Programa de Posgrado en Ciencias en Acuicultura · 2016-10-21 · ii Resumen de la tesis que presenta Candy Elizabeth Armuelles Bernal como requisito parcial para la obtención del

Centro de Investigación Científica y de Educación

Superior de Ensenada, Baja California

Programa de Posgrado en Ciencias

en Acuicultura

Efecto del ajo (Allium sativum) adicionado a la dieta del jurel

(Seriola lalandi) para el tratamiento preventivo contra

infestaciones de Zeuxapta seriolae (Meserve, 1938) Price,

1962

Tesis

para cubrir parcialmente los requisitos necesarios para obtener el grado de

Maestro en Ciencias

Presenta:

Candy Elizabeth Armuelles Bernal

Ensenada, Baja California, México

2016

Tesis defendida por

Candy Elizabeth Armuelles Bernal

y aprobada por el siguiente Comité

Dra. Mónica Hernández Rodríguez Codirectora de Tesis

Dr. Benjamín Barón Sevilla Codirector de Tesis

Dr. Benjamín Barón Sevilla Coordinador del Posgrado en Acuicultura

Dra. Rufina Hernández Martínez Directora de Estudios de Posgrado

Candy Elizabeth Armuelles Bernal © 2016 Queda prohibida la reproducción parcial o total de esta obra sin el permiso formal y explícito del autor

Dr. Miguel Ángel del Río Portilla

Dra. Ma. Elena Solana Arellano

ii

Resumen de la tesis que presenta Candy Elizabeth Armuelles Bernal como requisito

parcial para la obtención del grado de Maestro en Ciencias en Acuicultura.

Efecto del ajo (Allium sativum) adicionado a la dieta del jurel (Seriola lalandi) para el tratamiento preventivo contra infestaciones de Zeuxapta seriolae (Meserve,

1938) Price, 1962

Resumen aprobado por:

________________________________ ________________________________ Dra. Mónica Hernández Rodríguez Dr. Benjamín Barón Sevilla Codirectora de Tesis Codirector de Tesis El jurel (Seriola lalandi) es un organismo de alto valor comercial y bajo condiciones de cultivo, el sector acuícola ha tenido que controlar la presencia de parásitos como Zeuxapta seriolae. Este monogéneo se adhiere a las branquias del jurel y se alimenta de sangre, por lo que causa alteraciones en los parámetros sanguíneos y una disfunción en la transferencia de gases, situación que los hace susceptibles a otros parásitos o incluso les ocasiona la muerte. El control de parásitos se realiza con tratamiento farmacológico, sin embargo, existen restricciones de uso en animales de consumo humano, por lo que se ha estado evaluando el potencial de los productos derivados de plantas como tratamientos alternativos en la acuicultura, como el ajo (Allium sativum). Por lo anterior, en el presente estudio se evaluó el efecto antiparasitario de la adición del polvo de ajo al 0, 2 y 4% en la dieta del jurel cultivado en sistemas de recirculación; cada tratamiento tuvo tres repeticiones con un total de 180 organismos. Después de 32 días de administrar el alimento con ajo, se realizó la infestación experimental con Z. seriolae. Para evaluar el efecto antiparasitario, se analizó la intensidad media y prevalencia del parásito, las variables productivas y la hematología y química sanguínea como indicadores de una parte de la respuesta fisiológica del jurel al ajo y a la infestación parasitaria. El polvo de ajo, con 2.79% de alicina, no afectó la palatabilidad del alimento, ya que se observó un incremento en el consumo a medida que aumentó la dosis de ajo en el alimento (7.83 ± 2.31 g/pez con 0%, 8.52 ± 1.44 g/pez con 2% y de 9.20 ± 1.98 g/pez con 4%, p<0.0001). Z. seriolae no mostró una disminución significativa en la prevalencia (100% con el 2% y 93.33 ± 11.55% con el 4%) y la intensidad media (89.71 ± 68.19 con el 2% y 52.47 ± 48.84 parásitos/pez con el 4%) con el polvo de ajo, sin embargo, se evidenció una tendencia a la disminución. El índice de condición mostró variación debido a la infestación parasitaria (dosis baja de 2.04 ± 0.20, p=0.005 y dosis alta de 2.02 ± 0.13, p=0.003) y el índice hepatosomático fue menor con el 2% de ajo al día 32 (1.15 ± 0.18%, p=0.02) y con el 4% al día 61 (1.06 ± 0.13%, p=0.049). En los peces que recibieron la dieta con el 4% de polvo de ajo, se observó que disminuyeron la concentración total de eritrocitos (8.50 ± 0.76 cel x 106/mm3), el hematocrito (53.1 ± 3.49%), los leucocitos totales (5.35 ± 1.33 cel x 103 mm3), neutrófilos (496.60 ± 341.45 cel/µl), linfocitos (2816.76 ± 941.20 cel/µl), trombocitos (1130.54 ± 623.41 cel/µl), monocitos (186.98 ± 134.65 cel/µl con el 2% y 259.24 ± 17.71 con el 4%), proteínas totales (59.80 ± 3.88 mg/ml con el 2%) y las globulinas (48.07 ± 3.03 mg/ml con el 2%). Se registró un incremento en los eosinófilos con el 4% de ajo (614.68 ± 521.75 cel/µl), en los basófilos (64.35 ± 61.83 cel/µl con el

iii

2%) y la albúmina (10.71 ± 1.72 mg/ml con el 2%). Posterior a la infestación, en los organismos que consumieron la dieta con el 4% de ajo, se registró que disminuyeron los eritrocitos totales (7.06 ± 1.08 cel x 106/mm3), el hematocrito (47.69 ± 5.45% y 51.72% ± 5.72 con el 2 y 4%, respectivamente), los leucocitos totales (6.88 ± 1.67 cel x 103 mm3), los linfocitos (3452.78 ± 771.72 cel/µl) y trombocitos (1213.7 ± 805.11 cel/µl); mientras que se observó el incremento en los eosinófilos (2280.26 ± 2120.11 con el 2%), basófilos (70.66 ± 89.33 cel/µl), albúmina (13.28 ± 2.19 mg/ml) y globulinas (52.93 ± 5.78 mg/ml con el 2%). En este trabajo se enmarcaron los intervalos de referencia de la hematología y química sanguínea del jurel, además la adición del 4% de polvo de ajo en la dieta tuvo un efecto favorable en la preparación del organismo para su defensa ante infestaciones parasitarias con Z. seriolae.

Palabras clave: Seriola lalandi, monogéneo, Zeuxapta seriolae, ajo, índices biológicos, hematología, química sanguínea.

iv

Abstract of the thesis presented by Candy Elizabeth Armuelles Bernal as a partial

requirement to obtain the Master of Science degree in Aquaculture.

Effect of the garlic (Allium sativum) added to the yellowtail jack (Seriola lalandi) diet for the preventive treatment against infestations with Zeuxapta seriolae

(Meserve, 1938) Price, 1962

Abstract approved by:

________________________________ ________________________________ Dra. Mónica Hernández Rodríguez Dr. Benjamín Barón Sevilla Co-Director Thesis Co-Director Thesis The yellowtail jack (Seriola lalandi) is an organism of high commercial value, and in culture conditions, aquaculture producers have had to control the infection of parasites as Zeuxapta seriolae. This monogenean parasite attaches to the yellowtail’s gills and feeds with blood, causing alterations in blood parameters and dysfunctions in the gas transference, which make them susceptible to other parasites or even lead to death. Control of parasites is performed with pharmacological treatment, however, there are restrictions of use in animals for human consumption, so it has been evaluated the potential of plant-derived, such as garlic, as alternative treatments in aquaculture. Therefore, in this study the antiparasitic effect of the addition of garlic powder at 0, 2 and 4% in the diet of yellowtail cultured in recirculating systems was evaluated; each treatment had three repetitions (N=180 organisms). Thirty two days after supplying food with garlic to the fish, the experimental infestation with Z. seriolae was performed. To evaluate the antiparasitic effect of garlic, the mean intensity and prevalence of the parasite, the production variables, and hematology and blood chemistry of yellowtail were analyzed. The garlic powder, with 2.79% of allicin, did not affect the palatability of food, since an increase was observed in consumption according to the increased dose of garlic in food (7.83 ± 2.31 g/fish with 0%, 8.52 ± 1.44 g/fish with 2% y 9.20 ± 1.98 g/fish with 4%, p<0.0001). The prevalence and mean intensity of Z. seriolae did not show a significant decrease with 2 or 4% of garlic powder, however, it tends to decrease (100% and 89.71 ± 68.19 with 2%, and 93.33 ± 11.55% and 52.47 ± 48.84 parasites/fish with 4%). The condition factor fluctuated due to parasitic infestation (low dose 2.04 ± 0.20, p=0.005 and high dose 2.02 ± 0.13, p=0.003) and hepatosomatic index was lower with 2% of garlic at day 32 (1.15 ± 0.18%, p=0.02) and 4% at day 61 (1.06 ± 0.13%, p=0.049). Fishes that received 4% garlic powder in diet, showed a decrease in red blood cells concentration (8.50 ± 0.76 cel x 106/mm3), hematocrit (53.1 ± 3.49%), total leukocytes (5.35 ± 1.33 cel x 103/mm3), neutrophils (496.60 ± 341.45 cel/µl), lymphocytes (2816.76 ± 941.20 cel/µl), thrombocytes (1130.54 ± 623.41 cel/µl), monocytes (186.98 ± 134.65 cel/µl with 2% and 259.24 ± 17.71 with 4%), total proteins (59.80 ± 3.88 mg/ml con el 2%) and globulins (48.07 ± 3.03 mg/ml with 2%). Eosinophil concentration increase with 4% of garlic (614.68 ± 521.75 cel/µl), as well as the basophils (64.35 ± 61.83 cel/µl with 2%) and albumin (10.71 ± 1.72 mg/ml with 2%). After infestation, the organisms that consumed 4% garlic in diet, decreased the concentration of total erythrocytes (7.06 ± 1.08 cel x 106/mm3), hematocrit (47.69 ± 5.45% and 51.72% ± 5.72 with 2 and 4%, respectively), total

v

leukocytes (6.88 ± 1.67 cel x 103/mm3), lymphocytes (3452.78 ± 771.72 cel/µl) and thrombocytes (1213.7 ± 805.11 cel/µl); while there was an increase in eosinophils (2280.26 ± 2120.11 with 2%), basophils (70.66 ± 89.33 cel/µl), albumin (13.28 ± 2.19 mg/ml) and globulins (52.93 ± 5.78 mg/ml with 2%). In this work the normal ranges of hematology and blood chemistry of yellowtail were established, moreover the 4% addition of garlic powder in food had a benign effect in the fish defenses against parasite infestations.

Keywords: Seriola lalandi, monogenean, Zeuxapta seriolae, garlic, biological

indices, hematology, blood chemistry.

vi

Dedicatoria

A mi madre, padre, Marce y Gracy. Por ser el mejor apoyo en cada

uno de mis proyectos, por comprender que todo logro lleva consigo

un sacrificio y ese es estar lejos de ustedes y de mi querido

Panamá.

vii

Agradecimientos

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT), por el apoyo económico

otorgado durante mis estudios de Maestría.

Al Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de Ensenada (CICESE),

por darme la oportunidad de realizar mi estudios de posgrado en el Departamento de

Acuicultura.

A mis directores de tesis, la Dra. Mónica Hernández y el Dr. Benjamín Barón Sevilla

Rodríguez, muchas gracias por compartir su conocimiento y experiencia, y por brindarme

su gentil apoyo durante el desarrollo de mi tesis.

A mis sinodales, el Dr. Miguel Ángel del Río Portilla y la Dra. Elena Solana Arellano, por

sus valiosos aportes que fueron útiles para el desarrollo de este trabajo.

Al personal docente del Departamento de Acuicultura de CICESE: Dra. Beatriz Cordero,

Dr. Manuel Segovia, Dr. Juan Pablo Lazo, Dr. Eugenio Díaz, Dra. Carmen Paniagua, Dr.

Jorge Cáceres, Dra. Fabiola Lafarga, Dra. M. del Pilar Sánchez y Dra. Claudia Farfán,

por sus aportes en mi formación académica.

A la empresa Ocean Baja Labs, S. A. de C. V., por la donación de los jureles que se

utilizaron en este experimento.

Al Dr. Oscar del Río Zaragoza, por su orientación y consejos en el camino de la

fisiopatología.

Al Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

Unidad Saltillo por permitirme realizar una estancia académica que generó información

importante para mi tesis. A la Dra. María de Lourdes Díaz Jiménez del Laboratorio de

Revaloración de Residuos (LARR), por sus atenciones, por compartir conmigo sus

conocimientos y tiempo durante el tiempo de estancia. A Marlene, por abrirme las puertas

de su hogar y su apoyo en todo momento. A los compañeros del LARR: Marlene, Mary,

Edith, Eluzai y Omar, por su ayuda en el desarrollo de mis evaluaciones y hacer tan

amena la jornada de trabajo.

viii

A mis compañeros de generación: Ana Lucía Suárez, Luis Fernando Meza, Romy

Martínez, Sara Enciso, Denisse Chávez, Stefanny Córdova, Constanza del Mar Ochoa,

Luis Humberto Madero, Celia Carolina Romero, Miriam Bautista y Yessica Hernández,

por su ayuda y por los gratos momentos compartidos, se les va a extrañar.

Al personal técnico, en especial Uvinai Salgado por su colaboración en el mantenimiento

de los organismos previo a la fase experimental, M. en C. Yanet Guerrero por la

realización de cortes histológicos de las branquias de jurel, Luis Murillo y Jesús Mariscal

por su ayuda en la instalación y funcionamiento del sistema de cultivo y M. en C. Abelardo

Campos por su colaboración en el análisis por espectrofotometría de muestras. Al

personal administrativo, de seguridad y personal de aseo.

A mi familia, mamá, papá, Marce, Gracy, abuela, tías/tíos, primos/primas, aun en la

distancia siempre los sentí cerca, gracias por su apoyo constante.

A Salvador, por estar ahí siempre para mí, por su colaboración en los momentos que

necesitaba otras manos y ser mi apoyo en los momentos que sentía no poder lograrlo.

Al Dr. Jorge Cuéllar-Ánjel, por introducirme a la acuicultura y continuar siendo una guía,

no fueron en vano cada uno de sus consejos.

A Ensenada, por recibir a esta Centroamericana de la forma más amable y hacer mi

estadía muy agradable.

ix

Tabla de contenido

Página Resumen español...…………………………………...……...…………….. ii Resumen inglés…………………………………………………...…………. iv Dedicatorias………………………………………………………..………… vi Agradecimientos…………………………………………………..……….... vii Lista de figuras…………………………………………………….…..…..… xi Lista de tablas………………….…………………………………….………. xiii Capítulo 1. Introducción 1.1 Generalidades de la Acuicultura…………….…..…………………. 1 1.2 Generalidades del Jurel……………………………………………. 2 1.3 Generalidades de Zeuxapta seriolae……………………………... 4 1.4 El ajo (Allium sativum) y su uso terapéutico……………………… 8 1.5 Índices de crecimiento……………………………………………… 11 1.6 Hematología y química sanguínea………….………………..…… 12 Capítulo 2. Justificación……………………………………………………. 18 Capítulo 3. Hipótesis………………………………………………………… 20 Capítulo 4. Objetivos 4.1 Objetivo general……….………………………………….………… 21 4.2 Objetivos específicos……………………..………………………… 21 Capítulo 5. Materiales y métodos 5.1 Cultivo de organismos….………………..…….…………...... 22 5.2 Diseño experimental………………….……………..……...... 23 5.3 Preparación del polvo de ajo……………..………..………… 23 5.4 Preparación del extracto de ajo……………………………... 24 5.5 Cuantificación de la alicina del polvo y el extracto de ajo… 24 5.6 Cuantificación de alicina lixiviada del alimento para peces

mezclado con polvo de ajo………………….……………..... 25 5.7 Preparación de la dieta y estrategia de alimentación……… 25 5.8 Infestación experimental…………………………..…………. 26 5.9 Prevalencia e intensidad parasitaria………………..………. 27 5.10 Índices biológicos……………………..………………………. 28 5.10.1 Índice de condición de Fulton….…………………………….. 28 5.10.2 Índice hepatosomático……………………...……………...… 28 5.11 Consumo de alimento y Factor de conversión alimenticia… 29 5.12 Análisis de muestras de sangre………………...…………… 29 5.12.1 Hematocrito………………………………………………........ 30 5.12.2 Recuento de eritrocitos y leucocitos………………..………. 30 5.12.3 Análisis diferencial de leucocitos……….…………….….….. 31 5.12.4 Bioquímica sérica…...………………………………………… 32 5.12.4.4 Proteínas totales……...………………………………………. 32 5.12.4.2 Albúmina…………………………………………………….. 33

x

5.12.4.3 Globulinas…...………………………………………………… 33 5.11 Análisis estadístico…………...……………………….……… 33 Capítulo 6. Resultados 6.1 Concentración y lixiviación de alicina……………………..… 35 6.2 Calidad del agua……………………….……………………… 37 6.3 Variables productivas….……………….……………….…..... 38 6.4 Prevalencia e intensidad parasitaria media…….………….. 41 6.5 Análisis de componentes sanguíneos………….…………… 43 6.5.1 Parámetros hematológicos………….……………………….. 43 6.5.2 Química sanguínea………..……………………………….…. 47 6.5.3 Interpretación clínica de resultados de hematología y química sanguínea del jurel………………………………….. 48 Capítulo 7. Discusión……..…………………………………..…..……...… 55

Capítulo 8. Conclusiones…………………………………………………... 72 Capítulo 9. Recomendaciones…………………………………………….. 73 Lista de referencias bibliográficas………….…...................................... 74 Anexos

Anexo 1. Preparación de reactivos para análisis de alicina en ajo.... 87 Anexo 2. Cuantificación de alicina……………………………………… 87

xi

Lista de figuras

Figura Página

1 Abastecimiento mundial de carne y pescado……………………………. 1

2 Morfología de Seriola lalandi……………………………………………… 3

3 Morfología de Z. seriolae: a) Ventosa, b) Opistohaptor y c) Extremidad anterior mostrando poro genital y vagina……..……..……………………

5

4 Ciclo de vida de la Zeuxapta seriolae.………………………………….… 7

5 Formación de compuestos organosulfurados…………………………… 10

6 Eritrocitos de jurel.………………………………………………………….. 13

7 Leucocitos de Acipenser transmontanus (a) Eosinófilos; (b) punta de flecha: trombocito, flechas: linfocitos; (c) flecha superior: neutrófilo, flecha inferior: monocito..…………………………………………..………

15

8 a) Alimento con polvo de ajo en agua de mar, b) Agua de mar después del tiempo de lixiviación, b) Lixiviado mezclado con el estándar interno…………………………………………..……………………………

25

9 Preparación de la dieta con ajo: (a) Homogenización de polvo de ajo y aceite, (b) Mezcla de homogenizado con el alimento, (c) Alimento mezclado con polvo de ajo………………………...………….……………

26

10 Implantación de marca electrónica en peces parasitados…….…..…... 27

11 Evaluación de branquias del jurel para la cuantificación de parásitos..………………………………………………………….……….. 27

12 Cámara del hematocitómetro: cuadrantes para el recuento de leucocitos (azul) y eritrocitos (rojo)…..…………………………………… 31

13 Concentración de alicina (%) en el extracto de ajo….….……………….. 35

14 Concentración de alicina (%) en el polvo de ajo……..………………….. 36

15 Lixiviación de alicina en el alimento suplementado con la dosis baja (2%) y alta (4%) de polvo de ajo.………………………………………….. 37

16 Evaluación del consumo de alimento del jurel (S. lalandi), suplementado por 61 días con el 0, 2 y 4% de polvo de ajo (grupo control, dosis baja y alta, respectivamente) y expuesto a Z. seriolae por los últimos 29 días de experimento...………….……………….…….. 40

xii

17 Zeuxapta seriolae adherida a un filamento branquial de jurel Seriola lalandi……………………………………………………………………….. 41

18 (a) Dinoflagelados en branquias de jurel Seriola lalandi (2X), (b) Mucus de branquia de jurel infestado con dinoflagelados…..………….. 42

19 Glóbulos blancos del jurel (Seriola lalandi) señalados con flechas: a) Neutrófilo, b) Eosinófilo, c) Basófilo, d) Linfocito, e) Trombocito y f) Monocito…………………………………………………………………….. 43

20 Dispersión de la concentración de eosinófilos en el jurel (Seriola lalandi) para establecer los valores de referencia…….………………... 49

21 Cromatograma de alicina sintética……………………………………….. 88

22 Cromatograma del polvo de ajo con el valor de cada uno de los picos... 89

xiii

Lista de tablas

Tabla Página

1 Causas de alteraciones en los parámetros hematológicos de

los peces………………………………………………………….…. 16

2 Valores promedio de las variables relacionadas con la calidad del agua de las unidades de cultivo de jurel (Seriola lalandi), agrupadas en sus respectivos tratamientos: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%) de polvo de ajo en el alimento………………….………………………………………….. 38

3 Análisis de los parámetros productivos en el transcurso del bioensayo, agrupados en sus respectivos grupos experimentales: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%)…………..……………………………………………….…….. 39

4 Prevalencia e intensidad de Zeuxapta seriolae en las branquias de jurel (Seriola lalandi) alimentado con una dieta enriquecida con polvo de ajo: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%)………………..…………………………………….………….. 42

5 Parámetros hematológicos del jurel Seriola lalandi alimentado con una dieta suplementada con ajo: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%) y evaluados a los 0, 32 y 61 días………………..………………………………..……………….. 46

6 Concentración de proteínas sanguíneas del jurel Seriola lalandi alimentado con una dieta suplementada con polvo de ajo (Control 0%, Dosis baja 2% y Dosis alta 4%) y evaluados a los 0, 32 y 61 días de cultivo…………………………………………… 48

7 Interpretación clínica de los resultados de la hematología del jurel (Seriola lalandi), posterior al periodo de alimentación experimental con polvo de ajo (día 32) y la infestación experimental con Z. seriolae (día 61)…………………………….. 52

8 Interpretación clínica de los resultados de las proteínas totales, albúmina y globulinas del jurel (Seriola lalandi) posterior al periodo de alimentación experimental con polvo de ajo (día 32) y la infestación experimental con Z. seriolae (día 61)..………….. 53

Capítulo 1. Introducción

1.1 Generalidades de la Acuicultura

La Organización de las Naciones Unidas reportó que en 2014 la población mundial fue

de 7.3 mil millones de personas y se proyecta un incremento de 9.6 mil millones en 2050,

lo que significa que habrá una mayor demanda de alimentos para abastecer las

necesidades de la población (ONU, 2014).

El consumo de proteína de origen animal forma parte fundamental de la dieta de la

población humana. En el 2009, el 69% de las proteínas consumidas correspondieron a

carnes de ave, cerdo y res principalmente, y el 31% restante a pescados y mariscos

provenientes de la pesca y la acuicultura (Figura 1) (FAO, 2014).

Figura 1. Abastecimiento mundial de carne y pescado (FAO, 2014)

En el año 2012 se documentó la disminución de la producción pesquera de 93.7 a 91.3

millones de toneladas, mientras que la acuicultura mostró un notable aumento en la

producción, de 62 a 66.6 millones de toneladas (FAO, 2014). Actualmente, la acuicultura

se considera como la actividad productiva que abastecerá la demanda de productos de

2

origen acuático, por lo que deberá ser sostenible e ir acorde con las necesidades de una

población en crecimiento (Msangi et al., 2013).

En 2012 la producción acuícola de peces a nivel mundial fue de 44.2 millones de

toneladas, de las cuales 5.6 millones corresponden a peces marinos cultivados como la

cobia, jurel, pámpano y peces planos (FAO, 2014).

1.2 Generalidades del Jurel

Jurel, jurel de castilla o jurel aleta amarilla (SAGARPA, 2012) son algunos de los nombres

comunes con los que se conoce a Seriola lalandi (Valenciennes, 1833). Es un organismo

pelágico demersal, de distribución cosmopolita, que habita en las regiones subtropicales

(18 a 24 °C) entre los 20 y 70 m de profundidad (Paxton et al., 1989; Avilés Quevedo y

Castelló Orvay, 2004).

Actualmente, se reconoce oficialmente como especie a S. lalandi, pero en estudios

recientes se han encontrado evidencias genéticas de las diferencias entre los jureles, que

se catalogaban como S. lalandi, dependiendo de la zona geográfica donde habitan

(Martinez-Takeshita et al., 2015; Purcell et al., 2015). Martinez-Takeshita et al. (2015),

encontraron tres líneas genéticas en jureles de diferentes localidades y proponen que se

nombre a Seriola lalandi (Valenciennes, 1833) como la especie del Pacífico Sur, que se

vuelvan a utilizar las especies Seriola aureovittata (Temminck and Schlegel 1845) para

el Pacífico Noroeste y Seriola dorsalis (Gill, 1863) para el Pacífico Noreste. Esta última

especie es la que corresponde a la zona donde se obtuvieron los progenitores de los

cuales se obtuvieron los organismos utilizados en este bioensayo, sin embargo, no hay

una conciliación mundial para utilizar esta especie, por lo que para fines de la presente

investigación se seguirá nombrando como S. lalandi.

El jurel es un carángido que se caracteriza por tener una tonalidad azul oscuro en el

dorso, el color del vientre varía de plateado a blanco y tiene una línea de color bronce a

cada lado del cuerpo. La columna vertebral está formada por 11 vértebras precaudales y

14 caudales. La primera aleta dorsal tiene seis espinas unidas por una membrana y siete

3

radios, seguida por la segunda aleta dorsal que cuenta con 33 a 36 radios; ambas de un

color oscuro con una banda amarillenta. Las aletas pectorales, de una tonalidad

amarillenta oscura, son más cortas que las pélvicas que son de una coloración amarilla.

La aleta anal tiene una coloración oscura con puntas pálidas, está precedida por dos

espinas distintas y seguida por 20 a 22 radios. El pedúnculo caudal es delgado y la aleta

caudal está profundamente furcada (Avilés Quevedo y Castelló Orvay, 2004; SAGARPA,

2012) (Figura 2).

Figura 2. Morfología de Seriola lalandi

Estos organismos carnívoros forman parte importante de la gastronomía asiática, donde

se consumen en forma cruda, como sushi o sashimi y cocido en presentación de teriyaki

(Avilés Quevedo y Castelló Orvay, 2004).

El inicio del cultivo de Seriola spp. se dio en Japón en 1927 con juveniles silvestres de

Seriola quinqueradiata, para 1950 la producción era de 40 t.; el desarrollo posterior de la

tecnología permitió un incremento sustancial de la producción, que para el 2013 ascendió

a 149,766 t (Nakada, 2002; FAO, 2015).

En México, el cultivo de Seriola lalandi se realiza hace menos de 10 años en los estados

de Baja California, Baja California Sur y Sonora bajo la categoría de acuicultura comercial

y de fomento (SAGARPA, 2012). En 2010, fueron registradas las primeras empresas que

se dedican al cultivo de estos organismos y para el año 2014, la producción fue de 47.5

t (CONAPESCA, 2014).

4

1.3 Generalidades de Zeuxapta seriolae

El cultivo de peces marinos se ve seriamente afectado por la presencia de parásitos

(Möller y Anders, 1986; Ogawa, 1996; Ogawa y Yokoyama, 1998), y los organismos

silvestres son los principales reservorios de patógenos que pueden afectar a los peces

cultivados como el jurel (Ogawa, 1996; Hutson et al., 2007).

El cultivo de organismos acuáticos en jaulas tiene ciertos beneficios económicos como

una disminución en los costos asociados al uso de grandes volúmenes de agua, pero a

la vez tiene desventajas, ya que las artes de cultivo están inmersas en un ambiente

natural, que posibilita el ingreso de patógenos o de sus vectores (Kent, 2000). Las

condiciones de cultivo, como la densidad de cultivo y movilización de organismos, las

fluctuaciones en la calidad del agua, la movilización de organismos acuáticos, la falta de

conocimiento de las interacciones entre los organismos silvestres y los cultivados y un

laxo seguimiento de las normas de bioseguridad, entre otros (McVicar, 1997; Subasinghe

et al., 2001; Olivier, 2002), han propiciado que las enfermedades sean una limitante para

el cultivo de organismos acuáticos (Bondad-Reantaso et al., 2005).

Los gusanos planos, como los monogéneos, son parásitos que causan un impacto en la

economía, debido a que pueden ocasionar deformidades, pérdida de peso, mala

apariencia y mortalidades masivas, entre otros (Ogawa, 1996; Ernst et al., 2002;). Los

parásitos monogéneos pertenecen al filo Platyhelminthes, y se dividen en dos subclases:

monopistocotíleos y poliopistocotíleos. Los monopistocotíleos se caracterizan por tener

un aparato de fijación ligeramente dividido por septos, tienen de uno a tres pares de

ganchos centrales, además de ganchos marginales; estos parásitos se alimentan de

células epiteliales (Eiras, 1994). Los parásitos Benedenia seriolae (Sharp et al., 2004;

Hutson et al., 2007; Williams et al., 2007) y Neobenedenia girellae (Ohno et al., 2008,

2009; Hirayama et al., 2009) forman parte de esta subclase.

Los poliopistocotíleos tienen un aparato de fijación subdividido con varias ventosas y

complejos de ganchos, tienen ventosas que rodean a la boca, un canal genito-intestinal

y carecen de ocelos (Eiras, 1994). Zeuxapta seriolae es uno de los parásitos de este

5

grupo que resaltan por el perjuicio que ocasiona en los jureles (Lia et al., 2007; Lu et al.,

2012).

Morfológicamente, el adulto de Z. seriolae se describe como un organismo alargado de

1.65 a 25.8 mm de largo (Sepúlveda y González, 2015) y 0.772 a 1.288 mm de ancho

(Lamothe-Argumedo, 1970). El prohaptor o extremidad cefálica tiene un órgano de

naturaleza glandular que secreta una sustancia adhesiva que facilita la fijación de la

región bucal. El opistohaptor o extremidad posterior es asimétrico y está dividido en dos

lados, uno de 33 a 40 ventosas y otro de 28 a 31 ventosas. Las ventosas son de tipo

Microcotyle y están formadas por una esclerita central y dos pares de escleritas

marginales. El sistema digestivo está conformado por la cavidad bucal que se ubica en

la región anterior del cuerpo con dos ventosas prehaptorales, seguido por la faringe y el

esófago que tiene de 2 a 4 pares de ramas laterales que se localizan en los bordes del

cuerpo, los ciegos están bifurcados y tienen ramificaciones laterales que se introducen

en la extremidad posterior. Por su condición de hermafroditas, presentan de 103 a 133

testículos situados en la línea media detrás del ovario, mientras que este último se

encuentra intercecalmente en la región posterior del tercio medio del cuerpo; el útero y el

gonoconducto masculino convergen en el poro genital (Lamothe-Argumedo, 1970;

Rohde, 1978) (Figura 3).

Figura 3. Morfología de Z. seriolae: a) Ventosa, b) Opistohaptor y c) Extremidad anterior mostrando poro genital y vagina (Lamothe-Argumedo, 1970).

a b c

6

El ciclo de vida de Z. seriolae es de tipo monoxeno, esto quiere decir que no necesitan

de un hospedero intermediario para el desarrollo de sus estadios de vida (Whittington y

Kearn, 2011) (Figura 4). El parásito adulto vive adherido a las branquias del jurel y

produce un promedio de 22 huevos/parásito/hora, a 18 ± 0.5 °C y 40 ups, que son

liberados al ambiente por la influencia de factores como la temperatura y el fotoperiodo

(Mooney et al., 2006).

Los huevos son de tonalidad amarillenta, ovalados y resistentes a químicos; tienen un

filamento en uno de sus polos que les permite unirse entre sí para formar masas de

huevos, lo que facilita la sujeción a las superficies, como las de las mallas utilizadas en

el cultivo de peces (Lamothe-Argumedo, 1970; Montero et al., 2004).

La eclosión del oncomiracidio, estadio infestante, se da aproximadamente a los 7 días de

incubación del huevo a 21 °C (Tubbs et al., 2005). Pero la eclosión de estos parásitos

está condicionada a señales endógenas y exógenas como el fotoperiodo, la percepción

en el cambio de la iluminación ambiental generada por la aproximación de los

hospederos, la liberación de compuestos químicos del hospedero, como la urea en el

mucus de los peces (Kearn y Macdonald, 1976; Whittington, 1987) y el estímulo

mecánico, entre otros (Whittington y Kearn, 2011). Los oncomiracidios pueden medir de

100 a 300 µm de longitud y tienen un tiempo de vida de 48 horas como máximo, es por

esto que deben encontrar, identificar e infestar a un hospedero antes de que sus reservas

energéticas se agoten y para esto han desarrollado comportamientos como la fototaxis,

geotaxis, reotaxis, quimiotaxis y respuesta a estímulos mecánicos (Whittington et al.,

2000).

7

Figura 4. Ciclo de vida de la Zeuxapta seriolae.

Z. seriolae se alimenta de la sangre de los hospederos, misma que ingiere de los vasos

sanguíneos de las branquias (Mooney et al., 2006). La sangre es digerida con mucha

rapidez e ingerida por células ameboides, el producto nutritivo de la hemólisis es la

globina y se ha reportado la excreción de la hematina intacta a través de las células

epiteliales del intestino (Llewellyn, 1954).

Estos parásitos se adhieren a una o dos lamelas branquiales a través de los ganchos del

haptor, donde ocasionan palidez, hipersecreción de moco, deformación de la estructura

lamelar, adhesión y posterior fusión de lamelas contiguas y zonas blanquecinas en el

tejido branquial (Montero et al., 2004; Lu et al., 2012). En otros monogéneos hematófagos

se ha reportado la infiltración de leucocitos relacionados al proceso inflamatorio y un

aumento de las células del cloro (Ogawa, 2002; Del Rio-Zaragoza et al., 2010).

Entre los efectos sistémicos de la parasitosis en los hospederos, se ha observado una

disminución de los valores del hematocrito e hipovolemia (Llewellyn, 1954; Montero et al.,

2004; Lu et al., 2012). La disminución del hematocrito se relaciona con la ingesta de

sangre por parte del parásito y la pérdida de sangre por la ruptura de vasos marginales

en las branquias ocasionada por los ganchos del parásito. Además, hay una disminución

8

de la hemoglobina, un aumento de la circulación de eritrocitos inmaduros, lo que indica

un estado anémico en los peces y un aumento en la cantidad de eosinófilos en el torrente

sanguíneo (Yoshinaga et al., 2001; Molnár y Székely, 2004). Estas respuestas se han

asociado con una ligera palidez en el hígado y bazo de Seriola dumerili (Montero et al.,

2004).

La anemia, las lesiones en las branquias y la interrupción del flujo normal del agua en las

branquias por la presencia del parásito, ocasionan un mal funcionamiento de la estructura

branquial, lo que dificulta el intercambio gaseoso y el transporte de oxígeno a los tejidos

(Montero et al., 2004; Feist y Longshaw, 2008). Al estar el organismo tan comprometido

inmunológicamente, es posible que organismos patógenos oportunistas como virus,

hongos y bacterias lo invadan, como es el caso de epiteliocistis, una bacteria gram

negativa, que coloniza las branquias de S. dumerili previamente parasitado con Z.

seriolae, deteriorando aún más su capacidad respiratoria y osmoreguladora (Montero et

al., 2004).

Los tratamientos que se utilizan actualmente contra los parásitos monogéneos son los

fármacos como el prazicuantel, el peróxido de hidrógeno y el formaldehído, entre otros

(Sharp et al., 2004; Ernst et al., 2005; Mansell et al., 2005; Shinn y Bron, 2012; Hirazawa

et al., 2013; Hirazawa et al., 2016). Sin embargo, en los últimos años se ha incrementado

la investigación para evaluar el potencial de las plantas (cebolla, epazote, ajenjo y el ajo,

entre otros), como terapia alternativa contra los parásitos que afectan a la acuicultura

(Prieto et al., 2005; Lee y Gao, 2012; Gao et al., 2013; Bulfon et al., 2015; Van Hai, 2015).

1.4 El ajo (Allium sativum) y su uso terapéutico

Los medicamentos herbarios como el ajo, se caracterizan por tener una acción preventiva

y eficiente en diferentes organismos, por lo que se han intensificado los estudios para

ampliar el conocimiento de sus propiedades y uso en peces de cultivo (Schelkle et al.,

2013; Militz et al., 2013, 2014; Bulfon et al., 2015).

9

El ajo (Allium sativum), perteneciente a la familia Liliaceae, es una planta medicinal

originaria de Asia Central. El bulbo está compuesto por 65% de agua, 28% de

carbohidratos en forma de fructanos, 2.3% de compuestos organosulfurados, 2% de

proteínas, 1.2% de aminoácidos libres y 1.5% de fibra (Santhosha et al., 2013). La

característica sobresaliente de esta planta es la concentración de compuestos

organosulfurados, el contenido de azufre es cuatro veces mayor que el de otros productos

como el brócoli, la cebolla, la coliflor y los albaricoques (Lawson, 1996).

Los compuestos organosulfurados más abundantes en el ajo entero son el ɣ-glutamil -S-

alquil cisteína y el súlfóxido de S-alquil cisteína, en este último grupo se incluye la alina

(sulfóxido de alil cisteína) (Lawson, 1996; Lanzotti, 2006). La alina carece de olor y es el

compuesto azufrado más abundante en el ajo (6-14 mg/g de ajo fresco) y es precursor

de compuestos a los que se le atribuyen efectos benéficos para la salud (Lawson, 1996;

Prati et al., 2014).

La alina está presente en el ajo intacto, pero su concentración disminuye al momento que

el bulbo es fracturado; esto se debe a la alinasa, enzima C-S liasa contenida en vacuolas,

la cual entra en contacto con la alina libre en el citoplasma, generando ácidos sulfénicos

intermediarios muy reactivos, que por condensación se transforman en alicina (principal

tiosulfinato) (Lanzotti, 2006; Corzo-Martínez et al., 2007; Díaz y Jiménez, 2008; Prati et

al., 2014) (Figura 5).

La alicina (S-2-propenil éster del ácido 2-propenol-1-sulfinotiotico) es el producto más

abundante en el ajo, representa entre un 60 a 90% de productos sulfurados formados a

partir de la reacción que ocurre luego de cortar el ajo (Lawson, 1998). Es un producto

muy inestable, según el solvente con el cual se mezcle, la temperatura y la concentración.

El olor del ajo fresco se debe a la alicina, pero después de 30 minutos se debe a los

productos que se generan a partir de la descomposición de la alicina como el dialil

disulfuro (Figura 5) (Lawson, 1996).

10

Figura 5. Formación de compuestos organosulfurados (Modificación de Corzo-Martínez et al., 2007).

En el mercado es posible encontrar el ajo fresco, en vinagre, en polvo, además del aceite

de ajo y el extracto añejado. El polvo de ajo, que es sometido a una temperatura de

deshidratación de 50-60 °C, presenta una disminución del 5 al 15% de la concentración

de alicina, lo que lo hace más parecido al ajo fresco que otras presentaciones (Lawson,

1998). A los compuestos organosulfurados derivados de la alina, como la alicina, se les

atribuyen varios efectos benéficos en la salud de humanos y animales, ya que actúa como

antimicrobiano, antioxidante, inmunoestimulante, hepatoprotector y antifibrinolítico, entre

otros (Sahu et al., 2007; Iciek et al., 2009; Lee y Gao, 2012; Bulfon et al., 2015).

El ajo ha sido empleado en la acuicultura en diferentes presentaciones, como extracto

acuoso, polvo y fresco macerado, se administra por vía oral o intraperitoneal y en baños

de inmersión. Este fitobiótico se ha utilizado en Oreochromis niloticus (Shalaby et al.,

2006; Aly et al., 2008; Aly y Mohamed, 2010; Aly et al., 2010; Omima, 2010), Labeo rohita

(Sahu et al., 2007) y Oncorhynchus mykiss (Nya y Austin, 2009, 2011) para evaluar su

efecto en retos bacterianos con Aeromona hydrophila y Pseudomonas fluorescens. En

estos experimentos se obtuvieron resultados variables (aumento o disminución) del

hematocrito, el recuento total de leucocitos y eritrocitos, y el conteo diferencial de

11

leucocitos, así como una notable disminución de la mortalidad en los organismos que

recibieron el tratamiento con ajo.

Con el propósito de probar los efectos del ajo en organismos parasitados, se han

realizado experimentos con protozoarios como Ichthyophthirius multifilis (in vitro y en

baños) en Poecilia latipinna y Poecilia sphenops (Buchmann et al., 2003; Bartolome et

al., 2010; Gholipour-Kanani et al., 2012), así como Trichodina sp. en O. niloticus

(Chitmanat et al., 2005; Omima, 2010). En cuanto a los parásitos monogéneos, se han

realizado pruebas con Neobenedenia sp. en Lates calcarifer (Militz et al., 2014) y

Gyrodactylus turnbulli en Poecilia reticulata (Schelkle et al., 2013). El resultado de estas

evaluaciones indican que hay un aumento de la sobrevivencia, efecto letal en la fase de

teronte (forma nadadora) del ciclo de vida de I. multifilis y disminución de la prevalencia

e intensidad parasitaria.

Entre los resultados obtenidos después de la administración por vía oral del ajo, se ha

encontrado que tiene efectos tanto preventivos como correctivos contra parásitos

monogéneos de la piel en L. calcarifer (Militz et al., 2013), de branquias en Piaractus

mesopotamicus (Martins et al., 2002) y de branquias y piel en P. reticulata (Fridman et

al., 2014). Además, se han observado resultados favorables en el incremento de peso,

factor de conversión e índice de condición, en parámetros hematológicos y bioquímicos,

así como en la respuesta inmune no específica (Shalaby et al., 2006; Ndong y Fall, 2007;

Sahu et al., 2007; Aly et al., 2008; Nya y Austin, 2009, 2011; Aly y Mohamed, 2010;

Fazlolahzadeh et al., 2011).

1.5 Índices de crecimiento

La adición de ajo en la dieta de los peces ha demostrado beneficios en las variables

productivas, como un aumento en la ganancia de peso, tasa de crecimiento específica y

una disminución de la tasa de conversión alimenticia (Shalaby et al., 2006; Aly et al.,

2008; Nya y Austin, 2009; Aly y Mohamed, 2010; Talpur e Ikhwanuddin, 2012). Para

conocer el crecimiento de un organismo o un grupo de ellos, se toma en cuenta el peso

corporal y la longitud, entre los cuales generalmente hay correlación (Dutta, 1994).

12

El índice de condición hace una relación del peso y la longitud de un individuo y se utiliza

para evaluar su estado fisiológico, desde el punto de vista de su bienestar (Lizama y

Ambrósio, 2002). El índice de condición de Fulton es mundialmente utilizado en los

estudios afines a la biología de los peces y es indicado para comparar organismos de

una misma especie (Ricker, 1975).

El índice hepatosomático hace una relación entre el peso corporal total y el peso del

hígado expresado en porcentaje, y el aumento o disminución de este índice demuestra

la condición en la que se encuentra el hígado como órgano de reserva energética (Dutta,

1994; Htun-Han, 1978). Algunos autores lo mencionan como un indicador de la tasa de

crecimiento, ya que han encontrado correlación entre ambas variables (Holdway y

Beamish, 1984; Adams y McLean, 1985; Cui y Wootton, 1988).

1.6 Hematología y química sanguínea

Diferentes respuestas fisiológicas tales como la hematología y la química sanguínea han

sido consideradas para evaluar el efecto del ajo. La sangre es un tejido compuesto por

células y plasma, tiene diferentes funciones como medio de transporte de sustancias

como el oxígeno, glucosa, lípidos y aminoácidos, además de sustancias de desecho

como el dióxido de carbono y desechos nitrogenados, entre otros (Cunningham, 2003).

El plasma es la porción líquida de la sangre, compuesta en un 92 a 95% de agua y de 5

a 8% de proteínas (en su mayoría), glucosa, urea, electrolitos y otras sustancias

(Stockham y Scott, 2013). Las principales proteínas presentes en el plasma son el

fibrinógeno, que está involucrado en la formación del coágulo, además la albúmina y la

globulina, que forman parte de la respuesta inmune y contribuyen al mantenimiento de la

presión osmótica y la densidad de la sangre (Lepkovsky, 1930; Cunningham, 2003).

En los peces, la formación de la porción celular de la sangre se divide en dos etapas: la

hematopoyesis primitiva y la definitiva. La hematopoyesis primitiva inicia en el huevo o

poco tiempo después de la eclosión, con la formación de la red vascular y la circulación

13

de los proeritroblastos que posteriormente maduran como eritrocitos primitivos; además

se da la formación de células mieloides, específicamente macrófagos y monocitos. En la

hematopoyesis definitiva de peces en desarrollo, las células madre hematopoyéticas se

producen en la región aorta-gónada-mesonefro y posteriormente se producen en el riñón

o el bazo donde se da la formación de eritrocitos y leucocitos (de Jong y Zon, 2005; Weiss

y Wardrop, 2011). Los trombocitos aparecen en el bazo a partir de la primera semana

posterior a la fertilización (Romano et al., 1997).

Los eritrocitos o glóbulos rojos son los elementos encargados del transporte de oxígeno

y participan de manera importante en el transporte del dióxido de carbono de la sangre

(Randall et al., 1998; Núñez y Bouda, 2007). Morfológicamente, los eritrocitos maduros

son ovalados con citoplasma ligeramente eosinofílico y núcleo ovalado o redondo con la

cromatina condensada (Figura 6). Para conocer la cantidad de eritrocitos que existen en

un determinado momento en el individuo, es necesario obtener una muestra de sangre

venosa con la cual se puede realizar el recuento total de eritrocitos en una cámara de

Neubauer, que es el método manual para contabilizar la cantidad de células por microlitro

que hay en la sangre. La medición del contenido de eritrocitos con respecto al volumen

total de sangre se expresa en forma porcentual mediante la técnica de microhematocrito

(Stoskopf, 1993; Stockham y Scott, 2013). El hematocrito puede aumentar debido a la

contracción del bazo o posterior a la extracción de sangre y disminuye en procesos de

anemia (Weiss y Wardrop, 2011; Stockham y Scott, 2013).

Figura 6. Eritrocitos de jurel.

14

Los glóbulos blancos o leucocitos forman parte de la fracción celular de la sangre y están

involucrados en la respuesta inmune de los organismos. Los leucocitos, clasificados en

granulocitos, monocitos y linfocitos, utilizan la sangre como medio de transporte desde

los órganos hematopoyéticos hacia los sitios de acción o de eliminación (Stockham y

Scott, 2013). Los granulocitos se caracterizan porque tienen gránulos en su citoplasma y

un núcleo lobulado, además tienen la capacidad de trasladarse a los sitios de acción

atravesando los vasos sanguíneos luego de recibir señales químicas de infección o

inflamación (Gordon-Smith, 2009). Los granulocitos a su vez se dividen en tres tipos de

células: los neutrófilos, también conocidos como polimorfonucleares (porque su núcleo

cuenta con varios lóbulos) su principal función es fagocitar y destruir bacterias, así como

participar en el inicio del proceso inflamatorio; los eosinófilos tienen gránulos

citoplasmáticos de color rojizo (con tinción de eosina y azul de metileno) y núcleo

excéntrico, están presentes en la respuesta parasitaria y también tienen actividad

fagocítica; y los basófilos que se caracterizan por presentar un citoplasma de tonalidad

púrpura, su presencia es poco común debido a que no son muy abundantes y su

presencia se asocia a parasitosis y respuestas alérgicas (Gordon-Smith, 2009) (Figura

7).

Los monocitos son otro tipo de leucocitos, son las principales células fagocíticas y se

distinguen por ser células grandes, redondas con un núcleo excéntrico con forma de

herradura u ovoide, vacuolas en el citoplasma y tienen la capacidad de migrar a los tejidos

en donde se denominan macrófagos. Los leucocitos tipo linfocitos son redondos, con

núcleo compacto de color azul oscuro (con tinción de eosina y azul de metileno) y

presentan pseudópodos, forman parte de la respuesta inmune innata y adaptativa en sus

formas de linfocitos T, B y citotóxicos no específicos (Ainsworth, 1992; Conroy y Conroy,

2007; Weiss y Wardrop, 2011) (Figura 7).

El último de los tipos celulares que forman parte de la sangre son los trombocitos. La

forma inmadura es alargada y estrecha, al igual que su núcleo. Tiene un citoplasma azul

pálido (Conroy y Conroy, 2007). Los trombocitos maduros son pequeños, con núcleo

condensado, citoplasma de color claro, con formas que pueden ser ovaladas o redondas,

con cierto parecido a los linfocitos. Estas células activadas por colágeno son

15

responsables de la coagulación sanguínea como respuesta a daños vasculares (Rowley

y Ratcliffe, 1988; Stoskopf, 1993; Romano et al., 1997; Weiss y Wardrop, 2011) (Figura

7).

Figura 7. Leucocitos de Acipenser transmontanus (a) Eosinófilos; (b) punta de flecha: trombocito, flechas: linfocitos; (c) flecha superior: neutrófilo, flecha inferior: monocito (Imágenes tomadas de Grant, 2015).

Los valores de los componentes de la sangre varían entre especies, edad, sexo y

condiciones del ambiente, entre otras; pero generalmente las alteraciones en estos

valores están relacionados a procesos fisiológicos y/o enfermedades (Weiss y Wardrop,

2011) (Tabla 1).

a b c

16

Tabla 1. Causas de alteraciones en los parámetros hematológicos de los peces (Weiss y Wardrop, 2011; Stockham y Scott, 2013)

Parámetro hematológico Aumento (+)

/Disminución (-) Causa de alteración

Eritrocitos Eritrocitosis (+)

Deshidratación Contracción esplénica

Anemia (-) Pérdida de sangre

Disminución de la producción de eritrocitos

Neutrófilos Neutrofilia (+)

Estrés Infecciones (bacterias, hongos, protozoarios,

virus) Inflamación

Necrosis/hemorragias

Neutropenia (-) Inflamación crónica

Enfermedades inmunomediadas

Eosinófilos Eosinofilia (+) Ectoparásitos

Hipersensibilidad

Eosinopenia (-) Inflamación aguda

Basófilos Basofilia (+) Hipersensibilidad

Parásitos

Basopenia (-) No reportado

Monocitos Monocitosis (+) Inflamación (bacterias, hongos, protozoarios)

Necrosis/hemorragias Estrés

Monocitopenia (-) No reportado

Linfocitos Linfocitosis (+) Inflamación crónica

Linfopenia (-) Estrés

Inflamación aguda

Trombocitos

Trombocitosis (+) Inflamación

Pérdida de sangre

Trombocitopenia (-) Esplenomegalia

Coagulación intravascular Hipofosfatemia

Proteínas séricas

Hiperproteinemia(+) Hemoconcentración

Procesos inflamatorios Hiperglobulinemia

Hipoproteinemia (-)

Pérdida de sangre Lesiones en piel

Insuficiencia hepática Alteraciones en la digestión y absorción de

nutrientes Caquexia

Albúmina

Hiperalbuminemia (+) Hemoconcentración

Hipoalbuminemia (-)

Pérdida de sangre Lesiones en piel

Insuficiencia hepática Alteraciones en la digestión y absorción de

nutrientes Caquexia

Globulina

Hiperglobulinemia (+) Hemoconcentración

Inflamación

Hipoglobulinemia (-)

Disminución de la producción de globulinas por falla hepática Pérdida de sangre

Lesiones en mucosa intestinal y/o piel

17

El sistema inmune de los peces involucra una serie de mecanismos que interactúan para

controlar o destruir a casi cualquier invasor, por lo que el organismo se defiende a través

de tres mecanismos: barreras físicas externas como la piel, escamas, mucus y flora

bacteriana normal (no patógena), constituyen la primera línea de defensa y excluyen a

invasores potenciales. La respuesta inmune innata o no específica es la segunda línea

de defensa, la cual está compuesta por mecanismos químicos y celulares que se

encargan de reconocer a los invasores y de establecer una línea de defensa celular

(granulocitos y monocitos), capaz de destruir las paredes de los microorganismos

patógenos por medio de enzimas. La activación de este mecanismo de defensa no

requiere de la exposición previa al patógeno. La tercera línea de defensa es la respuesta

inmune adquirida o específica, y se desencadena cuando el organismo afectado ha

tenido una exposición previa al patógeno, de manera que ha desarrollado una línea

celular específica (Tizard, 2000).

Tomando en cuenta que la acuicultura va en aumento y que las enfermedades son una

limitante en la producción, es necesario la implementación de tratamientos preventivos

contra patógenos que ocasionan grandes pérdidas económicas en organismos marinos

cultivados a escala industrial, por lo que en este trabajo se evaluó el efecto preventivo del

ajo adicionado a la dieta, en jureles expuestos a un desafío experimental al parásito

monogéneo Zeuxapta seriolae.

18

Capítulo 2. Justificación

El desarrollo del cultivo de peces marinos ha traído consigo un nuevo reto a los

productores, el manejo de las enfermedades. Específicamente en el jurel S. lalandi, el

parásito monogéneo Z. seriolae ocasiona un desequilibrio fisiológico que se ve reflejado

en bajos rendimientos productivos y en eventos de mortalidad que afectan a la economía

de los productores.

La terapia convencional contra parásitos externos implica el uso de fármacos que han

demostrado controlar las infestaciones por este parásito monogéneo, pero en algunos

países, la legislación sanitaria restringe o prohíbe su uso en organismos que dedican al

consumo humano (Sharp et al., 2004; FDA, 2014). La razón de su desaprobación se debe

a que después de su administración quedan residuos en los tejidos y además,

contaminan el ambiente (Lee y Gao, 2012). También estos fármacos son rechazados por

los peces debido a su baja palatabilidad (Williams et al., 2007). Esta situación ha

propiciado la incursión de productos naturales como una alternativa para la prevención

y/o tratamiento de diferentes patologías (FDA, 2011).

La aplicación de un producto de origen natural como el ajo, ha demostrado que en otras

especies de peces tiene la capacidad de prevenir infestaciones de parásitos

monogéneos, además de que confiere otros beneficios en la acuicultura, como promotor

del crecimiento, inmunoestimulante, estimulante del apetito, agente antibacteriano,

antiparasitario y antifúngico. La Administración de Alimentos y Drogas de los Estados

Unidos de América (FDA, por sus siglas en inglés U. S. Food and Drug Administration)

reconoce al ajo como un producto de baja regulación para su uso en la acuicultura en el

control de helmintos y piojo de mar en salmónidos de todas las edades (FDA, 2011).

El uso de ajo en el cultivo de peces permite la comercialización de un producto con

etiqueta verde, lo que representa una reducción del riesgo de contaminación ambiental,

un producto para el consumidor libre de residuos de fármacos, con la garantía de que

durante su cultivo estos organismos estuvieron bajo vigilancia sanitaria, lo que se

circunscribe a los parámetros de bienestar animal de la OIE (Organización Mundial de

Sanidad Animal).

19

Por lo anteriormente mencionado, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto

preventivo del ajo contra el parásito monogéneo Z. seriolae y sus efectos en el jurel,

medidos a través de algunos parámetros productivos y de variables hematológicas y

bioquímica sanguínea, relacionadas con el sistema inmune no específico, para conocer

los posibles mecanismos de acción de este producto natural.

20

Capítulo 3. Hipótesis

1. La suplementación con polvo de ajo en la dieta del jurel (S. lalandi) disminuye la

infestación de Z. seriolae.

2. La suplementación con polvo de ajo en la dieta del jurel (S. lalandi) aumenta los

índices de condición y hepatosomático y disminuye el factor de conversión

alimenticia.

3. La suplementación con polvo de ajo en la dieta del jurel (S. lalandi) aumenta la

concentración de proteínas totales, globulinas en el suero, el hematocrito y así

como la concentración de eritrocitos y leucocitos.

21

Capítulo 4. Objetivos

4.1 Objetivo general

Evaluar el efecto del polvo de ajo (Allium sativum) adicionado a la dieta del jurel (Seriola

lalandi) como antihelmíntico sobre las variables productivas y sanguíneas.

4.1.1 Objetivos específicos

1. Estimar la prevalencia e intensidad de Zeuxapta seriolae en los hospederos para

evaluar la efectividad del ajo adicionado a la dieta.

2. Evaluar el índice de condición de Fulton, el índice hepatosomático y el factor de

conversión alimenticia en juveniles de jurel a los 32 y 61 días de consumo de la dieta

suplementada con polvo de ajo.

3. Evaluar la concentración de proteínas totales, albúmina y globulina en juveniles de

jurel al día 0, 32 y 61 del consumo de la dieta suplementada con polvo de ajo.

4. Realizar el recuento total de leucocitos y eritrocitos, el análisis diferencial de

leucocitos y el hematocrito en la sangre de juveniles de jurel al día 0, 32 y 61 del

consumo de la dieta suplementada con polvo de ajo.

22

Capítulo 5. Materiales y Métodos

5.1 Cultivo de organismos

Los jureles fueron donados por la empresa Ocean Baja Labs S. de R.L. de C.V. ubicada

en el ejido de Eréndira, Municipio de Ensenada, Baja California, México. Los organismos

tenían un peso promedio de 4.24 ± 1.16 g y se mantuvieron en un estanque de 3 m3 en

el Laboratorio de Peces Marinos del Departamento de Acuicultura de CICESE, hasta que

alcanzaron 93.5 ± 2.98 g en 68 días para transferirlos al sistema experimental.

Para monitorear la calidad del agua del cultivo cada día se midieron las siguientes

variables: el pH con un potenciómetro Thermo modelo Orion 290ª+, el oxígeno disuelto

(mg/l), saturación de oxígeno (%), salinidad (ups) y temperatura (°C) con un analizador

multiparámetrico YSI modelo 85. La concentración de amonio, nitritos y nitratos se

cuantificó, dos veces por semana con los reactivos de la línea Permachem Reagents de

HACH®.

Los peces se trasladaron al laboratorio húmedo del Departamento de Acuicultura y se

colocaron en 9 tanques de 460 litros de capacidad. Cada tanque estaba provisto de

aireación y un calentador de titanio acoplado a una caja reguladora de la temperatura y

un sensor de nivel. Se colocaron 20 organismos en cada uno de los tanques que estaban

distribuidos en tres grupos experimentales, un grupo control y dos tratamientos con 2 y

4% de polvo de ajo, cada uno con tres repeticiones (n=180 organismos). Durante 15 días

se realizó la aclimatación de los peces a las nuevas unidades de cultivo, el agua se

mantuvo a 20 °C y 12 recambios al día; los organismos fueron alimentados con Marine

MX de Skretting®, con una ración diaria equivalente al 3.5% de la biomasa suministrada

en dos raciones.

Posteriormente se realizó el incremento de 1 °C cada dos días, para llevar la temperatura

de 20 a 25 °C, ya que Rodríguez Fonseca (2014) reportó que el intervalo térmico de 22

a 25 °C es el adecuado para el cultivo de S. lalandi; la cual se mantuvo durante la fase

experimental. El régimen de alimentación y recambios de agua se mantuvo durante 10

días más, de manera que las condiciones fisiológicas del organismo se estabilizaran.

23

5.2 Diseño experimental

El experimento se diseñó para 20 organismos por tanque (n=180), en un total de 9

unidades de cultivo, en donde se mantuvieron hasta el día 32 con el agua a 25 °C, 33

ups, 12 recambios al día y alimentándose con las dietas experimentales. A la dieta

comercial se le adicionó polvo de ajo al 2 y 4% para los grupos dosis baja y alta,

respectivamente; mientras que al grupo control solamente se le agregó aceite de

pescado. El día 33 se introdujeron 2 peces infestados con Zeuxapta seriolae por unidad

de cultivo, se alteraron las condiciones del ambiente al aumentar la temperatura del agua

a 28 °C y disminuir los recambios, a 3 por día, de manera que aumentara la turbiedad y

la concentración de desechos nitrogenados. La ración de alimento suplementado con

polvo de ajo se mantuvo igual hasta el día 61. Los muestreos se realizaron a los 0, 32 y

61 días de experimento, en cada muestreo se extrajeron 4 organismos por tanque y se

evaluó el peso, la longitud, el índice de condición de Fulton, el factor de conversión

alimenticia, la prevalencia e intensidad parasitaria, el recuento total de eritrocitos y

leucocitos, el conteo diferencial de leucocitos, las proteínas totales, la albúmina y las

globulinas.

5.3 Preparación del polvo de ajo

Al ajo adquirido en un supermercado de la localidad, se le eliminó la cutícula

delicadamente y se cortó en láminas de aproximadamente 1 mm de espesor con la ayuda

de un bisturí, las cuales se colocaron en una charola metálica cubierta con papel

encerado y se secaron en una estufa marca Thermolyne modelo Oven series 9000 a 60

°C durante 20 horas.

El ajo seco se introdujo en una licuadora marca Osterizer para triturarlo hasta obtener un

polvo fino, que se filtró a través de un tamiz #35 para eliminar partículas mayores a 500

µm y el producto resultante se almacenó en un recipiente de vidrio color ámbar a

temperatura ambiente.

24

5.4 Preparación del extracto de ajo

El extracto acuoso de ajo se preparó siguiendo la metodología de Militz et al. (2013). Se

homogenizó con agua a razón de 1 g de ajo fresco sin cutícula por cada 5 ml de agua

destilada durante 60 s. El homogenizado se dejó reposar por 5 minutos y se filtró a través

de una malla de 105 µm y posteriormente por un filtro Whatman #1. El producto final se

almacenó en refrigeración en un recipiente de vidrio cerrado y cubierto con papel

aluminio.

5.5 Cuantificación de la alicina del polvo y el extracto de ajo

Con el propósito de conocer la concentración de uno de los principios activos en mayor

proporción en el ajo y al que se le atribuyen la mayor cantidad de efectos benéficos, se

realizó la cuantificación de alicina. Esta valoración se realizó en el Laboratorio de

Revaloración de Residuos del CINVESTAV- Unidad Saltillo. Para conocer la

concentración de alicina presente en el polvo y el extracto de ajo, primero se mezclaron

5 ml de extracto de ajo o 3 g del polvo de ajo con 30 g de solución de etilparabeno y se

homogenizaron durante 2.5 minutos en un agitador Thermo® Vortex Maxi Mix I, para

posteriormente dejarlo reposar durante 30 min. El homogenizado se centrifugó a 3500

rpm (5257.5 X·g) durante 10 min en un equipo Solbat C-600A y se tomaron 2 ml del

sobrenadante que se aforó a 10 ml con ácido cítrico 1 mM. Finalmente, con la ayuda de

un filtro de 0.45 µm se inyectó en viales que se colocaron en el equipo de HPLC Agilent

Technologies 1200 series, con columna Phenomenex Luna 5µ C18(2) 100 A. Se utilizó

una solución de 55% agua: 45% metanol como fase móvil con un flujo de 0.8 ml/min. El

volumen de inyección de la muestra fue de 10 µl, se apagó la iluminación del equipo y se

mantuvo una temperatura de 25 °C. Finalmente, se leyó la absorbancia a 230 nm

(Anexos).

25

5.6 Cuantificación de alicina lixiviada del alimento para peces

mezclado con polvo de ajo

Se colocaron 10 g de alimento mezclado con polvo de ajo (2 y 4%) y 2% de aceite vegetal

en un recipiente con 10 ml de agua a 35 ups y 25ºC por 30 segundos, 1, 4.5 y 13.5 min.

Posteriormente, se mezclaron 3 ml del agua de mar con 5 g de etilparabeno y se

homogenizaron en un agitador vortex por 1 minuto (Figura 8). Finalmente, se utilizó un

filtro de 0.45 μm para depositar la muestra en los viales para el análisis por HPLC.

Figura 8. a) Alimento con polvo de ajo en agua de mar, b) Agua de mar después del tiempo de lixiviación, c) Lixiviado mezclado con el estándar interno.

5.7 Preparación de la dieta y estrategia de alimentación

La dieta base utilizada para el grupo control y los dos grupos experimentales fue Marine

MX de Skretting®, de 4 mm de diámetro de partícula y compuesto con 46% de proteína

cruda, 12% de grasa cruda y 1% de fibra cruda. El alimento para el grupo control se

mezcló con el aceite de pescado al 3% de la dieta base, mientras que para preparar la

dieta de los grupos experimentales (dosis baja y dosis alta) se mezcló el aceite de

pescado al 3% de la dieta base con el 2 y el 4% de polvo de ajo respectivamente. El

aceite de pescado se utilizó para que el polvo de ajo se pudiese adherir a la superficie de

las partículas de alimento. Se prepararon lotes de 1 kg de alimento para cada uno de los

grupos (Figura 9).

a b c

26

Figura 9 . Preparación de la dieta con ajo: (a) Homogenización de polvo de ajo y aceite, (b) Mezcla de homogenizado con el alimento, (c) Alimento mezclado con polvo de ajo.

Al inicio del experimento los organismos consumieron una ración equivalente al 3.5% de

su biomasa y posteriormente, a la mitad del experimento, la ración se ajustó al 2.5%,

tomando como guía la tabla de alimentación propuesta por Orellana et al. (2014).

5.8 Infestación experimental

Con la intención de contar con un vector para la transmisión de Zeuxapta seriolae, un

grupo adicional de jureles infectados con Z. seriolae (vectores) se mantuvo durante un

mes en un tanque de 7 m3 equipado con su propio biofiltro. Durante este período los

peces se alimentaron con Marine MX de Skretting® de 4 mm.

La infestación de los organismos experimentales se hizo por cohabitación, al finalizar los

32 días de alimentación con la dieta experimental (grupo control con dieta base y grupos

experimentales con adición de polvo de ajo), se colocaron dos peces vectores en cada

tanque de cultivo. Para identificar a los jureles que sirvieron como vectores, antes de

introducirlos en los tanques se les implantó una marca electrónica (Biomark® modelo

KAA000870) en la musculatura dorsal del flanco izquierdo (Figura 10). Para comprobar

la ubicación de la marca electrónica se utilizó un lector portátil (Mini Portable Reader

Destron Fearing modelo 800-0249-01).

a b c

27

Figura 10. Implantación de marca electrónica en peces parasitados.

Con la intención de hacer más propicio el ambiente para el parásito y aumentar las

posibilidades de éxito de infestación, a partir de la fecha en que se introdujeron los jureles

vectores en los tanques (día 33), se elevó la temperatura de 25 a 28 °C y se disminuyeron

los recambios de agua a 3 por día, lo que propició el incremento de la concentración de

los compuestos nitrogenados y la turbiedad del agua.

5.9 Prevalencia e intensidad parasitaria

Para evaluar la intensidad media y prevalencia de la infestación parasitaria al final del

experimento, a cada pez se le disecaron las branquias y se preservaron en una solución

de alcohol (60%). Posteriormente, en las branquias de cada pez se contó la cantidad de

parásitos (Z. seriolae) con la ayuda de un microscopio estereoscópico modelo

Discovery.V8 (Zeiss®) (Figura 11).

Figura 11. Evaluación de branquias del jurel para la cuantificación de parásitos.

28

Para el cálculo de la prevalencia parasitaria se utilizaron las siguientes ecuaciones (Bush

et al., 1997):

𝐼𝑛𝑡𝑒𝑛𝑠𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑎𝑟á𝑠𝑖𝑡𝑜𝑠

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑠𝑝𝑒𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠 (1)

𝑃𝑟𝑒𝑣𝑎𝑙𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑠𝑝𝑒𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑖𝑛𝑓𝑒𝑠𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 ℎ𝑜𝑠𝑝𝑒𝑑𝑒𝑟𝑜𝑠 𝑒𝑥𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎𝑑𝑜𝑠∗ 100 (2)

5.10 Índices biológicos

5.10.1 Índice de condición de Fulton

El índice de condición se calculó los días 0, 32 y 61 del experimento, utilizando las

medidas del peso húmedo (g) y la longitud (cm) de 4 organismos de cada unidad de

cultivo. Para el cálculo de este índice se utilizó la siguiente ecuación (Ricker, 1975)

3100

L

WK (3)

Donde:

K= Índice de condición de Fulton

W= Peso húmedo (g)

L= Longitud (cm)

5.10.2 Índice hepatosomático

El índice hepatosomático (IHS) se calculó los días 0, 32 y 61 del experimento. Para

realizar este cálculo se midió el peso total húmedo (g) y el peso húmedo del hígado (g)

de 4 organismos de cada unidad de cultivo y se utilizó la siguiente ecuación

(Sadekarpawar y Parikh, 2013):

29

T

H

P

PIHS 100 (4)

Donde:

IHS= Índice hepatosomático

PH= Peso hígado (g)

PT= Peso total (g)

5.11 Consumo de alimento y Factor de conversión alimenticia

El consumo de alimento de los peces se calculó a los 32 y 61 días del experimento,

mediante la siguiente ecuación:

𝐶𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑜 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑔/𝑝𝑒𝑧) =𝑐𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝑔)

𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑑𝑒 𝑝𝑒𝑐𝑒𝑠

(5)

El factor de conversión alimenticia (FCA) se calculó los días 32 y 61 del experimento.

Para realizar este cálculo se midió el peso húmedo total (g) de los peces de cada unidad

experimental (biomasa total) y se relacionó con la cantidad de alimento consumido en

cada periodo, mediante la siguiente ecuación:

𝐹𝐶𝐴 =𝑎𝑙𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑠𝑢𝑚𝑖𝑑𝑜 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑑𝑜 (𝑔)

𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑔𝑎𝑛𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑢𝑟𝑎𝑛𝑡𝑒 𝑒𝑙 𝑝𝑒𝑟𝑖𝑜𝑑𝑜 (𝑔)

(6)

5.12 Análisis de muestras de sangre

La sangre de los peces se obtuvo mediante la punción de la vena caudal con una jeringa

Terumo® de 3 ml provista de una aguja calibre 21. Posteriormente se colocó una parte

de la sangre extraída en un tubo de 0.5 ml con el anticoagulante K2EDTA (BD

30

Microtainer®) y otra porción de sangre se depositó en un tubo Eppendorf® de 1 ml sin

anticoagulante.

Los tubos con EDTA que contenían la muestra se mantuvieron a 8 °C en un refrigerador

VWR Scientific® hasta que fueron utilizados para realizar los frotis sanguíneos, el

hematocrito y el recuento de eritrocitos y leucocitos.

Para obtener las muestras de suero, después de la extracción, la sangre se colocó en

tubos Eppendorf® y permanecieron en refrigeración por una hora, permitiendo así la

formación del coágulo (Stockham y Scott, 2013). Posteriormente se centrifugaron por 10

minutos a 7,000 RPM (5040 X·g) en una centrífuga VWR® Micro 1207, el suero se

mantuvo -81 °C en un ultracongelador Revco ExF de la marca Thermo Scientific®, hasta

que se realizaron los análisis de la concentración de proteínas totales y albúmina.

5.12.1 Hematocrito

Los tubos capilares de microhematocrito (Corning®) se llenaron con sangre con

anticoagulante a ¾ partes de su capacidad y se sellaron con plastilina en uno de sus

extremos. Se colocaron en una centrífuga de microhematocrito Clay Adams® por 10

minutos a 7,000 RPM (5117.1 X·g). Finalmente los capilares se colocaron en un lector de

microhematocrito Clay Adams® para medir la proporción de suero y del paquete celular,

los resultados se expresaron como porcentaje (%) del volumen total.

5.12.2 Recuento de eritrocitos y leucocitos

La sangre con anticoagulante se mezcló con la solución de Natt-Herrick en una

proporción 1:200 (Natt y Herrick, 1952) y se dejó reposar por una hora como mínimo,

tiempo necesario para teñir las células sanguíneas del jurel. A continuación, la muestra

se depositó en cada cámara de un hematocitómetro (Hausser Scientific®) y se dejó

reposar por 10 minutos.

31

Para el recuento total de eritrocitos y leucocitos se utilizó un microscopio Axio Scope.A1

(Zeiss®) con un aumento de 400X. En cada cámara del hematocitómetro se ubicaron los

cuadrantes correspondientes para el conteo de los leucocitos y eritrocitos (Figura 12). El

número de leucocitos y eritrocitos (por sus siglas en inglés WBC y RBC, respectivamente)

fueron calculados con las siguientes ecuaciones:

𝑊𝐵𝐶 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑒𝑢𝑐𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠

8 𝑥 200 (7)

𝑅𝐵𝐶 =𝑛ú𝑚𝑒𝑟𝑜 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑒𝑟𝑖𝑡𝑟𝑜𝑐𝑖𝑡𝑜𝑠 𝑥 1

0.020 𝑚𝑚3 𝑥 200 (8)

Figura 12. Cámara del hematocitómetro: cuadrantes para el recuento de leucocitos (azul) y eritrocitos (rojo).

5.12.3 Análisis diferencial de leucocitos

El frotis sanguíneo se hizo colocando 3 µl de sangre con anticoagulante en uno de los

extremos de un portaobjetos de vidrio (Corning®) y extendiendo la muestra con la ayuda

del borde de otro portaobjetos. El frotis se secó a temperatura ambiente, para luego

sumergirlo en la solución fijadora del kit Hemacolor® y a continuación se secó bajo las

condiciones ambientales del laboratorio. El frotis se sumergió en la solución 2 y 3 del kit

Hemacolor® por 1 minuto respectivamente y se lavó con agua destilada hasta retirar

completamente los restos de colorante. Finalmente se colocó resina Cytoseal®60 y un

cubreobjetos de 24 x 50 mm (Corning®) para sellar y conservar la muestra.

32

Los frotis sanguíneos se observaron en un microscopio Axio Scope.A1 (Zeiss®) con un

aumento de 630X y se clasificaron y cuantificaron los diferentes tipos de leucocitos:

neutrófilos, monocitos, eosinófilos, basófilos y trombocitos.

5.12.4 Bioquímica sérica

El suero previamente ultracongelado (-80 °C) se descongeló en un refrigerador (VWR

Scientific®) a 4 °C durante una noche y posteriormente se analizaron las concentraciones

de proteínas totales y albúmina.

5.12.4.1 Proteínas totales

El análisis de la concentración de proteínas totales se realizó por la técnica de Bradford,

estandarizada para microplaca por Castillo y Hernández (2013, en proceso). Para

preparar la curva de calibración se depositaron alícuotas de 5, 10, 15, 20 y 25 µl del

estándar de calibración de proteínas de 0.5 mg/ml en tubos eppendorf y se aforaron a

100 µl. Posteriormente se hicieron las diluciones de las muestras de suero, mezclando

10 µl con 500 µl de agua destilada. En una microplaca de 96 pocillos (Costar Corning®),

se colocaron por triplicado 10 µl de agua destilada (blanco), 10 µl de cada una de las

soluciones de calibración y de las muestras de suero; a cada pocillo se le agregaron 100

µl de solución de Bradford (Amresco®).

En un espectrofotómetro Varioskan Flash (Thermo®) se programó el protocolo Bradford

para proteínas totales, que incluyó: agitación por 40 s, incubación a 25 °C por 5 min,

registro de las absorbancias a una longitud de onda de 595 nm y sustracción de la

absorbancia del blanco. Para obtener la concentración de proteínas totales (mg/ml) de

cada muestra, se utilizó la ecuación de la regresión lineal de la curva de calibración con

un coeficiente de determinación mayor a 0.95.

33

5.12.4.2 Albúmina

La concentración de albúmina se obtuvo mediante espectrofotometría con el kit de

albumina AB362 de Randox®. Para el blanco se colocaron 10 µl de agua destilada y 3

ml de reactivo de verde de bromocresol (R1) en cubetas de 5 ml. Para el estándar se

colocaron 10 µl de solución de calibración y 3 ml de R1 y en las muestras se colocaron

10 µl de suero con 3 ml de R1. La reacción se incubó a una temperatura entre 20 a 25 °C

durante 5 minutos, a continuación se leyó la absorbancia a una longitud de onda de 578

nm en un espectrofotómetro DR5000 (HACH®).

Las absorbancias finales se obtuvieron por la diferencia de la absorbancia de la muestra

y el blanco. Estos datos fueron introducidos a la ecuación que provee el fabricante del kit

de albúmina:

[𝑎𝑙𝑏ú𝑚𝑖𝑛𝑎](𝑔

𝑙⁄ ) =𝐴𝜆 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

𝐴𝜆 𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟 𝑥 [𝑒𝑠𝑡á𝑛𝑑𝑎𝑟] (9)

5.12.4.3 Globulinas

La concentración de globulinas se calculó por la diferencia entre proteínas totales y

albúmina (Crivelenti et al., 2011) .

5.13 Análisis estadístico

Se realizaron las pruebas de Shapiro-Wilks, Kolmogorov-Smirnov y Liliefors para la

normalidad y las pruebas C de Cochran, Hartley y Bartlett para la homogeneidad de

varianza, donde se demostró que los valores no cumplieron con la normalidad ni

homogeneidad de varianza, por lo que se realizaron pruebas no parámetricas . Además

se realizó el análisis de varianza de una vía para comprobar que las unidades

correspondientes a cada tratamiento fueran realmente réplicas, las unidades que se

comprobaron que no funcionaban como réplicas no fueron tomadas en cuenta para el

34

análisis estadístico. El análisis de la concentración de alicina en el extracto y el polvo de

ajo se realizó por medio de una prueba de Friedman. Para el análisis de los tratamientos

de las variables productivas, de hematología y química sanguínea se realizó la prueba

de Kruskal-Wallis y la prueba de Wilcoxon para el análisis de los días de muestreo de

cada tratamiento. En caso de haber diferencias significativas se realizó la prueba de

comparación múltiple de rango de medias de todos los grupos. Todas las pruebas fueron

realizadas en el programa estadístico Statistica 10 y para considerar las diferencias se

utilizó un nivel de significancia de ɑ=0.05.

35

Capítulo 6. Resultados

6.1 Concentración y lixiviación de alicina

La concentración de alicina en el extracto de ajo recién preparado fue de 0.03 ± 0.0003%,

y la mayor concentración se cuantificó cuatro días después de la extracción, lo que

posiblemente se deba a, que al momento de la extracción el tiempo de reacción para la

conversión de alina en alicina no fuera suficiente, por esta razón, la concentración inicial

no se tomó en cuenta para el análisis estadístico. Después de un periodo de 4, 16 y 22

días de almacenamiento, la concentración de alicina en el extracto de ajo fue de 0.047 ±

0.003%, 0.043 ± 0.0004% y 0.040 ± 0.00008%, respectivamente, los cuales fueron

significativamente diferentes (p=0.049) (Figura 13). A partir del día 4 de almacenamiento,

se observó una disminución de la concentración de alicina, con una diferencia del 8.51%

entre los días 4 al 16 y del 14.89% del día 4 al día 22.

Media

Media±ES

Día 4 Día 16 Día 22

Día de Evaluación

0.039

0.040

0.041

0.042

0.043

0.044

0.045

0.046

0.047

0.048

0.049

% d

e a

licin

a

Figura 13. Concentración de alicina (%) en el extracto de ajo. Las letras diferentes establecen diferencias significativas (p<0.05) (ANOVA de Friedman, H(2)=6.0, p=0.049). ES=error estándar.

En el polvo de ajo recién procesado (día 0) la concentración de alicina fue de 2.79 ±

0.005%, a los 8 y 16 días de almacenamiento la concentración se redujo a 2.67 ± 0.004%

a

b

c

36

y 2.56 ± 0.07%, respectivamente, lo que equivale a una disminución significativa

(p=0.049) del 8.24% de la concentración de alicina entre los días 0 y 16 (Figura 14).

Media

Media±ES

Día 0 Día 8 Día 16

Día de Ev aluación

2.50

2.52

2.54

2.56

2.58

2.60

2.62

2.64

2.66

2.68

2.70

2.72

2.74

2.76

2.78

2.80

2.82

% d

e a

licin

a

Figura 14. Concentración de alicina (%) en el polvo de ajo. Las letras diferentes establecen diferencias significativas (p<0.05) (ANOVA de Friedman, H(2)=6.0, p=0.049). ES=error estándar.

El análisis de la concentración de alicina en el extracto acuoso y en el polvo de ajo fue

fundamental para definir la forma y vía de suministro del tratamiento, con base en los

resultados se escogió el polvo de ajo como la presentación adecuada para los propósitos

de este trabajo.

La alimentación de los jureles involucra la introducción del alimento particulado en el

agua, donde los peces lo ingieren; el contacto del alimento con el agua, supone la

lixiviación de la alicina, ya que este compuesto es hidrosoluble. En la Figura 15 se

observan los resultados de las pruebas de lixiviación para el alimento adicionado con la

dosis baja y alta de polvo de ajo.

La máxima concentración de alicina lixiviada en la dosis baja se registró a los 1.5 min de

exposición al agua (1.02 ± 0.23%) y para la dosis alta a los 4.5 min (2.36 ± 0.99%). En

las medidas posteriores a los valores máximos de lixiviación para el alimento con la dosis

baja, se observó una disminución significativa de la concentración de alicina (p=0.0036),

a

b

c

37

mientras que con la dosis alta no se encontraron diferencias significativas. Cabe resaltar

que por el comportamiento alimenticio frenético del jurel, las partículas de alimento no

permanecieron en el agua un tiempo mayor a 10 segundos, por lo que la pérdida de

alicina por lixiviación debe ser menor al 28% en la dosis baja y 65% en la dosis alta de la

cantidad incluida en la dieta y que fue evaluada a los 30 segundos.

Tiempo

Alicin

a (

%)

Media

Media±ES Tratamiento: Dosis baja

0.5 min 1.5 min 4.5 min 13.5 min0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

2.2

2.4

2.6

2.8

3.0

Tratamiento: Dosis alta

0.5 min 1.5 min 4.5 min 13.5 min

Figura 15. Lixiviación de alicina en el alimento suplementado con la dosis baja (2%) y alta (4%) de polvo de ajo. Las letras diferentes establecen diferencias significativas (p<0.05) (Kruskal-Wallis, H(3)=13.52, p=0.0036). ES=error estándar.

6.2 Calidad del agua

En la Tabla 2 se resumen los resultados del análisis de la calidad del agua de los cultivos

de jurel para el periodo experimental. El experimento tuvo una duración de 61 días, en

los primeros 32 días la tasa de recambio del agua en las unidades de cultivo fue de 12

veces el volumen del tanque por día y la temperatura se mantuvo entre 24.9 ± 0.2 y 25.1

± 0.14 °C, lo que permitió mantener una condición adecuada de la calidad del agua y de

la condición de los organismos. Sin embargo, con el propósito de propiciar la infestación

de los jureles con Z. seriolae, a partir del día 33 se incrementó la temperatura del agua a

a

ab

ac ac

a

a

a

a

38

una tasa de 1 °C por día, hasta alcanzar 28 °C, además, se redujo la tasa de recambio

del agua a 3 veces el volumen del estanque por día.

La concentración de compuestos nitrogenados como nitrógeno amoniacal total (NAT) y

nitritos (NO2) se presentan en la Tabla 2. La concentración de NAT varió de 0.43 ± 0.29

a 0.58 ± 0.37 mg/l entre los tratamientos al día 32, mientras que a los 61 días del

experimento fue de 0.73 ± 0.21 a 0.82 ± 0.17; solamente se registró un aumento poco

significativo del NAT al día 61 en el grupo control (p=0.04). La concentración de NO2 se

mantuvo entre 0.52 ± 0.07 y 0.59 ± 0.20 mg/l al día 32 y de 0.45 ± 0.19 a 0.77 ± 0.46 mg/l

al día 61, estos valores no fueron significativamente diferentes entre los 32 y 61 días.

Tabla 2. Valores promedio de las variables relacionadas con la calidad del agua de las unidades de cultivo de jurel (Seriola lalandi), agrupadas en sus respectivos tratamientos: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%) de polvo de ajo en el alimento. Media ± Desviación estándar.

Día Control Dosis Baja Dosis Alta

Oxígeno disuelto (mg/l) 32 6.42 ± 0.36 6.33 ± 0.30 6.41 ± 0.29

61 5.92 ± 0.83 6.04 ± 0.60 6.13 ± 0.60

Saturación de oxígeno (%) 32 92.94 ± 8.06 101.50 ± 83.92 94.14 ± 4.04

61 90.82 ± 6.39 90.74 ± 8.23 92.12 ± 7.52

Temperatura (°C) 32 24.88 ± 0.20 24.98 ± 0.12 25.11 ± 0.14

61 28.01 ± 0.13 28.01 ± 0.10 28.09 ± 0.22

Salinidad (ups) 32 33.61 ± 0.08 33.61 ± 0.07 33.60 ± 0.07

61 33.39 ± 0.16 33.35 ± 0.13 33.32 ± 0.10

NAT (mg/l) 32 0.50 ± 0.26 0.43 ± 0.29 0.58 ± 0.37

61 0.76 ± 0.32 0.73 ± 0.21 0.82 ± 0.17

NO2 (mg/l) 32 0.55 ± 0.06 0.59 ± 0.20 0.52 ± 0.07

61 0.77 ± 0.46 0.45 ± 0.19 0.51 ± 0.12

6.3 Variables productivas

En la Tabla 3 se presenta el promedio y la desviación estándar del peso, longitud, índice

de condición de Fulton y el índice hepatosomático, para cada uno de los grupos

experimentales a los 0, 32 y 61 días del bioensayo. Cabe aclarar que al día 61, se registró

un evento de mortalidad súbita en dos de los tres tanques del grupo control, por lo que el

análisis estadístico para esta fecha solo se realizó entre los tratamientos dosis baja y alta.

39

En la evaluación de las variables productivas entre los tratamientos (control, dosis baja y

alta), solo se observaron diferencias significativas en el incremento en peso al día 32

(p=0.002, 0.003 y 0.002, respectivamente). Para la longitud, solamente se registraron

diferencias entre los días de muestreo (p=0.002, p<0.002 y p<0.034, del control, dosis

baja y alta, respectivamente) (Tabla 3).

El índice de condición de los peces disminuyó al día 61 para los grupos dosis baja

(p=0.005) y alta (p=0.003). Los organismos del tratamiento dosis baja, al día 32 tuvieron

un índice hepatosomático menor (1.15 ± 0.18%) (p=0.02) en comparación con el control

(1.41 ± 0.20%). En los peces del grupo control, el índice se incrementó de 1.18 ± 0.22 a

1.41 ± 0.20% (p=0.049) a los 32 días y en el grupo dosis alta disminuyó de 1.21 ± 0.21 a

1.06 ± 0.13 entre los 32 y 61 días del experimento (p=0.049).

Tabla 3. Análisis de los parámetros productivos en el transcurso del bioensayo, agrupados en sus respectivos grupos experimentales: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%). Media ± Desviación estándar. Letras mayúsculas se utilizaron para la comparación entre los días de evaluación en cada tratamiento y letras minúsculas para la comparación entre tratamientos, letras diferentes del mismo tipo, mayúsculas o minúsculas, son significativamente diferentes (p<0.05).

Días de muestreo

Tratamiento 0 32 61

Peso (g)

Control 174.88 ± 18.81aA 302.94 ± 46.48aB 340.11 ± 53.38*

Dosis baja 178.76 ± 26.19aA 283.88 ± 47.87aB 335.28 ± 70.74aB

Dosis Alta 189.73 ± 33.86aA 316.23 ± 40.52aB 354.14 ± 57.12aB

Longitud (cm)

Control 20.02 ± 0.83aA 23.81 ± 1.20aB 25.66 ± 1.07*

Dosis baja 20.07 ± 1.12aA 23.38 ± 1.16aB 25.33 ± 1.42aC

Dosis Alta 20.58 ± 1.17aA 24.13 ± 0.88aB 25.91 ± 1.43aC

Índice de condición de Fulton

Control 2.18 ± 0.11aA 2.23 ± 0.13aA 2.01 ± 0.24*

Dosis baja 2.21 ± 0.20aA 2.20 ± 0.14aA 2.04 ± 0.20aB

Dosis Alta 2.16 ± 0.15aA 2.24 ± 0.12aA 2.02 ± 0.13aB

Índice hepatosomático (%)

Control 1.18 ± 0.22aA 1.41 ± 0.20aB 1.00 ± 0.21*

Dosis baja 1.21 ± 0.25aA 1.15 ± 0.18bA 1.14 ± 0.21aA

Dosis Alta 1.25 ± 0.23aA 1.21 ± 0.21abA 1.06 ± 0.13aB

* Este tratamiento no se incluyó en el análisis estadístico.

En el análisis de la mortalidad solo se consideró el periodo comprendido del día 33 al 61,

ya que antes no se presentó mortalidad, donde se observó que los valores fueron de

40

58.33 ± 50.52, 29.17 ± 19.09 y 29.17 ± 26.02% en los grupos control, dosis baja y alta,

respectivamente, los cuales no fueron diferentes.

En relación al consumo de alimento, a los 32 días del experimento los organismos

consumieron todo el alimento según la ración diaria calculada y ajustada semanalmente.

Cuando se realizó la infestación experimental y se modificó la calidad del agua, en el

periodo comprendido entre los 33 y 61 días de experimentación, fue evidente que los

peces de algunas unidades de cultivo no estaban consumiendo la ración diaria completa,

por lo que se cuantificó la cantidad de alimento consumido. El consumo de alimento en

los jureles fue de 7.83 ± 2.31 g/pez en el grupo control, de 8.52 ± 1.44 g/pez en el grupo

dosis baja y de 9.20 ± 1.98 g/pez en el grupo dosis alta, lo que demuestra un mayor

consumo a medida que aumentaba la inclusión de ajo en el alimento (p<0.0001) (Figura

16).

Media Media±ES

Control Dosis baja Dosis alta

Tratamiento (Día 61)

7.4

7.6

7.8

8.0

8.2

8.4

8.6

8.8

9.0

9.2

9.4

9.6

Co

nsu

mo

de

alim

en

to (

g/p

ez)

Figura 16. Evaluación del consumo de alimento del jurel (S. lalandi), suplementado por 61 días con el 0, 2 y 4% de polvo de ajo (grupo control, dosis baja y alta, respectivamente) y expuesto a Z. seriolae por los últimos 29 días de experimento. Las letras diferentes establecen diferencias significativas (p<0.05). (Kruskal-Wallis, H(2)=41.55, p<0.0001). ES=error estándar.

Por otro lado, el factor de conversión alimenticia se evaluó al día 32 y fue de 1.57 ± 0.32,

1.82 ± 0.46 y 1.46 ± 0.32 en los grupos control, dosis baja y alta, sin observar diferencias

significativas.

a

b c

41

6.4 Prevalencia e intensidad parasitaria

El análisis microscópico de las branquias de los jureles reveló la presencia de Z. seriolae

en todos los tratamientos (Figura 17). En la Tabla 4 se presentan los resultados de la

prevalencia e intensidad parasitaria cuantificados al día 61, después de la introducción

de jureles infestados con Z. seriolae por un período de 29 días y del deterioro inducido

de la calidad ambiental (incremento de la temperatura y reducción de la tasa de recambio

de agua de mar); cabe resaltar que al inicio del experimento (día 0) y al día 32 (período

de consumo de la dieta experimental), se analizaron las branquias en busca de parásitos

o daño, con esta observación se comprobó que las branquias se encontraban en buen

estado y libres de parásitos.

Figura 17. Zeuxapta seriolae adherida a un filamento branquial de jurel Seriola lalandi.

En los organismos de los tratamientos dosis baja y alta, la prevalencia e intensidad media

parasitaria, no hubo diferencias significativas (Tabla 4). En el tratamiento control, la

mortalidad de un 88% de los jureles en dos de las tres unidades experimentales no

permitió hacer la comparación estadística de la prevalencia e intensidad con respecto a

los tratamientos (dosis alta y baja), sin embargo, la intensidad parasitaria promedio de

los jureles que sobrevivieron en la unidad control fue mayor (114.10 ± 132.31

parásitos/pez).

42

Tabla 4. Prevalencia e intensidad media de Zeuxapta seriolae en las branquias de jurel (Seriola lalandi) alimentado con una dieta enriquecida con polvo de ajo: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%). Media ± Desviación estándar. Las letras diferentes establecen diferencias significativas (p<0.05).

Control Dosis Baja Dosis Alta

Prevalencia (%) 100* 100a 93.33 ± 11.55a

Intensidad media (# de parásitos/pez) 114.10 ± 132.31* 89.71 ± 68.19a 52.47 ± 48.84a


En el último muestreo (61 días), se pudo observar la presencia de un dinoflagelado

parásito en las branquias de los jureles de todas las unidades experimentales. Este

dinoflagelado se detectó en otras unidades de cultivo del Departamento de Acuicultura

de CICESE, antes de que se identificaran los signos clínicos de esta parasitosis en los

organismos utilizados en este bioensayo (Figura 18). Es posible que la calidad del agua

en la última etapa del experimento haya propiciado la infestación de los jureles con este

dinoflagelado que ya estaba circulando en la red del sistema cerrado del Departamento.

Figura 18. (a) Dinoflagelados en branquias de jurel Seriola lalandi (2X), (b) Mucus de branquia de jurel infestado con dinoflagelados (flechas rojas) (10X).

a b

43

6.5 Análisis de componentes sanguíneos

6.5.1 Parámetros hematológicos

La interpretación de estos resultados se presenta haciendo un análisis del efecto entre

los tratamientos, posteriormente, el análisis de la respuesta en el transcurso de los días

del experimento y por último la evaluación clínica de los parámetros sanguíneos

evaluados.

En la Tabla 5 se presentan los valores de los parámetros hematológicos: concentración

de glóbulos rojos (GR), hematocrito (Hct), concentración total de glóbulos blancos (GB),

de sus diferentes tipos (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos) y la

concentración de trombocitos. En la Figura 19 se observan los diferentes tipos de

leucocitos, además de los trombocitos.

Figura 19. Glóbulos blancos del jurel (Seriola lalandi) señalados con flechas: a) Neutrófilo, b) Eosinófilo, c) Basófilo, d) Linfocito, e) Trombocito y f) Monocito.

En los jureles tratados con una dosis alta de ajo, se observó una disminución significativa

(p=0.001) de la concentración total de eritrocitos a los 32 días de evaluación (8.50 ± 0.76

cel x 106 /mm3). Al inicio del experimento, el porcentaje de hematocrito de los jureles fue

significativamente mayor (p=0.01) en el grupo dosis alta con 63.52 ± 3.68% y a los 32

días disminuyó (p=0.02) en el tratamiento dosis alta con un 53.1 ± 3.49%, contrastado

con el 57.69 ± 8.58 y 57.13 ± 4.51% del control y dosis baja, respectivamente. Finalmente

a los 61 días, el hematocrito del grupo dosis baja es menor (47.69 ± 5.45%, p=0.046) al

del grupo dosis alta (51.72 ± 5.72%) (Tabla 5).

44

Al inicio del bioensayo, en los peces del grupo dosis alta se registró un valor

significativamente mayor (p=0.003) en la concentración total de leucocitos (10.95 ± 1.18

cel x 103/mm3). Posteriormente, se presentó una disminución del recuento total de

leucocitos en el grupo dosis alta en los días 32 (5.35 ± 1.33 cel x 103/mm3) y 61 (6.88 ±

1.67 cel x 103/mm3) (p=0.01 y 0.0008, respectivamente) con respecto al grupo control y

dosis baja (Tabla 5).

La concentración inicial de eosinófilos fue menor (p=0.02) en el grupo dosis alta (67.98 ±

62.54 cel/µl) al inicio del experimento. A los 32 días, se observó un incremento (p=0.004)

en los organismos del grupo dosis alta de 614.68 ± 521.75 cel/µl con respecto a 127.01

± 91.64 y 157.22 ± 113.17 cel/µl del control y dosis baja, respectivamente. Mientras que

la cantidad de basófilos fue mayor (p=0.007) en el tratamiento dosis baja a los 32 días

con 64.35 ± 61.83 cel/µl en comparación a los 9.35 ± 19.82 y 34.26 ± 29.52 cel/µl del

grupo control y dosis alta, respectivamente (Tabla 5).

Al inicio del experimento, en el grupo dosis alta se observó una mayor cantidad de

linfocitos (4896.99 ± 1219.65 cel/µl) (p=0.03) y posteriormente una disminución (p=0.003)

a los 61 días (3452.78 ± 771.72 cel/µl) con respecto al grupo dosis baja (6123.05 ±

3824.75 cel/µl). En relación a la cantidad de trombocitos, en los peces del grupo dosis

alta se registró una disminución (p=0.02) en la cantidad de trombocitos en el grupo dosis

alta a los 61 días, con una concentración de 1213.70 ± 805.11 cel/µl comparado con las

2699.49 ± 1779.40 cel/µl del grupo dosis baja (Tabla 5).

En el análisis de cada tratamiento en el transcurso del tiempo, se encontraron diferencias

significativas (p=0.004) en la disminución de la concentración total de eritrocitos del grupo

dosis alta a los 61 días (7.06 ± 1.08 cel x 103/mm3). También se observó una disminución

del valor del hematocrito en los organismos de los grupos dosis alta (53.1 ± 3.49%)

(p=0.01) a los 32 días y el grupo dosis baja (47.69 ± 5.45%) (p=0.003) al día 61 (Tabla

5).

45

En los organismos del grupo dosis alta, el número total de leucocitos (5.35 ± 1.33 cel x

103/mm3) disminuyó significativamente (p=0.01) a los 32 días y posteriormente aumentó

(p=0.02) a los 61 días (6.88 ± 1.67 cel x 103/mm3) (Tabla 5).

En relación a la concentración de neutrófilos, en el grupo dosis alta disminuyó

significativamente (p=0.008) a los 32 días (496.6 ± 341.45 cel/µl). Por otra parte se

registró un incremento significativo (p=0.005) en la concentración de los eosinófilos del

grupo dosis baja a los 61 días (2280.26 ± 2120.11 cel/µl) y en el grupo dosis alta

(p=0.004) a partir de los 32 días (614.68 ± 521.75 cel/µl). La cantidad de basófilos del

grupo control disminuyó (p=0.03) al día 32 de 110.41 ± 188.35 cel/µl el día 0 a 9.35 ±

19.82 cel/µl. También hubo un incremento (p=0.02) del 106% en los basófilos (70.66 ±

89.33 cel/µl) en el grupo dosis alta a los 61 días (Tabla 5).

En el número de linfocitos se observó una disminución (p=0.008) en los peces del grupo

dosis alta a los 32 días (2816.76 ± 941.20 cel/µl). En relación a la concentración de

monocitos fue evidente una disminución en el grupo dosis baja (186.98 ± 134.65 cel/µl) y

alta a los 32 días (259.24 ± 177.71 cel/µl) (p=0.008 y 0.02, respectivamente), el mismo

efecto se observó en los trombocitos del grupo dosis alta a los 32 días (1130.54 ± 623.41

cel/µl) (p=0.01) (Tabla 5).

46

Tabla 5. Parámetros hematológicos del jurel Seriola lalandi alimentado con una dieta suplementada con ajo: Control (0%), Dosis baja (2%) y Dosis alta (4%) y evaluados a los 0, 32 y 61 días. Media ± Desviación estándar. Se utilizaron letras mayúsculas para la comparación entre los días de evaluación en cada tratamiento y letras minúsculas para la comparación entre tratamientos, letras diferentes del mismo tipo, mayúsculas o minúsculas, indican las diferencias significativas (p<0.05).

Días de muestreo

Tratamiento 0 32 61

Eritrocitos (cel x 106/mm3)

Control 8.99±1.30aA 9.86±0.77aA 9.03±1.70*

Dosis baja 8.81±0.98aA 9.08±0.82abA 7.77±1.92aA

Dosis Alta 8.67±1.28aA 8.50±0.76bA 7.06±1.08aB

Hematocrito (%)

Control 58.84±2.55aA 57.69±8.58aA 51.78±6.56*

Dosis baja 60.34±4.88abA 57.13±4.51abA 47.69±5.45 aB

Dosis Alta 63.52±3.68bA 53.10±3.49bB 51.72±5.72bB

Leucocitos (cel x 103/mm3)

Control 7.90±2.04aA 8.46±3.32 aA 13.78±5.98*

Dosis baja 8.01±1.23aA 8.18±3.28abA 13.08±5.83 aA

Dosis Alta 10.95±1.18bA 5.35±1.33bB 6.88±1.67bC

Neutrófilos (cel/µl)

Control 805.61±450.32aA 860.74±648.78aA 1685.08±830.32*

Dosis baja 965.61±511.13aA 697.95±608.96aA 1215.74±730.27aA

Dosis Alta 1331.39±749.01aA 496.60±341.45aB 978.86±749.88aAB

Eosinófilos (cel/µl)

Control 380.11±413.05aA 127.01±91.64aA 3616.04±4018.90*

Dosis baja 196.72±181.58abA 157.22±113.17aA 2280.26±2120.11aB

Dosis Alta 67.98±62.54bA 614.68±521.75bB 1257.89±1277.09aB

Basófilos (cel/µl)

Control 110.41±188.35aA 9.35±19.82aB 238.35±278.41*

Dosis baja 53.23±61.69aA 64.35±61.83bA 97.33±92.48aA

Dosis Alta 73.10±102.82aA 34.26±29.52abA 70.66±89.33aB

Linfocitos (cel/µl)

Control 3408.77±951.73aA 3680.30±2398.55aA 5902.05±5001.55*

Dosis baja 4036.53±1565.65abA 4455.56±1500.43aA 6123.05±3824.75aA

Dosis Alta 4896.99±1219.65bA 2816.76±941.20aB 3452.78±771.72bB

Monocitos (cel/µl)

Control 449.28±197.76aA 572.41±419.59aA 121.54±119.17*

Dosis baja 579.51±419.32aA 186.98±134.65aB 295.17±371.09aB

Dosis Alta 930.68±733.57aA 259.24±177.71aB 280.29±346.28aB

Trombocitos (cel/µl)

Control 2750.60±1224.10aA 3018.35±2736.73aA 2219.45±1031.54*

Dosis baja 2182.98±1240.82aA 2216.88±1333.21aA 2699.49±1779.40aA

Dosis Alta 2364.45±1174.29aA 1130.54±623.41aB 1213.70±805.11bB


47

6.5.2 Química sanguínea

En la Tabla 6 se presentan los resultados del análisis de la concentración de proteínas

totales, albúmina y globulina. La interpretación de estos resultados se realizó de la misma

forma que en la sección de los parámetros hematológicos.

En el análisis entre tratamientos, al inicio del experimento, los peces del grupo dosis baja

tuvieron la mayor concentración de proteínas totales (71.55 ± 4.57 mg/ml) y globulina

(60.16 ± 4.12 mg/ml) (p=0.005 y 0.0003, respectivamente), y en el grupo dosis alta

solamente la albúmina (15.39 ± 1.67 mg/ml) (p=0.0001). Al día 32 se presentó una

disminución significativa en el grupo dosis baja de la concentración de proteínas totales

(59.80 ± 3.88 mg/ml) (p=0.0007) y globulina (48.07 ± 3.03 mg/ml) (p=0.0001); en este día

de evaluación también hubo un incremento en la concentración de albúmina (10.71 ± 1.72

mg/ml) en los organismos del grupo dosis baja (p=0.03), contrario a la disminución

observada en el grupo dosis alta (8.89 ± 0.91 mg/ml) (p=0.03) (Tabla 6).

El análisis de los cambios temporales de la química sanguínea indicaron una disminución

en la concentración de proteínas totales del grupo dosis baja a los 32 días (59.80 ± 3.88

mg/ml) (p=0.002). Los peces del grupo dosis alta, tuvieron una menor concentración de

albúmina a los 32 días (8.89 ± 0.91 mg/ml) (p=0.002) y posteriormente aumentó a los 61

días (13.28 ± 2.19 mg/ml) (p=0.002) (Tabla 6).

En cuanto a la concentración de globulinas, en el grupo dosis baja se observó una

disminución de 60.16 ± 4.12 a 48.07 ± 3.03 mg/ml al día 32 (p=0.002) y después de la

infestación experimental se registró un aumento del 10.1% (p=0.04), mientras que, en el

grupo dosis alta hubo un aumento a los 32 días (57.86 ± 6.36 mg/ml) (p=0.02) y

posteriormente una disminución a los 61 días (49.40 ± 2.86 mg/ml) (p=0.01) (Tabla 6).

48

Tabla 6. Concentración de proteínas sanguíneas del jurel Seriola lalandi alimentado con una dieta suplementada con polvo de ajo (Control 0%, Dosis baja 2% y Dosis alta 4%) y evaluados a los 0, 32 y 61 días de cultivo. Media ± Desviación estándar. Se utilizaron letras mayúsculas para la comparación entre los días de evaluación en cada tratamiento y letras minúsculas para la comparación entre tratamientos, letras diferentes del mismo tipo, mayúsculas o minúsculas, indican las diferencias significativas (p<0.05).

Días de muestreo

Tratamiento 0 32 61

Proteínas totales (mg/ml)

Control 63.11±4.02aA 65.69±2.23aA 66.64±4.52*

Dosis baja 71.55±4.57bA 59.80±3.88bB 63.54±8.53aB

Dosis Alta 67.20±2.84abA 66.52±6.27aA 63.34±3.74aA

Albúmina (mg/ml)

Control 9.84±2.14aA 9.39±1.0aA 14.14±2.72*

Dosis baja 10.83±2.55aA 10.71±1.72abA 11.49±4.46aA

Dosis Alta 15.39±1.67bA 8.89±0.91acB 13.28±2.19aC

Globulina (mg/ml)

Control 53.55±5.37aA 56.15±2.18aA 52.50±2.70*

Dosis baja 60.16±4.12bA 48.07±3.03bB 52.93±5.78aC

Dosis Alta 51.08±2.82aA 57.86±6.36aB 49.40±2.86aC


6.5.3 Interpretación clínica de resultados de hematología y química

sanguínea del jurel

Para interpretar los resultados del análisis clínico, primero se definieron los valores de

referencia para cada una de las variables a partir de los valores obtenidos al día 0,

tomando en cuenta los datos dentro de los percentiles 5 y 95, como valores mínimo y

máximo, así como haber constatado que los organismos se encontraban libres de

parásitos. En la Figura 20 se presenta un gráfico de dispersión de la concentración de

eosinófilos donde se ejemplifica el criterio para delimitar el intervalo de los valores de

referencia. Las líneas de color rojo delimitan el intervalo para cada parámetro. Los valores

que estén fuera de este intervalo (inferiores o superiores) se consideraron como valores

anormales. Para cada grupo se calculó la proporción de individuos, la media y la

desviación estándar.

49

Figura 20. Dispersión de la concentración de eosinófilos en el jurel (Seriola lalandi) para establecer los valores de referencia.

Los resultados de la hematología clínica se detallan en la Tabla 7, donde se presentan

los valores de referencia para cada variable, además de la proporción de organismos que

se encontraron fuera del rango normal junto a la media y la desviación estándar.

El intervalo normal de eritrocitos en los peces fue de 6.9 a 11.4 cel x 106, se observó a

los 61 días de evaluación, una disminución de esta variable en el 10% (6.88 cel x

106/mm3) del grupo control, 29.41% (5.43 ± 1.49 cel x 106/mm3) del grupo dosis baja y

23.53% (5.85 ± 3.15 cel x 106/mm3) del grupo dosis alta, solamente se observó el

aumento de los eritrocitos en el 5.88% (12.81 cel x 106/mm3) del grupo dosis baja.

En el jurel, los valores de referencia para hematocrito van del 48.6 al 66.4%. A los 32 días

el 8.33 (33.8%) y 16.67% (47.98 ± 0.39%) de los organismos de los grupos control y dosis

alta disminuyeron, mientras que el 8.33% (66.8%) aumentó. Este efecto también se

presentó a los 61 días en el 40% (46.9 ± 2.60%) del grupo control, 35.29% (42.75 ±

2.83%) del grupo dosis baja y 29.41% (45.13 ± 2%) del grupo dosis alta (Tabla 7).

La distribución de los datos de leucocitos totales fuera de un intervalo de 5.1 a 12.3 cel x

106/mm3 fue muy variable, ya que se observó a los 32 días que los grupos control y dosis

baja presentaron leucocitosis en el 16.67% (14.09 ± 2.17 cel x 106/mm3) y 8.33% (14.55

50

cel x 106/mm3) de los organismos y leucopenia en los tres tratamientos en el 8.33% de

los organismos del grupo control (3.72 cel x 106/mm3) y en el 41.67% de los peces que

recibieron la dosis baja (3.97 ± 0.83 cel x 106/mm3) y alta (4.09 ± 0.66 cel x 106/mm3) de

ajo. Asimismo, después de la infestación experimental, se presentó leucocitosis en el 50

(18.78 ± 3.91 cel x 106/mm3), 41.18% (18.78 ± 3.86 cel x 106/mm3) y 11.76% (12.67 ±

0.18 cel x 106/mm3) de los organismos en los tres tratamientos y leucopenia en el 5.88%

(4.65 cel x 106/mm3) y 11.76% (4.54 ± 0.72 cel x 106/mm3) de los grupos dosis baja y alta

(Tabla 7).

Los valores de referencia de neutrófilos variaron de 241.5 a 2328.8 cel/µl, con base en

esto se observa que a los 32 días, hubo una marcada neutropenia en el 8.33% (156.25

cel/µl), 16.67% (174.25 ± 44.90 cel/µl) y 33.33% (187.12 ± 52.75 cel/µl) de los peces de

los grupos control, dosis baja y alta, respectivamente. Por el contrario, a los 61 días se

presenta neutrofilia en el 30% (2512.21 ± 147.46 cel/µl), 11.8% (2701.56 ± 314.40 cel/µl)

y 5.88% (2880 cel/µl) de los tres grupos experimentales, también se observó neutropenia

en el 10% (182.5 cel/µl) y 5.88% (142.5 cel/µl) del grupo control y dosis baja (Tabla 7).

La evidencia de una eosinofilia, se presentó cuando los valores estuvieron fuera del

intervalo normal de 0 a 879.8 cel/µl y se registró en el grupo dosis alta a los 32 días en

un 25% de la población (1347.33 ± 392.68 cel/µl), condición que se mantuvo hasta los 61

días con un 90% (3927.26 ± 4132.90 cel/µl), 76.47% (3402.86 ± 2481.66 cel/µl) y 52.94%

(2960.24 ± 1905.98 cel/µl) de la población de los grupos control, dosis baja y alta,

respectivamente. Por otro lado, la concentración de basófilos en el intervalo de referencia

fue de 0 a 492.4 cel/µl y los eventos de basofilia se registraron en el grupo dosis baja a

los 32 días y control al día 61, en el 8.33% (582 cel/µl) y 10% (873.25 cel/µl) de los

organismos, respectivamente (Tabla 7).

Los valores de referencia de linfocitos tuvieron un intervalo de 2046 a 6580.9 cel/µl y en

la evaluación posterior a la alimentación experimental se observó linfocitosis en el 16.67

(8093.25 ± 707.81 cel/µl) y 8.33% (7161 cel/µl) en los organismos del grupo control y

dosis baja, también se presentó linfopenia en el 33.33% del grupo control (1500.94 ± 330

cel/µl) y dosis alta (1804.31 ± 167.10 cel/µl) y en el 16.67% del grupo dosis baja (1547.56

51

± 604.49 cel/µl). Por otro lado, a los 61 días se observaron ambas condiciones en los

grupos control (linfocitosis en el 40% de los organismos de 11290.41 ± 2635.54 cel/µl y

linfopenia en el 30% de los peces de 1062.83 ± 577.51 cel/µl) y dosis baja (linfocitosis en

el 29.41% de los organismos de 10725.05 ± 3612 cel/µl y linfopenia en el 11.76% con

organismos de 1070 ± 656.90 cel/µl) (Tabla 7).

En la mayor parte de los casos se observó una disminución en la concentración de

monocitos, tomando en cuenta el intervalo de referencia de 51 a 1863 cel/µl, a los 32

días, en el 8.33% (2879.38 cel/µl) del grupo control y 16.67% del grupo dosis baja (39 ±

12.02 cel/µl) y alta (38.88 ± 10.25 cel/µl). Este efecto también se registró a los 61 días,

en el 40% del grupo control (8.56 ± 17.12 cel/µl) y el 23.53% del grupo dosis alta (8.97 ±

17.94 cel/µl) al día. En los peces del grupo control solamente se presentó monocitosis en

el 8.33% (2879.38 cel/µl) de los organismos a los 32 días de evaluación (Tabla 7).

Por último, de un rango de referencia de 671.6 a 4810 cel/µl en los trombocitos, a los 32

días se registró trombocitosis en el 25% del grupo control (6851.38 ± 2653.85 cel/µl) y

8.33% del grupo dosis baja (5310.75 cel/µl); la trombocitopenia se observó en el 16.67%

del grupo control (376.19 ± 90.77 cel/µl), 8.33% de dosis baja (495 cel/µl) y 25% de dosis

alta (373.29±159.38 cel/µl). En el día 61, se presentó un aumento en el 17.65%

(5430.62±471.49 cel/µl) y disminución en el 11.76% (450.38±86.44 cel/µl) de los

organismos del grupo dosis baja y en el grupo dosis alta se detectó trombocitosis en el

5.88% (5529 cel/µl) y trombocitopenia en el 17.65% (351.83±190.51 cel/µl) de los peces

evaluados (Tabla 7).

52

Tabla 7. Interpretación clínica de los resultados de la hematología del jurel (Seriola lalandi), posterior al periodo de alimentación experimental con polvo de ajo (día 32) y la infestación experimental con Z. seriolae (día 61). Proporción de organismos fuera del rango normal (%) superior e inferior y media ± desviación estándar. IR= intervalo de referencia.

IR Tratamiento Día 32 Día 61

Eritrocitos (cel x 106/mm3)

6.9-11.4

Control ꜛ8.33% (11.46) ꜜ10% (6.88)

Dosis baja 0% ꜜ29.41% (5.43±1.49)

Dosis Alta 0% ꜛ5.88% (12.81)

ꜜ23.53% (5.85±3.15)

Hematocrito (%) 48.6-66.4

Control ꜛ8.33% (66.8)

ꜜ8.33% (33.8) ꜜ40% (46.9±2.60)

Dosis baja 0% ꜜ35.29% (42.75±2.83)

Dosis Alta ꜜ16.67%(47.98±0.39) ꜜ29.41% (45.13±2)

Leucocitos (cel x 103/mm3)

5.1-12.3

Control ꜛ16.67% (14.09±2.17)

ꜜ8.33% (3.72) ꜛ50% (18.78±3.91)

Dosis baja ꜛ8.33% (14.55)

ꜜ41.67% (3.97±0.83)

ꜛ41.18% (18.78±3.86)

ꜜ5.88% (4.65)

Dosis Alta ꜜ41.67% (4.09±0.66) ꜛ11.76% (12.67±0.18)

ꜜ11.76% (4.54±0.72)

Neutrófilos (cel/µl)

241.5-2328.8

Control ꜜ8.33% (156.25) ꜛ30% (2512.21±147.46)

ꜜ10% (182.5)

Dosis baja ꜜ16.67% (174.25±44.90) ꜛ11.8% (2701.56±314.40)

ꜜ5.88% (142.5)

Dosis Alta ꜜ33.33% (187.12±52.75) ꜛ5.88% (2880)

Eosinófilos (cel/µl)

0-879.8

Control 0% ꜛ90% (3927.26±4132.90)

Dosis baja 0% ꜛ76.47% (3402.86±2481.66)

Dosis Alta ꜛ25% (1347.33±392.68) ꜛ52.94% (2960.24±1905.98)

Basófilos (cel/µl) 0-492.4

Control 0% ꜛ10% (873.25)

Dosis baja ꜛ8.33% (582) 0%

Dosis alta 0% 0%

Linfocitos (cel/µl)

2046-6580.9

Control ꜛ16.67% (8093.25±707.81)

ꜜ33.33% (1500.94±330)

ꜛ40% (11290.41±2635.54)

ꜜ30% (1062.83±577.51)

Dosis baja ꜛ8.33% (7161)

ꜜ16.67% (1547.56±604.49)

ꜛ29.41% (10725.05±3612)

ꜜ11.76% (1070±656.90)

Dosis Alta ꜜ33.33% (1804.31±167.10) 0%

Monocitos (cel/µl)

51-1863

Control ꜛ8.33% (2879.38)

ꜜ8.33% (40.88) ꜜ40% (8.56±17.12)

Dosis baja ꜜ16.67% (39±12.02) 0%

Dosis Alta ꜜ16.67% (38.88±10.25) ꜜ23.53% (8.97±17.94)

Trombocitos (cel/µl)

671.6-4810

Control ꜛ25% (6851.38±2653.85)

ꜜ16.67% (376.19±90.77) 0%

Dosis baja ꜛ8.33% (5310.75)

ꜜ8.33% (495)

ꜛ17.65% (5430.62±471.49)

ꜜ11.76% (450.38±86.44)

Dosis Alta ꜜ25% (373.29±159.38) ꜛ5.88% (5529)

ꜜ17.65% (351.83±190.51)

53

En la Tabla 8 se presentan los resultados del análisis clínico de las proteínas totales,

albúmina y globulina del jurel, donde se muestran los valores de referencia para cada

variable, además de la proporción de organismos que se encontraron fuera del intervalo

normal junto a la media y la desviación estándar.

En las proteínas totales, del intervalo normal de 57.1 a 76.1 mg/ml, en el grupo dosis baja

y alta se reportó hipoproteinemia en el 8.33% (48.92 y 53.4 mg/ml, respectivamente) de

los organismos a los 32 días y 23.53% (52.25 ± 4.22 mg/ml) y 6.25% (55.87 mg/ml) al día

61. En el grupo dosis baja, a los 61 día se registró hiperproteinemia en el 11.76% (77.34

± 1.29 mg/ml) de los organismos (Tabla 8). En la concentración de albúmina sucedió lo

contrario, ya que se presentó un aumento del valor normal de 7.1 a 16.4 mg/ml, en el

30% (17.02 ± 0.15 mg/ml), 5.88% (21.86 mg/ml) y 11.76% (17.14 ± 0.05 mg/ml) de los

peces de los grupos control, dosis baja y alta al día 61 de evaluación; únicamente se

detectó hipoalbuminemia en el 17.65% (5.44 ± 1.34 mg/ml) de los organismos del grupo

dosis baja (Tabla 8).

Finalmente, en los organismos de los grupos dosis baja y alta correspondientes al 25%

(43.92 ± 2.59 mg/ml) y 8.33% (44.46 mg/ml) a los 32 días del bioensayo y 5.88% (44.72

mg/ml) y 18.75% (45.66 ± 0.46 mg/ml) a los 61 días, corresponden a los valores que

quedaron fuera del intervalo normal de la concentración de globulinas que iba de 46.6-

66.8 mg/ml (Tabla 8).

54

Tabla 8. Interpretación clínica de los resultados de las proteínas totales, albúmina y globulinas, que son parte de la química sanguínea del jurel (Seriola lalandi) posterior al periodo de alimentación experimental con polvo de ajo (día 32) y la infestación experimental con Z. seriolae (día 61). Proporción de organismos fuera del rango normal (%) y media ± desviación estándar. IR= intervalo de referencia.

IR Tratamiento Día 32 Día 61

Proteínas totales (mg/l)

57.1-76.1

Control 0% 0%

Dosis baja ꜜ8.33% (48.92) ꜛ11.76% (77.34±1.29)

ꜜ23.53% (52.25±4.22)

Dosis Alta ꜜ8.33% (53.4) ꜜ6.25% (55.87)

Albúmina (mg/ml)

7.1-16.4

Control 0% ꜛ30% (17.02±0.15)

Dosis baja 0% ꜛ5.88% (21.86)

ꜜ17.65% (5.44±1.34)

Dosis Alta 0% ꜛ11.76% (17.14±0.05)

Globulina (mg/ml)

46.6-66.8

Control 0% 0%

Dosis baja ꜜ25% (43.92±2.59) ꜜ5.88% (44.72)

Dosis Alta ꜜ8.33% (44.46) ꜜ18.75% (45.66±0.46)

55

Capítulo 7. Discusión

En este trabajo se evaluó la concentración de alicina en el extracto acuoso y en el polvo

de ajo y el efecto de la adición del polvo de ajo sobre la prevalencia e intensidad media

parasitaria, las variables productivas, hematológicas y la química sanguínea de juveniles

de jurel (S. lalandi) cultivados bajo condiciones experimentales y desafiados con Z.

seriolae.

Al trabajar con productos naturales, es muy importante conocer la concentración de los

principios activos que lo componen, aún más si estos son altamente inestables. En el

extracto de ajo, se observó que la concentración promedio de alicina fue de 0.047 ±

0.003% y en el polvo de ajo fue de 2.79 ± 0.005%. El contenido promedio de alicina en el

polvo del ajo utilizado en este trabajo fue similar al de otros ajos cultivados en distintas

zonas geográficas de Irán, que van desde 1.75 ± 0.1 hasta 13.03 ± 1.7% de alicina

(Baghalian et al., 2005).

Al adicionar el polvo de ajo a las partículas de alimento usando aceite como producto

adherente, hay que tomar en cuenta que el fitobiótico se encuentra en contacto más

directo con el agua del cultivo, lo que puede propiciar pérdidas por lixiviación, en contraste

con lo que ocurre cuando el ajo se adiciona junto con las materias primas al momento de

producir el alimento. Por esta razón, es necesario hacer pruebas de lixiviación, en

particular para cuantificar las pérdidas de alicina. En este sentido, Militz et al. (2013)

cuantificaron una pérdida menor al 3% de alicina en el alimento suplementado con

extracto de ajo a una dosis de 150 ml/kg; en el presente bioensayo, se cuantificó a los 30

segundos una pérdida por lixiviación equivalente al 28 y 65% del contenido inicial de

alicina para las dosis de 2 y 4% de polvo de ajo, respectivamente. Probablemente, esta

diferencia en la lixiviación de alicina tenga que ver con la forma en la que se adicionó el

ajo, ya que Militz et al. (2013) lo mezclaron con el resto de los ingredientes previo a la

pelletización de la dieta y en el presente trabajo con jurel, se hizo por medio de un

recubrimiento externo del pellet con aceite de pescado.

56

El aceite derivado de pescados y mariscos se utiliza en forma común como agente

adherente para el suministro de ciertos fármacos en el alimento de los peces. Duis et al.

(1995) observaron que a los 15 minutos de que las partículas de alimento recubiertas con

antibióticos como la oxitetraciclina, la amoxicilina, el trimetoprim/sulfametoxazol y ácido

oxolínico permanecieron en el agua, se registró una pérdida del 8.4 al 67.3% del fármaco,

y que utilizando alginato de calcio la lixiviación se registró del 0 al 24%, por lo que esta

última opción podría ser evaluada en futuros bioensayos relacionados con el

recubrimiento externo del alimento con el polvo de ajo.

Es importante resaltar que durante el desarrollo del experimento, no se observó que los

peces rechazaran el alimento suplementado con polvo de ajo en ninguna de sus

proporciones (2 y 4%), ya que después de la alimentación no se encontró alimento en el

fondo de los tanques; de manera similar, Militz et al. (2013) y Martins et al. (2002)

observaron que la adición de ajo al alimento, no disminuye su palatabilidad.

En las variables productivas, el peso y longitud de los peces, no fueron afectados por la

dosis de ajo (2 y 4%) incluida en el alimento, lo que también se observó en Piaractus

mesopotamicus (infestado con Anacanthorus penilabiatus), el cual recibió alimento

suplementado con disulfuro de alilo por 15, 30 y 45 días (Martins et al., 2002) y en

Oncorhynchus mykiss (infectado experimentalmente con Aeromona hydrophila) al

proporcionarle alimento con alicina comercial durante 14 días (Nya et al., 2010). La

inclusión de ajo o de alguno de sus componentes, también ha producido un aumento del

peso final. En Oreochromis niloticus, la adición del 3% de polvo de ajo a la dieta produjo

un incremento del 21% a los 60 días de alimentación (Felicitta et al., 2013) y al agregar

el 1%, el incremento en peso fue del 12.94% después de 60 días (Mehrim et al., 2014).

El índice de condición no fue afectado por los tratamientos, pero es notable una

disminución después de la infestación experimental. Estos resultados concuerdan con lo

reportado por Nya et al. (2010), quienes expusieron a O. mykiss a la alicina pura, la cual

no afectó el factor de condición; en contraste, en Acipenser ruthenus se observó un mayor

índice de condición cuando los organismos recibieron una dieta suplementada con 2%

de polvo de ajo por 12 semanas (0.52 ± 0.08) (Lee et al., 2014).

57

Un análisis de la dinámica estacional de la carga parasitaria de Z. seriolae en Seriola

dumerili, capturado del medio silvestre, indicó que a una mayor longitud del hospedero,

la carga parasitaria y el índice de condición eran menores, este resultado estaba muy

relacionado con la temperatura del agua, ya que en los meses más cálidos (abril-octubre),

cuando la temperatura del agua incrementó de 17.3 a 27 °C se registró una disminución

del peso y un aumento en la intensidad y abundancia parasitaria (Repullés-Albelda et al.,

2013). Lo contrario a esta observación, se documentó en Lutjanus guttatus parasitado

con dactilogíridos (Del Rio-Zaragoza et al., 2010) y en S. dumerili con Z. seriolae (Montero

et al., 2004), en los cuales no se observaron efectos en el índice de condición debido a

la intensidad parasitaria.

En los organismos, la evaluación del índice hepatosomático está relacionado con el

contenido de grasa en el hígado, es específico para cada especie y en los peces

teleósteos oscila entre 1.09 y 5.65% (Ando et al., 1993; Oguri, 1978, 1985). En Seriola

quinqueradiata, el valor del índice es sensible al contenido energético y proteico de la

dieta y puede variar de 1.40 a 1.70% (Shimeno et al., 1985). En el presente trabajo con

S. lalandi, se observó que después del periodo de alimentación experimental, el índice

hepatosomático fue mayor en el grupo control (1.41 ± 0.20%), en contraste con los

tratamientos dosis baja y alta (1.15 ± 0.18 y 1.21 ± 0.21). Estos resultados son similares

a lo documentado en O. niloticus que recibió alimento suplementado con ajo por 3 meses,

donde el índice hepatosomático fue mayor en el control sin ajo (1.90 ± 0.09%), en

comparación con los tratamientos con ajo fresco (40 g/kg de la dieta), aceite de ajo (150

mg/kg de la dieta) y polvo de ajo (32 g/kg) (de 1.58 a 1.63%) (Metwally, 2009). En el

esturión, A. ruthenus, este índice fue disminuyendo a medida que aumentaba la

concentración de polvo de ajo, de 1.87 ± 0.05% con 0.5% de polvo de ajo a 1.71 ± 0.11%

con 3% de polvo de ajo (Lee et al., 2014). Por el contrario, en O. niloticus no se

observaron diferencias entre los diferentes niveles de suplementación de ajo (Shalaby et

al., 2006).

El efecto del ajo en la disminución del índice hepatosomático, está relacionado con la

disminución de los niveles de lípidos en la sangre e hígado de los peces, ya que este

fitobiótico inhibe las enzimas involucradas en la síntesis de colesterol y ácidos grasos e

58

incrementa el uso del colesterol previamente sintetizado (Al-Salahy y Mahmoud, 2003;

Metwally, 2009; Cardelle-Cobas et al., 2010; Gao et al., 2013; Lee et al., 2014).

La presencia de parásitos en los organismos de cultivo son un problema por resolver y

complica el desarrollo del ciclo productivo (Bondad-Reantaso et al., 2005).

Específicamente en el jurel, se ha reportado la incidencia de parásitos monogéneos, entre

los que resalta Z. seriolae. Este organismo parasita a los jureles silvestres y a los

cultivados, se han descrito intensidades parasitarias de 5 a 731 parásitos/pez y la

magnitud de la infestación se ha relacionado positivamente con la temperatura del agua

(Montero et al., 2004; Mansell et al., 2005; Lia et al., 2007; Lu et al., 2012; Repullés-

Albelda et al., 2013).

La terapia utilizada para remover y eliminar el parásito branquial Z. seriolae se ha

restringido al uso de productos como el prazicuantel, el peróxido de hidrógeno y la

formalina (Sharp et al., 2004; Mansell et al., 2005; Williams et al., 2007). En otras especies

se ha utilizado el ajo contra parásitos como en Lates calcarifer (Militz et al., 2013), Poecilia

reticulata (Fridman et al., 2014) y P. mesopotamicus (Martins et al., 2002), y para el

tratamiento de infecciones bacterianas en O. mykiss (Nya y Austin, 2009; Nya et al.,

2010), O. niloticus (Aly et al., 2008, 2010), Dicentrarchus labrax (Colorni et al., 1998) y L.

calcarifer (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). En S. lalandi no se ha documentado el uso de

este fitobiótico como agente para el tratamiento de ectoparásitos o de infecciones

bacterianas.

Los resultados de este trabajo indican que el consumo del alimento enriquecido con dos

concentraciones de polvo de ajo (2 y 4%) no redujo en forma significativa la intensidad

media del parásito Z. seriolae. En contraste, en L. calcarifer, P. reticulata y P.

mesopotamicus se observó una reducción de los parásitos Neobenedenia sp. (Militz et

al., 2013), Dactylogyrus sp. (Fridman et al., 2014) y A. penilabiatus (Martins et al., 2002),

respectivamente. Es probable que estas diferencias se deben a que en S. lalandi se

utilizaron las concentraciones establecidas por Fridman et al. (2014) en P. reticulata, por

lo que será necesario determinar la concentración de ajo adecuada para el jurel.

59

Z. seriolae no fue el único parásito que se observó en el periodo comprendido del día 33

al 61 de experimento, la presencia de un dinoflagelado parásito, similar a Amyloodinum

ocelatum, proliferó solamente en las branquias de los jureles. Este microorganismo es un

ectoparásito que se encuentra en forma común en la piel y branquias de organismos

marinos y ocasiona problemas sanitarios debido a su rápida reproducción, por su ciclo

de vida directo, que se caracteriza por tres estadios: el trofozoíto, que es la fase adulta y

se adhiere al epitelio del hospedero a través de una estructura tipo rizoide, con la que se

mantiene adherido hasta que madura y se desprende; el tomonte, que es el estadio

reproductivo, se encuentra en el fondo marino y se divide para formar las dinosporas, que

son el estadio de vida libre y el único reconocido como susceptible a los tratamientos

antimicrobianos (Francis-Floyd y Floyd, 2011; Noga, 2011; Woo y Buchmann, 2012).

Es importante destacar que en S. lalandi, la presencia del dinoflagelado muy probable A.

ocelatum, se suscitó cuando se propició que los jureles se parasitaran con Z. seriolae, al

incrementar la temperatura (28 °C) y deteriorar la calidad del agua. En el estudio de

Brown (1934), se documentó que las condiciones térmicas (23-27 °C) favorecen la

proliferación de A. ocelatum, y en algunas especies, la infección se restringe a las

branquias y su especificidad es muy baja, en este sentido, Colorni (1994) reportó que A.

ocelatum no solo parasitó a Sparus aurata sino también a Neobenedenia melleni que ya

infestaba a este pez.

En los últimos días del cultivo de los jureles, se observó una disminución del consumo de

alimento, un incremento en la frecuencia de los movimientos operculares y apertura de

la cavidad oral, una disminución de la actividad y un comportamiento de fricción sobre las

superficies de los estanques. Estas características conductuales también fueron

observadas por Brown (1934) y Lawler (1980) en presencia de A. ocelatum y Montero et

al. (2004), Lia et al. (2007) y Lu et al. (2012) en infestaciones con Z. seriolae. En este

trabajo no se hicieron observaciones del tejido branquial a nivel histológico en los jureles,

pero en hospederos de Z. seriolae y A. ocelatum se ha observado palidez branquial,

hipersecreción de mucus en las branquias, hiperplasia e hipertrofia del epitelio branquial

y fusión lamelar, inflamación, hemorragia y necrosis del tejido branquial, lo que

desencadena una disfunción respiratoria, que impide el intercambio de gases, por lo tanto

60

les ocasiona letargia y finalmente la muerte de los organismos (Lawler, 1980; Paperna,

1980; Grau et al., 2003; Montero et al., 2004; Mansell et al., 2005; Lia et al., 2007; Lu et

al., 2012).

La muerte del hospedero sobreviene por la imposibilidad de intercambiar gases a través

de las branquias por Z. seriolae (Grau et al., 2003; Montero et al., 2004; Lia et al., 2007)

y por A. ocelatum en los cultivos de S. dumerili (Aiello y D’Alba, 1986), Rachycentron

canadum (que también estaba parasitado por Neobenedenia melleni) (Moreira et al.,

2013) y en Scophthalmus maximus (Saraiva et al., 2011). Lawler (1980) estudió diferentes

especies de peces y menciona que cuando una infestación es muy severa, la muerte

puede ocurrir en un plazo de 12 horas posteriores a la introducción de los peces a

estanques con altas concentraciones de dinosporas de A. ocelatum.

En este experimento, posterior a la infestación parasitaria, se registró una mortalidad

entre los diferentes tratamientos, del 58.33 ± 50.52% de los organismos del grupo control,

29.17 ± 19.09% del grupo dosis baja y del 29.17 ± 26.02% en el grupo dosis alta, sin ser

significativamente diferentes. Los estudios con otras especies donde se utilizaron dietas

suplementadas con ajo, demuestran que este fitobiótico tuvo una respuesta en mejorar

la supervivencia ante desafíos bacterianos en peces como L. calcarifer cuando recibió 5,

10, 15 o 20 g/kg de polvo de ajo en la dieta durante cuatro meses (Talpur e Ikhwanuddin,

2012). Resultados similares fueron documentados en O. mykiss con la adición de 0.5 y 1

g de polvo de ajo por cada 100 g del alimento durante 14 días (Nya y Austin, 2009), en

O. niloticus expuesto con el 1 y 2% de ajo adicionado al alimento durante uno y dos meses

(Aly et al., 2008) y con el 3% durante 3 meses (Aly y Mohamed, 2010). Contrario a esto,

Aly et al. (2010) no observaron diferencias en la mortalidad entre las tilapias (O. niloticus)

tratadas con la dieta enriquecida con y sin ajo. Por lo anterior, es posible que en el jurel

las dosis de polvo de ajo utilizadas (2 y 4%) no hayan sido las adecuadas para eliminar

a Z. seriolae.

La terapia preventiva o correctiva con ajo no se ha documentado para A. ocelatum, pero

si para otros protozoarios que parasitan piel, aletas y branquias, donde el tratamiento

solamente ha resultado efectivo cuando se suministra en forma de baños de inmersión.

61

En este sentido, el tratamiento de O. niloticus con baños con aceite de ajo a una

concentración de 2, 2.5 y 3 ppt por 4 h para el control simultáneo de Trichodina sp. y

Gyrodactylus sp. eliminó la presencia de estos parásitos (Abd El-Galil y Aboelhadid,

2012). De la misma forma, en Poecilia latipinna el tratamiento en baños con extracto de

ajo a una concentración de 0.1 g/l, resultó efectivo para la eliminación de Ichthyophtirius

multifilis hasta el quinto día de tratamiento y con una mortalidad de 11%, en contraste

con el 28% obtenido con el tratamiento con Matricaria chamomilla (Gholipour-Kanani et

al., 2012). Un tratamiento similar en O. niloticus eliminó a Trichodina sp. con 800 ppm de

extracto de ajo por 48 h (Chitmanat et al., 2005) y un tratamiento por 24 h de 200 ppm de

ajo crudo, logró la remoción de Trichodina jadranica en Anguilla anguilla (Madsen et al.,

2000). En pruebas in vitro con I. multifiliis se documentó un efecto letal con 62.5 mg/l de

extracto de ajo durante 15 h (Buchmann et al., 2003).

El mecanismo de acción del ajo como agente antiparasitario no está definido, pero se

conoce que tiene diferentes efectos terapéuticos: a) antimutagénico, que se logra por la

inhibición de la división celular e inducción de la apoptosis; b) antimicrobiano, mediante

la inhibición del crecimiento de las bacterias, y c) la inmunoestimulación por la liberación

de citosina proinflamatoria y por la estimulación de las células citolíticas (Focke et al.,

1991; Salman et al., 1999; Cardelle-Cobas et al., 2010; Gao et al., 2013). El efecto

antiparasitario del ajo puede depender de la forma en la que se procesa y suministra, ya

que Peña et al. (1988) observaron que al agregar ajo fresco picado en el agua de los

estanques de cultivo de Cyprinus carpio, se eliminaron completamente los huevos y

adultos de Capillaria sp.; la adición del extracto de ajo en hexano disminuyó la carga

parasitaria y en contraste, la adición del extracto acuoso no surtió efecto como agente

antiparasitario.

Debido a que la inmunoestimulación se menciona entre los efectos beneficiosos del ajo,

como parte de este trabajo se realizó el análisis de los componentes sanguíneos, los

cuales son útiles para conocer el estado fisiológico de los organismos, ya que las

alteraciones de los valores normales se pueden relacionar con diferentes patologías

(Mehrim et al., 2014). En relación al efecto del ajo en la hematología y química sanguínea

del jurel S. lalandi, el intervalo de los valores de referencia para la concentración de

62

eritrocitos fue de 6.9 a 11.4 cel x 106/mm3, el cual es mayor a los valores que propusieron

Filho et al. (1992) para la misma especie (3.966 ± 0.17 106 cel/mm3). Una disminución

significativa en el recuento de glóbulos rojos se observó posterior al consumo de la dosis

alta (4%) de ajo con 8.50 ± 0.76 cel x 106/mm3, en contraste el grupo control registró 9.86

± 0.77 106 cel x 106/mm3. Este resultado difiere de lo observado en O. niloticus alimentado

por 90 días con un suplemento del 2 y 4% de polvo de ajo en la dieta, en el cual se registró

un incremento en la cantidad de eritrocitos del 12.7 y 23.6%, respectivamente (Shalaby

et al., 2006), asimismo en tilapias alimentadas durante 60 días con polvo de ajo al 1%,

se registró un incremento de casi el 100% (Mehrim et al., 2014). Esta tendencia también

fue documentada en O. mossambicus que recibió alimento suplementado con el 2 y 3%

de polvo de ajo durante 60 días, donde el incremento fue del 53 y 66%, respectivamente

(Felicitta et al., 2013).

La disminución de la concentración de eritrocitos, también se presentó después de la

infestación parasitaria en el grupo dosis alta (7.06 ± 1.08 cel x 106/mm3) con respecto al

control (10.95 ± 1.18 cel x 106/mm3), que al parecer se vio más afectado por la pérdida

de sangre debido al hábito alimenticio de Z. seriolae, situación que también fue

documentada en S. dumerili (Montero et al., 2004). Estos resultados difieren de lo

observado en O. mykiss alimentado con polvo de ajo a razón de 1 g/100 g (Nya y Austin,

2009) y cuando se suministró 1 ml de alicina pura por 100 g de alimento (Nya et al.,

2010) durante 14 días para posteriormente infectarlos con A. hydrophila, bajo esta

condición fue notable un incremento de 11 veces y 8% la concentración de eritrocitos,

respectivamente. Resultados similares se han documentado en L. calcarifer al consumir

de 5 a 20 g/kg de polvo de ajo durante dos semanas y posteriormente ser infectado con

V. harveyi, donde el incremento en la concentración de eritrocitos fue de 32 a 152% en

la concentración de eritrocitos (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). Además del polvo de ajo y

la alicina pura, otros compuestos derivados del ajo también han sido evaluados con el

mismo propósito, tal es el caso del disulfuro de alilo (1 a 2 g/kg) que fue agregado en el

alimento y proporcionado durante 45 días a P. mesopotamicus e infestado naturalmente

con Anacanthorus penilabiatus; en estos peces se observó un incremento del 35% en la

concentración de eritrocitos (Martins et al., 2002).

63

En otros vertebrados como caninos, bovinos y equinos se ha reportado anemia hemolítica

causada por el consumo de ajo, debido al daño oxidativo de los eritrocitos (Rae, 1999;

Pearson et al., 2005; Yamato et al., 2005; Weiss y Wardrop, 2011), en peces este efecto

no ha sido documentado, por lo que la disminución en la concentración de eritrocitos

posterior a la adición de ajo en el alimento, parece estar relacionada probablemente con

varias causas: la duración de la administración del polvo de ajo por 30 días y/o a la dosis

real ingerida por los organismos relacionada con la pérdida de alicina en el agua.

En el jurel S. lalandi, el intervalo de referencia del hematocrito fue de 48.6 a 66.4%, el

cual se mantuvo en el rango normal de 50.1 ± 12.4 propuestos por Filho et al. (1992) para

la misma especie. En el presente trabajo, el hematocrito disminuyó después de 32 días

de que los peces consumieron el alimento enriquecido con el 4% de polvo de ajo (53.10

± 3.49%) con respecto al valor del grupo control (57.69 ± 8.58%), sin embargo, posterior

a la infestación experimental, el hematocrito en el grupo dosis baja disminuyó poco menos

de 10% (47.69 ± 5.45%) en comparación con el grupo dosis alta que fue de 1.3% (51.72

± 5.72%).

En O. niloticus se observó un efecto parecido al registrado en este experimento por la

adición de ajo, cuando se suministró una dieta suplementada con polvo de ajo al 1 y 2%

por 90 días, con una disminución del 16% en el valor del hematocrito (Shalaby et al.,

2006). Por el contrario, en O. niloticus alimentadas durante 60 días con una dieta

enriquecida con el 1% de polvo de ajo, el incremento fue del 55% (Mehrim et al., 2014).

En la tilapia O. mossambicus, se observó un incremento del 50% cuando se alimentó

durante 60 días con una dieta que contenía el 3% de polvo de ajo (Felicitta et al., 2013).

En otras especies como O. mykiss que recibió alimento con polvo de ajo a razón de 0.05

a 1 g/100 g de la dieta, el incremento fue de 29% a 6%, respectivamente (Nya y Austin,

2009).

El hematocrito también se ha evaluado considerando la dieta con ajo o alguno de sus

compuestos y la presencia de parásitos, tal es el caso de P. mesopotamicus infestado

naturalmente con A. penilabiatus y alimentado durante 45 días con disulfuro de alilo a

razón de 1 a 2 g/kg de la dieta (Martins et al., 2002). Los autores mencionan que no

64

encontraron diferencias entre las dosis, sin embargo, hubo un incremento en el

hematocrito a medida que aumentó la duración del tratamiento con este fitobiótico de 15

a 45 días. En el presente estudio con el jurel, el hematocrito disminuyó 8% después de

consumir alimento con ajo y 10% posterior a la infestación parasitaria, por lo que al

parecer el ajo tuvo un efecto en mantener estos valores en el intervalo de referencia.

En relación a los cambios en la concentración de leucocitos, la leucopenia (disminución

de la concentración de leucocitos) se presentó a los 32 días, en los jureles que

consumieron polvo de ajo al 4%, con un valor de 5.35 ± 1.33 cel x 103/mm3 y posterior a

la infestación parasitaria con un valor de 6.88 ± 1.67 cel x 103/mm3, estos valores fueron

menores con respecto al grupo que recibió el 2% de ajo en la dieta (13.08 ± 5.83 cel x

103/mm3) y también con el valor inicial de 10.95 ± 1.18 cel x 103/mm3. En la trucha O.

mykiss se observó un efecto similar a este bioensayo, cuando se suplementó la dieta con

0.5 y 1.0 ml de alicina pura por cada 100 g de alimento durante 14 días y posteriormente

infectado con A. hydrophila, en esta especie fue notable la disminución en la

concentración de leucocitos a medida que aumentaba la dosis de alicina (Nya et al.,

2010). En contraste, en O. mykiss alimentado con 0.05 a 1 g/100 g de polvo de ajo durante

14 días y posteriormente infectado con A. hydrophila, el incremento del 50% en los

leucocitos se presentó en los organismos que recibieron la dieta con 1 g/100 g de ajo

(Nya y Austin, 2009). Talpur e Ikhwanuddin (2012) documentaron que al alimentar a L.

calcarifer con una dieta suplementada con polvo de ajo (5 a 20 g/kg) e infectarlo con V.

harveyi, se observó un incremento del 70% en los leucocitos en los peces de la dieta con

15 g/kg de polvo de ajo antes del desafío y se mantuvo posterior a la infección. En la

tilapia, O. niloticus, se registró un incremento del 41% en los leucocitos cuando fueron

alimentadas con el 1% de polvo de ajo durante 60 días (Mehrim et al., 2014). En P.

mesopotamicus, infestado naturalmente con A. penilabiatus y alimentado durante 45 días

con disulfuro de alilo a razón de 1 a 2 g/kg de la dieta, no se observó un efecto entre los

tratamientos, sin embargo, la concentración de leucocitos se incrementó a medida que la

duración del tratamiento fue mayor (Martins et al., 2002). En el presente trabajo con S.

lalandi, no fue evidente un incremento en la concentración de leucocitos antes y después

de la infestación parasitaria en el grupo dosis alta, por lo que al parecer el 4% de polvo

65

de ajo recubriendo externamente la partícula de alimento no tiene efecto sobre algunos

tipos de leucocitos.

Los neutrófilos son las primeras células que responden a la presencia de estímulos

estresores e inflamatorios, tienen la función de fagocitar las partículas extrañas

(bacterias) y formar parte de la respuesta inflamatoria (Hampton et al., 1998; Gordon-

Smith, 2009). En este bioensayo se observó que antes de la infestación parasitaria, la

concentración de neutrófilos disminuyó de 1331.39 ± 749.01 cel/µl en la evaluación inicial

a 496.60 ± 341.45 cel/µl con el 4% de polvo de ajo en la dieta. En la trucha arcoíris se

observó una respuesta similar, una disminución del 62 y 56% en la cantidad de neutrófilos

cuando se adicionó por 15 días el 3 y 4% de polvo de ajo respectivamente (Fazlolahzadeh

et al., 2011); por el contrario, en L. calcarifer que consumió una dieta enriquecida con 15

g/kg de polvo de ajo por dos semanas, se observó un incremento del 15% (Talpur e

Ikhwanuddin, 2012). Resultados similares fueron reportados en O. mossambicus cuando

por 60 días fue alimentada con el 3% de polvo de ajo en la dieta (Felicitta et al., 2013).

En el jurel S. lalandi, la disminución de la concentración de neutrófilos parece estar

relacionada con la forma en que se adicionó el ajo, ya que tomando en cuenta el trabajo

de Fazlolahzadeh et al. (2011) el recubrimiento externo de la dieta también se realizó con

una mezcla del polvo de ajo con aceite y la disminución de estas células es notable si se

compara con los resultados obtenidos en L. calcarifer (Talpur e Ikhwanuddin, 2012) y O.

mossambicus (Felicitta et al., 2013), a los cuales se les proporcionó el ajo en la

premezcla.

Los leucocitos tipo eosinófilos son células que contienen gránulos que se tiñen de color

rosado a rojo en la presencia de eosina y no siempre son detectables en los peces

(Tizard, 2000; Nya y Austin, 2009). En estos organismos, los eosinófilos están

especialmente relacionados con la respuesta a los parásitos, sus gránulos están

compuestos por enzimas (histaminasa, lisofosfolipasa y fosfolipasa D), prostaglandinas,

leucotrienos y factor activador de trombocitos relacionados con la respuesta inflamatoria,

proteínas catiónicas que tienen efecto letal en los parásitos y productos de la explosión

respiratoria, entre otros (Ainsworth, 1992; Tizard, 2000; Alvarez-Pellitero, 2008; Balla et

al., 2010). En el jurel de este bioensayo, se registró un incremento significativo de la

66

concentración de eosinófilos (614.68 ± 521.75 cel/µl) cuando se suplementó el alimento

con el 4% de polvo de ajo a los 32 días con respecto al valor inicial (67.98 ± 62.54 cel/µl),

después de la infestación parasitaria se duplicó la concentración (1257.89 ± 1277.09) en

el grupo dosis alta y se registró un aumento en el grupo dosis baja de 157.22 ± 113.17

cel/µl a 2280.26 ± 2120.11 cel/µl. En L. calcarifer alimentado con polvo de ajo a razón de

5 a 20g/kg de la dieta, se registró un incremento de 14 a 48%, posteriormente se infectó

experimentalmente con V. harveyi y la mayor concentración de eosinófilos se presentó

con la adición de 10 a 20 g/kg de polvo de ajo (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). En P.

mesopotamicus, infestado naturalmente con A. penilabiatus y en O. niloticus, no se

observaron diferencias en la concentración de eosinófilos cuando fueron alimentados con

1 a 2 g/kg de disulfuro de alilo durante 45 días (Martins et al., 2002) y con ajo fresco

macerado durante uno y dos meses (Aly et al., 2008), respectivamente, no se observaron

diferencias en la concentración de eosinófilos. En el jurel S. lalandi fue evidente un

incremento en la concentración de eosinófilos en relación directa con la dosis de ajo, lo

que pudo haber permitido que estos organismos estuviesen preparados para la

infestación parasitaria.

Los basófilos son granulocitos, que en los mamíferos se asocian con la respuesta inmune

a los parásitos y cuando el receptor de IgE es ocupado por el antígeno del parásito, se

liberan los gránulos intracelulares que entre otras sustancias contienen histamina y

leucotrienos y provocan la secreción de moco, vasodilatación y contracción del músculo

liso (Gordon-Smith, 2009; Weiss y Wardrop, 2011; Stockham y Scott, 2013). En los peces,

aún no se esclarece la función de este tipo de leucocitos en los mecanismos de defensa

(Roberts, 2012).

La basofilia (incremento de la concentración de basófilos) en el jurel fue establecida

considerando la concentración de los granulocitos tipo basófilos, la cual se observó en

los grupos que recibieron el 2% de polvo de ajo y después de la infestación experimental,

donde las concentraciones se mantuvieron estables (sin aumento o disminución de los

valores) con el 2%, mientras que se registró un aumento con la dosis del 4% de 34.26 ±

29.52 a 70.66 ± 89.33 cel/µl. En L. calcarifer, se obtuvieron resultados similares y la

mayor cantidad de estas células se encontró en los organismos que recibieron del 0.5 al

67

1.5% de ajo en la dieta por dos semanas (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). En contraste, el

análisis de la concentración de este tipo celular en la sangre de O. mykiss, no revelaron

diferencias en la concentración después del suministro de ajo al 1 y 2% durante uno y

dos meses, seguido de un desafío bacteriano con A. hydrophila (Aly et al., 2008). Nya y

Austin (2009), en la misma especie de trucha no encontraron este tipo celular en los frotis

de sangre de los organismos, tanto los que recibieron ajo a razón de 0.05 a 1 g/100g

como los que no consumieron este fitobiótico en la dieta. Con base en los resultados

obtenidos en el jurel y en las otras especies, el incremento en la concentración de

basófilos parece estar relacionada con la dosis de ajo suministrada, la duración del

tratamiento y la forma en que se agrega este fitobiótico en la dieta.

Los linfocitos son las células encargadas de la respuesta inmunitaria y se dividen en

linfocitos T, que se originan en el timo y se encargan de expresar los receptores de células

T; los linfocitos B, se producen en el riñón cefálico y tiene la función de expresar

inmunoglobulinas; y los linfocitos citolíticos también conocidos como células natural killer,

que forman parte de la respuesta inmune innata, se encuentran en organismos sin

exposición a patógenos y tienen un efecto citotóxico, especialmente en células tumorales

o aquellas infectadas con algún virus (Tizard, 2000; Weiss y Wardrop, 2011).

En este estudio se observó una condición de linfopenia (disminución de la concentración

de linfocitos) de 4896.99 ± 1219.65 a 2816.76 ± 941.20 cel/µl después de que el jurel

consumió el 4% de polvo de ajo. En O. mossambicus se observó una respuesta similar,

con una disminución de la concentración de linfocitos con el 2 y 3% de polvo de ajo

durante 60 días (Felicitta et al., 2013). En contraste, en O. mykiss no se registró este

efecto (Nya et al., 2010) o se reportó una linfocitosis después de agregar de 5 a 20 g/kg

(Talpur e Ikhwanuddin, 2012) o de 20 a 40 g/kg (Fazlolahzadeh et al., 2011) de polvo de

ajo durante dos semanas. La concentración de linfocitos en el jurel S. lalandi, parece

estar asociado con la dosis administrada (4%) en el alimento y la duración de la

exposición a este tratamiento.

De los diferentes tipos celulares que se encuentran en la sangre de los organismos, los

monocitos son células inmaduras que circulan en el torrente sanguíneo y las formas

68

maduras se encuentran en los tejidos, donde fagocitan partículas extrañas, células

dañadas o muertas y moléculas liberadas, forman parte de la respuesta inmune

específica, regulan la inflamación y preparan al organismo para la respuesta inmune

adquirida mediante el procesamiento de antígenos (Tizard, 2000; Gordon-Smith, 2009).

En los jureles que fueron alimentados por un periodo de 32 días con una dieta que

contenía el 2 y 4% de polvo de ajo, se observó una disminución de los monocitos del 32

y 28% del valor inicial de cada una de las dosis, respectivamente. En la etapa posterior a

la infestación parasitaria no hubo cambios en la concentración de este tipo celular.

Felicitta et al. (2013), documentaron un incremento en los monocitos (conocido como

monocitosis) en la sangre de O. mossambicus cuando se adicionó 2 y 3% de polvo de

ajo en el alimento durante 60 días; un efecto similar se registró después de adicionar de

5 a 15 g/kg de ajo en la dieta de L. calcarifer por 2 semanas, el cual se mantuvo después

de la infección experimental con V. harveyi (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). En presencia

de bacterias o parásitos, se ha documentado monocitopenia con el 1% de ajo en la dieta

de la trucha arcoíris O. mykiss (Nya y Austin, 2009), en contraste no se registraron

diferencias al adicionar este agente fitobiótico a razón de 0.5 a 100 ml de alicina/100 g

de alimento en la misma especie durante 14 días (Nya et al., 2010). Resultados similares

fueron reportados para P. mesopotamicus infestado con A. penilabiatus y alimentado con

1 a 2 g/kg de disulfuro de alilo, sin embargo, se observó un incremento en la

concentración de monocitos en el periodo de 30 días de tratamiento (Martins et al., 2002).

En O. niloticus se reportó monocitosis cuando se agregó el 1 y 2% de ajo fresco macerado

en el alimento durante 1 y 2 meses (Aly et al., 2008). Las diferencias en los resultados

encontrados en S. lalandi del presente estudio con los reportados por otros autores,

probablemente se debe a la forma en que se adicionó el ajo en el alimento y la dosis

efectiva ingerida.

Los trombocitos de los peces son células que están relacionadas con procesos

fagocíticos, respuesta inmune y hemostasis (Claver y Quaglia, 2009; Tavares-Dias,

2009). La disminución de los trombocitos observada en el jurel después de 32 días de

alimentación con la dieta enriquecida con ajo, está relacionada con la adición del 4% de

ajo en el alimento de 2364.45 ± 1174.29 a 1130.54 ± 623.41 cel/µl. Esta condición se

69

mantuvo estable durante la etapa de infestación en el grupo dosis alta con 1213.70 ±

805.11 cel/µl, pero se registró una disminución significativa de la cantidad de trombocitos

con el 4% cuando se comparó con los organismos que recibieron el 2% de ajo (2699.49

± 1779.4 cel/µl). La disminución de la concentración de trombocitos observada en este

estudio coincide con lo observado en L. calcarifer con 15 y 20 g/kg de polvo de ajo en el

alimento suministrado por dos semanas antes y después de la infección con V. harveyi

(Talpur e Ikhwanuddin, 2012).

En otros organismos se ha observado un incremento en la concentración de trombocitos,

tal es el caso de la tilapia O. mossambicus donde hubo un aumento en la concentración

de este tipo celular en relación con la adición del 2 y 3% de ajo a la dieta durante 60 días

(Felicitta et al., 2013) y en P. mesopotamicus infestado con A. penilabiatus, este

incremento se registró con 1.5 y 2 g/kg de disulfuro de alilo por 30 y 45 días (Martins et

al., 2002). Sin embargo, en O. mykiss infectado con A. hydrophila, la dosificación de

alicina pura de 0.5 y 1 ml/100 g (Nya et al., 2010) y de 0.05 a 1 g/100 g de polvo de ajo

en el alimento (Nya y Austin, 2009) por 14 días, no tuvo efecto al comparar la

concentración con el grupo control. La trombocitopenia registrada en el jurel, se explica

de forma análoga con el efecto observado en humanos, donde se afirma que el ajo tiene

efecto inhibitorio sobre la agregación plaquetaria y la formación de tromboxanos (Bordia

et al., 1998; Santhosha et al., 2013). Los tromboxanos son derivados eicosanoides que

forman parte de la activación de las plaquetas y trombocitos (Rodríguez Llach, 1986;

Matsumoto et al., 1989; Koolman y Röhm, 2009; Murray et al., 2010).

En relación a la química sanguínea y específicamente las proteínas totales, en los jureles

alimentados con la dosis del 2% de ajo y después de 32 días de tratamiento se observó

una condición de hipoproteinemia, es decir, una disminución de las proteínas en la

sangre. Un efecto similar se presentó en O. niloticus alimentadas con el 2 y 3% de polvo

de ajo durante 60 días (Mehrim et al., 2014). En otros organismos se ha documentado el

efecto opuesto, como en el barramundi L. calcarifer donde la hipoproteinemia se observó

después de la adición de este fitobiótico a razón de 5 a 20 g/kg por dos semanas, sin

embargo, después de la infección con V. harveyi este efecto solamente fue notable con

la adición de 10 y 20 g/kg (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). El mismo efecto se registró en

70

O. mykiss infectado con A. hydrophila cuando se utilizó 1 g de polvo de ajo en 100 g de

alimento durante 14 días (Nya y Austin, 2009) y con 1 ml de alicina pura por cada 100 g

de dieta (Nya et al., 2010). La proteínas en la sangre tienen una función primordial, ya

que están directamente asociadas con la presión osmótica y la viscosidad de la sangre

(Lepkovsky, 1930; Cunningham, 2003), por lo que su cuantificación bajo las condiciones

que se describieron en el estudio con jurel, fueron fundamentales para poder establecer

los efectos del tratamiento con ajo y la infestación parasitaria sobre esta variable.

En la albúmina, que forma parte de las proteínas séricas, se observó un incremento antes

de la infestación (10.71 ± 1.72 mg/ml) con el 2% de ajo, con respecto a 8.89 ± 0.91 mg/ml

con el 4% de ajo en la dieta, pero después de la infestación, se registró hiperalbuminemia

en el grupo dosis alta (4%) de 8.89 ± 0.91 a 13.28 ± 2.19 mg/ml. Talpur e Ikhwanuddin

(2012) documentaron una respuesta similar en L. calcarifer alimentado con polvo de ajo

(5, 15 y 20 g/kg) antes y después de la infección con V. harveyi. En O. niloticus con el 1%

de este fitobiótico, también observaron un incremento en la concentración de albúmina

(Mehrim et al., 2014). En otras especies de peces como la trucha O. mykiss alimentada

con alicina pura (0.5 ml/100 g de alimento) o con polvo de ajo (0.05 a 1 g/100 g de

alimento) y posteriormente infectada con A. hydrophila, no se registraron diferencias (Nya

y Austin, 2009; Nya et al., 2010).

La presencia de las globulinas es importante para mantener un sistema inmune activo y

en buen funcionamiento (Talpur e Ikhwanuddin, 2012). En este bioensayo, se observó

que la concentración de globulinas se modificó por efecto de la dosis de ajo en la dieta,

ya que con el 2% hubo una disminución de 48.07 ± 3.03 mg/ml con respecto al control

(56.15 ± 2.18 mg/ml) y 4% (57.86 ± 6.36 mg/ml) a los 32 días y con el valor al tiempo cero

(60.16 ± 4.12 mg/ml). En la concentración de las globulinas después de la infestación, no

se observan diferencias entre los tratamientos, sin embargo, sí hubo un incremento

relacionado al tiempo, con un aumento en las globulinas (52.93 ± .78 mg/ml) con el 2%

de ajo y una disminución con el 4% (49.40 ± 2.86 mg/ml). En otros organismos, se ha

observado una hiperglobulinemia con el 1 y 2% de ajo en la dieta suministrada a O.

niloticus, O. mykiss y L. calcarifer durante 14 a 60 días (Nya y Austin, 2009; Nya et al.,

2010; Talpur e Ikhwanuddin, 2012; Mehrim et al., 2014). El efecto del ajo sobre las

71

globulinas, parece ser de preparación del organismo ante situaciones adversas, como es

el caso de la infestación parasitaria.

Para la evaluación de la susceptibilidad de Z. seriolae a las respuestas celulares y

humorales contenidas en el suero y mucus de S. lalandi, Leef y Lee (2009) expusieron a

este parásito a los fluidos de organismos parasitados y no parasitados bajo condiciones

in vitro y no registraron mortalidad. En contraste, los fluidos tuvieron un efecto letal en

Benedenia seriolae. En una evaluación preliminar en el presente estudio con el jurel, se

realizó la exposición in vitro de Z. seriolae a 27 ml/l de extracto de ajo donde se observó

que el 100% de los organismos se desprendieron a la hora de estar en contacto con el

ajo y el 50% de los parásitos murieron entre 7 y 8 h. De este efecto diferencial se

presume que este parásito branquial es resistente a la respuesta inmunológica del

hospedero y que por lo tanto, la respuesta inmune puede que no sea directamente

responsable del efecto antiparasitario y que posiblemente se deba a la acción directa de

algún producto o subproducto del ajo, pero esto debe ser evaluado con mayor

profundidad en futuros estudios sobre de este tema.

La mayor parte de la información disponible, relacionada con los beneficios y con los

mecanismos de acción de los componentes del ajo, se han derivado de estudios

relacionados con la salud de los seres humanos, sin embargo, recientemente por la

importancia que ha tomado la acuicultura a nivel mundial, la comunidad académica

internacional ha puesto atención al estudio de los efectos benéficos del uso de fitobióticos

en la salud y la producción animal. En los peces se han observado efectos benéficos del

uso del ajo en el sistema inmune, cardiovascular y hepático, además se ha sugerido la

posibilidad de que tiene un efecto positivo en la calidad y sabor de la carne de los peces

cultivados (Boxaspen y Holm, 1992; Lee y Gao, 2012). No obstante los avances en el

conocimiento de los efectos benéficos del ajo en el cultivo de organismos son recientes

y se requiere generar mayor información que permita conocer los efectos y la forma en

que actúa el ajo, con la finalidad de mejorar la sanidad y rentabilidad de los sistemas

acuícolas para poder ofrecer al mercado un producto alimenticio con la mejor calidad e

inocuidad.

72

Capítulo 8. Conclusiones

El ajo es un producto con potencial en el tratamiento alternativo de patologías de los

peces. Aunque no logró eliminar los parásitos de S. lalandi, se observó una tendencia a

la disminución de la intensidad media de Z. seriolae. Este efecto parcial puede estar

asociado con la forma en que se adicionó al alimento, y que resultó en una débil adhesión

externa del polvo de ajo con el aceite y/o que la dosis de ajo suministrada no fue la

adecuada.

La presencia del dinoflagelado influyó en las respuestas evaluadas en los peces y no fue

evidente que el ajo tuviese un efecto protector o letal sobre estos.

Este fitobiótico fue muy bien aceptado por los organismos, por lo que la palatabilidad del

alimento no fue afectada.

El peso, la longitud y el índice de condición no se vieron afectados por la dosis de ajo,

pero si por la presencia de los parásitos.

La dosis de ajo (2 y 4%) causó el incremento en la concentración de los eosinófilos y

basófilos, lo que sugiere que estimula ciertos componentes del sistema inmune para

situaciones que puedan comprometer la supervivencia de los organismos.

En el jurel la disminución de los valores del índice hepatosomático, del recuento total de

glóbulos rojos y blancos, el hematocrito, los neutrófilos, linfocitos, monocitos, trombocitos

y las proteínas totales se debe al efecto del ajo incluido en la dieta.

73

Capítulo 9. Recomendaciones

1. Realizar la cuantificación de alicina en cada lote de ajo fresco que se utilice, así

como durante las diferentes épocas del año para conocer la variabilidad estacional

de la calidad del mismo.

2. Utilizar sistemas de recirculación separados del sistema general para evitar la

transmisión de organismos perjudiciales a los sujetos experimentales.

3. Utilizar otras presentaciones de la matriz de ajo, como extracto acuoso, alcohólico,

en aceite y como extracto añejado de ajo en la eliminación de los parásitos y sobre

la respuesta de los organismos y realizar pruebas con otras sustancias adherentes

como el alginato de calcio, así como la inclusión del ajo antes de la pelletización.

4. Evaluar y cuantificar los cambios, durante el tránsito gastrointestinal, en los

compuestos químicos del ajo y cuales son detectables en mucus, suero,

estómago, branquias, piel, riñón cefálico, hígado e intestino delgado.

5. Evaluar la función hepática midiendo las concentraciones de lípidos, triglicéridos,

colesterol y las enzimas alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato

aminotransferasa (AST).

6. Realizar pruebas bromatológicas (con un enfoque particular al contenido de lípidos

y ácidos grasos) y organolépticas de la carne.

7. Evaluar el efecto de la exposición in vitro de diferentes presentaciones de ajo sobre

la mortalidad de los diferentes estadios de vida de Z. seriolae (huevos,

oncomiracidios y adultos).

8. Establecer un protocolo estandarizado de incubación de Z. seriolae en condiciones

de laboratorio.

74

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Anexos

Anexo 1. Preparación de reactivos para análisis de alicina en ajo

Para la cuantificación de la alicina se aplicó el método desarrollado por el Laboratorio de

Análisis Fitoquímico de Southern Cross University en Australia.

1. Como estándar interno se utilizó etilparabeno (p-hidroxibenzoato de etilo), se

agregaron 0.53 g de etilparabeno en 500 ml de agua destilada en un matraz de

aforación de 1000 ml. A continuación, se disolvió el soluto con la ayuda de un baño

ultrasónico Branson® 3510 y finalmente se aforó a 1000 ml con agua destilada.

2. Se utilizó ácido cítrico monohidratado Fermont® para detener la formación de la

alicina por inactivación de la alinasa. Se diluyeron 0.021 g de ácido cítrico en 100

ml de agua destilada para obtener una solución 1 mM.

Anexo 2. Cuantificación de alicina

1. Extracto de ajo: del extracto de ajo previamente preparado, se colocan 5 ml en un

matraz Erlenmeyer con 30 g de solución de estándar interno. Esta solución se

centrifugó por 10 minutos a 3500 rpm, se retiraron 2 ml del sobrenadante y se

colocaron en un matraz donde se aforó a 10 ml con ácido cítrico.

2. Polvo de ajo: se colocaron 3 g del polvo de ajo en un matraz Erlenmeyer con 30 g

de solución de estándar interno, se homogenizó en un agitador por 2.5 minutos y

se dejó reposar por 30 minutos. Esta solución se centrifugó por 10 minutos a 3500

rpm, se retiraron 2 ml del sobrenadante y se colocaron en un matraz donde se

aforó a 10 ml con ácido cítrico.

La solución a analizar se inyecta en viales color ámbar luego de ser pasados por un filtro

de 0.45 µm para eliminar impurezas y evitar que estas afecten el equipo.

88

En la Figura 22 y 23 se observan los cromatogramas que generó el equipo. El primero se

utilizó para saber el tiempo de elusión de alicina en una solución de alicina sintética, el

cual es el más alto a los 8.6 min.

Figura 21. Cromatograma de alicina sintética.

En la Figura 23 se presenta un cromatograma del análisis de la concentración de alicina

en el polvo de ajo. Las flechas en el mismo, muestran los picos de alicina y estándar

interno en sus respectivos tiempos de retención, con esta información se busca el área

bajo el pico de cada sustancia y se integra en una ecuación.

89

Figura 22. Cromatograma del polvo de ajo con el valor de cada uno de los picos.

Para calcular la concentración de alicina se utilizó la siguiente ecuación propuesta por

Baghalian et al., (2005) y utilizada en el Laboratorio de Revaloración de Residuos del

CINVESTAV-unidad Saltillo:

𝐴𝑙𝑖𝑐𝑖𝑛𝑎 (%) =(𝑆1𝑚2) 22.75

𝑆2𝑚1

(9)

Donde:

S1= área del pico de alicina en el cromatograma

m2= masa de etilparabeno que se utiliza para preparar la solución del estándar interno

S2= área del pico de etilparabeno en el cromatograma

M1=masa de la matriz de alicina, que es la cantidad de ajo (g) que se utilizó para el análisis

Alicina (S1)

Estándar interno (S2)

90

El valor resultante fue la proporción de alicina que había en una masa conocida de ajo,

en cualquiera de sus presentaciones. Para hacer la comparación de la concentración de

alicina entre diferentes presentaciones, es necesario ser consecuente al utilizar el valor

del peso seco o húmedo del ajo, ya que se pueden presentar variaciones en los

resultados.

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Programa de Posgrado en Ciencias en Acuicultura · 2016-10-21 · ii Resumen de la tesis que presenta Candy Elizabeth Armuelles Bernal como requisito parcial para la obtención del