction utilising foodwaste materials................................................................ Rp 7.500,-

5. Invited papers presented at the first ASEAN workshop on the technology ofanimal feed production utilising foodwaste materials Rp 7.500,-

6. Proceedings of the second ASEAN workshop on the technology of animal feedproduction utilising foodwaste materials................................................................ Rp 12.500,-

7. ASEAN bibliography on fermentation technology Rp 7.500,-

8. Biogasification of various organic residues in the ASEAN region Rp 5.000,-

9. Proceedings of the first ASEAN seminar workshop on biogas technology(+ supplementary information) .

10. Buletin Limbah Pangan .

Rp 12.500,-

Rp 1.500,-

Rp 7.500,-

Rp 7.500,-

Rp 3.500,-

Rp 2.000,-

11. Proceedings of the First ASEAN workshop on solid substrate fermentation .

12. Proceedings of the second ASEAN workshop on food analytical techniques .

13. Jumal Kimia Terapan 1991-1992 .

14. Warta Kimia Analitik .

JKTI, VOL. 4 - No.1, Junl, 1994 23