Propiedades qumicas de aminocidos y protenas

Quiones Jhon Alexander 1426826 (jaquipe06@hotmail.com)Rivera Juan Fernando 1429905 (rivera.juan@correounivalle.edu.co)Sierra Victoria Alejandra 1425191 (alejaluna7@gmail.com)Laboratorio de Qumica Orgnica GeneralUniversidad del ValleDepartamento de Qumica

RESUMEN

Se llev a cabo una serie de reacciones de coloracin, coagulacin, precipitacin y de cido-base, partiendo de la albmina (protena que se encuentra en el plasma sanguneo), en este caso, de clara de huevo, con el objetivo de determinar visualmente la reactividad y los efectos que causan en aminocidos y protenas al reaccionar con sustancias como cidos o sales, o al someterlas a cambios de temperatura.

RESULTADOS

La prctica de laboratorio consisti en distintas reacciones, de las cuales se obtuvo los siguientes resultados:

Tabla 1. Resultados de las recciones.ReaccinResultados

Acidez de los aminocidos.Al adicionar 4 gotas de tornasol (fenolftalena) a 0.5 mL de cido aminoactico, la solucin pas de incolora a blancuzca. Al adicionarle la sptima gota, la solucin retorn a su color original.

Formacin de una sal compleja de cido aminoactico.Al agregar 1 g de xido de cobre (II) pulverizado a la solucin de 0.5 mL de cido aminoactico con 3 mL de agua, la solucin pas de incolora a un color negro. Despus se calent en bao de Mara durante varios minutos hasta que se formara un precipitado que posteriormente, se filtr a gravedad. El lquido obtenido presentaba una coloracin azul clara, ste se evapor en bao de Mara hasta que se pudieron apreciar unos cristales adheridos al fondo de la cpsula de porcelana, los cuales eran de color verdoso.

Coagulacin de albmina.El procedimientos const de cinco reacciones, todas a partir de 1.0 mL de una solucin de clara de huevo:a) A los 5 minutos de calentar la solucin en bao de Mara, y una temperatura de 78C la solucin se torn blanca, con un precipitado del mismo color. Ocurre coagulacin.b) Al adicionar 4 mL de etanol, se formaron 2 fases, una fase inferior color blanco de aspecto grumoso, y una superior incolora viscosa. Ocurre coagulacin.c) Se agregaron 10 gotas de HCl y se form un precipitado blanco. Se aprecia slo una fase. Ocurre coagulacin.d) Al momento se agregarle la dcima gota de cido ntrico, se form una base superior amarilla y una inferior blanca, luego pas a verse slo una fase amarilla de aspecto espeso y grumos correspondientes al precipitado. Ocurre coagulacin.e) No ocurri reaccin alguna al adicionarle NaOH al 50% ni coagulacin.

Precipitacin de protenas con metales pesados.A 1.0 mL de solucin de clara de huevo se le agregaron 5 gotas de sulfato de cobre al 5%, la solucin tom un color azul claro y de aspecto lechoso con un pequeo precipitado.

Reaccin Xantoproteica.Se calent la solucin de clara de huevo con 5 gotas de cido ntrico y despus de 10 minutos, se le adicionaron 10 gotas de hidrxido de sodio y se form una sola fase color naranja con espuma en la parte superior de un tono amarillo.

Reaccin de biuret.Al adicionarle 1 mL de NaOH al 10% y 10 gotas de sulfato de cobre al 2% a 1 mL de solucin de clara de huevo, se form una fase superior color azul oscura y abajo incolora. Se calent y a los 3 minutos la solucin se volvi homognea de color azul oscuro y a los 5 minutos, torn a violeta.

Reaccin coloreada de formaldehdo para protenas.A 0.5 mL de solucin de clara de huevo se le agregaron 2 gotas de solucin diluida de formaldehdo y no ocurri reaccin. Posteriormente, se agregaron 3 gotas de cido sulfrico concentrado, pero debido a la rapidez de la reaccin o a exceso de cido sulfrico no se alcanzaron a diferenciar bien las dos fases que se deban formar.

Figura 1. Procedimiento de acidez de aminocidos [Fuente: Juan Fernando Rivera]

Figura 2. Procedimiento de la formacin de la sal compleja de cido aminoactico. (De izq. a der. solucin formada, resultados de la filtracin a gravedad (slido y lquido) y cristales formados al calentar) [Fuente: Los autores]

Figura 3. Coagulacin de la albmina. (De izq. a der. y de abajo a arriba, Soluciones de clara de huevo, reaccin con calor (a) reaccin con etanol (b), reaccin con cido clorhdrico (c), reaccin con cido ntrico (d) y reaccin con hidrxido de sodio (e)) [Fuente: Los autores]

Figura 4. Precipitacin de protenas con metales pesados. Solucin de clara de huevo con sulfato de cobre. [Fuente: Los autores]

Figura 5. Reaccin Xantoproteica. (De izq. a der. solucin de clara de huevo con cido ntrico, solucin despus de calentar. [Fuente: Los autores]

Figura 6. Reaccin de biuret. (De izq. a der. Solucin sin calentar y despus de 5 minutos de calentar) [Fuente: Los autores]

Figura 7. Reaccin coloreada de formaldehdo para protenas. (De izq. a der. Solucin donde se aprecia la pequea fase inferior lquida amarrilla y solucin blanca homognea) [Fuente: Los autores]

ANLISIS DE RESULTADOS

Acidez de los aminocidos

El objetivo de esta prueba era identificar la acidez de cido aminoactico, para esto, se agreg fenolftalena a una determinada cantidad de cido aminoactico, el cual presento un cambio en la coloracin, de incolora a blanca. Lo que ocurri aqu es que se demostr, por medio de la fenolftalena, el cual es un medidor de pH, que el reactivo era acido [1].

EL cido aminoactico, el aminocido correspondiente a la glicina presenta un momento dipolar, as como todos los aminocido, llamado estado zwitterion, donde el grupo carboxilo se desprotona y forma el ion carboxilato (-COO-) actuando como la base y el grupo amino se protona para formar el ion amonio (-NH3+) y acta como cido, lo que permite que existe un equilibrio entre ellos [2].

Un cido con un solo grupo amino y un grupo carboxilo, como la glicina (+H3NCH2COO-), es ligeramente ms cido que bsico (Ka = 1.6 x 10-10 y Kb= 2.5 x 10-12). Si se coloca este aminocido en solucin acuosa, la solucin resultante est dirigida hacia la forma aninica, es decir aparecen ms aniones que cationes. Entonces para neutralizar la molcula es decir, llevar a su estado zwitterion y alcanzar su punto isoelctrico se debe protonar por medio de la adicin de un cido. En consecuencia su punto isoelctrico est ligeramente debajo de la neutralidad (pH 7). Para la glicina, el punto isoelctrico corresponde a un pH de 6.1. [2]

Esquema 1. Formas ionicas de un aminocido. [Fuente: Los autores]

Formacin de una sal compleja de cido aminoactico

Cuando la glicina (cido aminoactico) se encuentra en solucin acuosa, debido a que es un aminocido neutro, est bajo la forma zwitterion.

Esquema 2. Forma zwitterion de un aminoacido en solucin acuosa. [Fuente: Los autores]

De esta manera, la glicina forma un complejo neutro con el ion metlico cobre (Cu2+) con nmero de coordinacin 4 al reaccionar con el xido de cobre (II). Luego, el agente quelante o quelato es la glicina. Cabe recordar, que un quelato es aqul compuesto que posee dos o ms grupos dadores de un mismo ligando capaces de coordinarse con un ion metlico para formar un anillo heterocclico. El cobre se coordina con el oxgeno del grupo carboxilo y con el nitrgeno del grupo amino de la glicina. Lo anterior indica que la glicina es un ligando bidentado, es decir posee dos grupos dadores. El complejo formado es el glicinato de cobre una vez se someti a calor. Este complejo presenta isomera geomtrica cis-tran que refiere a la posicin de los grupos dadores que guarda el ligante en la esfera de coordinacin del tomo central y que es posible debido a que el ion metlico est enlazado a un ligante bidentado asimtrico y presenta una configuracin geomtrica cuadrada y tetradrica distorsionada debido al nmero de coordinacin.

Esquema 3. Formacin de glicinato de cobre. [Fuente: Los autores]

Cuando se produce esta sal compleja se establece un equilibrio entre ambos ismeros, pero ambos presentan diferente estabilidad, debido a que el ismero trans pierde la capacidad de cristalizarse entre los 100 y 127C, mientras que el ismero pierde esta capacidad entre 145C y 181C, por tanto, este ltimo se ve favorecido por la cintica, causante de que slo este (ismero cis) se precipite en la solucin tomando un color azul claro caracterstica del complejo.

Esquema 4. Isomero cis y trans del glicinato de cobre. [Fuente: Los autores]

Reaccin Xantoproteica

La reaccin Xantoproteica es una prueba cualitativa que se realiza para identificar grupos laterales R en los aminocidos de las protenas en una solucin. La reaccin ocurre una vez se nitra el anillo aromtico con cido ntrico concentrado para generar un precipitado blanco, que luego, al calentar forma una coloracin amarilla, que posteriormente se alcaliniza, para esta reaccin se us hidrxido de sodio y presenta una coloracin naranja gracias a la formacin de sales. Esta prueba da positivo para la tirosina, fenilalanina, triptfano, albmina, entre otros.

Esquema 5. Formacin de compuesto naranja por reaccin xantoproteica. [Fuente: Los autores]

Precipitacin con metales pesados

En general las protenas globulares son solubles en agua y las protenas fibrosas todo lo contrario en su estado nativo, pero este comportamiento puede ser variable dependiendo de los factores en que estas se encuentren. Cuando una protena se desnaturaliza, pierden propiedades de su solubilidad, lo que provoca su precipitacin. Una protena desnaturalizada, es aquella protena que pierde su estructura tridimensional, llegando a su estructura primaria, es decir, los enlaces entre ellas se rompen debido a factores, como calor, cambios pH, cidos, lcalis, metales pesados, entre otros; una protena, como ya se mencion posee cargas positivas por parte del grupo amino y negativas por el grupo carboxilo en una misma molcula, lo que permite reaccionar fcilmente entre s, con el agua y con iones pequeos. Entonces, pueden ocurrir tres tipos de interacciones protena-protena, protena-agua y protena-iones pequeas. En tanto aumente la interaccin protena-protena y disminuya la interaccin protena-agua, la solubilidad disminuye y genera precipitacin de las protenas.

Una manera de que esto ltima ocurre, como ya se mencion es la reaccin con metales pesados; el ion metlico o catin se enlaza a la parte aninica de la molcula proteica de su punto isoelctrico o con pH superiores al punto isoelctrico (pues, en esta forma la molcula se comporta como anin), es decir al grupo carboxilo para formar proteinatos. Para est reaccin se utiliz sulfato de cobre, donde el metal pesado se enlaz al grupo COO- y form lo que se conoce como proteinato de cobre, un precipitado insoluble.

Esquema 6. Formacin de proteinato de cobre. [Fuente: Los autores]

Reaccin de Biuret La solucin de albumina en presencia de sulfato cprico e hidrxido de sodio permite verificar la presencia de enlaces peptdicos, dando a lugar a la reaccin de Biuret que debe su nombre el compuesto conocido comobiuret, la reaccin forma enlaces coordinados entre los iones Cu+2y los pares de electrones no compartidos del nitrgeno. Esta reaccin la producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos ya que se debe a la presencia del enlace peptdico CO-NH que se destruye al liberarse los aminocidosLos enlaces peptdicos de las protenas son estructuralmente similares a los delbiurety reaccionan de la misma manera. La reaccin delbiuretes una reaccin general que se produce con las protenas que presentan al menos dos enlaces peptdicos o dos grupos amida consecutivos como es el caso de la albumina. Estos grupos son capaces de reducir el Cu2+a Cu+, igual que hacen las molculas delbiuretformando Cu+un complejo con las protenas en medio alcalino, que produce una coloracin azul con mximo de absorcin de radiacin electromagntica de 330nm y a 345nm. Aunque en este mtodo las medidas de absorcin de luz a la menor longitud de onda de absorcin (330nm) proporcionan mayor sensibilidad (ya que el coeficiente de extincin molar es mayor), a dicha longitud de onda es tambin ms fcil que se presenten interferencias debidas a la presencia de otros compuestos.La cantidad de luz absorbida por el complejo es directamente proporcional al color del producto, el cual, a las vez, es proporcional al nmero de enlaces peptdicos. El contenido total de protena es proporcional al nmero la determinacin cuantitativa de protena total por espectrofotometra. Debido a que al menos se requieren dos enlaces peptdicos no reaccionan de esta manera. El color alcanza su intensidad mxima a los 10 minutos de la reaccin y estable durante al menos varias horas.

Esquema 7. Formacin de compuesto de biuret. [Fuente: Los autores]

Reaccin coloreada de formaldehdo para protenas.

Esta reaccin es especfica para el aminocido triptfano o protenas con triptfano, debido a que este aminocido posee derivados del indol que al tratar con un aldehdo en presencia de cido sulfrico concentrado forma un anillo color violeta en la interfase de los lquidos. No se tiene pleno conocimiento de qu ocurre en la reaccin pero se cree que el grupo los nitrgenos del grupo indol reaccionan con el grupo aldehdo del formaldehdo formando un producto de condensacin. Sin embargo, este cambio en la coloracin no se logr observar debido a la rapidez de la reaccin.

Esquema 8. Formacin de producto de condensacin del triptofano. [Fuente: Los autores]

Reacciones de coagulacin de albumina

Para los ensayos de coagulacin se realizaron cinco experimentos de desnaturalizacin de la albmina. En el primero, se puso a calentar la albmina por unos minutos formando un precipitado, que se form debido a las bajas estabilidades de conformacin de las protenas nativas, que las vuelve susceptibles a la desnaturalizacin por la alteracin del equilibrio de las fuerzas dbiles que no forman enlaces y mantienen la conformacin nativa. Cuando se calienta una protena en solucin, sus propiedades sensibles de conformacin, como la rotacin ptica, la viscosidad y la absorcin de UV, cambian de forma abrupta en su espectro de temperaturas estrecho. Esta alteracin discontinua indica que la protena nativa se despliega en una forma cooperativa: cualquier desplegamiento parcial de la estructura desestabiliza el remanente, que debe colapsar en forma simultnea para enrollarse al azar. La temperatura en ese punto medio de este proceso se conoce como temperatura de fusin de una protena la cual esa anloga a la temperatura de fusin de un slido [3].

En el segundo ensayo se aadi etanol, disolvente orgnico, a la solucin de la albmina, molcula polar, y se observ inmediatamente la formacin de dos fases, evidencia de la coagulacin.

Lo que se debe a la solubilidad del disolvente que disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol, con ello disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin.Eletanolreaccionaconelinteriorhidrfobodelasprotenasydesorganizanlaestructuraterciaria,provocandosudesnaturalizacinyprecipitacin [4].EsdecirInterfierenconlasfuerzashifrofobas queestabilizanlasestructurasproteicaspormediodesuspropiasinteraccioneshidrofobicasconelagua. Pues Los solventes orgnicos rompen las uniones relativamente dbiles como las fuerzas de Vander Waals y las interacciones hidrofobias (causando la desnaturalizacin), pero no son capaces de destruir los enlaces covalentes en las cadenas polipeptdicas, por lo que se mantiene la estructura primaria de la protena [5].

Posteriormente se aadi cido clorhdrico, a la albmina, que incrementa la concentracin de protones del medio y disminuye significativamente el pH, este exceso de protones cambia las interacciones electrostticas entre las molculas y se da un cambio en la estructura de la protena (desnaturalizacin) evidencindose la agregacin y precipitacin. Debido a que aumenta la concentracin de protones, disminuyendo as su Ph [6]. Los H+ son los que intervienen en la reaccin, unindose a los iones libres del nitrgeno en donde se encuentra en los enlaces peptdicos de las protenas, haciendo que el nitrgeno exceda su valencia, rompindose entonces el enlace peptdico para estabilizar la carga el nitrgeno. Dicha proceso lleva a la protena a desestabilizar su estructura terciaria [7]. As mismo sucede con el NaoH solo que en este mecanismo de reaccin sucede ms lento y debido a que en el experimento se esper lo suficiente no aprecio algn cambio.

Cuando las protenas se tratan con cidos ntrico concentrado dan una coloracin amarilla Se debe a los ncleos aromticos que se nitran formando cidos pcrico. Se puede considerar como una sustitucin electrfila aromtica de los residuos de tirosina de las protenas por el cido ntrico dando un compuesto coloreado amarillo a pH cido.

PREGUNTAS

1. Qu es una protena globular?

Las protenas globulares son protenas esfricas que forman una estructura compleja, propiedad que las hace solubles en agua a diferencia de las protenas fibrosas o de las membranas. La estructura esfrica de estas protenas es inducida por la estructura terciaria; los aminocidos apolares estn delimitados al interior de la molcula y los aminocidos polares estn delimitados al exterior, permitiendo las interacciones dipolo-dipolo con el disolvente. Desarrollan distintos papeles en el organismo. Actan como enzimas, catalizando reacciones orgnicas, transmiten mensajes para regular los procesos biolgicos, transportan molculas a travs de la membrana celular y almacenan aminocidos.

2. Qu es el punto isoelctrico de una protena?

Esquema 9. Formas inicas de un aminocido. [Fuente: Los autores] Lo que sucede con la solucin de un aminocido cuando se la coloca en campo elctrico, depender de su acidez o alcalinidad. En solucin muy alcalina, hay ms aniones en II que cationes enIII, por lo que hay una migracin neta del aminocido hacia el nodo.SII y III en exceso, por lo que hay migracin: en estas condiciones existe cualquiera de las molculas como ion positivo y negativo durante el mismo lapso, de modo que cualquier movimiento pequeo en cualquier direccin de uno de los electrodos es anulados por uno igual y contrario hacia el otro electrodo. La concentracin de ion hidrgeno de la solucin para la cual el aminocido ni migra en un campo elctrico se denomina puntoisoelctricode dicho aminocido.

Aunque la mayora de los grupos carboxilo y gruposamnicosde los aminocidos se bloquean cuando estos se unen para formar la unionespeptdicas, siempre quedan libres algunos de estos grupos, ya sea en los extremos de la cadenaspoli peptdicas, o en las cadenas laterales dekisaminocidosacidcosy bsicos. La disociacin de los grupos ionizables que estn presentes en las protenas, ocurre como en el caso de los grupos ionizables de los aminocidos individuales, y es gobernada por un pH del medio en el que se encuentra la protena. A pH 7,0 o en valores cercanos a esta condicin, que son los habituales en la mayora de las clulas, los grupos carboxilo de los cidosasprticoyglutmicose encuentran es sus formas bsicamente cargadas negativamente, mientras que los aminocidos lisina yargininaestn presentes en sus formasacidias, cargadas positivamente. El aminocido histidina aparece en su mayor partedancarga solo cerca de un 10% del total de esteaminocidose encuentraprotonadocon carga positiva. La contribucin de los grupossulfhdricode lacistena, yfenlicode la tirosina, esmnima; por ejemplo, el grupofenlicode tirosina se encuentra ionizado en 0,1%. La carga total de la molcula proteica depende pues, del pH de la solucin del nmero relativo de cada aminocido en la molcula.As, cuando el pH de lasolucines tal que la carga neta de lamolculaproteica es cero, es decir, cuando el nmero total de cargas negativas iguala al nmero total de cargas positivas presentes en lamolcula, cargadas positivas presentes en lamolcula, se llama a este valor pH, puntoisoelctricoo pHisoelctricode laprotena. El tamao de las cadenaspoli peptdicas, de manera que una cadenapoli peptdicaconstituida principalmente porisoleucina, que es unaminocidocon cadena voluminosa, no formahliceestable ensolucin.

3. Qu propiedades presentan las albminas? Qu funcin tiene la albmina de suero sanguneo?

La albmina es la protena ms importante de la sangre. Se encuentre en mayor proporcin en el plasma sanguneo. Est constituido por una larga cadena de 585 aminocidos que forman una estructura compleja tridimensional que le da sus caractersticas qumicas. Posee 17 puentes disulfuro entrecruzados en sus molculas y presenta un peso molecular de 67.000 daltons. La protena tiene un pKa de 8.5 y un pH de 8. La albmina tiene carga elctrica negativa. Esta protena es sintetizada por el hgado, por lo general, produce de 12 a 15 gramos por da. La albmina de suero sanguneo, tambin llamada "seroalbmina" estabiliza el volumen sanguneo y desarrolla un papel de agente transportador y de almacenamiento de distintos componentes y sustancias de bajo peso molecular de la sangre, tales como la biliburrina, cortisol, hormonas, enzimas, cidos grasos libres, frmacos y drogas, permitiendo que estas sustancias lleguen desde la circulacin sangunea hasta los rganos como el rin, el hgado, el cerebro, etc. Su principal funcin es regular la presin coloidosmtica.

4. Identificacin de aminocidos con azufre

Para identificar aminocidos azufrados, es decir, la cisterna o protenas que la contengan, se coloca la solucin en un medio alcalino, puede ser hidrxido de sodio y a continuacin se desprende el mecarcapto (HS-) de la cisterna y se forma cido sulfhdrico y el azufre saliente se reemplaza por un oxgeno formando el grupo hidrxido (-OH). Para detectar la formacin de cido sulfhdrico se reacciona con sales de plomo y debe formarse un precipitado negro de sulfuro de plomo. Por otra parte, el cido sulfhdrico tambin es fcilmente detectable por su olor desagradable caracterstico.

Esquema 10. Identificacin de aminocidos azufrados. [Fuente: Los autores]

CONCLUSIONES

Los aminocidos poseen la caracterstica principal de contener un grupo amino y un grupo carboxilo enlazado al mismo carbono, denominado carbono . Los aminocidos tienden a presentarse en su estado zwitterion, que es el estado de equilibrio de la molcula. Esto ocurre cuando el carboxilo se desprotona y el grupo amino se protona, llamado punto isoelctrico. A pesar de esto, los aminocidos pueden ser ligeramente acidos o ligeramente bsicos, dependiendo de la direccin a la que est dirigida la molcula (puede ser hacia la forma aninica o hacia la forma catinica), como es el caso de la glicina, que presenta un pH ligeramente cido. Por otra parte, los aminocidos son capaces de formar complejos con metales pesados, pues actan como ligandos bidentados, unindose al nitrgeno del grupo amino y al oxgeno del grupo carboxilo, estos complejos forman un precipitado y cambios en la coloracin dependiendo del metal con que reaccionen, esta reaccin disminuye la solubilidad de la protena logrando precipitar el ismero cis, debido a que se cristaliza a menor temperatura que el ismero trans.

Las reacciones de coloracin sirven para identificar el grupo R de los aminocidos y protenas. Dependiendo del tipo de reactivo a usar, del mismo grupo R y el nmero de enlaces peptdicos, la protena forma una precipitacin y toma una coloracin determinada, como es el caso de la reaccin xantoproteica, que toma una coloracin amarilla cuando el grupo R contiene un grupo aromtico y posteriormente se basifica tomando una coloracin naranja; As mismo, cuando el grupo R contiene un indol, al reaccionar con un aldehdo, este forma un producto de condensacin y una coloracin violeta. Por ltimo, en las reacciones de coloracin de aminoacidos, se analiz la reaccin de biuret, que se da cuando en la estructura proteica hay dos o ms enlaces peptdicos, que reaccionan con sulfato de cobre en medio bsico, formando un complejo y un cambio en la coloracin (violeta).

En las reacciones de coagulacin, la protena se desnaturaliz debido a diferentes factores como la temperatura, la cual aumenta la energa cintica, lo que produce rompimiento en los enlaces alterando la estructura terciaria; con los solventes polares ocurre algo similar, estos desorganizan la capa acuosa de las protenas destruyendo las interacciones dbiles, de forma que el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada; con los cidos y bases ocurre un cambio en el pH y punto isoelctrico alterando la estructura proteica; La nica diferencia entre la xantoproteica y la coagulacin del cido ntrico, es que esta esta ltima no se basifica.

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