Produksi, Pemurnian, dan KarakterisasiPektinase dari Bacillus sp. DT17

1)Fhani Meliana1206212413, Teknologi Bioproses

ABSTRAKPektinase atau dikenal sebagai poligalatrunase adalah suatu enzim yang memiliki kemampuan untuk memecah dan mentransformasi pektin. Pektin adalah zat yang menstabilisasi dinding sel pada sel tanaman. Beberapa buah membentuk pektin selama periode pembuahan. Dalam produksi pektin secara ekstraseluler, ditemukan bakteri Bacillus sp. DT 17 dapat memproduksi pektin dan telah dikarakteristik sebagai pektin liase (EC.4.2.2.10).

Keyword: presipitasi, SDS – Page, pektinase, purifikasi, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography

Deksripsi PektinasePektinase digunakan untuk mengkatalis degradasi polimer pektin yang terdapat pada dinding sel tanaman (Fogarty & Kelly, 1982). Pektinase diproduksi oleh beberapa organisme seperti bakteri (Hirokoshi, 1972; Karbassi & Vaughn 1980), jamur (Aguilar & Huitron 1990) dan kapang (Gainvors & Belarbi 1993). Pada produksi pektinase, isolat yang digunakan adalah isolat tanah dan mengisolasi Bacillus mesofilik yang memproduksi alkalofilik dan pektinase termotoleran. Melalui optimasi kondisi pertumbuhan, Bacillus sp. DT 17 dapat memproduksi jumlah pektin liase lebih tinggi (53 unit/ml) dibandingkan dengan literatur yang lain. Menggunakan gel filtration dan ion exchange cromatography, enzim pektin dipurifikasi dan ditemukan massa molekulnya yaitu 106 kDa. Enzim pektinase yang telah dimurnikan menunjukkan aktivitas maksimal pada suhu 600C dan pH 8.0. Keberadaan konsentrasi 100 mM CaCl2 dan mercaptoethanol secara signifikan meningkatkan aktivitas

enzim yang telah dimurnikan. Pektinase memiliki lahan aplikasi yang luas pada industri tekstil, penanganan limbah buah. Enzim ini dimurnikan sehingga homogen dan berpotensi untuk digunakan pada level komersial.Proses PemunianPada proses pemurnian secara umum, tahapan yang harus dilalui adalah Recovery, Isolation, Purification, dan Polishing. Pada pemurnian pektinase, Bacillus sp.DT7 diisolasi pada isolat tanah kemudian masuk ke tahap purifikasi. Pektinase dari Bacillus sp DT7 dimurnikan pada 1 liter YEP culture broth (kondisi pertumbuhan 370C dalam 17 jam). Kemudian disaturasi menggunakan (NH4)SO4 kemudian dibagi dua yaitu saturasi 0-40% dan 40-100%.

PresipitasiPresipitat dilarutkan pada jumlah minimum buffer Tris – HCl (0.01 M, pH 7.5) dan didialisis pada buffer yang sama. Metode untuk membuat protein terpresipitasi dengan mengubah sifat pelarut sehinga

mempengaruhi kelarutan protein. Presipitat protein merupakan molekul-molekul protein yang teragregasi cukup besar untuk dapat terlihat.

Gambar 1. Presipitasi Protein(Sumber: Kashyap, 2000)

Ion Exchange Chromatography

Anion Exchanger, DEAE Sephacel disusun menjadi kolom kaca, dan kolom disetimbangkan dengan buffer Tris – HCl (10 mM, pH 7.5) dan dimasukkan sample sebanyak 3 ml. Kolom dicuci dengan buffer Tris - HCl yang berisi NaCl berbagai konsentrasi 0, 50, 100, dan 150 mM. Kemudian fraksi diambil pada volume 2,5 ml lalu fraksi protein diukur melalui spektrofotometri pada 280 nm dan aktivitas pectinase diuji.

Gambar 2. Purifikasi pektinase menggunakan ion – exchange

chromatography(Sumber: Kashyap, 2000)

Gel Filtration ChromatographyKolom kaca disusun dengan Sephadex G 150 (35 x 1,5 cm, volume bed 60 ml). Sample dimasukkan pada kolom ini dan elusi protein dilakukan dengan buffer Tris – HCl (10 mM, pH 7,5). Setelah volume kekosongan (20 ml), diambIil fraksi 1,5 ml. Absorbansi sample protein dan aktivitas pektinase diteliti menggunakan metode yang telah dijelaskan.

Pemurnian Pektinase

Pektinase dari Bacillus sp. DT7 dimurnikan menjadi homogen melalui beberapa langkah. Pertama dimurnikan secara parsial dengan penambahan padatan ammonium sulfat ke supernatant. Kemudian dilakukan salting, kemudian aktivitas pektinase ditemukan pada fraksi saturasi garam 40 – 100%. Selanjutnya protein dielusi dengan NaCl bergradien 0 – 2 M. Kebanyakan protein memiliki 2 peak besar namun pektinase dideteksi hanya pada fraksi pertama. Menggunakan DEAE – Sephacel cromatography pemurnian 67,2 lipatan dari enzim telah dicapai dan aktivitas spesifiknya menjadi 730 U/mg. Kemudian konsentrasi diolah lebih lanjut dan protein dielusi dengan buffer Tris – HCl pH 7,5. Aktivitas pektibase dideteksi pada fraksi 21 – 30, fraksi ini disatukan, dikonsentrasikan dan didialisis terhadap 0.01 M buffer Tris – HCl. Fase purifikasi ini mengahasilkan pemurnian 131.8 lipatan pektinase dan aktivitas spesifiknya menjadi meningkat mencapai 1433 U/mg protein.

Gambar 3. Profil elusi protein dan aktivitas pektinase pada Sephandex

G150.(Sumber: Kashyap, 2000)

SDS PageDeteksi aktivitas pektinase pada fraksi 21 – 30 menghasilkan bahwa enzim ini memiliki berat molekul yang tinggi. Ketika pektinase yang telah dimurnikan menggunakan elektroforesis 10% SDS Page, pita tunggal diamati dan mengindikasikan pemurnian protein telah selesai. Menggunakan protein standard, ukuran enzim yang telah dimurnikan berada pada kisaran 106 kDa atau lebih tinggi dari pektinase dari Fusarium oxysporium (58 kDa), Penicillium frequentans (20 kDa) dan Bacillus stearothermophillus (24 kDa) (Karbassi & Vaughn 1980).

Gambar 4. SDS Page dari pektinase pada 10% gel, 50 V.

Jalur 1: berat molekul protein standard, jalur 2: ammonium sulfat

mempresipitasi protein, jalur 3: DEAE-Sephacel mengelusi, dan jalur

4L Sephadex G150(Sumber: Kashyap, 2000)

REFERENSID. R. Kashyap, S. Chandra, A. Kaul and R. Tewari. 2000. Production, purification, and charaterization of pectinase from Bacillus sp. DT7. India. Departement of Microbiology, Panjab University, India.