Universidade de São Paulo Instituto de Química

Proposta de atividade didática para a disciplina QBQ3400 – Bioquímica

Metabólica

Trabalho de conclusão da disciplina QBQ5825 – Prática de ensino de Química e Bioquímica

Melissa Cavalheiro Tourino

Supervisor da Disciplina: Prof. Dr. Sandro R. Marana

São Paulo, junho de 2010

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Índice

1. Introdução................................................................................................03

2. Atividades desenvolvidas.........................................................................04

3. Dificuldades detectadas...........................................................................05

4. Proposta de atividade didática.................................................................06

5. Conclusões..............................................................................................12

6. Observações adicionais...........................................................................13

7. Sugestões adicionais...............................................................................14

8. Referências..............................................................................................17

9. Anexo I.....................................................................................................18

10. Anexo II..................................................................................................22

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1. Introdução

O objeto de estudo foi uma turma de graduação matriculada na disciplina

QBQ3400 – Bioquímica Metabólica, lecionada pela Profa. Dra. Sayuri

Miyamoto, no Instituto de Química da Universidade de São Paulo. Participaram

também da disciplina duas monitoras, Márcia Cristina, aluna de Doutorado

Direto do departamento de Bioquímica do Instituto de Química e Melissa

Tourino, aluna de mestrado do departamento de Análises Clínicas da

Faculdade de Ciências Farmacêuticas.

As aulas foram ministradas no período noturno, duas vezes por semana.

A turma era composta por 57 alunos, matriculados, em média, no terceiro ano

do curso de Química. Por se tratar de uma turma noturna, a maioria dos alunos

desenvolviam atividades profissionais durante o dia, fato que acredita-se ter

influenciado no rendimento dos alunos no decorrer da disciplina. Durante o

semestre pôde-se observar certo desinteresse por parte dos alunos, com

exceção de alguns que tiveram ótimo rendimento.

A evolução da disciplina se deu diante de aulas expositivas, três aulas

práticas e listas de exercícios semanais resolvidas em sala de aula. As aulas

expositivas foram apresentadas essencialmente em Datashow, sem adoção de

outras técnicas didáticas. As aulas práticas foram referentes ao fracionamento

de proteínas, cinética enzimática e extração de lipídeos. Os exercícios eram

semanais e referentes ao conteúdo apresentado durante a semana. Eram

resolvidos em sala de aula com o auxilio de livros da área como "Princípios de

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Bioquímica" (LEHNINGUER, A. L., et al), "Bioquímica" (VOET, D.) e

"Bioquímica Básica" (MARZZOCO, A., et al).

A avaliação do desempenho dos alunos ficou a cargo de três provas

escritas (subjetivas) e a computação das notas dos exercícios semanais e

relatório das aulas práticas. A média final foi calculada com base em média

ponderada.

2. Atividades desenvolvidas

Durante o semestre foram acompanhadas algumas aulas expositivas, as

aulas práticas, confecção e auxílio nas resoluções dos exercícios, além da

correção dos mesmos e dos relatórios.

As aulas práticas eram testadas no dia anterior para avaliação de

reagentes e condições necessárias e eram ministradas no Laboratório de

Didática do Bloco 7. Os alunos eram agrupados em trios para a execução da

prática e as aulas introdutórias, divididas entre as duas monitoras e a

professora Dra. Sayuri Miyamoto. Assim sendo, a prática de "Fracionamento de

Proteínas" foi apresentada pela monitora Márcia Cristina; a de "Cinética

Enzimática" pela monitora Melissa Tourino; e a de "Extração de Lipídeos" pela

Profa. Dra. Sayuri Miyamoto.

As listas de exercícios eram confeccionadas pelas monitoras com base

nos livros utilizados para a sua resolução em sala de aula, isto é, "Princípios de

Bioquímica" (LEHNINGUER, A. L., et al), "Bioquímica" (VOET, D.) e

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"Bioquímica Básica" (MARZZOCO, A., et al), abrangendo de forma integrada

os assuntos abordados durante a semana.

As correções das listas de exercícios e dos relatórios das aulas práticas

eram divididas entre as monitoras e foi com base nessa experiência que pôde

se chegar a uma conclusão com relação às dificuldades enfrentadas pelos

alunos nessa disciplina.

3. Dificuldades detectadas

Após acompanhamento da disciplina, chegou-se à conclusão de que

uma das dificuldades apresentadas pela maioria dos alunos era com relação à

Cinética Enzimática. Vários pontos de deficiência dentro desse assunto

contribuíram para que o entendimento do conteúdo fosse prejudicado. São

eles:

3.1 Dificuldade na visualização da formação do complexo enzima-

substrato (ES), prejudicando, assim, o entendimento da forma pela qual

variações nas concentrações de enzima e substrato podem influenciar na

velocidade de uma reação enzimática;

3.2 Utilidade da transformação de Lineweaver-Burk, uma vez que os

alunos não enxergaram essa transformação como a possibilidade de se

calcular Vmáx e Km. Pelo que foi observado, os alunos entenderam que se

tratava apenas de uma outra possibilidade de visualização do gráfico V0 x [S], e

que Vmáx e Km poderiam sim ser calculados por este gráfico.

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3.3 Tipos de inibição enzimática, no sentido da diferenciação das

relações existentes entre enzima-inibidor-substrato (EIS) características de

cada tipo de inibição e suas consequências em termos de variação de Vmáx e

KM.

4. Proposta de atividade didática

Para auxiliar e tentar sanar a dificuldade encontrada pelos alunos

referente ao conteúdo de cinética enzimática, propõe-se a utilização do

software Enzyme [1], desenvolvido pelo Laboratório de Tecnologia Educacional

da Unicamp. Trata-se de um software interativo e relativamente completo que

possibilita aos alunos a visualização, muitas vezes animada, dos parâmetros

necessários ao entendimento do assunto. O software pode ser baixado

diretamente da Revista Brasileira de Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular

(RBEBBM) após cadastro e necessita da instalação do programa Adobe Flash

Player, disponível para download gratuito. Sendo assim, trata-se de um

material de fácil acesso, que pode ser utilizado tanto por professores, quanto

por alunos.

Iniciando o programa, na tela principal, os autores dividem o conteúdo

em dois tópicos:

4.1 - Enzima: Estrutura e Função

4.2 - Cinética Enzimática

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Cada tópico possui subitens como textos explicativos, imagens,

animações, simulações de experimentos e uma seção de auto-avaliação

contendo oito questões sobre os assuntos abordados nos subitens.

O tópico “Enzima: Estrutura e Função” discorre sobre assuntos básicos

ao entendimento da cinética enzimática. Está estruturado da seguinte forma:

4.1.1Textos: 4.1.1.1 Energia livre

4.1.1.2 Aumento da velocidade de reação

4.1.1.3 Conformação Protéica

4.1.1.4 Efeitos do pH

4.1.1.5 Efeitos da temperatura

4.1.1.6 Efeitos da [S]

4.1.1.7 Classificação enzimática

4.1.1.8 Enzimas alostéricas

4.1.1.9 Ligação não-covalente

4.1.1.10 Ligação covalente

4.1.2 Imagens: 4.1.2.1 Estrutura primária, secundária, terciária e quaternária

4.1.2.2 Gráfico Distribuição de energia

4.1.2.3 Gráfico Aumento de energia

4.1.2.4 Gráfico Adição do catalisador

4.1.2.5 Gráfico Redução da energia de ativação

4.1.2.6 Gráfico pH ótimo

4.1.2.7 Gráfico Temperatura ótima

8

4.1.2.8 Classificação das enzimas

4.1.2.9 Gráfico sigmóide

4.1.2.10 Gráfico Modulador alostérico

4.1.2.11 Feedback

4.1.2.12 Ligações covalentes

4.1.3 Animações: 4.1.3.1 Efeito do pH

4.1.3.2 Ação de Oxidorredutases

4.1.3.3 Ação de Transferases

4.1.3.4 Ação de Hidrolases

4.1.3.5 Ação de Liases

4.1.3.6 Ação de Isomerases

4.1.3.7 Ação de Ligases

4.1.3.8 Ação de Moduladores alostéricos

4.1.4 Simulação: Experimento interativo demonstrando os efeitos do pH,

temperatura e [S] sobre enzimas como pepsina, tripsina e TAQ-polimerase.

Auxilia na compreensão de pH e temperatura ótimos.

Embora esse tópico seja bastante relevante para a compreensão do

assunto, o conteúdo apresentado pode ser encontrado facilmente em livros da

área, não oferecendo alternativa didática tão inovadora, à exceção dos itens

animações e simulações, que são muito interessantes no sentido de

fornecerem uma opção visual e animada do que acontece durante a reação

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enzimática de acordo com diferentes tipos de influências. Além disso, os itens

abordados neste tópico não representam o foco desse trabalho.

Já o segundo tópico, “Cinética Enzimática”, é o que abrange maior parte

das dúvidas apresentadas pelos alunos. Encontra-se dividido em:

4.2.1 Textos: 4.2.1.1 Cinética enzimática

4.2.1.2 Constante de Michaelis-Menten

4.2.1.3 Gráfico Duplo-Recíproco

4.2.1.4 Inibidores competitivos reversíveis

4.2.1.5 Inibidores não-competitivos e mistos reversíveis

4.2.1.6 Inibidores incompetitivos reversíveis

4.2.1.7 Inibidores irreversíveis

4.2.2 Imagens: 4.2.2.1 Gráfico V0 x [S]

4.2.2.2 Gráfico representativo do KM

4.2.2.3 Equação de Michaelis-Menten

4.2.2.4 Gráfico Duplo-Recíproco

4.2.2.5 Equação de Lineweaver-Burk

4.2.2.6 Esquema de inibição competitiva

4.2.2.7 Comportamento de inibidores competitivos

4.2.2.8 Esquema de inibição não-competitiva

4.2.2.9 Comportamento de inibidores não-competitivos

4.2.2.10 Comportamento de inibidores mistos

4.2.2.11 Esquema de inibição incompetitiva

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4.2.2.12 Comportamento de inibidores incompetitivos

4.2.2.13 Esquema de inibição irreversível

4.2.3 Animações: 4.2.3.1 Inibição competitiva

4.2.3.2 Inibição não-competitiva

4.2.3.3 Inibição incompetitiva

4.2.4 Simulações:

4.2.4.1 Experimento de Regulação Enzimática – experimento

interativo que compara os gráficos V0 x [S] e Duplo-Recíproco diante de

inibidores competitivos e não-competitivos em concentrações variadas. O

usuário do software pode escolher um tipo de inibidor, determinar sua

concentração e a do substrato da reação e observar a conseqüência de sua

escolha na quantificação do produto formado em determinado tempo. Esse

experimento demonstra muito claramente o comportamento dos inibidores

competitivos e não-competitivos, quando presentes na reação.

4.2.4.2 Experimento de Cinética – pode-se avaliar de maneira

interativa e animada a concentração de substrato, interações ES e quantidade

de produto formado em diferentes pontos da reação enzimática, isto é,

demonstra esses parâmetros quando a velocidade de reação é igual a ¼ da

velocidade máxima, quando é ½ da velocidade máxima (referente ao KM) e

quando atinge a velocidade máxima. Basta o usuário clicar nessas posições.

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Esse tópico também apresenta itens facilmente encontrados em livros da

área, como os textos e as imagens, porém, as animações e simulações

mostram-se bem didáticas e simples, passando de maneira clara e objetiva as

idéias que se propõem a passar. A interação de todos os subitens desse tópico

proporciona ao usuário do software ferramentas valiosas para o sucesso na

compreensão do conteúdo como um todo.

Mais especificamente, o Experimento Cinética auxilia de maneira muito

positiva no entendimento da relação entre [S] e formação de complexos ES de

acordo com o andamento da reação, um dos pontos apresentados como

deficiência dos alunos. Esse experimento pode ser um complemento à

exposição teórica e das imagens a respeito da evolução da reação como os

gráficos V0 x [S], KM e Equação de Michaelis-Menten.

O experimento de Regulação Enzimática, por promover uma

comparação entre os gráficos V0 x [S] e Duplo-Recíproco, diante de inibidores,

salienta a idéia de que um gráfico é complementar ao outro, e pode ser

utilizado com essa finalidade após discussão de imagens isoladas dos gráficos

V0 x [S], KM e Duplo-Recíproco. Essa atitude pode auxiliar na resolução do

segundo ponto deficiente dos alunos.

Na tentativa de solucionar o terceiro ponto de dúvida detectado, a

sugestão é utilizar também o experimento de Regulação Enzimática, pois

confronta os comportamentos distintos apresentados por reações na presença

de inibidores competitivos e não-competitivos, auxiliando na sua distinção.

Além disso, as animações relacionadas aos tipos de inibição são bem simples

e claras, sendo alternativas interessantes para a sedimentação dessa idéia.

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Associado a isso há, como para os demais pontos deficientes citados, os

componentes mais teóricos como textos e imagens que podem ser utilizados

em conjunto.

Nesse momento do software foi detectada uma deficiência já que nas

animações são apresentados os comportamentos de três tipos de inibidores

(competitivos, não-competitivos e incompetitivos) e no experimento de

regulação enzimática são utilizados apenas dois tipos (competitivos e não-

competitivos). Essa variação, associada à ausência do quarto tipo de inibição

(mista) em ambos os subitens, pode gerar dificuldade ao docente no momento

de sua apresentação aos alunos, porém, como trata-se de um software de

auxílio, sugere-se que o docente intercale seu uso com a apresentação em

powerpoint ou até mesmo em quadro negro. Uma outra opção é, após

passados os conceitos e comportamentos dos tipos de inibidores ausentes no

software na aula expositiva, o docente estimule a participação dos alunos a

desenharem no quadro negro, a exemplo do software, os gráficos V0 x [S] e

duplo recíproco característicos de cada tipo de inibição.

5. Conclusões

Diante do que foi exposto conclui-se que trata-se de um software

relativamente completo, com uma distribuição didática bem ampla, uma vez

que fornece informações de várias naturezas, abrangendo todas as

capacidades, seja por meio da leitura de textos, da visualização de imagens

e/ou de animações.

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Pode-se dizer que sua utilização alcança o objetivo desse trabalho pois

conseguiu fornecer ferramentas úteis para a solução dos pontos detectados

como deficientes nos alunos da disciplina acompanhada.

O software pode ser apresentado aos alunos por partes, à medida que o

conteúdo avança nas aulas expositivas, principalmente as imagens e

animações, ficando as simulações de experimentos para a sedimentação da

idéia como um todo. Não é necessária a divisão da turma, a apresentação

pode ser feita pelo docente em sala de aula após a aula expositiva, utilizando o

computador já em uso.

O fato de não representar custos à Universidade valoriza ainda mais o

uso do software, pois trata-se de uma opção didática interessante, ampla e de

qualidade, ao alcance do docente, possibilitando-o desenvolver e enriquecer

suas atividades com uma ferramenta mais chamativa aos olhos dos alunos.

É importante salientar que embora seja um software de qualidade,

apresenta falhas, não devendo ser utilizado com a finalidade de substituição

das aulas expositivas e sim como uma complementação, uma opção de

enriquecimento visual do conteúdo.

6. Observação adicional

Aulas práticas revelam-se ser atividades úteis e essenciais para os

alunos visualizarem, na prática, os assuntos que foram abordados na teoria,

possibilitando a sedimentação das informações. Associado a essa idéia, vem o

fato de que os alunos apresentam aptidões diferentes no tocante ao

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entendimento dos conteúdos ministrados, isto é, há alunos com habilidades

mais teóricas, outros práticas e, ainda, alunos que conseguem associar ambas

as formas de conhecimento. Cabe ao docente promover certa variabilidade

didática para que possa alcançar e satisfazer essas diferentes capacidades.

Além disso, o contato íntimo com a prática propicia aos alunos um treinamento

valioso para o futuro no mercado de trabalho, tanto com relação ao manuseio

de equipamentos e insumos do laboratório quanto ao senso de trabalho em

equipe e organização.

Durante o acompanhamento da disciplina pôde-se observar um número

reduzido de aulas práticas em laboratório. Foram ministradas apenas três aulas

durante o semestre, o que acredita-se ser um número muito reduzido por se

tratar de uma disciplina de conteúdo extenso e variado.

Ao longo do semestre foram abordados em aula prática o fracionamento

de proteínas, a cinética enzimática e a extração de lipídeos. Ambas são

relevantes para o entendimento do conteúdo da disciplina e abordam pontos

importantes, porém, acredita-se que há outros assuntos que poderiam ser

abordados para o enriquecimento da disciplina.

7. Sugestões adicionais

Sugerem-se dois assuntos para serem abordados em aula prática:

Caracterização de Proteínas e Propriedades das Enzimas, retirados do material

didático da disciplina de Bioquímica, ministrada ao curso de Farmácia da

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Universidade Federal de Alfenas (Unifal). As aulas são compostas pelos

seguintes experimentos (os protocolos encontram-se no Anexo I):

7.1 Aula 1: Caracterização de Proteínas:

7.1.1 Determinação do ponto isoelétrico da caseína [2] – os alunos

preparam tubos contendo caseína (leite desnatado) em

variados valores de pH e observam a precipitação da proteína

em seu ponto isoelétrico.

7.1.2 Identificação de aminoácidos:

7.1.2.1 Reação Xantoprotéica – demonstra a presença de anel

aromático de aminoácidos como fenilalanina, tirosina e

triptofano.

7.1.2.2 Reação de Millon – específica para a identificação de

tirosina, pela reação de seu grupo hidroxifenil com

fenilato de mercúrio.

7.1.2.3 Reação de enxofre – evidencia a presença de enxofre

na estrutura de cistina e metionina.

7.1.2.4 Reação de Pauly – específica para a identificação de

tirosina e histidina, pela reação do anel imidazólico da

histidina e grupo fenil da tirosina com ácido sulfônico.

7.1.2.5 Reação de Sakaguchi – Identifica o guanido grupo da

arginina.

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7.2 Aula 2: Propriedades das enzimas:

7.2.1 Influência da temperatura - demonstra a variação de atividade

enzimática na presença de temperaturas diferentes.

7.2.2 Influência do pH – demonstra a variação da atividade

enzimática na presença de diferentes valores de pH.

7.2.3 Especificidade enzimática – compara resultados de atividade

de enzimas quando reagem com seus substratos e quando

reagem com outros compostos que não são substratos.

A primeira aula evidencia, principalmente, características estruturais das

proteínas e seus aminoácidos. As reações são bem simples e seus resultados,

claros. É possível que a execução dessa prática auxilie na sedimentação do

conhecimento a respeito das estruturas dos aminoácidos e da ocorrência do

estado de Zwitterion ou ponto isoelétrico.

A aula de "Propriedades das Enzimas" reforça idéias abordadas nas

aulas expositivas e funciona até como um complemento ao software sugerido

como proposta de atividade didática neste trabalho. Apresenta resultados

práticos das influências sofridas pela temperatura e pH, além de elucidar

claramente a propriedade de especificidade enzimática, o que auxilia na

resolução do primeiro ponto de dificuldade apresentado no item 3 desse

trabalho.

As aulas pode ser executadas conforme os procedimentos já adotados

pela disciplina com relação a aulas práticas, descritos na introdução. Os

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reagentes utilizados são de fácil acesso e provavelmente já constam da lista de

insumos do Laboratório de Didática, onde são ministradas as aulas práticas.

8. Referências

1. GALEMBECK, E.; FILHO, C. E. S. P. Enzyme Revista Brasileira de

Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular, 03 sep. 2007. Disponível

em:

<http://www.ib.unicamp.br/lte/rbebbm/visualizarMaterial.php?idMaterial=

528>. Acesso em: 05 abr. 2010.

2. IB, D. B. -. Desnaturação de Proteínas Revista Brasileira de

Ensino de Bioquímica e Biologia Molecular, 05 abr. 2007.

Disponível em:

<http://www.ib.unicamp.br/lte/rbebbm/visualizarMaterial.php?i

dMaterial=454>. Acesso em: 23 jun. 2010.

3. Manual de técnicas em histologia e biologia celular do

laboratório de biologia celular da Faculdade de Medicina da

Universidade de São Paulo, 2002.

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Anexo I

Protocolos das aulas práticas

Aula 1: Caracterização de proteínas

1. Determinação do ponto isoelétrico da caseína (proteína do leite)

Tubos Água destilada

(mL)

Ac acético

0,01M (mL)

Ác acético

0,1M (mL)

Ac acético

1M (mL)

Caseína

(mL)

pH

1 8,4 0,6 - - 1,0 5,9

2 7,7 1,3 - - 1,0 5,5

3 8,7 - 0,3 - 1,0 5,3

4 8,5 - 0,5 - 1,0 5,0

5 8,0 - 1,0 - 1,0 4,7

6 7,0 - 2,0 - 1,0 4,4

7 5,0 - 4,0 - 1,0 4,1

8 1,0 - 8,0 - 1,0 3,8

9 7,4 - - 1,6 1,0 3,5

Numere os tubos de acordo com a tabela acima e adicione os reagentes nesta

ordem: água destilada, ácido acético e leite desnatado (caseína). Observe o

que aconteceu e determine o ponto isoelétrico da caseína (pI).

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2. Identificação de aminoácidos

Solução protéica = clara de 1 ovo + 200 mL de água

3.1 Reação Xantoprotéica

Em um tubo de ensaio colocar 2 mL de solução protéica e 10 gotas de

ácido nítrico concentrado. Aquecer até o aparecimento de coloração amarelo

claro. Adicionar amoníaco concentrado ou hidróxido de amônio e agitar até que

a coloração se fixe em alaranjado, indicando a presença de um anel aromático.

3.2 Realção de Millon

Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de solução protéica e 8 gotas do

reativo de Millon (protocolo no Anexo II), agitar. Aquecer em chama direta até

que o precipitado se torne avermelhado, indicando a presença de tirosina.

3.3 Reação de enxofre

Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de solução protéica e 1 mL de

NaOH 10%, agitar. Aquecer por 2 minutos e em seguida acrescentar 4 gotas

de acetato de chumbo 10%, agitar. Observar o escurecimento da mistura,

devido à formação de sulfeto de chumbo.

3.4 Reação de Pauly

Colocar em um tubo de ensaio 5 mL da solução protéica, 1mL de

carbonato de sódio 10%, 1 mL de diazo-reagente de Ehrlich (comercial), agitar.

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A reação positiva se traduz pelo aparecimento de coloração alaranjada,

indicando a presença de tirosina e histidina.

2.5 Reação de Sakaguchi

Colocar em um tubo de ensaio 2 mL da solução protéica, 4 gotas de

NaOH 10%, 8 gotas de solução alcoólica de alfa-naftol 5%, 2 mL de solução de

hipoclorito de sódio, agitar. O aparecimento de cor vermelha intensa indica a

presença de arginina.

Aula 2: Propriedades das enzimas

Lavar bem a boca e coletar cerca de 5 mL de saliva (amilase). Depois

fazer a diluição da saliva (1:1) colocando 2 mL de saliva e 2 mL de água

destilada.

1. Influência da temperatura

Numerar dois tubos de ensaio e colocar em cada um deles, 3 mL de

solução de amido 1%. Levar o primeiro tubo ao banho maria à 37oC, e

mergulhar o segundo tubo em banho de gelo, durante 10 minutos. Adicionar

0,4 mL de saliva diluída (1:1) em cada tubo e agitar. Após 5 minutos, retirar os

tubos do banho maria e banho de gelo e adicionar 3 gotas de iodo (lugol) em

cada tubo, agitar. Interpretar o resultado.

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2. Influência do pH

Numerar 3 tubos de ensaio de adicionar a cada um deles:

Tubo 1: 3 mL de solução de amido 1% + 1 gota de NaOH 0,1M + 0,4 mL

de saliva diluída (1:1), agitar.

Tubo 2: 3 mL de solução de amido 1% + 1 gota de ácido acético 1N +

0,4 mL de saliva diluída (1:1), agitar.

Tubo 3: 3 mL de solução de amido 1% + 0,4 mL de saliva diluída (1:1),

agitar.

Levar os tubos ao banho maria 37oC durante 15 minutos. Após esse

tempo adicionar 3 gotas de iodo em cada tubo e agitar. Interpretar o resultado.

3. Especificidade enzimática

Colocar em 4 tubos de ensaio numerados:

Tubo 1: 1,0 mL de sacarase + 1 mL de sacarose 1%

Tubo 2: 1 mL de sacarase + 1 mL de amido 1%

Tubo 3: 1 mL de saliva + 1mL de amido 1%

Tubo 4: 1 mL de saliva + 1 mL de amido 1%

Agitar todos os tubos. Levar os tubos ao banho maria 37oC por 10

minutos. Adicionar a cada um dos tubos, 1 mL do reativo de Benedict

(identificador da presença de açucares redutores). Aquece-los até a diluição.

Observar e interpretar os resultados.

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Anexo II

Protocolos de preparo de reagentes

1. Reativo de Millon [3]

Preparar solução aquosa de ácido nítrico 40%, dissolvendo o ácido gota

a gota na água (40 mL de ácido nítrico + 60 mL de água destilada). Deixar

solubilizar por 48 horas. Diluir 40 mL dessa solução em 360 mL de água

destilada para obtenção de 400 mL de ácido nítrico 4%. Deixar repousar por 24

horas. Saturar essa solução com excesso de cristais de nitrato de mercúrio.

Filtrar e adicionar 1,4g de nitrato de sódio e 4 mL da solução aquosa de ácido

nítrico 40% (preparada inicialmente). O reativo de Millon assim preparado pode

ser guardado em geladeira por muito tempo.