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i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos
laticíferos: atividade e mecanismo de ação
Diego Pereira de Souza
Fortaleza-CE
2010
i
UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA
Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos
laticíferos: atividade e mecanismo de ação
Diego Pereira de Souza
Orientador: Prof. Dr. Márcio Viana Ramos
Fortaleza-CE
2010
Dissertação submetida à
Coordenação do Programa de Pós-
Graduação em Bioquímica da
Universidade Federal do Ceará,
como requisito parcial para a
obtenção do grau de Mestre em
Bioquímica.
ii
Esta dissertação foi apresentada ao Curso de pós-graduação em
Bioquímica da Universidade Federal do Ceará como parte dos requisitos
necessários à obtenção do grau de Mestre em Bioquímica, outorgado pela
Universidade Federal do Ceará, e encontrar-se-á disposição na Biblioteca
Central da referida Universidade.
A transcrição ou utilização de qualquer trecho deste trabalho é permitida,
desde que seja feito de acordo com as normas da ética científica.
Dissertação aprovada em: ____/____/____
__________________________________________
Diego Pereira de Souza
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________
Prof. Dr. Márcio Viana Ramos Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará Orientador
___________________________________________
Prof. Dr. Carlos Edmundo Salas Bravo Departamento de Bioquímica e Imunologia- ICB
Universidade Federal de Minas Gerais Examinador
___________________________________________
Dr. Cleverson Diniz Teixeira de Freitas Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular
Universidade Federal do Ceará Examinador
iii
À memória de
Ananias Azevedo de Souza.
.
iv
FINANCIAMENTO
Este trabalho foi realizado com o suporte das seguintes instituições:
Universidade Federal do Ceará, através do Laboratório de Bioquímica e
Biologia de Proteínas Vegetais, coordenado pelo Prof. Dr. Márcio Viana
Ramos, do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade
Federal do Ceará.
Universidade Federal de Minas Gerais, através do Laboratório de Biologia
Molecular de Produtos Naturais, coordenado pelo Prof. Dr. Carlos Edmundo
Salas Bravo, do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Universidade
Federal de Minas Gerais.
Coordenação de aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Ceará (FUNCAP)
Rede Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO)
International Foundation for Science (IFS)
v
AGRADECIMENTOS
Ao Professor Márcio Viana Ramos pela competência e valorização
acadêmica que sempre procurou semear em mim. Agradeço a confiança e
paciência (muita paciência). Por me fazer acreditar em um futuro grandioso.
Pela sua obstinação em viabilizar meu crescimento como estudante e pessoa.
Pela orientação. Por ter acreditado em mim e pela amizade.
Ao Prof. Dr. Carlos Edmundo Salas Bravo pela valiosa orientação
científica e apoio incondicional em tudo que precisei. Por ter aberto as portas
do seu laboratório, até mesmo as portas da sua própria casa. Agradeço pela
disponibilidade em me ajudar, desde a minha chegada em MG até a saída.
Espero um dia poder retribuir tudo.
A Profa. Dra. Miriam T. P. Lopes pelo apoio enquanto estive em MG, por
ter aberto sua casa e exporto sua própria família.
Ao Dr. Cléverson Diniz pela co-orientação e participação em todas as
etapas da realização desse trabalho. Pelo incentivo que sempre me deu e por
seu emprenho e amizade ao longo da minha vida acadêmica, bem como
contribuir com meu desenvolvimento intelectual
Ao Dr. Marco T. R. Gomes pelo orientação e por está sempre disposto a
esclarecer dúvidas e fornecer valiosas sugestões para a complementação do
presente trabalho.
Ao Ms. Fabiano Teixeira por seu companheirismo e sua imensa
disponibilidade em me ajudar em qualquer hora. Pela co-orientação nesse
trabalho. Por me ensinar a driblar as dificuldades. Pela amizade.
Aos professores do Departamento de Biologia e de Bioquímica e
Biologia Molecular. Pelas valiosas contribuições na minha formação acadêmica
e como cidadão.
vi
Aos amigos de Laboratório de Biologia e Bioquímica de Proteínas
Vegetais do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular – UFC. Pela
ótima e agradável convivência e amizade. A Danielle Aragão e Raquel Sombra
pela amizade inconfundível. Ao Jefferson Soares pelos grandiosos
ensinamentos e amizade. A Eliane Silva, Mariana Giovenardi, Mayara
Janaguba, e Cristina Quitina pela amizade e por sempre estarem dispostos a
me ajudar.
Aos amigos do Laboratório de Biologia Molecular de Produtos Naturais
do Departamento de Bioquímica e Imunologia –ICB da UFMG pelo apoio e
amizade.
A minha família (Priscilla, Delan, Dione, Helena, Ananias) pelo amor,
carinho, compreensão e apoio a mim concedido.
“que possamos continuar unidos em todos
os momentos das nossas vidas”
vii
"A natureza, assim parece, é o nome popular
Para milhares e milhares e milhares
De partículas jogando seu jogo infinito
De “bilhares” e “bilhares” e “bilhares”"
Piet Hein
viii
RESUMO
Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos: atividade e
mecanismo de ação
Um relevante número de espécies vegetais é descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de látex. Nestas espécies, o látex é sintetizado e armazenado sob pressão em um sistema de canais formados por células altamente especializadas denominadas de laticíferas, cujos citoplasmas estão presentes todas as estruturas eucariontes em meio à água, borracha e inúmeras moléculas, muitas das quais específicas deste conteúdo. Muitos estudos têm sugerido que moléculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o látex de 5 espécies foi coletado e processado em laboratório para obtenção de suas frações protéicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogênicos através de ensaios de inibição da germinação de esporos e crescimento de hifas. Proteínas do látex de Calotropis procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1G10) apresentaram atividade antifúngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) não apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitória das frações protéicas se correlacionou diretamente com a presença de atividade proteolítica do tipo cisteínica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifúngica foi aumentada na presença de DTT, um ativador destas proteases, e foi diminuída ou eliminada quanto às amostras foram pré-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor específico de proteases cisteínicas. Além disso, a atividade antifúngica foi observada quando papaína, uma protease cisteínica purificada do látex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serínicas não apresentaram atividade. Através de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteínica foi isolada de PLCg. A proteína purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolítica máxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseína e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinação de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentração de 28,12 µg/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteínicas de fluidos laticíferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogênicos e que o provável mecanismo de ação destas proteínas seja a alteração da permeabilidade da membrana plasmática destes microrganismos. A descrição de atividade antifúngica de proteases cisteínicas oriundas de fluidos laticíferos não é ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho original.
Palavras-Chave: látex, atividade antifúngica, proteinases cisteínicas
ix
ABSTRACT
Inhibitory proteins of plant pathogens in fluids latex: activity and
mechanism of action
Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in
the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense
metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells
growing intrusively into organized tissues and organs, forming an
interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue
damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however
minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this
study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp),
Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10),
Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested
for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F.
oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and
Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal
activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein
fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these
fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal
growth were both increased when samples were first activated with DTT, a
cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with
iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of
both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine
proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex
of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-
type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified
form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix
monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular
mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of
proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed
with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani
and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90
ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids
are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and
inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are
still scarce in literature and this work appears as an important contribution to
this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple
defensive role of latex in plants.
Key-words: latex, antifungal activity, proteolytic activities, cysteine proteinase
x
_______________________________________________________________
LISTA DE FIGURAS
_______________________________________________________________
Figura 1 Representação esquemática e anatomia dos dois
tipos de laticíferos
5
Figura 2 Efeito inibitório de proteínas laticíferas sobre o
crescimento de diferentes fungos fitopatogênicos
40
Figura 3 Ensaio de inibição da germinação de esporos de F.
solani utilizando a fração protéica do látex de C.
procera
43
Figura 4 Ensaio de inibição da germinação de esporos de F.
solani utilizando a fração protéica do látex de Cr.
grandiflora
44
Figura 5 Ensaio de inibição da germinação de esporos de F.
solani utilizando a fração protéica do látex de Ca.
cadamarcensis
45
Figura 6 Ensaio de inibição da germinação de esporos de F.
solani utilizando a papaína, tripsina e quimotripsina
46
Figura 7 Cromatografia em coluna de troca catiônica “Mono-S
Sepharose” acoplada ao sistema FPLC
47
Figura 8 Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% na
presença de β mercaptoetanol dos picos eluídos da
cromatografia em coluna Mono-S Sepharose.
49
Figura 9 Perfil cromatográfico do PIII em cromatografia de
fase reversa em coluna C4
51
Figura 10 Zimograma e Espectrometria de Massa 53
Figura 11 Efeito de inibidores específicos na atividade
proteolítica presente no PIII, utilizando caseína ou
BANA
55
Figura 12 Efeito do pH na atividade proteolítica do PIII
utilizando caseína como substrato.
56
xi
Figura 13 Ensaio de inibição da germinação de esporos de F.
solani utilizando a protease CG24-I
57
Figura 14 Efeito da CG24-I sobre a permeabilidade da
membrana plasmática de esporos de F. solani
58
_______________________________________________________________
xii
_______________________________________________________________
LISTA DE TABELAS
_______________________________________________________________
Tabela 1 Alguns hospedeiros e as doenças causadas por
fungos utilizados neste estudo
12
Tabela 2 Classes de proteínas antifúngicas 15
Tabela 3 Atividade antifúngica (IC50) de proteínas laticíferas de
C. procera, Cr. grandiflora, Ca. candamarcensis, P.
rubra e E. tirucalli
35
Tabela 4 Efeito inibitório das proteínas dos látices nativas e
tratadas com pronase
36
Tabela 5 Atividade proteolítica das proteínas laticíferas
estudadas utilizando azocaseína como substrato
38
Tabela 6 Atividade amidásica específica das frações de C.
grandiflora eluídas da coluna Mono-S Sepharose
50
Tabela 7 Purificação de uma protease de C. grandiflora 54
_______________________________________________________________
xiii
ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES
BANA N-benzoil-DL-arginina-2-naftilamida
BApNA N-α-benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida
BSA Albumina Sérica Bovina
IC50 Concentração que inibe 50 % do crescimento de fungos
PLCg Proteínas do látex de Crypstostegia grandiflora
PLCp Proteínas do látex de Calotropis procera
PLPr Proteínas do látex de Plumeria rubra
PLEt Proteínas do látex de Euphorbia turucalli
P1G10 Fração protéica de Carica candamarcensis
DMACA 4-Dimetil-amino-cinamaldeído
DMSO Dimetilsulfóxido
DTT Dithiothreitol
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
E-64 trans-epoxisuccinil-L-leucilamida-(4- guanidino)-butano
HCCA ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico
IAA Iodoacetamida
MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionization
PEP Pepstatina
PMSF Fenilmetilsulfonilflúor
SDS Dodecil Sulfato de Sódio
TCA Ácido tricloro acetic
TOF Time of Fly
xiv
SUMÁRIO
Item Título Página
RESUMO xiii
ABSTRACT ix
LISTA DE FIGURAS x
LISTA DE TABELAS xii
ABREVIATURAS E DEFINIÇÕES xiii
I INTRODUÇÃO 1
1.1 Defesa Vegetal 1
1.2 Látex 3
1.3 Evidencias de látices como defesa 6
1.4 Enzimas Proteolíticas 7
1.5 Proteases em Plantas Laticíferas 8
1.6 Proteinases Cisteínicas (EC 3.4.22) em Látices 10
1.7 Fungos e Proteínas Antifúngicas 11
II OBJETIVOS 16
III JUSTIFICATIVA 17
IV MATERIAL E MÉTODOS 18
MATERIAL 18
4.1 Reagentes
18
xv
4.2 Material Vegetal 19
4.3 Fungos 19
MÉTODOS 20
4.4 Coleta e Fracionamento do Látex 20
4.5 Dosagem de Proteínas 21
4.6 Atividade Proteolítica Total 21
4.7 Ensaio para Detecção de Proteinases Cisteínicas 22
4.8 Ensaios Biológicos 22
4.8.1 Cultivo dos Fungos 22
4.8.2 Obtenção da Suspensão de Esporos 23
4.8.3 Ensaio de Inibição do Crescimento Fúngico em Meio Líquido 24
4.8.4 Ensaio de Inibição da Germinação de Esporos 25
4.8.5 Envolvimento de Proteínas na Atividade Antifúngica 25
4.8.6 Envolvimento das Proteinases Cisteínicas na Atividade
Antifúngica
26
4.8.7 Atividade Antifúngica de Proteinases Purificadas 27
4.9 Purificação de Proteinase com Atividade Antifúngica 27
4.9.1 Cromatografia em Coluna de Troca Catiônica “Mono-S
Sepharose” Acoplada ao Sistema FPLC
27
4.9.2 Concentração das Amostras por Ultrafiltração 28
4.9.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) 28
4.9.4 Zimograma
29
xvi
4.9.5 Determinação da Atividade Amidásica 30
4.9.6 Cromatografia em Coluna de Fase Reversa 30
4.9.7 Espectrometria de Massa 31
4.9.8 Efeito de Inibidores Específicos na Atividade Proteolítica da
Cg24-I
31
4.9.9 Avaliação da Atividade proteolítica da Cg24-I em diferentes
valores de pH
32
4.9.10 Avaliação do Efeito da Cg24-I Sobre a Germinação de
Esporos de F. solani
32
4.9.11 Avaliação do Efeito da Cg24-I Sobre a Permeabilidade da
Membrana Plasmática de F. solani.
33
V RESULTADOS 34
VI DISCUSSÃO 59
VII CONCLUSÃO 68
VIII REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 69
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
1
1 - INTRODUÇÃO
1.1 Defesa Vegetal
Como um organismo séssil, uma planta não pode se mover para
escapar de ataques por predadores e invasores. Assim, as plantas
desenvolveram mecanismos complexos de defesa para se protegerem contra
patógenos e insetos, e contra estresses abióticos (DANGL & JONES, 2001;
TIFFIN & MOELLER, 2006). Ao mesmo tempo, alguns destes invasores
desenvolveram meios para superar os mecanismos de defesa de plantas,
como em um jogo de ping-pong de milhões de anos durante a evolução
(FERREIRA, et al, 2007). A cada inovação nos mecanismos de defesas
estabelecidos pelas plantas, novas maneiras para contornar essa defesa
evoluíram no invasores.
Ao longo do tempo, essa luta co-evolucionária entre invasores e plantas
estabeleceu uma das interações mais complexas e interessantes conhecidas
na biologia (TAYLOR, 1998). A interação planta – patógeno pode ser
considerada uma guerra aberta, onde as principais armas são as proteínas
sintetizadas em ambos os organismos (FERREIRA, et al., 2006).
As plantas apresentam estratégias multidimensionais de defesas contra
diversos predadores fitopatogênicos e herbívoros de múltiplas ordens e de
diversos tipos. Esta particularidade leva à classificação dessas defesas de
várias maneiras (UCHÔA, et al, 2002). A defesa física envolve a presença de
espinhos, acúleos, tricomas e tegumentos mais resistentes (LEQUEU, et al.,
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
2
2003; MEDEIROS, et al., 2003). A defesa química é um mecanismo de
proteção da planta que envolve a produção de compostos químicos, como
flavonóides, alcalóides, terpenóides, compostos fenólicos, inibidores de
proteinases, vicilinas, lectinas, proteínas inativadoras de ribossomos,
quitinases, proteases, ureases (GOMES, et al., 2005; BECKER-RITT, et al.,
2007; MCCAFFERTY, et al., 2008; FOLLMER, 2008).
As defesas de plantas ainda podem ser classificadas como induzidas ou
constitutivas. Os mecanismos naturais de proteção contra patógenos e
predadores que fazem parte do programa de desenvolvimento normal da planta
são referidos como resistência constitutiva. Além disso, os vegetais podem
ativar mecanismos protetores em resposta a alguma agressão ou infecção,
esse tipo de defesa é denominada de induzida ou adquirida (UCHÔA et al.,
2002, van Loon et al., 2006). Essa resposta induzida pode resultar em efetivos
mecanismos de resistência a doenças, quando ela é expressa pela planta
sistematicamente (KUC & HAMMERSCHMIDT, 1995). Nesse caso, os agentes
envolvidos induzem uma resposta do hospedeiro, não apenas em torno das
partes atingidas, como também em partes da planta distantes da área onde
ocorreu à injúria, sendo este processo denominado de imunização sistêmica
(DEAN & KUC, 1986; GOTTSTEIN & KUC, 1989).
Proteínas induzidas relacionadas à defesa vegetal foram relatadas pela
primeira vez em plantas de tabaco (van LOON, 1997). Essas proteínas
induzidas relacionadas à defesa são denominadas como proteínas
relacionadas à patogênese (PR-proteínas). O conceito de PR-proteínas foi
introduzido em 1980 para designar qualquer proteína codificada por uma planta
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
3
hospedeira, que foi induzida somente em situação relacionadas a infecções por
vírus, fungos ou bactérias, ataque por nematóides, insetos fitófagos e outras
formas de animais superiores, tais como herbívoros (ANTONIW, et al., 1980,
FERREIRA, et al., 2007). As famílias das PR-proteínas são enumeradas em
ordem de descobrimento e compreendem de proteínas com características
bioquímicas e biológicas similares. Exemplificando, temos as β-1,3-glucanases,
quitinases, inibidores de proteinases, proteinases, peroxidases e defensinas
que pertencem às famílias PR-2, PR-3 e PR-6, PR-7, PR-9 e PR-12,
respectivamente (FERREIRA, et al., 2007)
1.2 Látex
O termo látex é amplamente usado para descrever um líquido de
aspecto leitoso, presente em, aproximadamente, 20.000 espécies de plantas
de 40 famílias (DOMSALLA & MELZIG, 2008). Quando os vegetais sofrem
algum tipo de injúria física, o látex é liberado, e aglutina progressivamente,
impedindo que patôgenos penetrem na área danificada. Devido a essa e outras
observações, o látex tem sido amplamente relacionado com a defesa vegetal
contra a invasão de patógenos e insetos (FARREL, et al., 1991; BERNAYS &
CHAPMAN, 1994, HAGEL, et al., 2008). O látex também pode ter uma ação
colante imobilizando pequenos insetos ou mesmo uma lagarta (DUSSOURD,
1995). Entretanto, além deste efeito mecânico, a composição química do látex
parece ser também objeto de defesa, neste caso agindo quimicamente no
combate a fungos e insetos (GIORDANI, et al., 2002; RAMOS, et al., 2007).
Látex é uma suspensão aquosa ou emulsão de vários tipos de partículas
sintetizadas e armazenadas sob pressão em um sistema de canais formados
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
4
por células denominadas de laticíferos. Neste fluído são encontrados proteínas,
terpenos, alcalóides, vitaminas, lipídios, aminoácidos livres, amido, açúcares,
óleos, taninos, resinas, borracha e típicas estruturas sub-celulares, variando
seu teor de acordo com a espécie (MORCELLE, et al., 2004; DOMSALLA &
MELZIG, 2008). Geralmente, metabólitos específicos presentes no látex são
derivados do metabolismo primário do vegetal, que não são reaproveitados
pelas células (HAGEL et al., 2008). Embora o látex, na maioria das vezes,
apresente aspecto leitoso, este pode apresentar coloração amarelada ou
alaranjada, como em plantas pertencentes à família Papaveraceae, marrom-
amarelado em plantas do gênero Cannabis, ou pode ser límpido como em
Nerium oleander (KEKWICK, 2001).
O látex é secretado por estruturas especializadas, que são compostas
por uma única célula ou um enfileirado de células altamente especializadas,
chamadas de laticíferos. Os laticíferos podem ser divididos, considerando seus
aspectos anatômicos, em dois tipos: os articulados, que são formados por
células seqüenciais interrompidas pela parede celular, mas interconectadas; e
os não articulados, que são formados por uma única célula que cresce nos
espaços intercelulares e eventualmente se ramificam nos tecidos das plantas
de um modo similar às hifas de fungos (KEKWICK, 2001) (FIGURA 1). Em
algumas espécies, os laticíferos consistem de discretas cadeias de células (não
anastomizadas), enquanto outras podem ser conectadas lateralmente para
formar uma estrutura similar a uma rede (anastomizado) (HANGEL, et al.,
2008).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
5
Figura 1: Anatomia dos quatro tipos principais de laticíferos mostradas através
de cortes longitudinais de caule de oito espécies de plantas. O canal laticífero
está indicado pelo asterisco vermelho (HAGEL et al., 2008)
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
6
1.3 Evidências do látex como defesa
Várias funções biológicas têm sido atribuídas aos laticíferos. Tem-se
sugerido há 100 anos, desde que o látex foi encontrado em plantas do semi-
árido, que os laticíferos podem ser uma reserva de água, mas nem todas as
plantas que contêm látex estão restritas a regiões secas. Possivelmente, a
justificativa mais aceita da presença de látex é seu envolvimento na defesa da
planta (KEKWICK, 2001).
A presença de glucanases e quitinases (VAN LOON & VAN STTRIEN,
1999), funcionaria como defesa contra fungos. Outro mecanismo proposto é a
proteção contra herbívoros através da presença de inibidores de proteinases
(SRITANYARAT et al., 2006), os quais podem inibir as enzimas digestivas
destes, causando uma disfunção nutricional (AZARKAN, et al., 2004).
Outro dado importante que corrobora a hipótese da função do látex
atuando como um mecanismo de defesa de planta, é que após injúrias
consecutivas de frutos imaturos de Carica papaya, a composição bioquímica do
látex sofre modificações. A papaína presente no látex passa a ser liberada
tanto com uma maior atividade proteolítica como em maior quantidade,
provavelmente para aumentar a defesa contra larvas de insetos. Em adição,
outras três substâncias têm suas concentrações aumentadas no látex desta
planta: uma proteína inibidora de tripsina, uma quitinase classe II e uma enzima
denominada glutaminil ciclase (AZARKAN, et al., 2004). Esta última, realiza a
ciclização da glutamina presente em cadeias polipeptídicas liberando como
subproduto a amônia, uma substância volátil que possui efeitos inibitórios sobre
alguns microorganismos (BANUELOS, et al., 2000).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
7
Diversos estudos foram realizados adicionando látex em dietas artificiais
para avaliar o papel na resistência. Por exemplo, proteínas do látex de
Calotropis procera adicionada em dietas artificiais provocaram efeitos
inseticidas contra o Callosobruchus maculatus, Anticarsia gemmatalis e
Ceratitis capitata (RAMOS, et al., 2007; RAMOS, et al., 2010).
1.4 Enzimas Proteolíticas
Proteases ou peptidases são enzimas que catalisam a hidrólise da
ligação peptídica. Elas podem ser divididas em exopeptidases e
endopeptidases de acordo com a posição da ligação peptídica na qual elas
agem. Deste modo, as exopeptidases podem agir unicamente sobre ligações
envolvendo aminoácidos carboxi- ou amino-terminais da cadeia peptídica,
sendo denominadas carboxi-peptidases ou amino-peptidases, respectivamente.
As endopeptidases ou proteinases (EC 3.4) têm a capacidade de agir sobre
todas as ligações peptídicas envolvendo outros aminoácidos que não os
terminais (BARRETT, 1986).
As proteinases são divididas segundo o resíduo de aminoácidos
presentes no sítio catalítico e ou seu mecanismo de catálise em: proteinases
serínicas (EC 3.4.21), que possuem um resíduo de serina no sítio ativo;
proteinases cisteínicas (EC. 3.4.22), que possuem um resíduo de cisteína que
participa da catálise enzimática; proteinases aspárticas (EC 3.4.23)
dependentes de um resíduo de aspartato que participa da catálise enzimática;
metaloproteinases (EC 3.4.24) que usam um metal (normalmente Zn2+) na sua
catálise (BARRETT, 1994). As proteases glutâmicas são encontradas em
fungos e possuem um resíduo de acido glutâmico no sítio catalítico
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
8
(FUJINAGA, et al., 2004). Proteases treoninas requerem um resíduo de
treonina para sua atividade catalítica. Por fim, existem aquelas que não têm o
mecanismo de catálise decifrado, essas pertencem ao clã das proteinases
desconhecidas (LÖWE, et al.; 1995; RAWLINGS, et al., 2010). O grupo
hidroxila das proteinases serínicas e treoninas e o grupo sulfidrila das
proteinases cisteínicas agem como nucleófilos durante a catálise, enquanto a
água atua com nucleófilo nas proteinases aspárticas, glutâmicas e
metaloproteinases (SALAS, et al., 2008).
1.5 Proteases em Plantas Laticíferas
Enzimas proteolíticas em plantas estão envolvidas em todos os aspectos
do crescimento e desenvolvimento, incluindo a germinação, senescência e
morte celular programada, e o látex é uma importante fonte dessas enzimas
(DOMSALLA & MELZIG, 2008). A utilização do látex na medicina tradicional e
na indústria é bem conhecida. Atualmente, pesquisas de proteases presentes
em látices são direcionadas, principalmente, para aplicações comerciais
(GOLOVKIN, 2006) ou em relação a problemas alergênicos (RADAUER, 2007).
A presença de enzimas proteolíticas em látex de plantas de diversas
famílias é bastante conhecida. A função dessas proteases ainda não é bem
elucidada. Uma possibilidade é a degradação de proteínas durante o
desenvolvimento do laticífero ou o favorecimento da coagulação (DUBEY &
JAGANADHAM, 2002). Algumas plantas secretam imediatamente o látex
quando as folhas, caules ou frutos são injuriados (AGRAWAL, 2009). O látex
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
9
escorre por alguns minutos até formar um coágulo em volta da área danificada.
A coagulação é um processo vital para a defesa das plantas contra possíveis
ataques de patógeno. O látex pode agir para proteger o meristema cambial e
os conteúdos dos tubos crivados de predadores, parasitas ou agentes
patogênicos. Assim, enzimas proteolíticas presentes no látex podem está
envolvidas nesse processo de coagulação (LIGGIERI, et al., 2004).
As proteases de látices são relacionadas à proteção de frutos em
processo de amadurecimento contra patôgenos. A presença de atividade
bactericida em látex de frutos de Carica papaya, Ficus glabrata, Ervatamia
coronaria e Tabernaemontana divaricata sugerem que as proteases agem na
proteção (PATEL & JAGANNADHAM, 2003). As enzimas proteolíticas têm
também um papel importante na fisiologia da planta. Eles não somente mantém
o “pool” de proteínas na célula, mas também estão envolvidas em vários
processos intra e extracelulares, como a senescência da folha, quebra de
proteínas de armazenamento, na germinação da semente, desenvolvimento e
amadurecimento dos frutos, mecanismos regulatórios, e outros. Tecidos que
são metabolicamente muito ativos tem abundância de atividade proteolítica
(PANDE, et al., 2006).
A maioria das proteases encontradas em látices pertence à família das
proteinases cisteínicas e serínicas. Somente alguns membros da família das
proteinases aspárticas são conhecidos e nenhuma metaloprotease foi descrita
em látex até agora (DOMSALLA & MELZIG, 2008).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
10
1.6 Proteinases Cisteínicas (EC 3.4.22) em Látices
No banco de dados MEROPS (http://merops.sanger.ac.uk/index.htm),
todas as proteases são anotadas de acordo com a classificação de RAWLINGS
e colaboradores (2010). Até janeiro de 2010, o MEROPS listava 155.000
sequências de proteases distribuídas em 205 famílias e 52 clãs. As proteinases
cisteínicas representam aproximadamente 17 % das sequências depositadas
no MEROPS, representadas em 72 famílias, pertencentes a 12 clãs.
A maioria das proteinases cisteínicas oriundas de látex pertencem à
família da Papaína (C1). Proteinases cisteínicas de plantas desempenham
importantes papéis nos processos intra e extracelulares, tais como
desenvolvimento e amadurecimento de frutos (BRADY, 1985); degradação de
proteínas de reserva durante a germinação de sementes (KEMBHAVI, et al.,
1993); ativação de zimogênios (TAYLOR & CUMING, 1993). Estão envolvidas
na maturação protéica, degradação e renovação de proteínas em resposta a
vários estímulos externos e também atuam na remoção de proteínas com
conformação anormal (WISNIEWSKI & ZAGDANSKA, 2001). Elas também
participam nos estágios do desenvolvimento vegetal, tais como morfogênese,
biogênese celular e senescência, bem como no processo de morte celular
programada (SOLOMON, et al., 1990; PALMA, et al., 2002). Além disso, elas
estão envolvidas na percepção, sinalização e resposta a estresses bióticos e
abióticos. (GRUDKOWSKA & ZAGDANSKA, 2004; KONNO, et al., 2004; van
der HOORN & JONES, 2004; GAVIRA, et al., 2007).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
11
Além da sua importância nos processos fisiológicos, proteinases
cisteínicas de plantas também recebem atenção especial da indústria
alimentícia e biotecnológica devido a propriedade de serem ativas em amplas
faixas de pHs e temperaturas. Elas também têm aplicações na indústria
farmacêutica para produção de drogas. Por exemplo, para cicatrização de
feridas e prevenção de infecção em queimaduras (STARLEY, et al., 1999;
SALAS et al., 2008).
1.7 Fungos e Proteínas Antifúngicas
Fungos são organismos surpreendentes, podendo usar praticamente
qualquer superfície (por exemplo, azulejo de banheiro, peles, folhas, matéria
em decomposição) para se desenvolverem. Infelizmente, eles são muito
eficientes em colonizar e utilizar plantas, seres humanos e animais como
substrato (COX & PERFECT, 1993). A classificação desses organismos
demonstra que cerca de 250.000 espécies de fungos habitam a superfície
terrestre, distribuídos essencialmente em todos os ecossistemas
(SELITRENNIKOFF, 2001). As plantas estão expostas a uma grande
quantidade de fungos patogênicos, embora não tenham sistema imune, elas
evoluíram uma grande variedade de potentes mecanismos de defesa, incluindo
a síntese de compostos de baixo peso molecular, proteínas e peptídeos com
atividade antifúngica (SELITRENNIKOFF, 2001). A tabela 1 mostra exemplos
de fungos fitopatogênicos usados nesse estudo.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Tabela 1: Alguns hospedeiros e as doenças causadas por fungos utilizados
neste estudo.
Fungos Principais hospedeiros
Doenças causadas
Tecido/órgão injuriado
Referências
Hemibiotrófico
Colletotrichum gloeosporioides
Carica papaya Antracnose de mamão
Frutas Cia et al., 2007
Fusarium oxysporum
Mais de 100 espécies de plantas
Murcha vascular e podridão radicular
Raízes Agrios, 2005
F. solani Glycine max, Phaseolus vulgaris
Deterioração, murcha e podidão de raízes
Raízes Fu & Chang, 1999; Iqbal, et al., 2005;
Necrotrófico
Rhizoctonia solani Oryza sativa, Phaseolus vulgaris
Queima da bainha
Hipocótilos e raízes
Datta, et al., 1999;
Abeysinghe, 2007.
Aspergillus niger
Neurospora sp.
Uva, cebola e amendoim
Mofo negro Frutas Samson, et al., 2001
As proteínas antifúngicas são produzidas por muitos organismos
incluindo plantas superiores, gimnospermas, fungos, bactérias, insetos,
molusco e mamíferos (WANG & NG, 2001; SELITRENNIKOFF, 2001). Nas
plantas, elas estão envolvidas na defesa constitutiva e induzida do vegetal.
Sementes de plantas são especialmente ricas em proteínas antifúngicas, com
quantidades diversas vezes mais altas do que aquelas presentes em folhas e
flores (WANG & NG, 2001).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Uma grande variedade de sequências de aminoácidos de proteínas
antifúngicas é descrita (NG, 2004). Selitrennikoff (2001) descreveu 13 classes
de proteínas antifúngica (Tabela 2), classificando principalmente em relação ao
seu mecanismo de ação (por exemplo, quitinases, β- glucanases), a sua
estrutura (rica em glicina) ou na sua similaridade com proteínas conhecidas
(proteínas do tipo taumatina) (WANG, et al., 2005).
Os alvos estruturais das proteínas antifúngicas vão desde a parte mais
exterior da célula fúngica, como a parece celular, membrana plasmática e,
finalmente a diversos alvos intracelulares (THEIS & STAHL, 2004). Assim,
essas proteínas exibem uma ampla variedade de mecanismos de ação,
incluindo, por exemplo, inibição da síntese da parede celular ou alteração da
estrutura, formação de poros e canais na membrana, danos nos ribossomos,
inibição da síntese de DNA e inibição do ciclo celular. Contudo, o modo de
ação da maioria dessas proteínas ainda não foi elucidado (SELITRENNIKOFF,
2001; NG, 2004).
Quitinases (EC 3.2.1.14) já foram isoladas de látex de Hevea
brasiliensis, Carica papaya e na maioria das vezes estão associados a
processos de defesa (AZARKAN, et al., 2004). Elas são o segundo principal
grupo de proteínas antifúngicas. Elas catalisam a clivagem das ligações β-1,4-
glicosídica que unem as unidades de N-acetil-D-glicosamina presentes na
quitina, principal componente do exoesqueleto dos insetos bem como da
parede celular da maioria dos fungos (GOORMACHTIG, et al., 1998).
Proteínas do tipo taumatina são proteínas antifúngica que também já
foram purificada de látex, como por exemplo, uma proteína de 22,1 kDa isolada
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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látex de Carica papaya (LOOZE, et al., 2009). Osmotina e proteínas do tipo
taumatina (TL), agem através de interação especifica com a membrana
plasmática que resulta na formação de poros. Essas proteínas também
apresentam atividade β-1,3-glucanase (KITAJIMA & SATO, 1999).
Uma das principais classes de proteínas presente em tecidos de plantas,
incluem os inibidores de proteases serínicas, cisteínicas, aspárticas e
metaloproteases. Inibidores de proteases serínicas são considerados
bifuncionais, pois também inibem outras enzimas com a α-amilase
(SELITRENNIKOFF, 2001). Um inibidor de proteinase do tipo Kunitz foi isolado
de látex de Carica papaya (AZARKAN, et al., 2006a).
Como novas proteínas com grande potencial antifúngicas estão
constantemente sendo descobertas, o número de proteínas que não se
enquadram em nenhuma das 12 classes é crescente. Entre elas, proteínas
bem conhecidas tais como lectinas, ribonucleases, desoxoribonucleases,
peroxidases e proteases (AZARKAN, et al., 2006b).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Tabela 2: Classes de proteínas antifúngicas
Fonte: FERREIRA, et al., 2007
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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2 – OBJETIVOS GERAIS
Avaliar o papel de proteínas laticíferas, especialmente de proteinases
cisteínicas, na defesa da planta contra fungos fitopatogênicos.
2.1 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a ação do látex de Calotropis procera, Cryptostegia grandiflora,
Carica candamarcensis, Plumeria rubra e Euphorbia tirucalli sobre os
fungos Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium
solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger.
Examinar o envolvimento de proteases cisteínicas na atividade antifúngica
de fluidos laticíferos.
Purificar e caracterizar uma protease de látex com atividade antifúngica.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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3 – JUSTIFICATIVA
O ataque de patôgenos é um dos principais fatores de perda na
produção na agricultura. O uso de agrotóxicos químicos tem várias
características negativas que vão desde problemas de contaminação
ambiental, mortalidade de espécies não-alvo, resistência e surgimento de
novas pragas, até o alto custo econômico para sua aquisição e aplicação.
Muitas alternativas ao uso de agrotóxicos químicos têm sido propostas.
Dentre elas, a utilização de produtos naturais tem sido promissora. Dentro
desse contexto, é crescente a pesquisa por proteínas vegetais que poderiam
ser utilizadas como ferramentas biotecnológicas para tal fim.
Nesse contexto, as plantas laticíferas têm um grande potencial, pois são
reconhecidamente fontes de proteínas relacionadas à defesa vegetal.
Com base no problema exposto, o efeito tóxico de proteínas dos látices
de Calotropis procera, Cryptostegia grandiflora, Carica candamarcensis,
Plumeria rubra e Euphorbia tirucalli foi avaliado sobre seis fungos fitopatôgenos
causadores de grandes perdas em importantes culturas brasileira.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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4 - MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL
4.1 Reagentes
Os meios de cultura Sabouraud Dextrose Agar (SDA) e Yeast Peptone
Dextrose (YPD) foram obtidos da DIFCO e Himedia, respectivamente.
Azocaseína, N-Benzoil-arginina-naftilamida (BANA), Benzoil-arginina-
nitroanilida (BApNA), Trans-Epoxisuccinil-Leucilamido-3-Metil-Butano (E-64),
Tripsina (E.C. 3.4.21.4), Quimotripsina (E.C. 3.4.21.1) e Papaína 2x
cristalisada (E.C. 3.4.22.2), Caseína, Cisteína, Marcadores de Massa
Molecular, Pronase de Streptomyces griseus , Persulfato de Amônio,
Membrana de diálise com poro de exclusão de 8.000 Da foram obtidos de
Sigma ou Sigma-Aldrich Co. USA.
Ditiotreitol (DTT), Dodecil sulfato de sódio (SDS),
etilenodiaminotetraacetico (EDTA), foram obtidos da Amersham Bioscience,
USA. Azul de bromofenol foi obtido da Acros Organics, USA. Albumina Sérica
Bovina Fração V foi obtida de INLAB, Brasil. Triton X-100 foi obtido da USB
Corporation, Cleveland, OH USA. Os demais reagentes foram de grau
analítico.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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4.2 Material Vegetal
Plantas saudáveis e não cultivadas de Calotropis procera (Ait.) R.Br.,
Cryptostegia grandiflora R. Br., Plumeria rubra L. (todas Apocynaceae) e
Euphorbia tirucalli L. (Euphobiaceae) existentes nas proximidades de
Fortaleza–Brasil, foram utilizadas como fontes de látex fresco. Todas as
plantas foram identificadas pelo botânico Prof. Edson de Paula Nunes. Uma
exsicata de C. procera (N. 32663), Cr. grandiflora (N. 040409), P.rubra (N.
15018) e E. tirucalli (N. 38702) foi depositada no Herbário Prisco Berreza da
Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-Ceará.
Látex de fruto de Carica candamarcensis foi utilizado para obtenção da
fração P1G10. A fração P1G10 foi gentilmente cedida pelo Dr. Prof. Carlos
Edmundo Salas Bravo do Departamento de Bioquímica e Imunologia, Instituto
de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
4.3 Fungos
Os fungos fitopatogênicos, Fusarium solani, Fusarium oxysporum,
Neurospora sp., Rhizoctonia solani, Aspergillus niger e Colletotrichum
gloeosporioides, foram obtidos da micoteca mantida pelos Laboratórios de
Proteínas Vegetais de Defesa e de Toxinas Vegetais, ambos do Departamento
de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, Brasil.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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MÉTODOS
4.4 Coleta e Fracionamento do Látex
O látex de C. procera foi coletado de plantas saudáveis através de
incisões nos ápices caulinares em tubo do tipo Falcon contendo água destilada
para produzir uma mistura de 1:1 (v/v). Os látices de Cr. Grandiflora, P. rubra e
E. tirucalli foram coletados de ramos finais em água como descrito acima. A
mistura (látex e água) foi cuidadosamente agitada durante a coleta para
minimizar os efeitos a coagulação. As amostras foram centrifugadas a 5000 g
por 10 minutos a 4 ºC. O precipitado contendo grande parte de borracha foi
descartado e o sobrenadante foi extensivamente dialisado contra água
destilada utilizando membranas com poros de 8000 Da. O material retido nas
membranas foi novamente centrifugado nas mesmas condições descritas
acima. Os sobrenadantes límpidos e livres de borracha foram liofilizados,
chamados de proteínas do látex de Calotropis procera (PLCp), de Cryptostegia
grandiflora (PLCg), de Plumeria rubra (PLPr) e de Euphorbia tirucalli L. (PLEt),
e usados nos ensaios subseqüentes. Esse procedimento elimina compostos
insolúveis em água e de baixa massa molecular.
A fração P1G10 cedida pelo Dr. Carlos Edmundo Salas Bravo (UFMG)
foi obtida da seguinte maneira: o látex foi coletado através de diversas incisões
no fruto imaturo, armazenado e estocado a – 20ºC. Em seguida, o látex foi
liofilizado e armazenado. A fração P1G10 foi obtida a partir de látex liofilizado
usando cromatografia de filtração em gel em coluna Sephadex G-10
(TEIXEIRA, et al.,2008)
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
21
4.5 Dosagem de Proteínas
O teor de proteínas solúveis das amostras estudadas foi determinado
pelo método colorimétrico descrito por BRADFORD (1976). A partir de 100 μl,
da amostra em diferentes concentrações, foram adicionados 2,5 ml do
reagente de Bradford. As misturas foram levemente agitadas e após 10
minutos foram feitas as leituras das absorbâncias a 595 nm. A concentração de
proteínas foi estimada em relação a uma curva padrão obtida com albumina
sérica bovina (BSA).
4.6 Atividade Proteolítica Total
A atividade proteolítica das proteínas laticíferas de C. procera, Cr.
grandiflora, P. rubra, E. tirucalli e Ca. Candamarcensis já foi determinada
previamente (TEIXEIRA, et al., 2008; RAMOS, et al., 2009). Nesse estudo a
atividade proteolítica das frações foram quantificadas na tentativa de
correlacionar atividade proteolítica endógena com a inibição do crescimento
fúngico. Para isso, foi utilizada a metodologia descrita por Xavier-Filho (1989).
Azocaseína foi utilizada como substrato não específico para avaliação da
atividade proteolítica total. Essa proteína, ao sofrer degradação por proteases,
libera um composto denominado de “azo” que funciona como cromóforo, sendo
detectado por espectrofotômetro em comprimento de onda 420 - 440 nm. A
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
22
reação consistiu de 50 µl (1 mg/ml em acetato de sódio 50 mM pH 5,0) das
proteínas do látex C. procera, Cr. grandiflora, Ca. candamarcensis, P.rubra e E.
tirucalli (pré-incubadas com 40 µl de DTT 3 mM por 10 min a 37 °C), 200 µl de
azocaseina 1 % e o volume ajustado para 500 µl com tampão acetato de sódio
50 mM pH 5,0. Após 60 min a 37 ºC, a reação foi parada com adição de 300 µl
de ácido tricloroacético (TCA) 10 %. Os tubos foram centrifugados (5.000 x g
por 10 min a 25 °C) e 400 µl do sobrenadante foram alcalinizados com 400 µl
de uma solução de hidróxido de sódio 2 N e a absorbância medida por
espectofotômetro (Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia) a 420 nm. Uma
unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de
aumentar a absorbância em 0,01.
4.7 Ensaio para Detecção de Proteinases Cisteínicas
Ensaio para detecção de proteinases cisteínica foi realizado com
azocaseina como descrito acima, porém as amostras foram pré-incubadas com
iodoacetoamida (IAA) 20 mM por 30 minutos.
4.8 Ensaios Biológicos
4.8.1 Cultivo dos Fungos
O cultivo dos fungos foi realizado em 25 mL de Sabouraud Dextrose
Agar (SDA) estéril, distribuídos em placas de Petri (100 x 15 mm), mantidos em
câmara de germinação do tipo B.O.D., a 27 ± 2 ºC, umidade de 70% e
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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fotoperíodo de 12 horas. O meio de cultura era constituído de 65 g de SDA
dissolvido em 1 litro de água destilada e autoclavado por 20 minutos, a 120 ºC,
1,5 kgf. Os fungos eram renovados mensalmente através da transferência de
pellets de uma placa contendo os fungos para outra placa contendo apenas
meio de cultura SDA. Todos os procedimentos foram realizados em câmara de
fluxo laminar contendo chama de fogo.
4.8.2 Obtenção da Suspensão de Esporos
A obtenção das suspensões de esporos foi realizada segundo Melo e
colaboradores (2005), com algumas modificações. Após os fungos terem
tomado todo diâmetro da placa de Petri, cerca de 15 dias após o repique
(cultura fresca), essas foram abertas em capela de fluxo laminar e 10 ml de
água destilada foram adicionados aos meios de culturas contendo os
respectivos fungos. Com auxilio de uma alça de Drigalski (previamente
flambada), movimentos suaves na superfície do micélio foram realizados para a
liberação dos esporos. As suspensões obtidas foram filtradas em malhas finas
de nylon estéreis para a retirada das hifas remanescentes. O filtrado resultante
foi denominado de suspensão padrão de esporos. Para a realização dos
ensaios de inibição de crescimento e da germinação de esporos, as
suspensões contendo os esporos foram ajustadas para uma concentração de 2
x 105 esporos/ml. Os esporos foram contados com o auxílio de uma câmara de
Neubauer em microscópio óptico (Olimpus System Microscope BX 60).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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4.8.3 Ensaio de Inibição do Crescimento Fúngico em Meio Líquido e
Determinação da IC50
Os ensaios de inibição do crescimento foram realizados conforme a
metodologia descrita por Broekaert e colaboradores (1990), com algumas
adaptações. Os ensaios foram desenvolvidos em placas de microtitulação de
poliestireno de fundo chato (estéreis) de 96 poços. Cada poço continha 10 μl
de uma suspensão de esporos (2x105 esporos/ml) e 90 μl de meio YPD (“Yeast
Peptone Dextrose”). Após 16 h na ausência de luz, a 27 ºC, 100 μl das
amostras foram adicionados. Os controles negativos e positivos para inibição
do crescimento foram o tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,0, e o peróxido
de hidrogênio 200 mM, respectivamente. Todas as amostras foram filtradas em
membranas de 0,22 μm. O crescimento fúngico foi monitorado através de
leituras de absorbância a 620 nm, em intervalos de 12 ou 24 horas, até um total
de 48 ou 72 horas, em leitor de ELISA (Biotrak II Plate Reader, Amersham
Biosciences).
As concentrações protéicas capazes de reduzir em 50 % o crescimento
fúngico do controle (acetato de sódio 50 mM, pH 5,0), após 48 h de ensaio,
foram representadas como IC50. Os valores foram representados em
micrograma de proteína por mililitro, a partir de três ensaios realizados
independentemente.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
25
4.8.4 Ensaio de Inibição da Germinação de Esporos
O efeito das frações sobre a germinação dos esporos foi avaliado de
acordo com o método descrito por Ji e Kúc (1996), adaptado para uso de
placas de polietileno reticuladas. Uma alíquota de 10 µl da suspensão de
esporos (2,0 x 105 esporos/mL) foi incubada com 10 µl das amostras (pré-
incubadas ou não com DTT ou IAA). Como controles foram utilizados tampão
acetato de sódio 50m M, pH 5,0 estéril, BSA 5 mg/ml, peróxido de hidrogênio
200 mM e DTT 3mM. As placas de germinação foram mantidas a 27 ºC, por 24
horas, na ausência de luz, conservando a umidade do local por meio de um
papel de filtro embebido de água. Decorrido o tempo de germinação, o material
foi visualizado em microscópio óptico (“Olimpus System Microscope BX 60”).
Foram considerados germinados os esporos que apresentaram tubo
germinativo de, ao menos, duas vezes o seu comprimento.
4.8.5 Envolvimento de Proteínas na Atividade Antifúngica
Para avaliar o envolvimento de proteínas na atividade antifúngica
encontrada, as frações foram fervidas durante 30 min ou digerida com enzimas
proteolíticas.
As proteínas do látex (150 mg dissolvidos em 50 ml de água destilada)
foram incubadas em banho-maria por 30 min a 98 °C. Após o resfriamento, a
mistura foi centrifugada a 5.000 x g por 10 min a 25 °C e o sobrenadante
resultante foi liofilizado.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
26
A outra forma utilizada para avaliar o envolvimento de proteínas na
atividade encontrada foi promover a digestão destas com uma mistura de
proteases de Streptomyces griseus (Pronase), que clivam inespecificamente as
ligações peptídicas. Para tanto, as proteínas do látex (200 mg) foram
dissolvidas em 20 ml de tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e incubadas com 2 mg
da pronase dissolvida em 1 ml do mesmo tampão. Após 24 h de incubação a
37 °C em banho-maria. As amostras foram dialisadas, liofilizadas.
4.8.6 Envolvimento das Proteinases Cisteínicas na Atividade Antifúngica
Para avaliar o efeito das proteinases cisteínicas dos fluidos laticíferos
nas atividades antifúngicas, o látex de C. procera e Cr. grandiflora foram
coletado em água contendo IAA 20 mM. Após coleta do látex, a
suspensão foi centrifugada por 10 min a 4 ºC a 5.000 x g. O sobrenadante foi
exaustivamente dialisado contra água destilada durante três dias a 4 ºC e
novamente centrifugado, nas mesmas condições descritas acima. A fração
P1G10 de Ca. candamarcensis dissolvida em água destilada contendo IAA e
deixada por 30 minutos.
Azocaseína foi utilizada como substrato não específico para investigar a
atividade proteolítica total presente nas frações inibidas com IAA. A reação foi
realizada como descrito no item 4.6.
Em seguida, ensaio de inibição do crescimento fúngico com as frações
desprovidas de atividade proteolítica do tipo cisteínica foi realizado como
descrito anteriormente.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
27
4.8.7 Atividade Antifúngica de Proteinases Purificadas
Papaína, tripsina e quimotripsina foram utilizadas para evidenciar o
papel de proteinases na ação antifúngica encontrada nas proteínas dos látices.
As enzimas foram dissolvidas em tampão fosfato de sódio 50 mM pH 6,0
(papaína) ou em tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 (tripsina e quimotripsina) e
utilizadas nas concentrações de 1 mg/ml. Ensaios de inibição da germinação e
inibição do crescimento foram realizados como descrito anteriormente.
4.9 Purificação de uma Proteinase com Atividade Antifúngica
4.9.1 Cromatografia em Coluna de Troca Catiônica “Mono-S Sepharose”
Acoplada ao Sistema FPLC:
A fração Proteínas do Látex de Cryptostegia grandiflora (PLCg) foi
submetida à cromatografia de troca catiônica, usando uma coluna “Mono-S
Sepharose” acoplada ao sistema FPLC. A coluna foi previamente equilibrada
com o tampão tetraborato do sódio 25 mM e EDTA 5 mM (pH 9,2). As
proteínas foram eluídas com um gradiente não linear de cloreto de sódio (0,1
mM a 400 mM) em tampão de equilíbrio. O fluxo foi de 1 ml/min e as frações
foram coletadas de acordo com os picos de densidade ótica em 280 nm. Os
picos semelhantes das cromatografias foram reunidos e concentrados no
sistema de ultrafiltração a 4 °C.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
28
4.9.2 Concentração das Amostras por Ultrafiltração
Os picos obtidos da cromatografia de troca catiônica em “Mono-S
Sepharose” foram coletados e concentrados em sistema de ultrafiltração. Os
picos foram submetidos a uma pressão contra uma membrana com poro de
exclusão de 10 kDa. Após a redução do volume para aproximadamente 3 mL, a
amostra era suspendida com 100 ml de água milli-Q para livrar as frações do
excesso de sal, esse procedimento foi repetido 3 vezes. No final, cerca de 2 ml
das frações eram recuperadas e estocadas a -20°C.
4.9.3 Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)
SDS-PAGE foi conduzida de acordo com Laemmli (1970). As amostras
foram preparadas com tampão de amostra Tris-HCl 0,0625 M, pH 6,8 contendo
SDS 2% e 2-mecaptoetanol 5% para uma concentração final de 2 mg/mL,
aquecidas a 100ºC por 5 minutos em banho maria e centrifugadas a 5000 g por
5 minutos. Após resfriadas, foram adicionados cristais da sacarose e 3µl de
azul de bromofenol 0,1% (m/v) às amostras, logo em seguida foram aplicadas
em gel poliacrilamida (gel de concentração 5 % e de separação 12,5 %) na
presença de SDS (PAGE-SDS). As corridas eletroforéticas foram realizadas à
temperatura ambiente a 25 mA por um período entre 90 e 120 minutos. As
bandas protéicas foram coradas com Coomassie Brillint Blue (R-250) 0,1% em
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29
solução aquosa com ácido acético e metanol (6:1:3 v/v/v). O gel foi descorado
com a mesma solução na ausência do corante.
4.9.4 Zimograma
Para detectar a atividade proteolítica em gel, a amostra foi submetida a
eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5 %). Logo após a migração, a
proteína foi eletrotransferida para um gel de poliacrilamida (10 %) contendo
gelatina 0,1 %, usando Bio-Rad Mini-TransferTM. A eletrotransferência foi
realizada a 24 V durante 25 minutos. Depois da transferência, o gel foi
incubado em uma solução de Triton X-100 2,5 % em água a 25 ºC sob agitação
por 40 min. Em seguida, o gel foi incubado em tampão de ativação (tampão
acetato de sódio pH 5.0 contendo DTT 3 mM). A atividade proteolítica ocorreu
durante 30 minutos a 37 ºC e o gel foi corado em uma solução de Coomassie
Brilliant Blue R-250 0,2 %. A atividade enzimática foi detectada como bandas
transparentes nos géis.
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4.9.5 Determinação da Atividade Amidásica
A atividade amidásica específica dos picos obtidos da coluna “Mono-S
Sepharose” foi determinada utilizando o substrato sintético BAPNA. 10 µg das
frações eram incubados a 37°C com 1 mL de tampão de ativação (tampão
fosfato de sódio 25 mM, pH 8,0; cisteína 5 mM e EDTA 2 mM) juntamente com
3 µL da solução de BAPNA 100 mM. Após surgimento de uma cor amarela, a
reação era paralisada com 60 µL de solução de ácido acético 60% (v/v). A
determinação da concentração molar de para-nitro-anilida liberada (quantidade
de produto formado) era feita através da densidade ótica em 405 nm e sua
relação com o coeficiente de extinção molar desta substância, que é 8800 M-
1.cm-1 (BAEZA, et al., 1990). A atividade amidásica específica foi expressa em
concentração molar de produto formado por unidade de massa da enzima em
um determinado tempo, mais especificamente, nM produto x min-1 x µg-1
enzima.
4.9.6 Cromatografia em Coluna de Fase Reversa
Para avaliara pureza das amostras purificadas e dessalinização das
mesmas, foi utilizada uma coluna de fase reversa (C4-Vydac) acoplada ao
sistema HPLC. Foram aplicadas de 100 µg a 125 µg das frações por
cromatografia. As cromatografias foram feitas em TFA 0,1% (v/v) e a eluição
das amostras foi realizada em gradiente não linear de acetonitrila. Foi usado o
mesmo programa para o aumento do gradiente em todas as cromatografias. A
concentração de acetonitrila variava de 0% a 54% nos 20 minutos iniciais.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
31
Posteriormente, era aumentada gradativamente até 81% em 30 minutos,
permanecendo nesta concentração até o final da cromatografia. O fluxo era de
1 ml/min e as frações foram coletadas de acordo com os picos de densidade
ótica em 280 nm.
4.9.7 Espectrometria de Massas
Foi utilizado um espectrômetro de massas do tipo MALDI/TOF (Autoflex
III Smartbeam, Bruker Daltonics, Brender, Germany) para as análises da
massa molecular e o grau de pureza da amostra. A análise foi realizada com
0,5 µL da amostra e 0,5 µL da matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico em
acetonitrila 50% e ácido trifluoroacético 0,3%, utilizando uma placa MTP
Anchorchip 600/384 (Bruker Daltonics). A mistura foi deixada a 25 °C por 1 h
para completa cristalização da matriz, antes da análise no espectrômetro de
massas. O aparelho foi calibrado com padrões externos (Protein Calibration
Standard - Bruker Daltonics).
4.9.8 Efeito de Inibidores Específicos na Atividade Proteolítica da Cg24-I
A natureza da atividade proteolítica da enzima purificada Cg24-I foi
identificada usando diferentes inibidores para tipos específicos de proteases.
10 µg da enzima foi pré incubadas separadamente por 30 min a 25 ºC na
presença de 20 µL dos seguintes inibidores: iodoacetamida 20 mM, E-64 0,18
mM, PMSF 5 mM, pepstatina 10 µM e EDTA 10 mM. Os ensaios foram
realizados como descrito no item 4.6, porém substituindo azocaseína por
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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caseína. A atividade remanescente foi medida por absorbância a 280 nm
(Ultrospec 1000 Amersham Pharmacia).
4.9.9 Avaliação da Atividade proteolítica da Cg24-I em diferentes valores
de pH
A atividade proteolítica da enzima foi monitorada em diferentes valores
de pH, usando tampões específicos na concentrações de 50 mM: glicina (pH
3), acetato de sódio (pH 4,0 e 5,0), fosfato de sódio (pH 6,0 e 7,0) e Tris-HCl
(pH 8,0, 9,0 e 10,0). As atividades proteolíticas foram determinadas a 37 ºC
utilizando caseína 1 % como substrato.
4.9.10 Avaliação do Efeito da Cg24-I Sobre a Germinação de Esporos de F.
solani
O ensaio de inibição de germinação de esporo de F. solani foi realizado
como descrito no item 4.8.4. Alíquotas de 10 µl das suspensões de esporos (2
x 105 esporos/ml) foram incubadas com 10 µl da Cg24-I em diferentes
concentrações.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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4.9.11 Avaliação do Efeito da Cg24-I Sobre a Permeabilidade da Membrana
Plasmática de F. solani.
O corante iodeto de propídio foi usado para avaliar a integridade das
membranas do fungo F. solani na presença de Cg24-I. O ensaio foi realizado
como descrito na sessão 4.8.4, com algumas modificações. Uma solução de
iodeto de propídio 1 mM foi adicionada à suspensão de esporos (pré-incubada
com Cg24-I por 30 minutos) por 30 minutos a 37 ºC. As suspensões foram
transferidas para lâminas e visualizadas em microscópio óptico (“Olimpus
System Microscope BX 60”). Foram considerados esporos permeabilizados
aqueles em que os núcleos se apresentaram fluorescentes (vermelhos).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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5- RESULTADOS
O potencial antifúngico das proteínas do látex de Calotropis procera
(PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg), Carica candamarcensis (P1G10),
Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) foi testado sobre os fungos
Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani,
Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger. As concentrações
protéicas que reduziram o crescimento dos fungos em 50% do valor do controle
(tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0), após 48 horas de ensaio, foram
representadas como IC50. Considerou-se que se o valor de IC50 fosse menor
que 100 µg/ml, atividade antifúngica era tida como muito forte; de 100 a 500
µg/ml, atividade antifúngica forte; de 500 a 1000 µg/ml, atividade antifúngica
moderada; de 1000 a 1500 µg/ml, atividade antifúngica fraca; acima de 1500
µg/ml, foi considerada inativa (MINCOFF, et al., 2006).
C. procera (PLCp), Cr. grandiflora (PLCg) e Ca. candamarcensis
(P1G10) exibiram atividade antifúngica de forte a muito forte contra os fungos
Rhizoctonia solani, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium solani (Tabela 3).
Contra o fungo Fusarium oxysporum as proteínas de Cr. grandiflora (PLCg) e
C. procera (PLCp), exibiram atividade antifúngica muito forte com IC50 de 29,4
± 2,1 e 21,5 ± 1,5 µgProteína/ml, respectivamente.
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Tabela 3: Atividade antifúngica (IC50) de proteínas laticíferas de C. procera, Cr. grandiflora, Ca. candamarcensis, P. rubra e E.
tirucalli.
Atividade antifúngicaa (IC50 µgProteína/ml)
Fungos
C. procera Cr. grandiflora Ca. candamarcensis P. rubra E. tirucalli
Colletotrichum gloeosporioides 455,0 ± 9,3 447,5 ± 8,1 137 ± 4,3 Ib I
Fusarium oxysporum 29,4 ± 2,1 21,5 ± 1,5 NDc I I
Fusarium solani 134,5 ± 8,1 35,0 ± 2,9 56,1 ± 6,5 I I
Rhizoctonia solani 20,7 ± 1,6 9,8 ± 1,2 25,3 ± 2,4 I I
Neurospora sp. 549,9 ± 14,3 119,4 ± 15,9 40,2 ± 3,2 I I
Aspergillus Níger 1368,0 ± 11,2 282,8 ± 6,4 104 ± 3,4 I I
aCrescimento fúngico foi medido turbidimetricamente (como descrito em métodos) na presença de tampão acetato de sódio 50 mM
pH 5,0 (100 % de crescimento) ou diferentes concentrações de proteínas laticíferas. As concentrações protéicas que reduziram o
crescimento para 50 % do valor do controle depois de 48 horas foram representadas como IC50. Os valores são médias ± DP de
pontos em triplicatas.
bI: Inativa na dose máxima testada (5 mg/ml).
cND: Não determinado
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A atividade antifúngica de PLCg e P1G10 foi forte contra o fungo
Aspergillus niger, enquanto PLCp exibiu atividade fraca. As proteínas laticíferas
de P. rubra (PLPr) e E. tirucalli (PLEt) não foram ativa contra nenhum dos
fungos testados, nem mesmo na dose de 5 mg/ml (Tabela 3).
O possível envolvimento de proteínas nas atividades antifúngicas foi
testado tratando as frações PLCp, PLCg e P1G10 com um mistura de
proteases inespecíficas (Pronase). Em todos os ensaios de inibição do
crescimento, as proteínas laticíferas que foram tratadas com pronase perderam
a atividade antifúngica (Tabela 4). Estes resultados suportam a hipótese do
envolvimento de proteínas nesta atividade biológica.
Tabela 4: Efeito inibitório das proteínas dos látices de C. procera, Cr.
grandiflora e Ca. candamarcensis nativas e tratadas com pronase.
Fungos Crescimento Fúngico (%)
PLCp PLCg P1G10
Nativa Pronase Nativa Pronase Nativa Pronase
C. gloeosporioides 14,1 ± 3,7 100 15,1 ± 3,0 100 39,3 ± 5,5 100
F.oxysporum 31,3 ± 0,5 100 40,9 ± 2,2 100 ND* ND
F solani 13,2 ± 2,6 100 15,1 ± 3,0 100 27,2 ± 1,2 100
R solani 8,4 ± 5,9 100 14 ± 1,5 100 17,8 ± 2,2 100
Neurospora sp. 15,5 ± 4,4 94 ± 6,5 17,5 ± 6,5 94,6 ± 6,9 37,1 ± 1,5 97 ± 2,3
A niger 61,5 ± 3,3 96,3 ± 6,6 54,3 ± 11,3 98,3 ± 5,8 49,3 ± 5,8 98 ± 1,0
ND*: Não determinado. Ensaios realizados na concentração de 2,5 mg/ml em
tampão acetato de sódio pH 5,0
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Fluidos laticíferos são bastante conhecidos pela grande quantidade de
proteinases, entre elas proteinases cisteínicas. O látex de C. procera, Cr.
grandiflora, Ca. Candamarcensis e P. rubra apresentam atividade proteolítica
do tipo cisteínica (TEIXEIRA, et al., 2008; RAMOS, et al., 2009). As atividades
proteolíticas específicas dos fluidos laticíferos de C. procera (PLCp), Cr.
grandiflora (PLCg), Ca. candamarcensis (P1G10) e P. rubra (PLPr) foram 2,41
± 0,09, 4,77 ± 0,42, 4,54 ± 0,15 e 0,75 ± 0,02 AU/μgProteína, respectivamente
(Tabela 5). As proteínas do látex de E. tirucalli (PLEt) não apresentaram
atividade proteolítica nas condições experimentais testadas (10 mg/ml).
Quando as frações protéicas foram incubadas com iodoacetamida (IAA),
inibidor específico e irreversível de proteinases cisteínicas, a atividade
proteolítica foi perdida em todos os látices testados, exceto para P. rubra que
apresentou atividade proteolítica (0,27 ± 0,01 AU/μgProteina) mesmo depois do
tratamento com IAA.
Houve uma correlação entre a atividade antifúngica e a quantidade de
atividade proteolítica nas frações testadas. As amostras que exibiram forte
atividade proteolítica também mostraram alta toxicidade contra os fungos
fitopatogênicos testados.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Tabela 5: Atividade proteolítica das proteínas laticíferas estudadas utilizando
azocaseína como substrato.
Amostras protéicas
(Proteínas Laticíferas)
Atividade
Proteolítica
(AU/μgProteína)
Atividade Proteolítica
na presença de IAA
(AU/μgProteína)
C. procera (PLCp) 2,41 ± 0,09* 0
Cr. grandiflora (PLCg) 4,77 ± 0,42 0
P. rubra (PLPr) 0,75 ± 0,02 0,27 ± 0,01
Ca. candamarcensis
(P1G10)
4,54 ± 0,15 0
E. tirucalli (PLEt) Nd+ -
Papaína 1,54 ± 0,09 0
Tripsina 6,02 ± 0,21 -
Quimotripsina 2,56 ± 0,54 -
+Nd= Não detectado. IAA; Iodoacetamida.
Ensaio realizado em tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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O envolvimento de proteinases cisteínicas na atividade antifúngica de
PLCp, PLCg e P1G10 foi testado quando as frações foram incubadas na
presença de DDT (um eficiente ativador de proteinase cisteínica) ou de IAA
(Figura 2). O efeito antifúngico das frações analisadas foi substancialmente
aumentado depois do tratamento das frações com DDT, sugerindo o
envolvimento de proteinases cisteínicas na atividade antifúngica. Além disso,
as atividades antifúngicas de PLCp, PLCg e P1G10 foram drasticamente
reduzida quando as foram pré-tratadas com IAA, comparada com as amostras
correspondentes que tinham sido ativadas com DTT para obter máxima
atividade antifúngica. Somente o DDT e IAA não exibiram toxicidade nas
concentrações que foram analisados. O fato que a fração PLPr apresentou
atividade proteolítica e não afetou o crescimento dos fungos pode ser atribuído
a baixa de atividade proteolítica dessa fração, quando comparada com as
outras frações ativas contra os fitopatôgenos. Esse resultado também suporta a
hipótese que a atividade proteolítica pode está envolvida na atividade
antifúngica.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
40
Figura 2: Efeito inibitório de proteínas laticíferas sobre o crescimento de
diferentes fungos fitopatogênicos. Pap: Papaína 0,5 mg/ml. Ensaios realizados na
concentração de 2,5 mg/ml em tampão acetato de sódio pH 5,0.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
41
Esses resultados em conjunto apóiam a hipótese da ocorrência de uma
correlação direta entre a atividade proteolítica do tipo cisteínica e o efeito
deletério contra fungos. Contudo, há evidências que outras proteínas estejam
envolvidas na atividade antifúngica, já que esta não foi totalmente revertida na
presença de IAA.
Para enfatizar a importância da atividade proteolítica do tipo cisteínica na
toxicidade sobre fungos, a papaína, uma proteinase cisteínica purificada de
látex de Carica papaia (EC 3.4.22; obtida da Sigma), foi testada contra os
mesmos fungos. A atividade proteolítica da enzima foi totalmente inibida na
presença de IAA (Tabela 5). A papaína 0,5 mg/ml foi ativa contra os fungos
Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani,
Rhizoctonia solani e Neurospora sp. . Interessante que a atividade foi
aumentada na presença de DTT e anulada na presença de IAA. Esses
resultados corroboram com os dados obtidos dos ensaios com as proteínas de
fluidos laticíferos estudados nesse trabalho, suportando a hipótese da
participação de proteinases cisteínicas nos efeito deletérios em fungos.
A participação de proteinases cisteínicas de fluidos laticíferos foi
evidenciada através de ensaio de inibição da germinação de esporos de F.
solani. As figuras 3, 4 e 5 , mostra o envolvimento de proteinases cisteínicas de
PLCp, PLCg e P1G10 na inibição da germinação de esporos. Assim como no
ensaio de crescimento fúngico, as frações inibiram a germinação de esporos na
ausência e presença de DTT. Quando as frações foram pré-tratadas com IAA,
os esporos germinaram parcialmente. Contudo, assim como os dados obtidos
dos ensaios de inibição do crescimento, os resultados dos ensaios de
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
42
geminação mostram que outras classes de proteínas podem está envolvidas
com a atividade deletéria contra fungos. Na presença das proteínas laticíferas
aquecidas a 98°C por 30 minutos, os esporos germinaram normalmente.
Papaína purificada apresentou resultados similares aos das proteínas
laticíferas (Figura 6).
A tripsina e quimotripsina, ambas proteinases serínicas, foram testadas
quando suas capacidades de inibir a germinação de esporos de F. solani. A
atividade proteolítica dessas enzimas utilizando azocaseina com substrato foi
de 6,02 ± 0,21 e 2,56 ± 0,54 AU/μgProteina, respectivamente (Tabela 5).
Apesar destas duas enzimas terem apresentado atividades proteolíticas
similares ou superiores a da papaína, elas não apresentaram atividade
antifúngica (Figura 6). Similarmente, tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0,
BSA 2,5 mg/ml e DTT 3 mM não exerceram qualquer efeito negativo na
germinação.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Figura 3: Ensaio de inibição da germinação de esporos de F. solani utilizando a
fração protéica do látex de C. procera (PLCp). Ensaios realizados na
concentração de 2,5 mg/ml em tampão acetato de sódio pH 5,0. Controle:
Tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0; PLCp + DDT, PLCp ativada com DTT;
PLCp + IAA, PLCp inibida com IAA; PLCp-98ºC, PLCp fervida por 30 min.
Fotografias tiradas após 24 h de ensaio a 27 °C. Barras, 50 µm
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Figura 4: Ensaio de inibição da germinação de esporos de F. solani utilizando a
fração protéica do látex de Cr. grandiflora (PLCg). Ensaios realizados na
concentração de 2,5 mg/ml em tampão acetato de sódio pH 5,0. Controle:
Tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0; PLCg + DDT, PLCg ativada com DTT;
PLCg + IAA, PLCg inibida com IAA; PLCg-98ºC, PLCg fervida por 30 min.
Fotografias tiradas após 24 h de ensaio a 27 °C. Barras, 50 µm
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Figura 5: Ensaio de inibição da germinação de esporos de F. solani utilizando a
fração protéica do látex de Ca. cadamarcensis (P1G10). Ensaios realizados na
concentração de 2,5 mg/ml em tampão acetato de sódio pH 5,0. Controle:
Tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,0; P1G10 + DDT, P1G10 ativada com
DTT; P1G10 + IAA, P1G10 inibida com IAA; P1G10-98ºC, P1G10 fervida por
30 min. Fotografias tiradas após 24 h de ensaio a 27 °C. Barras, 50 µm.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Figura 6: Ensaio de inibição da germinação de esporos de F. solani
utilizando a papaína, tripsina e quimotripsina. Ensaios realizados nas
concentrações de 0,5 mg/ml (papaína, tripsina e quimotripsina) e 2,5 mg/ml
(BSA), em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 5,0 (papaína e BSA) ou tampão
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 (tripsina e quimotripsina). Fotografias tiradas após 24 h
de ensaio a 27 °C. Barras, 50 µm.
PLCg foi a fração que apresentou a maior atividade proteolítica entre os
outros látices testados e exibiu efeitos deletérios sobre todos os fungos
analisados. Além disso, foi mostrado o envolvimento de proteinases cisteínicas
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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em tais atividades. Logo, esta fração foi posteriormente caracterizada no intuito
de purificar uma protease com atividade antifúngica.
Assim, PLCg foi fracionada em uma coluna de troca catiônica “Mono-S
Sepharose” acoplada ao sistema FPLC. O perfil cromatográfico pode ser
observado na figura 7.
Figura 7: Cromatografia em coluna de troca catiônica “Mono-S Sepharose”
acoplada ao sistema FPLC. Foram aplicados 1 mg de PLCg. As amostras
foram eluídas com um gradiente não linear de NaCl em tampão tetraborato de
sódio 25 mM e EDTA 5 mM pH 9,2. O perfil protéico foi medido pela
absorbância em 280 nm. A cromatografia foi realizada com um fluxo de 1
ml/min.
Após cromatografia da fração PLCg, em coluna de troca catiônica,
foram obtidos três picos retidos, denominados PI, PII e PIII. O PI foi eluído com
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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aproximadamente 40 mM de NaCl. O PII teve uma quantidade de proteína
similar ao pico I, sendo eluído com 85 mM de NaCl. O PIII teve a maior
quantidade de proteínas e foi eluído com aproximadamente 110 mM de NaCl.
Após a realização de várias cromatografias em coluna “Mono-S
Sepharose”, os picos semelhantes foram agrupados e concentrados pelo
método de ultrafiltração como descrito na metodologia. A concentração protéica
dos picos foi realizada pelo método de Bradford (1976) utilizando albumina
sérica bovina como padrão.
Com o objetivo de determinar a massa molecular dos picos e avaliar o
grau de purificação destes, foi realizado eletroforese sob condições
desnaturantes. A eletroforese mostrou que as amostras tinham alto grau de
pureza, apresentando bandas protéicas com massas moleculares relativas em
torno de 24 kDa (Figura 8).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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Figura 8: Eletroforese em gel de poliacrilamida 12,5% na presença de β
mercaptoetanol dos picos eluídos da cromatografia em coluna Mono-S
Sepharose. MM: Marcador de massa molecular. Foram aplicados 10 µg de
proteína de cada pico. O gel foi corado com azul de coomassie.
Para acompanhar se os picos oriundos da cromatografia de troca
catiônica em coluna “Mono-S Sepharose” possuíam atividade proteolítica,
ensaios de atividade amidásica foram realizados utilizando o substrato sintético
BApNA. Os três picos apresentaram atividade amidásica específica de 2,31,
2,36 e 5,2 nM x min -1 x µg-1, respectivamente (Tabela 6). O pico PIII
apresentou atividade amidásica cerca de duas vezes maior que os outros
picos.
B
30,0
45,0
,0
20,1
66,0
,0
97,0
,0
14,0
,0
MM
,0
PLCg
,0
PI PII PIII
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
50
Tabela 6: Atividade amidásica específica das frações de C. grandiflora eluídas
da coluna Mono-S Sepharose.
Atividade amidásica específica
(nM x min -1 x µg-1)
PLCg 1,59
PI 2,31
PII 2,36
PIII 5,2
Para aumentar o grau de pureza das proteases eluídas da coluna „Mono-
S Sepharose‟ e dessalinização das mesmas, estas foram submetidas a
cromatografias de fase reversa em coluna C4 acoplada ao sistema de HPLC.
O perfil cromatográfico é mostrado na figura 9. PI e PII mostraram a presença
de mais de um pico, revelando que essas amostras não estavam puras. Porém,
o cromatograma de fase reversa em coluna C4 do PIII apresentou um único
pico simétrico com volume de retenção de 64,2 mL.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
51
Figura 9: Perfil cromatográfico dos picos PI, PII, PIII em cromatografia de fase
reversa em coluna C4. Foram aplicados 100 µg de proteína. O perfil protéico foi
determinado através da absorbância em 216nm. A concentração de acetonitrila
variava de 0% a 54% nos 20 minutos iniciais. Posteriormente, era aumentada
gradativamente até 81% em 30 minutos, permanecendo nesta concentração
até o final da cromatografia. O fluxo foi de 1 ml/min
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
52
A homogeneidade da protease purificada foi avaliada por zimograma e
espectrometria de massa. SDS-PAGE mostrou uma única banda (Figura 10a).
SDS-PAGE contendo gelatina usada especificamente para detectar proteases
também mostrou uma única banda ativa (Figura 10a). A massa molecular
determinada por MALDI/TOF foi de 24,118 kDa (Figura 10b). Esses resultados
em conjunto indicam que a protease purificada era homogênea. O resultado da
purificação pode ser resumido na tabela 7. Foi obtido um grau de purificação de
6,1 vezes com rendimento de 0,9 %.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
53
Figura 10: (a) Linha 1: SDS-PAGE da protease purificada Cg24-I. Linha 2:
Zimograma contendo gelatina 0,1% para detecção de atividade proteolítica
corada com azul de Coomassie. (b) Espectrometria de massa MALDI/TOF da
Cg24-I. A amostra foi misturada com a matriz HCCA dissolvida em acetonitrila
50% e ácido trifluoroacético 0,3%. O aparelho foi calibrado com padrões
externos (Protein Calibration Standard - Bruker Daltonics).
a
b
1 2
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
54
Tabela 7: Purificação de uma protease de C. grandiflora
Amostra
Volume
(mL)
Proteína
(mg/mL)
Proteína
Solúvela
(mg) Atividade(UAb)
Atividade
Específica
(UA/µgP) Purificação
Rendimento
(%)
PLCg 50 0,228 11,4 53,1 1,062 1 100
Cg24-I 2 0,053 0,106 33,8 6,5 6,1 0,9
a Proteínas Solúveis estimadas pelo método de Bradford (1976).
b Uma unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima capaz de
aumentar a absorbância em 0,01 (Xavier-Filho et al., 1989)
Essa protease foi denominada de Cg24-I e é a primeira protease isolada
de látex de Cryptostegia grandiflora.
A atividade proteolítica relativa de Cg24-I na presença de vários
inibidores foi realizada para estabelecer a classe que ela pertence. Os
inibidores avaliados incluíram inibidor de protease serínica (PMFS), inibidores
de proteases cisteínica (E-64 e Iodoacetoamida), inibidor de protease aspártica
(Pepstatina A) e inibidor de metaloprotease (EDTA). Utilizando caseína com
substrato, o inibidor E-64 inibiu a atividade em 100 %, e a iodoacetamida
reduziu a atividade em cerca de 80 %. Nenhum dos outros inibidores foi capaz
de reduzir a atividade proteolítica de forma efetiva (Figura 11). A protease foi
capaz de hidrolisar o BANA, um substrato específico de proteases cisteínicas e
foi completamente inibida na presença de E-64. O uso do DTT 3 mM aumentou
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
55
consideravelmente a atividade da protease em ambos os substratos testados.
Esse composto é um conhecido ativador de protease cisteínica. Esses dados
sugerem que a protease purificada é do tipo cisteínica.
Figura 11: Efeito de inibidores específicos na atividade proteolítica da Cg24-I,
utilizando caseína (A) ou BANA (B) como substratos em pH 8.0 a 37 ºC.
* Cg24-I sem pré-ativação com DDT. IAA: Iodoacetoamida; PEP: Pepstatina A
(A) (B)
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
56
A proteinase purificada foi avaliada quando a capacidade de hidrolisa a
caseína em diferentes valores de pH (Figura 12). A enzima teve atividade
máxima em pH 8,0. Em pH 10,0, a enzima ainda foi ativa, mas com uma
atividade 50 % menor que em relação ao pH 8,0. Em pH 5,0 esse enzima
mostrou cerca de 40 % da atividade máxima.
pH
2 4 6 8 10 12
Ati
vid
ad
e R
es
idu
al
(%)
0
20
40
60
80
100
120
Figura 12: Efeito do pH na atividade proteolítica da Cg24-I utilizando caseína
como substrato. Cada ponto é referente à média de três valores independentes
com respectivos desvios padrões.
A atividade antifúngica de Cg24-I foi avaliada utilizando o fitopatógeno
F. solani. A protease foi capaz de inibir a germinação dos esporos em uma
concentração de 28,12 µg/ml, indicando um grande potencial inibitório dessa
protease (Figura 13).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
57
Figura 13: Ensaio de inibição da germinação de esporos de F. solani utilizando a
protease Cg24-I. Controle: Tampão fosfato de sódio 50 mM pH 8,0;. Fotografias
tiradas após 24 h de ensaio a 27 °C. Barras, 50 µm
Muitas proteínas são deletérias a fungos devido a danos causados na
membrana plasmática. Para avaliar o mecanismo de ação da protease
purificada, esta foi a avaliada quanto sua capacidade de causar danos na
permeabilidade da membrana. Para isso, foi utilizado o fluoróforo iodeto de
propídio, que é impermeável à membrana plasmática íntegra. A protease foi
capaz de promover um aumento na permeabilidade da membrana dos esporos
de F. solani, permitindo a entrada do composto iodeto de propídio no interior da
célula e, assim, sua interação com as moléculas de ácido nucléico, liberando
fluorescência. Diferentemente do observado com os esporos tratados com
tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0 (controle), que não resultou no
aparecimento de fluorescência (Figura 14).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
58
Figura 14: Efeito da Cg24-I sobre a permeabilidade da membrana plasmática
de esporos de F. solani. Uma suspensão de esporos de F. solani ( 2 x 106
esporos/ml foi incubada por 30 minutos com Cg24-I (28,12 µg/ml). O fluoróforo
iodeto de propídio (1 mM) foi utilizado para determinar a integridade das
membranas dos esporos.
Controle
Cg24-I
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
59
6 – DISCUSSÃO
Látex é uma suspensão aquosa ou emulsão de vários tipos de partículas
sintetizadas e armazenadas sob pressão em um sistema de canais formados
por células altamente especializadas denominadas de laticíferos. Neste fluido,
são encontrados proteínas, alcalóides, amido, açucares livres, óleos, taninos,
resinas, borracha e típicas estruturas sub-celulares (DOMSALLA & MELZIG,
2008).
Ao longo dos últimos 20 anos, muitos trabalhos foram publicados sobre
látex, principalmente estudos bioquímicos, ecológicos e evolucionários dos
laticíferos. A maioria das evidências desses estudos tem reforçado a hipótese
que o látex tem um papel fundamental na defesa de plantas contra patôgenos e
herbívoros (AGRAWAL & KONNO, 2009).
Ação antifúngica in vitro de látices foi mostrada para algumas espécies
tais como Himatanthus articulatus (SEQUEIRA, et al., 2009), Lactuca sativa,
Asclepias curassavica (MOULIN-TRAFFORT et al., 1990; GIORDANI, et al.,
1991), Carica papaya (GIORDANI, et al., 1996;) e Hevea brasiliensis
(GIORDANI, et al., 1999) contra Candida albicans. O látex de Manihot glaziovii
mostrou atividade antifúngica sobre o crescimento de Colletotrichum
gloesporioides, Macrophomina phaseolina e Fusarium solani (PEREIRA, et
al.,1999). Contudo, existem poucos estudos sobre o envolvimento de fluídos
laticíferos em atividades deletérias contra fungos fitopatogênicos. Em vista
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
60
disto, o potencial antifúngico das proteínas do látex de Calotropis procera
(PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg), Carica candamarcensis (P1G10),
Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) foi avaliado sobre os fungos
fitopatogênicos Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium
solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger. As frações
PLCp, PLCg e P1G10 exibiram atividade antifúngica sobre todos os fungos
testados com valores de IC50 variando de 9,8 a 1.369,0 µg/ml. Entretanto, as
frações PLPr e PLEt não mostraram nenhum efeito sobre o crescimento dos
fungos fitopatogênicos testados. Ramos et al. (2009) mostraram que as frações
PLPr e PLEt não exibiram efeito deletério sobre o desenvolvimento larval de
Aedes aegypti. Parijs e coloboradores (1991) mostraram que a heveína, uma
proteína purificada de látex de Hevea brasiliensis, exibiu efeito antifúngico
sobre oito fungos fitopatogênicos, com valores de IC50 entre 90 e 1250 µg/ml. A
fração PLCp e PLCg exibiu valores de IC50 contra o F. oxysporum de 31,3 e
40,9 µg/ml, respectivamente. Esses valores são aproximadamente 25 vezes
menores ao IC50 da heveína (1250 µg/ml) e ao valor de IC50 (>1250 µg/ml)
encontrado para uma quitinase de Nicotina tabacum, uma proteína com
notáveis características antifúngicas (PARIJS, et al., 1991).
Atividade antifúngica de PLCp, PLCg e P1G10 foi inativada quando as
frações foram pré-tratadas com enzimas proteolíticas inespecíficas ou fervidas
por 30 minutos, demonstrando a natureza protéica dessas atividades. Várias
proteínas com atividade antifúngica foram purificadas de látices de algumas
espécies. Três quitinases purificadas do látex de Ficus microcarpa
apresentaram atividade contra Trichoderma viride (TAIRA, et al., 2005). A
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
61
heveína mostrou atividade antifúngica contra três diferentes espécies de fungos
patogênos da cavidade oral e do trato respiratório de humanos, Candida
albicans, Candida tropicalis e Candida krusei, em concentrações tão baixas
como 12 µg/ml (KANOKWIROON, et al., 2007). A atividade antifúngica do látex
de Hevea brasiliensis e Carica papaya foi associada com enzimas envolvidas
na degradação de polissacarídeos da parede celular de fungos (GIORDANI, et
al., 2002).
O efeito antifúngico de PLCp, PLCg e P1G10 foi correlacionado
diretamente com a atividade proteolítica de tipo cisteínica, pois a atividade
antifúngica foi substancialmente aumentada quando as frações foram tratadas
com DTT ou foi efetivamente reduzida quando inibida com IAA. Apesar da
fração PLPr apresentar atividade proteolítica do tipo cisteínica, o efeito
deletério contra os fungos testados não foi observado, este fato pode ser
atribuído a uma baixa atividade proteolítica apresentada pela fração PLPr se
comparada as frações que mostraram atividade antifúngica.
Ramos e colaboradores (2009) mostraram envolvimento da atividade
proteolítica do tipo cisteínica presente no látex de C. procera e Cr. grandiflora
no efeito larvicida contra o mosquito Aedes aegypti. Evidência direta da
participação de proteinases cisteínicas na defesa da planta vem de
experimentos que mostram que a forte toxicidade de folhas de Carica papaya e
Ficus virgata contra os insetos herbívoros Samia ricini e Mamestra brassicae,
desaparece quando as folhas foram lavadas para retirada do látex ou quando o
E-64, um inibidor específico de proteinases cisteínica, foi espalhado na
superfície das folhas (KONNOR, et al, 2004).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
62
Na literatura, existem relatos do envolvimento de proteases de látices
na defesa da planta contra insetos (KONNO, et al., 2004). Contudo, o papel
destas proteínas na defesa da planta contra fungos ainda não foi relatado. Há
relatos do envolvimento de proteases cisteínicas de outras fontes com
atividade antifúngica, antibacteriana e inseticida. Pechan e colaboradores
(2000) descreveram o efeito deletério de uma proteinase cisteínica de milho
sobre Spodoptera frugiperda e Diatraea grandiosella, ambos Lepidoptera. O
mesmo grupo também mostrou que essa mesma proteinase cisteínica era
capaz de degradar a matrix peritrófica destas lagartas (PECHAN, et al., 2002).
Krüger e colaboradores (2002) mostraram que um gene (Rcr3) que
codifica uma protease cisteínica em folhas de Solanum lycopersicum é
responsável pela resistência ao fungo Cladosporium fulvum. Similarmente, Hao
e colaboradores (2006) mostraram que dois genes que codificam proteinases
cisteínicas são necessário para a resistência de plantas de Nicotiana
benthamiana ao fungo Colletotrichum destrichum. Também foi descrito que
proteinases cisteínicas estão envolvidas na defesa da planta contra bactérias
(BERNOUX, et al., 2008).
Na literatura há relatos da participação de proteases aspárticas e
metaloproteases na defesa contra fungos. Uma protease aspárticas de
tubérculo (StAP1) e duas de folha (StAP2 e StAP3) de batata (Solanum
tuberosum) foram purificadas e caracterizadas. As duas isoformas StAP1 e
StAP3 mostraram atividade antifúngica contra os fungos Phytophthora
infestans e Fusarium solani (GUEVARA, et al., 2001, 2002, 2004). Mendieta e
colaboradores (2006) mostraram que o mecanismo de ação da atividade
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
63
antifúngica da protease aspártica de folha de batata (StAP3) envolve produção
de espécies reativas de oxigênio e alteração na permeabilização da membrana
plasmática. O gene Pi-ta de tomate que codifica uma proteína com 223
aminoácido com similaridade com classe das metaloproteases, conferiu
resistência ao arroz contra fungos (ORBACH, et al., 2000).
A atividade antifúngica das frações testadas não foi totalmente anulada
depois do tratamento com IAA, sugerindo que outras proteínas além de
proteases cisteínicas podem participar da atividade antifúngica. Freitas e
coloboradores (2007) descreveram a presença de quitinases no látex de
Calotropis procera. As quitinases são o segundo maior grupo de proteínas
antifúngicas. Elas catalisam a clivagem hidrolítica da ligação β-1,4-glicosídicas
presente em biopolimeros de N-acetil-D-glicosamina (quitina), que é o
constituinte majoritário da parede celular de fungos (JOSHI, et al., 1998;
KASPRZEWSKA, 2003).
A participação de proteinases cisteínicas na defesa da planta contra
fitopatôgenos foi enfatizada a partir dos ensaios antifúngicos com proteinases
purificadas. A papaína, uma proteinase cisteínica de Carica papaya, foi capaz
de inibir o crescimento de cinco dos seis fungos testados e inibir a germinação
de esporos de F. solani. Assim como as proteínas laticíferas estudadas, a
papaína teve seu potencial antifúngico aumentado na presença de DTT e
drasticamente reduzido na presença IAA. A especificidade da protease frente
esta atividade biológica foi confirmada quando a tripsina e a quimotripsina,
duas proteinases serínicas, não mostraram nenhum efeito na germinação de
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
64
esporos de F. solani, mesmo estas enzimas apresentando atividades
proteolíticas específicas similares ou maiores que da papaína.
A fração PLCg apresentou a maior atividade proteolítica nas condições
experimentais testadas e exibiu efeitos deletérios sobre todos os fungos
testados. Entretanto, não há relatos de proteases purificadas do látex de Cr.
grandiflora até o momento. Tendo em vista isso, a fração PLCg foi fracionada
através de cromatografia em coluna Monos-S Sepharose acoplada ao sistema
FPLC.
A cromatografia de fase reversa mostrou que apenas o PIII tinha um
único pico simétrico, demonstrando sua pureza. A homogeneidade da protease
purificada foi avaliada zimograma e espectrometria de massa MALDI/TOF. A
massa molecular relativa do PIII foi de aproximadamente 24 kDa obtida através
de SDS-PAGE. O zimograma para detecção de atividade proteolítica mostrou
uma única banda ativa confirmando o grau de pureza da enzima. A massa
molecular determinada por espectrometria de massa MALDI/TOF foi de 24,118
kDa. Esses resultados estão em concordância com outras proteases
purificadas de látex. Nas espécies do gênero Asclepias, como Asclepias
curassavica , Asclepias syriaca, Asclepias fruticosa foram purificadas
proteinases cisteínicas com massas moleculares de aproximadamente 24 kDa
(BROCKBANK & LYNN, 1979; TREJO, et al., 2001; LIGGIERI, et al., 2009).
Recentemente, Teixeira e colaboradores (2008) purificaram 12 isoformas de
proteinases cisteínicas no látex de Carica candamarcensis com massas
moleculares de aproximadamente 23 kDa. No látex de Carica papaya foram
identificadas, purificadas e caracterizadas quatro proteinases cisteínicas
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
65
estrutural e imunologicamente distintas: papaína, quimopapaina, proteinase III
e proteinase IV com massas moleculares de 23,4, 25,0, 26,0 e 24,5 kDa,
respectivamente (BUTTLE, et al., 1989). Geralmente as proteases cisteínicas
purificadas de látices apresentam massas moleculares variando de 20 a 35
kDa (SUNDD, et al., 1998; MORCELLE, et al., 2004; DEVARAI, et al., 2008;
DOMSALLA & MELZIG, 2008).
Essa protease foi denominada de Cg24-I e é a primeira protease isolada
de látex Cryptostegia grandiflora. O rendimento da Cg24-I de 0,9 % foi baixo
quando comparado com proteinases purificadas de outros látex como, por
exemplo, araujiaina h-I (12 %), purificada de Araujia hortorum, funastraina c-II
(8,5 %), purificada de Funastrum clausum, e asclepaina c-II (9,8 %), purificada
de Asclepias curassavica (PRIOLO, et al., 2000; MORCELLE, et al., 2004;
LIGGIERI, et al., 2009). Porém, a Cg24-I tem um potencial para um possível
uso na indústria, por causa da sua facilidade de purificação (KANEDA, et al.,
1997). Outras proteases de látex foram purificadas em um único passo
cromatográfico tem sido bastante usada na indústria (PRIOLO, et al., 2000,
DEVARAI, et al., 2008).
Estudos de inibição da atividade proteolítica pelo E- 64 e IAA sugerem a
possibilidade da natureza cisteínica da protease presente no látex de Cr.
grandiflora. A enzima foi fortemente ativada na presença do agente redutor
DTT. A ativação pelo DTT e inativação pelos inibidores E-64 e IAA indicam que
os grupos–SH podem está envolvidos no mecanismo catalítico da enzima,
sugerindo que ela pertence à classe das proteinases cisteínicas (DUBEY &
JAGANNADHAM, 2003). Cerca de 110 látices de diferentes plantas são
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
66
conhecidas por apresentarem pelo menos uma enzima proteolítica. A maioria
delas pertence à família das proteinases cisteínicas (PATEL &
JAGANNADHAM, 2003; DOMSALLA & MELZIG, 2008). A papaína, presente
em Carica papaya, é a mais conhecida. Além da papaína, o látex de Ca.
papaya possui outras proteinases cisteínicas, tais como, quimopapaína,
caricaina, glicilendopeptidase (MEZHLUMYAN, et al., 2003; DOMSALLA &
MELZIG, 2008). Do mesmo modo, várias proteinases cisteínicas foram
identificadas em látices de espécies do gênero Asclepias (TABLERO, et al.,
1991; TREJO, et al., 2001; LIGGIERI et al., 2004), Calotropis (RAJESH, et al.
2005; DUBEY, et al., 2003), Araujia (PRIOLO, et al., 2000; OBREGÓN, et al.,
2001).
A Cg24-I apresentou pH ótimo de atividade em torno de 8,0, assim como
é observado em proteases cisteínicas isoladas de Ervatamia coronária
(NALLAMSETTY, et al., 2003), Asclepias curassavica (LIGGIERI et al., 2004),
Morrenia brachytephana Griseb (CAVALLI, et al., 2003), Jacartia mexicana
(GAVIRA, et al., 2007).
A Cg24-I foi capaz de inibir a germinação de esporos F. solani. A
concentração mínima de protease capaz de inibir totalmente a germinação foi
de 28, 12 µg/ml. Não há relatos de proteinases cisteínicas isoladas de látices
com atividade antifúngica. O fato que Cg24-I exibir atividade antifúngica, assim
como outras proteínas presentes em látex, sugere que pode ter um papel na
defesa de plantas contra patôgenos.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
67
A proteinase Cg24-I pode atuar alterando a permeabilidade da
membrana de fungos tais como F. solani. Essa alteração na permeabilidade foi
revelada com auxílio do iodeto de propídio, um corante com alta afinidade para
ácido nucléico (DNA), que facilmente penetra em células com a membrana
plasmática comprometida. A permeabilidade das membranas biológicas é um
fator crucial na manutenção das condições celulares. Alterações mínimas em
sua estrutura acarretam grandes modificações no metabolismo e fisiologia das
células, além de promover distorções na transdução de sinais do meio externo
para o interior celular (ABAD, et al., 1995). As proteínas que apresentam
atividade antifúngica e atuam sobre a membrana plasmática possuem uma
grande variedade de estruturas tridimensionais, contudo todas apresentam no
mínimo duas características em comum: uma carga líquida positiva em
condições fisiológicas, que promoverá a interação com a superfície carregada
negativamente dos microorganismos e uma estrutura hidrofóbica ou neutra que
permitirá a formação dos poros (EPAND & VOGEL, 1999; TOSSI, et al., 2000;
WON, et al., 2008).
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
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7 – CONCLUSÃO
Os látices de Calotropis procera, Cryptostegia grandiflora e Carica
candamarcensis apresentam atividade antifúngica sobre vários fitopatôgenos, e
proteinases cisteínicas provavelmente estão envolvidas com essa atividade.
Esses resultados fortificam a hipótese que látex tem papel importante na
defesa vegetal.
A protease antifúngica purificada de Cr. grandiflora denominada de
Cg24-I apresenta massa molecular de 24.118 kDa. Provavelmente a Cg24-I
pertença a classe das proteinases cisteínicas e seu mecanismo de ação contra
fungos esteja relacionado a alteração na permeabilidade da membrana
plasmática.
Souza, D. P., 2010. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos... Resultados
69
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABAD, L. R., D‟URZO, M. P., LIU, D., NARASIMHAN, M. L., REUVENI, M., ZHU, J. K., NIU, X., SINGH, N. K., HASEGAWAA, P. M., BRESSAN, R. A. Antifungal activity of tobacco osmotin has specificity and involves plasma membrane permeabilization. Plant Science, 118: 22-23, 1995. ABEYSINGHE, S. Biological control of Fusarium solani f. sp. phaseoli the causal agent of root rot of bean using Bacillus subtilis CA32 and Trichoderma harzianum. Ruhuna Journal of Science, 2 : 82-88. 2007. AGRAWAL, A.A. & KONNO, KOTARO. Latex: a model for understanding mechanisms, ecology, and evolution of plant defense against herbivory. Annual Review Of Ecology And Systematics, 40: 311-31, 2009. AGRIOS, G.N., Plant Pathology, 5th edn. Elsevier Academic Press. 2005 ANTONIW, J., OOMS, G., WHITE, R.F. AND WULLEMS, G.J. The presence of pathogenesis-related proteins in callus of Xanthi-nc tobacco. Phytophathol. Z. 101: 179–184, 1980. AZARKAN, M., WINTJENS, R., LOOZE, Y. AND VOLANT, D.B. Detection of three wound -induced proteins in papaya latex. Phytochemistry, 65(5): 525-534, 2004 AZARKAN, M.; DIBIANI, R.; GOORMAGHTIGH, E.; RAUSSENS, V.; BAEYENS-VOLANT, D. The papain Kunitz-type trypsin inhibitor is a highly stable β-sheet glycoprotein. Biochemica et Biophysica Acta, 1764: 1063-1072. 2006a AZARKAN, M.; DIBIANI, R.; BAULARD, C.; BAEYENS-VOLANT, D. Effects of mechanical wounding on Carica papaya cysteine endopeptidases accumulation and activity. International Journal of Biological Macromolecules, 38: 216-224. 2006b.
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