Proizvodnja antitoksina(antivenoma)

Imunološki zavod d.d.

Mr. sc. Maja Lang Balija, dr. vet. med.

• Otrovne životinje (eng. poisonous

animals) – kriptotoksične životinje

• Životinje otrovnice ( eng. venomous

animals) – fanerotoksične životinje

• Toksini – mala molekulska masa

• Venomi – proteini/peptidi velike

molekulske mase (mješavina toksina)

Životinjski otrovi (venomi)

Fanerotoksične životinje

• posjeduju posebne sustave za proizvodnju i

aplikaciju otrova u žrtvu:

• zmije (poskok, riđovka)

• kukci (pčele, ose, bumbari, stršljeni)

• pauci (Crna udovica)

• ribe (pauk, škarpina, golub)

Kriptotoksične životinje

• dio tijela (meso, jetra, krv, koža) otrovan bez

posebnih aparata za unošenje otrova u žrtvu:

• tropske ribe (puffer fish – otrovna kuglasta riba) i hobotnice –

tetrodotoksin- neurotoksin (protuotrov još uvijek nije

pronađen) -bakterija roda Vibrio na površini tijela (1 200 puta

otrovniji od cijanida LD50 = 5 – 8 μg/kg)

• vodozemci (dart-žaba Phyllobates terriblis - batrahotoksin

(250 puta jači od strihnina) letalna doza 1 – 2 μg/kg tjelesne

mase); bufotoksin – žaba krastača (Buffo sp.)

Životinje otrovnice naših krajeva

• zmije:

• AGLYPHAE (bezubice)• OPISTOGLYPHAE (stražnjožljebozubice) porodice

Colubridae:» Malpolon insignitus (zmajur)» Telescopus fallax (crnokrpica)

• PROTEROGLYPHAE (prednjožljebozubice) porodice Elapidae i Hydrophiidae (nema slobodnoživućih predstavnika u Europi)

• SOLENOGLYPHAE (cjevozubice)porodice Viperidae:» Vipera ammodytes (poskok)» Vipera berus (riđovka)» Vipera ursinii macrops (planinski žutokrug)

Životinje otrovnice naših krajeva

• pauci:• Lactrodectus tredecimguttatus (Crna udovica)

• škorpioni (Euroscropius italicus, Euroscropius germanus)

• relativno bezopasni (neurotoksični peptidi i enzimi –fosfolipaza A2, fosfoesteraza, hijaluronidaza)

• upalna reakcija, bula na mjestu uboda, lokalna ukočenost

• pčele, ose, bumbari i stršljeni• relativno bezopasni (složena smjesa otrova: enzimi; biološki

aktivni peptidi – melitin, apamin, mastoporan, bombolitin)

• lokalna upalna reakcija do anafilaktičnog šoka

Otrovi i klinička slikaotrovanja

Podjela zmijskih otrova prema mehanizmu djelovanja

• Neurotoksični (postsinaptičke i predsinaptičke membrane) - Elapidae gujemišići oka (ptosis); jezik (teškoće u govoru); grlo(dysphagia); grudi (dyspnea)

• Miotoksični (rabdomioliza) - Hydrophiidae - morske zmije

• Vaskulotoksični – Viperidae – prave ljutice i jamičarke

hemoragini (metaloproteinaze)

oštećenja endotela, zgrušavanja krvi, bujanja (bubrenje, edem) na ugriženom mjestu, lokalna nekroza, tromboza - “suha gangrena”, šok - hipovolemija, acidoza, kardijalna i pulmonalna depresija

Otrov pauka Crne udovice:• smjesa citotoksičnih enzima (hijaluronidaza, kolagenaza, esteraza,

fosfolipaza, ribonukleaza) i α-latroksin (polipeptid LD50-0,1 mg/kg u mačke)

• intenzivna bol po cijelom tijelu (“ukočen bolan osmijeh”), lokalno crvenilo i oteklina; neurovegetativni simptomi; hipertenzija, tahikardija, srčana aritmija; psihičke reakcije (histerija, halucinacija, delirij); prijapizam u muškaraca (24 – 48 sati)

Dobivanje otrova

Zmijski otrovi:

• dobivaju se manualnom “mužnjom” zmija otrovnica

• viskozne bezbojne do žućkaste tekućine (oksidaza L-aminokiselina)

• svježi otrov nije stabilan - sušenje je esencijalno za održavanje biološke aktivnosti

Otrovi kukaca:

• dobivaju se maceracijom otrovnog aparata ili elektrostimulacijom (anestezija CO2+1-2V –

helicere ili cijeli pauk na 60V)

• viskozne bezbojne tekućina

• svježi otrov nije stabilan – 0,06-0,26 mg

poskok

Vipera ammodytes

(20- 45 mg suhe tvari)

riđovka

Vipera berus

(4 -10 mg suhe tvari)

sastav otrova ovisi o:

• vrsta, spol i dob zmije

• kondicija zmije

• geografsko podrijetlo (ambijentalne prilike)

• temperatura okoline (hibernacija, estivacija)

• način prehrane

Sastav zmijskih otrova

•proteinske

proteini, glikoproteini, peptidi

•neproteinske

aminokiseline, lipidi,

anorganski ioni, organske

kiseline, nukleozidi i

nukleotidi, i dr.

Georgieva D et al. Journal of Proteome Research 2008; 7: 866-886.

PAhomologija s

AtxBaa

numberi.v. LD50pIfosfolipaza

Amoditoksini (Atx)

+

+

+

95.9%1220,361mg/kg9.4-9.5AtxC (j)

/1220,58 mg/kg10.0AtxB (k1)

97.54%1220,021mg/kg10.2AtxA (k2)

++ 68%121-6.8AtnI2 (i2)

Ritonja et al. Biochim. Biophys. Acta 1985; 828: 306-312.Ritonja A et al. Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1986; 367: 919-923.Križaj I et al. Biochim. Biophys. Acta 1989; 999: 198-202Križaj I et al. Eur. J. Biochem. 1992; 204: 1057-62.

Sastav otrova poskoka

• odgovorni za hemoragičnu aktivnost venoma

• VaH1; VaH2, VaH3

• pI cca 5.5

• Mr 70 000 Da

Hemoragini (H)

Leonardi A et al. Toxicon. 2002;40:55-62.

Imunoreakcija na zmijske

otrove

• kompleksan antigen s jakim toksičnim djelovanjem

• humoralna imunoreakcija - visoki titar antitijela razreda IgG

• međusobno natjecanje više antigena unutar smjese

• križna reaktivnost antiseruma

zmijski otrov je “mozaik antigena” - Boquet (1979)

Imunoreakcija na zmijske

otrove

Imunoglobulini (protutijela/antitijela)

biološke makromolekule – važne sastavnice imunog sustava koje nastaju u reakciji sa antigenom

humoralna imunost

glikoproteini (aminokiseline 82-96% i ugljikohidrati 4-18%)

većina u krvnoj plazmi (međustanična tekućina, sekreti egzokrinih žlijezda, vezani na B-limfocite kao receptori za Ag)

specifično i selektivno vezanje Ag koji su potakli njihovu sintezu

biološka svojstva: vezanje komplementa

prolaženje kroz placentu

sudjelovanje u aktivaciji mastocita

vezanje za makrofage

pospješivanje fagocitoze

PRIKAZ KLASA IMUNOGLOBULINA KOD LJUDI

SVOJSTVA Ig G IgA IgM IgD IgE

mol.masa (kDa)

150 160 900 180 190

broj potklasa 4 2 2? 1 1

udio u ukupnim Ig (%)

75-80 13-15 7-9 1 0.002

vrijeme poluživota u plazmi (dani)

23 6 5 3 2

brzina sinteze (mg/kg/dan)

20-60 8-10 5-8 0,4 0,004

Klase imunoglobulina

Proizvodnja antitoksina

Pod pojmom antitoksina, obuhvaćeni su heterologni preparati

proizvedeni iz životinjske (pretežno konjske) hiperimune

plazme ili seruma, koji sadrže specifične imunoglobuline za

pasivnu zaštitu ljudi protiv toksina.

homologni (humani) imunoglobulinski preparati, normalni i specifični

heterologni (životinjski) hiperimuni antitoksični i antibakterijski

imunoglobulini (proizvodne životinja – kunić, ovce, koze, magarci, konji,…)

Tehnologija proizvodnje antiseruma (antivenoma)

1. postupak hiperimunizacije nemodificiranim otrovom

2. obrada hiperimune plazme do konačnog proizvoda

idealan antiserum (antitoksin) trebao bi biti sposoban neutralizirati sve toksične komponente

životinjskih otrova

• stoljetna tradicija proizvodnje antiseruma:

- 1890. godine - prvi proizvedeni antitoksin protiv tetanusa proizveden na kunićima

- 1892. godine – imunizacija ovaca i konja tetanusnim toksinom

- od 1959. godine - konjski antitoksin protiv otrova europskih zmija i pauka crne udovice (Latrodectus tredecimguttatus)

Povijest proizvodnje antitoksina u Imunološkom zavodu

Proizvodnja antiseruma u Imunološkom zavodu

način aplikacije antigena prilikom imunizacije (potkožno)

pripremna imunizacija• otrov europskih zmija • otrov pauka crne udovice • otrovi se apliciraju u rastućim dozama kroz više mjeseci

hiperimunizacija (proizvodna imunizacija)• otrov europskih zmija• otrov pauka crne udovice • otrovi se apliciraju jednokratno svakih cca mjesec dana

Uzimanje krvi

konj – zdrav, dobro gojno stanje i kondicija, pregledan na bolesti koje mogu biti potencijalne zoonoze (EMEA CPMP/BWP/3354/99 -

Note for guidance on production and

quality control of animal immunoglobulins

and immunosera for human use)

mjesto punkcije - Vena jugularis

mjesto punkcije oprano, obrijano, dezinficirano

Prikupljanje i obrada krvi

vađenje u PVC vrećice(ACD)

praćenje trijasa

sedimentacija na +40 C/24 h

Plazmafereza

miješanje staničnih elemenata krvi s fiziološkom otopinom

zagrijavanje mješavine na cca 37 0C

vraćanje staničnih elemenata krvi s fiziološkom otopinom

monitoring zdravstvenog stanja• homologna krv• zrak u sistemu• ugrušak – zastoj• paravenozno vraćanje• opće stanje

Prikupljanje plazme

odlijevanje plazme u prijenosne PVC spremnike; pohranjevanje plazme na < -20 0C do prerade

Prerada plazme (proizvodnja antitoksina)

Stites D.P. et al. Basic and clinical Immunology 1994.; Appelton&Lange, Prentice-Hall International Inc.

Tehnološke operacije koje se

koriste u preradi konjske plazme

enzimska razgradnja

precipitacija

adsorpcija

dijaliza

Enzimska razgradnja hiperimune konjske plazme praćena

SDS-elektroforezom

kDa

--- 53

--- 76

--- 116

--- 170--- 212

1. Početna plazma

2. Plazma (pH = 3,6)

3. Konc. pepsina 1

4. Konc. pepsina 2

5. Konc. pepsina 3

6. Konc. pepsina 4

7. Standardi poznatih mol.

masa

8. Plazma (pH = 3,6)

1 2 3 4 5 6 7 8

Konačni proizvodi –sastav antitoksina

aktivne tvari u ovako proizvedenom antitoksinu su

termostabilni F(ab)2 fragmenti specifičnih

imunoglobulina sposobnih da u ljudskom organizmu

neutraliziraju odgovarajuće toksine

pomoćne tvari antitoksina su natrijev klorid, pomoću

kojeg se postiže izotoničnost i m-krezol, koji se dodaje

kao konzervans

Proizvodnja antitoksina protiv otrova europskih zmija

Zmijski antitoksin Imunološkog zavoda

vodeće ljekovito sredstvo u terapiji zmijskih ugriza na području Europe i Male Azije

1 ml preparata štiti od najmanje:100 LD50 V. ammodytes venoma 100 LD50 V. aspis venoma 50 LD50 V.berus venoma 50 LD50 V. ursinii venoma50 LD50 V. lebetina venoma50 LD50 V. xanthina venoma

zmajur crnokrpica, pržac

planinski riđovka poskok u uzgoju(photo by Rainer Fesser)

Zmije Hrvatske

mbalija@imz.hr