Promoottorien etsintä

Jenni Hulkkonen

23.3.2005

Don King

Motivaatio

uusien geenien etsinnässä transkription aloituskohdan ja promoottorin

löytäminen vaikeata geenien säätely

ihmisellä on kaikissa soluissaan kaikki geenit, mutta vain osa geeneistä ilmentyy joissakin soluissa

jotkin geenit toiminnassa oletusarvoisesti sairauksien tutkiminen

Prokarioottien transkription aloitus

sigma tekijä kiinnittyy RNA polymeraasiin kompleksi löytää transkription aloituskohdan

Eukarioottien transkription aloitus

monimutkaisempi kuin prokarioottien, koska eukarioottien perimä ja systeemit monimutkaisempia

geenit pakkautuneina tarvitsee saada aloituskohta esille ennen kuin

voidaan aloittaa koodaus eukariooteilla tiukemmin säädelty useita säätely tekijöitä

Transcription factorit, TF

basal factors minimi promoottori TATAA, RNA polymeraasi II, TFIIB,…

upstream factors vahvistajat ja hiljentäjät

variaatiot jotkut kirjaimet voivat olla erilaisia, esimerkiksi viereinen

proteiini voi antaa tämän mahdollisuuden sensitiivisyys ja spesifisyys voidaan kuvailla matemaattisin mallein:

matriisipohjaiset ovat spesifisempiä kuin IUPAC painomatriisit voivat ennustaa sitoutumisaffiniteettia matriisiperheet sisältävät TF:ien biologisen vaihtelevuuden

TFBS =transcription factor binding site lyhyt pätkä DNA:ta (5-25nukleotidiä) sitoutunut yksi tai useita transcription factoreita hyvin konservoituneita säätelykohtia:

jopa 50 000nukleotidin päässä otettava huomioon myös toinen juoste voi olla myös geenin sisällä

DNA:han sitoutuvat domainit

Zinc finger Leucine Zipper Homeodomain

tärkeitä kehitysbiologiassa TATA- sitoutuva proteiini

CpG islands

Ihmisen genomissa CpG dinukleotidit ovat harvinaisia

CpG parit käyvät läpi metylaation, joka muuttaa C nukleotidia

Metyloitu C voi mutatoitua hyvin suurella todennäköisyydellä T:ksi

Promoottori alueet ovat CpG rikkaita Alueita ei ole metyloitu ja täten mutatoituvat

harvemmin (evolutionäärisesti tärkeitä) Näitä kutsutaan CpG islandeiksi

Mikrosirut

Promoottorien ennustamisessa käytetään hyväksi mikrosiruja

sirujen avulla etsitään samalla tavalla ekspressoituvia geenejä

tällä hetkellä käytännössä ainoa keino etsiä uusia transcriptio factoreita

Ohjelmat

pelkästään sekvenssiin pohjautuvia TATA box CpG islands tulevaisuudessa 3-uloitteisuus huomioon

Promoottori alueen etsintä promoottori analyysi tarvitsee promoottorin sekvenssin

saaminen voi olla triviaalia! meneekö vastavirta sekvenssi toisen promoottorin

päälle? ohjelmia:

UCSC tarvitsee RefSeq mRNA accession koodit tarjoaa valmiiksi tehdyn kokoelman vastavirta

sekvensseistä LocusLink

tärkeä UCSC:n käyttöön jos ei RefSeq koodeja EnsMART

Promoottori alueiden analyysi

etsitään jo tiedossa olevia TFBS vastavirrasta The TRANSFAC database ver. 6.0

eukarioottien transkriptio tekijöiden, niiden genomiin sitoutuvien osien ja DNA sitoutumisprofiilin tietokanta

Gene Regulation Match

potentiaalisten transkriptio tekijöiden sitoutumiskohtien etsimiseen

käyttää TRANFAC 6.0:n kirjastoa mononukleotidi painomatriiseista

Uusien transkriptio tekijöiden etsintä

MEME Työkalu motifien etsintään DNA:sta

Motif on pala sekvenssiä joka toistuu sukulais DNA sekvenssien ryhmässä

Kuvaa motifeja paikkariippuvaisilla kirjaintodennäköisyys matriiseilla, jotka kertovat kuinka todennäköisiä jokainen mahdollinen kirjain on kussakin kohtaa sekvenssi pätkää

Yksittäinen MEME motif ei sisällä aukkoja Aukkoja sisältävät MEME jaetaan kahteen tai

useampaan erilliseen motifiin Antaa ulos yhtä monta motifia kuin on pyydetty

AlignACE Käyttää Gibbs sampling algoritmiä

Genomatix Sovelluksella kuukausittaiset rajat Matinspector

Etsii transcriptio tekijöiden sitoutumiskohtia Käyttää matriiseja sekä IUPAC kirjastoja

Sisältää noin 400 sitoutumiskohtaa ElDorado

Näyttää saatavilla olevan annotaation genomi alueesta Gene2Promoter

Etsii ja analysoi promoottoreita Promoottoreiden suoraan hakemiseen

PromoterInspector Promoottorien hyvin specifinen ennustaminen nisäkkäille Promoottori alueiden etsimiseen Suunniteltu paikantamaan potentiaalisia promoottori alueita DNAn

kohdista, joita ei ole vielä annotoitu Ihmisen korkealaatuisiin promoottoreihin käytä elDoradoa tai

Gene2Promoteria

Lähteet

www.csc.fi/molbio/opetus/promoottorianalyysi luentokalvoja

Molecular Biology of the Cell

Kiitoksia!

Kysymyksiä?

http://www.bio.com/pics/nucleosomes_chromatin.jpg

http://www.mdx.ac.uk/www/lifesciences/alex/images/0905_2.gif

http://images.google.fi/imgres?imgurl=http://fajerpc.magnet.fsu.edu/Education/2010/Lectures/24_DNA_files/image014.jpg&imgrefurl=http://fajerpc.magnet.fsu.edu/Education/2010/Lectures/24_dna.htm&h=259&w=594&sz=28&tbnid=fAnLCofwn_IJ:&tbnh=57&tbnw=131&start=103&prev=/images%3Fq%3Dnucleosomes%26start%3D100%26hl%3Dfi%26lr%3D%26sa%3DN

Prokaryotic DNA       The main DNA in prokaryotes is a circular molecule attached to

the plasma membrane.       Some DNA is organized in smaller circles called plasmids.       90% of the genome consists of functional genes, i.e. genes

coding for proteins.       Genes coding for a metabolic pathway are lumped together into an

operon.   Eukaryotic DNA:       Prokaryotic DNA is a relatively simple circular molecule.  In

eukaryotes, DNA is associated with proteins to form a complex called chromatin.

   Chromatin       A variety of proteins form part of this complex:       Histones are small, basic, structural proteins that bind to

negatively charged phosphate groups.  They show a highly conserved structure (homology) between higher and lower organisms.

      Nonhistones are regulatory proteins(leucine zippers;  zinc fingers).

Promoottori

Ennen geenin transkription alkamista tarvitaan useita prosesseja ennen kuin varsinainen luenta voidaan aloittaa

Nucleosomes       DNA is tightly wrapped around a protein core made of basic protein (histones).       Each repeating unit (nucleosome) consists of 200 base pairs, which shortens the

length of DNA by about 10-fold.       The space between nucleosomes is a site for binding of regulatory proteins that initiate

DNA replication or transcription.       DNA appearing as a string of beads (nucleosomes) is an active form of DNA and is

called euchromatin. Coiled nucleosomes       In order to shorten DNA further (the shorter the strand the less likely it is to get

entangled with other       strands), nucleosomes are supercoiled like rope.        In this form, DNA is inactive, proteins reading DNA are sterically hindered by the

dense further packing of chromatin.  The inactive state of DNA is referred to as heterochromatin.

Extended chromatin       That’s not enough. The “rope” of coiled nucleosomes folds over in pleats, forming an

extended chromatin.  The folds are held by nonhistone binding proteins. Condensed chromatin       The folded fiber can be folded again, generating condensed chromatin. Chromosome       Finally, condensed chromatin folds again to form a chromosome.       This most condensed form of a single DNA molecule occurs only during cell division.

Kolme perusmekanismia