2014

Rapport

Arne Duinker1 og Mona E. Pedersen2

1Nasjonalt institutt for ernærings- og

sjømatforskning (NIFES) 2NOFIMA

20.06.2014

Prosjektrapport FHF prosjekt #900786:

Fettavleiring, tekstur og struktur i makrell fra juni til november

Fe

ttp

rosen

t

Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec0

5

10

15

20

25

30

35

2

Formålet med prosjektet var vitenskapelig dokumentasjon av endring i fettavleiring og tekstur hos

makrell fra Norskehavet og Nordsjøen gjennom sesongen. Fettinnhold ble analysert i lagdelte fileter,

og fettnivåer i tverrsnitt av makrell ble dokumentert med MR og histologi. I tillegg ble tekstur analysert

instrumentelt fra samme fisk analysert med histologi.

Makrellen har et tynt fettcellelag like under huden. Innenfor dette laget avtar fettinnholdet innover i

muskelen, mens buklappene har relativt høyt fettinnhold i hele muskelvevet. Fettinnholdet i filet var

lavt i juni, økte frem mot september og holdt seg stabilt høyt ut november. Fettavleiringen fulgte

fettinnholdet som varierte en del innenfor hver prøve. Den magre fisken hadde generelt mindre fett i

alle deler av filet, men også denne fisken hadde også høyest fettinnhold like under skinnet. Mager fisk

hadde derimot svært lite fett avleiret innover i muskel. Fettavleiringen i muskel økte med økende

fettinnhold. En typisk fet høstmakrell vil dermed ha mer fett marmorert inn i muskel enn en typisk

mager sommermakrell, selv om fetere og magrere fisk forekommer gjennom hele sesongen. Analyse

av lagdelte fileter, MR og histologi ga samme bildet, men MR og histologi ga et langt mer detaljert

bilde. Fettdråpene ble observert i histologien både mellom muskelskivene og mellom muskelcellene.

Det var en tendens til at høstfisken hadde fastere tekstur enn sommerfisken, men med en del

variasjon mellom de ulike uttakstidspunktene fra samme periode slik at det ikke kunne finnes et klart

sesongmønster. Ulik behandling og innfrysning av fisk i de ulike prøvene kan ha påvirket teksturen en

del.

Innhold Sammendrag ........................................................................................................................................... 2

Bakgrunn ................................................................................................................................................. 3

Metoder ................................................................................................................................................... 3

Prøveinnsamling .................................................................................................................................. 3

Teksturanalyser ................................................................................................................................... 4

Histologi ............................................................................................................................................... 4

Opparbeiding av hel makrell NIFES ..................................................................................................... 4

Fettinnhold i lagdelte fileter ................................................................................................................ 4

MR-bilder av fettinnhold ..................................................................................................................... 5

Resultater ................................................................................................................................................ 6

Fettinnhold i lagdelte fileter ................................................................................................................ 6

Generell beskrivelse fettavleiring fra MR-bilder ................................................................................. 7

Endring i fettavleiring gjennom sesongen ........................................................................................... 8

Tekstur og fettfordeling....................................................................................................................... 9

Appendiks .............................................................................................................................................. 13

SAMMENDRAG

3

Prosjektet har sin bakgrunn i at næringen i mange år har hatt inntrykk av at fettavleiring i makrell

endres gjennom året ved at den tidlig på året lagrer fettet like under skinnet og at fettreservene senere

i sesongen trekkes mer inn i muskelen. Dette har imidlertid ikke vært dokumentert tidligere, og målet

for prosjektet var å dokumentere vitenskapelig hvor i fileten fettet er fordelt hos makrell til ulike tider

i sesongen. Næringen har også hatt inntrykk av at teksturen til makrellfiletene endrer seg gjennom

sesongen, eventuelt i sammenheng med fettfordelingen, med betydelig bløtere tekstur tidlig i

sesongen i mai-juni sammenliknet med høstfisket. Prosjektet skulle derfor også dokumentere tekstur

og struktur i de samme prøvene som skulle samles inn til fettavleiringen.

Prøveinnsamling Prøver fra høstfisket ble samlet inn ved hjelp av Havforskningsinstituttet og referanseflåten. Prøver fra

Lofoten ble samlet inn fra FHF prosjekt «Låssetting av sommermakrell». Prøver fra Island og Færøyene

ble samlet inn ved hjelp av forskerkollegaer i disse landene.

04. jul

25. jun

30. okt

25. nov

16. jun

21. aug

20. jun

30. jun 12. jul

30. jul

04. aug

12. sep

27. sep

05. okt

Figur 1. Kart som viser posisjoner og dato for de ulike prøvene av makrell. Grensene for de ulike fiskerisonene er markert med grå linjer.

BAKGRUNN

METODER

4

Teksturanalyser

Tekstur av tinte fileter fra rundfrosset fisk ble målt instrumentelt ved hjelp av Texture analyser (TA-

XT2, Stable Micro Systems Ltd), og bruk av en sylinder (7 mm diameter, type P/0,25) og press

perpendikulært i forhold til muskelfiberretningen ved en hastighet på 1 mm/s. Sluttpunkt ved

målingen var ved 90 % av initiale filethøyde. Antall fisk fra hver uttaksgruppe var n=10, og 3 punkter

langs fileten ble målt for hver fisk. Følgende parameter ble registrert fra resulterende tid-kraft kurven:

Kraft (N) for punktering filet overflaten, og kraften målt ved 60 % og 90 % kompresjon (F60 og F90,

respektivt).

Histologi Blokker fra fryste fileter i området fra skinn og innover i fileten ble tatt ut til fiksering i 2,5

% glutaraldehyd, pH=7,2 over natt ved 4 0C, før innstøping i metyl methacrylate ifølge prosedyre

beskrevet av Torgersen et al. (2009). Snitt på 3 µm tykkelse ble snittet ved bruk av rotasjonsmikrotom

(Leica RM2165) og videre montert på poly-L-lysine glass slides før farging med 0,1 % toulidine blå

(Sigma Aldrich). Snittene ble analysert mikroskopisk (Carl Zeiss Microimaging GmbH), og vevsområdet

fra skinn og innover i fileten ble vurdert visuelt for rester etter fettdråper. Rester av fettdråper sees

som runde formasjoner, mens derimot fryseartefakter sees som kantede formasjoner i vevstrukturen.

Antall fisk fra hver uttaksgruppe var n=3.

Opparbeiding av hel makrell NIFES Fisken ble halvtint. Fremre del ble skåret av i forkant av ryggfinnen og fryst ned for analyse med MR.

Resten av fisken ble filetert halvtint der én filet ble homogenisert og analysert for fettinnhold. Den

andre fileten ble brukt til lagdeling. Denne ble tint videre på kjøl og deretter fryst inn med skinnsiden

ned og med press på bukdelen og ryggdelen for å få mest mulig at fileten flatt ned mot underlaget.

Fettinnhold i lagdelte fileter Frosne fileter ble trimmet slik at den ytterste delen av ryggsiden av fileten som ikke var helt plan ble

trimmet av. Deretter ble buklappen skåret av og analysert for seg. Den resterende delen av fileten fikk

først fjernet det gjennomsiktige skinnet før den ble skåret opp i skiver fra skinnsiden og inn mot

midten. Fileten ble så kuttet opp i skiver ved hjelp av påleggskjærer fra skinnsiden med økende

tykkelse på ca. 2, 2, 4 og så 4 mm og deretter en rest på ca. 8 mm fra den innerste delen nærmest

ryggbenet. Tykkelsene ble justert noe i forhold til tykkelse på filet. Skivene ble så hakket opp på kjølt

metallplate og analysert for innhold av fett ved ekstraksjon med etylacetat og gravimetrisk

bestemmelse av fettinnhold.

5

MR-bilder av fettinnhold Opprinnelig var det bestemt at prosjektet skulle bestemme prosentandel av fett i makrellen ved

skanning med en såkalt helkroppsmåler. Ved vurdering av denne metoden ble det imidlertid klart at

det tidligere har vært dokumentert fettinnhold i makrell med bruk av MR (magnetisk resonans) (Brix

et al 2009, Journal of Experimental Marine Biology and Ecology). Bildene fra dette bildet ga relativt

lite detaljer, men det viste seg at ny instrumentering med bedre oppløsning var tilgjengelig ved

Universitetet i Bergen sin

utstyrsplattform MIC

(Molecular Imaging center).

Det ble da gjort et forsøk på å

tilpasse metodikk beregnet

på forsøksdyr som rotter og

mus på én makrellprøve for å

fremstille bilder av

fettfordeling i tverrsnitt av

hel makrell. Resultatet fra

dette med en mer visuell

fremstilling av

fettfordelingen ble så

lovende at styringsgruppen

vedtok å inkludere mer

arbeid på MR-bilder og

mindre arbeid på lagdeling og

fettanalyse.

Metoden for skanning med MR ble utviklet i samarbeid med Dr. Tine Pavlin ved MIC. Tverrsnitt av

makrell ble scannet ved bruk av en 7T preklinisk MR skanner (Pharmascan 70/16 AS, Bruker

Corporation) som normalt brukes til analyse av rotter og mus. Metoden bruker T1-vektede aksiale

RARE bilder med og uten fett-suppresjon, og bilder av feltnivåer ble beregnet fra differansen mellom

disse. Prøverør med muskelvev av ulik fettprosent ble brukt som standarder og skannet sammen med

fisken.

Figur 2. MR-skanneren ved MIC/Universitetet i Bergen.

6

Fettinnhold i lagdelte fileter Under metodeutviklingen ble det gjort

målinger på rød muskel («brunfett») og hvit

muskel hver for seg. I mager fisk var det høyere

fettinnhold i rød muskel enn i hvit muskel mens

i fetere fisk var fettinnholdet likt i de to

muskeltypene (Figur 3).

Et utvalg av makrell med fettnivåer i filet typisk

for ulike deler av sesongen, fra lavt til høyt

fettinnhold, ble lagdelt og analysert for

fettinnhold, og resultatene er vist i Figur 4. For

alle fettnivåer var det en tydelig nedgang i

fettinnhold fra skinnsiden og inn mot

ryggbenet, mens buklappene er på nivå med de ytterste to millimeterne for den fetere fisken eller litt

lavere for den magrere fisken på 4 og 9 % fett i hel filet.

Figur 4. Fettprosent i ulike deler av filet fra skinn (0-2 mm) og inn mot ryggbenet, i ulike intervaller (se teksten). I tillegg er buklapp analysert for seg. Fisk med ulike fettnivåer i hel filet ble analysert, og alle viser en nedgang fra høyest fettinnhold ytterst mot skinnet til lavest fettinnhold innerst, og buklapp er på nivå med ytterste delen eller litt under. Merk at i den magreste fisken på 4 % fett i hel filet er kun de ytterste to mm over 10 % fett.

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25

32 %

20 %

13 %

9 %

4 %

Buklapp

RESULTATER

Figur 3. Fettnivåer i lagdelte fileter fra metodeutviklingen. Merk mindre forskjell mellom rød og hvit muskulatur i fetere fisk (øverst) enn i magrere fisk (nederst).

01020304050

010203040

7

Generell beskrivelse fettavleiring fra MR-bilder Makrellen har et tynt lag som trolig består av rene fettceller like under huden, som vist både med foto

av tverrsnitt av makrell og i MR-bild i Figur 5. Innenfor dette marmoreres fettet i muskel med

avtagende konsentrasjoner inn mot ryggbenet. I mager fisk er det lavere konsentrasjoner også i det

ytterste fettcellelaget og lave konsentrasjoner innover i muskelen. Ettersom fisken blir fetere fylles

først fettcellene under huden opp og deretter øker fettmarmoreringen i muskel, fortsatt med de

høyeste konsentrasjonene ytterst.

Figur 5. Øverst til venstre vises foto av tverrsnitt av makrell der vi ser muskelfibrene med ulike bindevevsdrag samt rød muskulatur («brunfett») og det tynne fettcellelaget like under huden. Dette fettcellelaget er vist tydeligere i utsnittet nederst til venstre fra buklapp. Bildet til høyre er differansen mellom et vanlig MR bilde og ett med fett-suppresjon som så er fargesatt etter en RGB-skala der blått er lavest og rødt er høyest fettinnhold.

Lav

t fe

ttH

øyt

fett

8

Endring i fettavleiring gjennom sesongen Makrellen begynner å spise i mai-juni og øker dermed gradvis fettinnholdet til ca. august (Figur 6).

Denne figuren viser også data fra andre prosjekter på makrell ved NIFES (Basisundersøkelse makrell og

FHF-prosjektet SIMA). Deretter er fettinnholdet stabilt høyt gjennom sesongen til ut november, med

ofte de høyeste konsentrasjonene i september. Innenfor hver fangst er det en viss spredning i

fettinnhold, og den største spredningen ser vi gjerne tidlig i sesongen. I dette prosjektet ble det fra

disse prøvene valgt ut fisk fra ulike måneder med lavest fettprosent, median/typisk fettprosent og

høyest fettprosent, og disse bildene er vist i appendiks (Figur 11). Ved sammenlikning av bilder fra ulike

måneder men fra fisk med samme fettinnhold i filet ser det ikke ut til å være en vesentlig forskjeller

mellom tidlig og sent i sesongen (appendiks, Figur 12). Fettavleiringen ser dermed ut til å følge

fettprosenten, slik at jo fetere makrellen er desto mer fett er marmorert i muskel. En makrell med 20 %

fett i juni vil dermed ha lik fettavleiring som en tilsvarende fet makrell fra september. Det er dermed

fettinnholdet og ikke sesong som bestemmer fettavleiringen. Gjennomsnittlig fettinnhold øker

gjennom sesongen fra vår til høst, og en typisk makrell fra høsten vil ha mer fett marmorert i muskel

enn en typisk makrell fra våren. Dette har vi illustrert med en serie av MR-bilder fra typisk fisk mellom

fra mars og utover høsten (Figur 6).

Figur 6. Figuren øverst viser fettprosent i filet i ulike prøver av makrell fra dette og tidligere prosjekter fra minimum om våren frem til det flater ut fra ca. august. Under er det vist MR-bilder av tverrsnitt av makrell med typisk fettinnhold for ulike deler av sesongen.

Fettpro

sent

Mar Apr May Jun Jul Aug Sep Oct Nov Dec0

5

10

15

20

25

30

35

9

Tekstur og fettfordeling Fileter fra ulike årstider innen perioden juni mot desember ble vurdert for fasthet ved måling av tekstur

(Figur 7). Teksturmålingene viste en økning av fasthet i fileten i tidlig høstperioden, med høyest verdier

i september og oktober. Det ble deretter observert en reduksjon i desember måned. I tillegg ble det

observert variasjon innen samme uttaksperiode, både for juni, september og oktober fisk.

Figur 7. Måling av tekstur i fileter fra fisk ved ulike tidsperiodene. Feilgrensene angir standardavvik.

Det ble videre utført histologi med farging med toluidin av de ulike fileter fra hele perioden. I dette

studie er histologi utført etter at fileten har vært fryst. En bløtere og mer vanninnholdig fisk vil ha

mere synlige fryseartefakter enn en fastere fisk ved at iskrystaller dannes lettere ved frysing. Rester

etter fettdråper/fettvev vil være synlig som små runde formasjoner ved farging med toluidin.

Det ble observert tydelige forskjeller i fettfordeling etter årstid ved histologi. Fordelingen av fettdråper,

runde små formasjoner i septemberfisken (Figur 9) ble observert i alle posisjoner fra skinnsiden og

innover mot buken i fisken. I tillegg ble det også observert forskjeller innad i samme periode mellom

ulike fisk, med enkeltfisk som var fetere versus magrere, der antall formasjoner av fettdråper var

høyere innerst hos fet fisk. Hos makrell fisket i perioden juni og juli ble det observert formasjoner av

fettdråper ytterst mot skinnet, mens derimot ingen/lite i midt og innerst (Figur 10). Også her var det

forskjeller mellom ulike fisk fra samme periode, hvor enkelte fisk var fetere (figur 1). Fettdråpene ble

observert både mellom muskelskivene (sarcomerene) og mellom muskelcellene (i endomysiet) for

begge årstider.

Ved histologi kunne vi se en tendens til at fetere fisk hadde mindre fryseartefakter enn magrere fisk.

Dette gjaldt både for sommer og høstmakrell. Fettmengden i fisk kan derfor ha betydning for

teksturmålinger, ved at bløtere fisk med mere fryseartefakter kan resultere i lavere teksturverdier. Fisk

fra uttak Lofoten juni 2012 med høyere teksturverdier enn fisk fra uttak Lofoten juni 2013 med lavere

teksturverdier hadde mer fett og mindre fryseartefakter. Fettmålingene ved NIFES viste like nivåer av

fett i disse to prøvene (Figur 8), men dette var et annet utvalg fisk og det kan ha blitt valgt ut fisk med

ulikt fettinnhold. Vi kunne også se samme tendens for fisk fra uttak 27.09.2012 med lavere

teksturverdier sammenliknet med fisk fra uttak 30.10.2012med høyere teksturverdier. Fisk fra uttak

27.09.2012 hadde tendens til mindre fett og mer fryseartefakter.

0.005.00

10.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00

Are

al 0

-90

% k

raft

N

Tekstur

10

Vi ser altså både ved histologi og MR

en økt marmorering av fett innover i

fileten ved tidlig høstperiode.

Teksturanalyser viste en tendens til

økning i fasthet fra sommer til tidlig

høstperiode, og dermed en

kvalitetsforbedring på frossen filet

fra høstfisket makrell. Fettnivåene

målt hos NIFES på et annet utvalg av

fisk fra de samme prøvene viser en

del støy ved at tekstur i noen tilfeller

ikke følger fettinnhold (Figur 8).

Dette kan skyldes både behandling

og innfrysning av prøvene samt ulikt

utvalg av fisk som kan ha gitt noe

ulikt fettinnhold i fisken hos NIFES

versus NOFIMA. Det er derimot ikke

ved nåværende tidspunkt mulig å konkludere om den økte fettmengden og fettmarmorering er

årsaken til de høyere teksturverdier målt på frossen filet. Laks med høyt fettinnhold er ofte mykere.

Dette i motsetning til våre resultater på makrell. I studiene på laks var teksturmålinger også utført på

fersk filet. En visuell vurdering med histologi kunne tyde på at magrere fisk hadde mer

fryseartefakter/mer ødelagt i struktur. Dette kan være noe av forklaringen på lavere teksturmålinger

på frossen filet fra sommermakrellen med mindre fett. Parametre som størrelse på fisk,

muskelfiberstørrelse, og mengde bindevev er også parametre som er kjent å gi fastere tekstur. Flere

analyser i forhold til dette vil være nødvendig for endelig kunne forklare mulig årsak til økte

teksturverdier utover i høstperioden på frossen makrellfilet.

Oppsummering

Jo fetere makrellen er jo mer fett er marmorert i muskel

Typisk fettinnhold øker gjennom sesongen fra vår til høst

Dermed vil mer fett være marmorert i muskel fra en typisk fisk om høsten sammenliknet med våren/sommeren

Det var en tendens til fastere tekstur hos høstmakrellen, men stor variasjon mellom enkelte prøver gjorde at det ikke var mulig å se et klart sesongmønster. Dette må følges opp ved en senere anledning.

15. May15. Jun

15. Jul15. Aug

15. Sep15. Oct

15. Nov15. Dec

5

10

15

20

25

30

35

40

Tekstu

r nm

elle

r fe

ttpro

sen

Tekstur

Fettprosent

Figur 8. Sammenstilling av data fra tekstur fra fisken NOFIMA analyserte og data fra fettmålingene som ble gjort på fisken som ble analysert hos NIFES.

11

Figur 9. Toulidin fargede vevsnitt av makrell fisket september. Runde små former representerer rester etter fettdråper i vevet. Mørkeblå farging representerer intakte muskelfibre. Hvite kantede former og lyseblå farge representerer fryseartefakte i bindevev og muskelfibre.

Fetere fisk Magrere fisk

Skinnside

Midt

Innerst

12

Figur 10. Toulidin fargede vevsnitt av makrell fisket juni. Runde små former representerer rester etter fettdråper i vevet. Mørkeblå farging representerer intakte muskelfibre. Hvite kantede former og lyseblå farge representerer fryseartefakte i bindevev og muskelfibre.

Fetere fisk Magrere fisk

Skinnside

Midt

Innerst

13

APPENDIKS

9 % 16 % 19 %

Lofoten 20/6

Færøyene 12/7

12 % 25 % 27 %

17 % 24 % 26 %

Island 30/7

Høstfisket 12/9

23 % 28 % 32 %

Figur 11. Oppstilling av MR-bilder fra ulike deler av sesongen. Innenfor hver prøve er det valgt ut fisk med lavest, typisk og høyt fettinnhold. Bildene er fargesatt slik at blått representerer lavest fettinnhold, gult middels og rødt høyest fettinnhold.

14

Juni Sept. Okt.

Figur 12. MR bilder fra ulike deler av året fra makrell med likt fettinnhold i filet.