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PROTEINE DES SERUMS

DAS BLUTPLASMA

BIOCHEMISCHE GRUNDLAGEN

Nach der Abtrennung aller korpuskularen Bestandteile (Blutkörperchen und Thrombozyten)

des Blutes erhält man das Blutplasma. Dieses weist einen Proteingehalt zwischen 60 und 80

g/l auf, ein Wert, der ein Gemisch aus über 100 Proteinen widerspiegelt (vgl. Tab.1), die

überwiegend in der Leber und im Lymphgewebe synthetisiert werden. Nach ihrer Funktion

lassen sich diese Proteine in folgende Gruppen einteilen:

Immunglobuline

Komponenten des Komplementsystems

Proteine der Blutgerinnung und Fibrinolyse

Transportproteine

Lipoproteine

Akute Phase Proteine

Die Biosynthese und der Abbau der Plasmaproteine werden im Rahmen eines dynamischen

Gleichgewichtes reguliert. Störungen dieses Gleichgewichtes können zu einem Absinken des

Plasmaproteinspiegels führen, was als Hypoproteinämie bezeichnet wird. Ursächlich kann

eine durch Hunger oder Schädigung des Leberparenchyms hervorgerufene Verringerung der

Biosynthese sein. Möglich ist aber auch die vermehrte Ausscheidung der Plasmaproteine über

den Gastrointestinaltrakt oder die Niere.

Erhöht sich hingegen die Konzentration der Plasmaproteine, so bezeichnet man dieses als

Hyperproteinämie. Hyperproteinämie liegt z.B. bei der vermehrten Biosynthese der -Globuline

vor, die durch maligne klonale Plasmazellen verursacht wird. Das so entstehende Krankheitsbild

wird als Plasmocytom bezeichnet.

Zur klinischen Diagnostik derartiger Erkrankungen ist allein die Bestimmung der

Proteinkonzentration im Plasma nicht ausreichend, da ein ungewöhnlicher

Plasmaproteingehalt auch durch eine nicht-pathologische Vermehrung oder Verminderung

des Wassergehalts des Bluts verursacht sein kann. Aus diesem Grund wird meist mit

elektrophoretischen Verfahren eine Grobauftrennung der Plasmaproteine in Einzelfraktionen

durchgeführt.

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Tab.1: Proteine des menschlichen Blutplasmas (Auswahl, entnommen aus Löffler-

Petrides, 7. Auflage)

Proteine Molekulargewicht (kD) Normalbereich im

Serum (g/l) Funktion

Albumine

Präalbumin 61 0,1-0,4 Thyroxinbindung

Albumin 69 35-55 Transportfunktion

α1-Globuline

α1-Antitrypsin 54 2-4 Proteaseinhibitor

α1-Lipoprotein 200 2,9-7,7 Transport von Lipiden,

Hormonen

Prothrombin 60 0,05-0,1 Proenzym des Thrombins

Transcortin 45 Cortisolbindung

Thyroxin-bindendes

Globulin 45 Thyroxinbindung

α1-Antichymotrypsin 68 0,3-0,6 Chymotrypsininhibitor

Gc-Globulin 50 0,2-0,55 Vitamin D-Bildung

α2-Globuline

α2-Antithrombin III 65 0,17-0,3 Thrombininhibitor

α2Haptoglobin 100 0,8-3,0 Hämoglobinbildung

α2-Makrogobulin 820 Plasmininhibitor

Plasminogen 143 0,06-0,25 Proenzyms des Plasmins

β-Globuline

β-Lipoprotein 3200 2,5- Transport von Lipiden

β-1C-Globulin 85 0,8-1,4 Komplementfaktor

Hämopexin 80 0,5-1,15 Häminbindung

Transferrin 90 2-4 Bindung und Transport von

Eisen

Fibrinogen 340 2-4,5 Blutgerinnung

-Globuline

IgG 150 8-18 Antikörper

IgA 160 0,9-4,5 Antikörper

IgM 900 0,6-2,8 Antikörper

IgD 170 <0,15 Antikörper

IgE 190 <6x10-4 Antikörper

Lysozym 15 5-15x10-3 Bakterienauflösung

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ELEKTROPHORETISCHE VERFAHREN

Methoden zur Trennung von Proteinen beruhen auf Eigenschaften wie elektrischer Ladung,

Größe und Löslichkeit, die je nach Protein variieren. Eine wichtige Methode basiert auf der

Eigenschaft geladener Proteine, in einem elektrischen Feld zu wandern, ein Prozess, den man

als Elektrophorese bezeichnet.

Die erste Elektrophorese wurde in den 30er Jahren des letzten Jahrhunderts von Arne Tiselius

entwickelt und 1948 mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. In einem mit Puffer gefüllten U-

förmigen Rohr, dessen Schenkel mit einer Gleichstromquelle verbunden waren, trennte

Tiselius menschliche Seren in die vier Hauptkomponenten Albumin sowie α-, β- und -Globulin

auf.

Dieses erste Elektrophoreseverfahren basierend auf flüssigen Medien wurde wegen der

komplizierten Handhabung und Auswertbarkeit bald zur Zonenelektrophorese weiterentwickelt.

Nun dienten feste Medien wie Papier, Agargele und Kieselgele der Probentrennung. Da jedoch

diese Trägermaterialien wegen ihrer starken Eigenladung und geringen Retardation sehr diffuse

Banden ergeben, wurden neue, inertere Matrices eingeführt: Stärkegele (Smithies, 1955),

Celluloseacetatfolien (Kohn, 1957), Polyacrylamidgele (Raymond und Weintraub, 1959) sowie

Agarosegele (Hjerten, 1961).

Noch heute werden Stärkegele für genetische Untersuchungen verwendet (z.B.

Chromosomenanalyse). Agarosegele werden hauptsächlich zur Trennung von kleineren DNA-

Fragmenten und für Immunelektrophoresen zur spezifischen und quantitativen Detektion von

Proteinen eingesetzt. Polyacrylamidgele besitzen das höchste Auflösungsvermögen sowohl für

DNA-Fragmente als auch für Proteine. Die Celluloseacetatfolien finden Verwendung bei

klinischen Routineuntersuchungen insbesondere der Analyse von Blutproben.

GRUNDLAGEN DER ELEKTROPHORESE

Unterschiedliche Ladungen und Größen der Teilchen bewirken eine unterschiedliche

elektrophoretische Beweglichkeit und infolge davon räumliche Trennung der Sorten von

Teilchen voneinander.

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Werden elektrisch geladene Teilchen einem elektrischen Feld ausgesetzt, so wandern die

positiv geladenen Teilchen (Kationen) zum Minus-Pol (Kathode), die negativ geladenen

Teilchen (Anionen) zum Plus-Pol (Anode). Der Grund für diese Wanderung ist die auf ein

Teilchen mit der Ladung q wirkende Kraft Fe:

Fe = E·q mit q=z·e

Fe= am geladenen Teilchen angreifende Kraft [N]

E = elektrische Feldstärke [V . m-1] = [N . C-1]

q = Netto-Ladung des Teilchens im Feld

z = Zahl der Elementarladungen pro Teilchen

e= Elementarladung 1,602 176 565 (35) · 10−19 C

Die Kraft Fe bewirkt, dass sich die Teilchen im elektrischen Feld bewegen. Ihr entgegengesetzt

wirkt die Reibungskraft Ffr, die durch das Stoke`sche Gesetz beschrieben wird:

Ffr=6·π·r·ŋ·v

Ffr = Reibungskraft [N]

r = Partikelradius [m]

ŋ = Viskosität des Mediums [Pa . s] = [N . m-2 . s]

v = Wanderungsgeschwindigkeit [m . s-1]

CELLULOSEACETATFOLIEN-ELEKTROPHORESE

Bei der Celluloseacetatfolien-Elektrophorese werden nicht-denaturierte Proteine getrennt. Die

native Konformation der Proteine wird dabei nicht verändert. Aufgrund ihres strukturellen

Aufbaus zeigen Celluloseacetatfolien nahezu keine Adsorptionseffekte gegenüber Proteinen

und kommen damit dem idealen Trägermaterial recht nahe. Celluloseacetatfolien haben eine

schaumartige Struktur und können, obwohl sie kaum hydrophile Eigenschaften aufweisen, bis

zu 85% Pufferlösung aufnehmen. Wegen ihrer durchgehend homogenen Struktur gelingt es,

mit derartigen Folien elektrophoretische Trennungen bei relativ hohen Spannungen

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durchzuführen, wodurch der Zeitaufwand der Elektrophorese wesentlich verkürzt wird. Da

Protein-Anfärbereagenzien ebenso wie Proteine kaum adsorbiert werden, können sie in

wenigen Minuten ausgewaschen werden. Durch geeignete Maßnahmen lassen sich die Folien

vollständig transparent machen und ermöglichen dadurch eine quantitative photometrische

(densitometrische), automatisierbare Auswertung. Diese Art der Elektrophorese gehört in der

klinischen Chemie und Biochemie zu den häufig durchgeführten Analysemethoden.

Als Probe für diese Art der Elektrophorese dient in der Regel das Blutserum, nicht aber das

Plasma (Blutserum inklusive Fibrinogen), da durch das darin enthaltene Fibrinogen das

Elektrophoresemuster häufig undeutlich wird. Nach dem Auftragen der Proben auf die

Acetatfolie wird an diese in einer feuchten Kammer eine konstante elektrische Gleichspannung

für die Trennzeit angelegt, in der die Proteine von der Auftragsstelle aus entsprechend ihrer

Ladung und damit ihrer elektrischen Beweglichkeit entlang einer Trennstrecke von der

Kathode (-) zur Anode (+) wandern (Abb.1).

Abb.1. Schematische Darstellung der Apparatur zur Serumelektrophorese

Aufgrund des Verhaltens bei der elektrophoretischen Trennung von Serumproteinen lassen

sich folgende Fraktionen einteilen:

Albumin

α1-Globuline

α2-Globuline

β-Globuline

-Globuline

Albumin läuft im elektrischen Feld am schnellsten, gefolgt von den α1, α2 und β-Globulinen; -

Globuline wandern besonders langsam (Abb.2).

Auftrags-Position für die Probe

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PROTEINBESTIMMUNG

Werden mehrere Seren parallel analysiert, ist es empfehlenswert, parallel zur Elektrophorese

eine Bestimmung des Gesamtproteingehaltes durchzuführen. Dies ermöglicht eine bessere

Einschätzung der relativen Abundanzen einzelner Proteinfraktionen, da die Summe der

abgebildeten Proteine immer bei 100% liegt.

Die Proteinbestimmung ist eine der am häufigsten durchgeführten Methoden in der

biochemischen Forschung. Es existieren eine Reihe verschiedener Methoden zur Bestimmung

der Proteinkonzentration. Diese unterscheiden sich hinsichtlich Sensitivität und Störanfälligkeit.

Man unterscheidet grundsätzlich die Absorptionsspektroskopie, bei der die Absorption der

Proteinlösung direkt gemessen wird, von kolorimetrischen Methoden, bei denen die Verfärbung

der Proteinlösung nach Zugabe bestimmter Farbstoffe gemessen wird. Zu den gängigsten

kolorimetrischen Methoden gehören die Biuret-Methode, die Bradford-Methode und die BCA-

Methode. Letztere Methode zeichnet sich durch eine einfache Durchführung, hohe Sensitivität

und geringe Störanfälligkeit aus, weshalb sie für die Proteinbestimmung von komplexen

Mischungen (wie z.B. Serum) gut geeignet ist.

Das Prinzip des hier verwendeten BCA-Assays beruht auf der Bildung von Cu2+-

Proteinkomplexen unter basischen Bedingungen. Im Anschluss erfolgt die Reduktion des Cu2+

zu Cu1+, dessen Konzentration direkt proportional zur Proteinkonzentration ist. BCA

(Bicinchoninic acid) bildet mit Cu1+ einen violett-blauen Komplex, der spektrometrisch bei 562

nm detektiert werden kann.

Das Prinzip des BCA-Assays soll im Rahmen dieses Praktikums durch die Messung zweier

Standard-Proteinlösungen demonstriert werden. Diese Standardproteine werden anschließend

zusammen mit den Seren elektrophoretisch aufgetrennt.

DENSITOMETRIE

Nachdem die Serumproteine elektrophoretisch aufgetrennt wurden, ist zur Krankheitsdiagnose

fast immer eine quantitative Auswertung der gefärbten Proteine notwendig. Hierzu werden

Densitometer eingesetzt, deren Funktionsweise mit der des Photometers vergleichbar ist.

Computerunterstützt wird mit einem Scanner eine bewegliche Lichtquelle über die Acetatfolie

geführt und die Absorption an jeder Stelle der Acetatfolie gemessen. Resultierend hieraus erhält

man eine Kurve der Extinktion lg(I0/I) über die Folienlänge, wobei I0 die eingestrahlte Intensität

und I die am Detektor gemessene Intensität darstellt (Abb.2).

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Abb.2: Angefärbte Celluloseacetatfolie nach erfolgter Elektrophorese (unten) und die

densitometrische Auswertung (oben). (Modifiziert nach Schmidt und Thews, 27. Auflage)

Nach dem Lambert Beerschen Gesetz nimmt die Extinktion einer verdünnten Lösung linear

zur Konzentration zu. Bei der Densitometrie von elektrophoretisch getrennten Proteinbanden

stimmt dieser Zusammenhang aber nicht mehr, da dort die Proteinkonzentration sehr hoch ist

und die Färbung in eine Sättigung übergeht, so dass über bestimmten Absorptionswerten

hyperbolische oder sigmoidale Abhängigkeiten beobachtet werden. Dazu trägt bei, dass

während der Färbung starken Banden in der Folienumgebung relativ weniger Farbstoff zur

Verfügung steht als schwachen Banden, die eine für sie maximale Menge an Farbstoff binden

können. Daher werden schwache Banden in ihrer Menge oft überschätzt und große

Proteinmengen unterschätzt.

Die Auswertung der gescannten Proteinbanden erfolgt nach Kalibrieren der Geräte mittels

photographischer Graukeile über die Proportionalität der Proteinkonzentration und der

Bandenintensität. Derartige Auswertungen erfolgen heute praktisch ausschließlich

computerunterstützt, wobei spezialisierte Softwarepakete die Subtraktion der

Hintergrundfärbung, die Bandenerkennung, Quantifizierung und die Dokumentation

übernehmen. Auch für den Vergleich von Mehrfachbestimmungen ein und derselben Probe

auf unterschiedlichen Folien, zwischen denen immer kleine Unterschiede und Verzerrungen

existieren, kann diese Software genutzt werden. Die Qualität der Resultate hängt aber

weitgehend von der Qualität der Folien ab und manuelle Nachbearbeitungen vor allem bei der

Bandenerkennung sind heute noch unerlässlich.

Auftrags-Position für die Probe

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PATHOBIOCHEMIE

Eine Abweichung des Profils der einzelnen Plasmaproteinfraktionen von der Norm ist ein

diagnostisches Merkmal unterschiedlicher Erkrankungen, die unter dem Begriff der

Pathoproteinämien zusammengefasst werden (vgl. Abb.3). Diese Bezeichnung umfasst im

einzelnen Dys-, Defekt- und Paraproteinämien.

Abb.3. Densitogramme von Blutseren unterschiedlicher Pathoproteinämien

Bei Dysproteinämien ist die Menge einzelner Plasmaproteinfraktionen erhöht oder erniedrigt.

In Abhängigkeit von der betroffenen Fraktion unterscheidet man den α-, α2-β, β- sowie den -

Typ. Der α-Typ ist meist durch akute Entzündungen verursacht und weist sich durch eine

Verminderung der Albumine einhergehend mit einer Erhöhung der α1- und β2-Globuline aus.

Die -Fraktion ist häufig erhöht, kann aber auch Normalwerte aufweisen.

Wie beim α-Typ liegt auch beim α2-β-Typ – wie z.B. beim nephrotischen Syndrom - eine

Verminderung der Albumine vor. Sehr stark erhöht sind die α2-Globuline, die β-Globuline sind

ebenfalls deutlich vermehrt. Die -Globuline sind meist vermindert, können aber auch normal

oder erhöht vorliegen.

Der β-Typ - die Vermehrung der β-Fraktion - kommt sehr selten vor.

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Chronische Entzündungen, Hepatitis oder auch Leberzirrhose sind durch eine -

Dysproteinämie gekennzeichnet. Hierbei sind die Albumine vermindert, die -Globuline

hingegen vermehrt. Durch die Vermehrung der IgG-, aber auch der IgA- und IgM-Globuline,

erscheint die gesamte -Bande verstärkt.

Defektproteinämien sind durch den genetischen Mangel einzelner Proteine gekennzeichnet.

Resultierend aus diesem Defekt kommt es zum Fehlen einzelner Fraktionen des Blutserums.

Ein Vertreter dieser sehr seltenen Erkrankungen ist die Agammaglobulinämie, die auch als

Antikörpermangelsyndrom bezeichnet wird. Dieser X-chromosomal gekoppelten Erkrankung

liegen einzelne Mutationen zugrunde, die eine Reifung von B-Zellen zu Antikörper-

produzierenden Zellen verhindern. Dies hat das Fehlen von Immunglobulinen zur Folge.

Im Gegensatz zur den beschriebenen Defektproteinämienen kommt es bei den

Paraproteinämienen zu einer drastischen Vermehrung einheitlicher Immunglobuline. Im Falle

des multiplen Myeloms (Plasmocytom) führen maligne Plasmazellen zu einer Überproduktion

monoklonaler Immunglobuline. In der Serumelekrophorese äußert sich diese Erkrankung in

Form einer schmalbasigen, hochaufstrebenden Bande (Peak).

ZIELSETZUNG DER EXPERIMENTE

Zahlreiche Erkrankungen sind anhand quantitativ unterschiedlicher Zusammensetzungen der

Serumproteine mittels der Serumelektrophorese zu diagnostizieren. Eine derartige Diagnose

soll im Rahmen der Versuche anhand von Normal- und pathologischen Seren mit der

Celluloseacetat-Folien-Elektrophorese und anschließender densitographischer Auswertung

und Vergleich der Proteinbanden mit zwei Standard-Serumproteinen erfolgen.

Die Densitogramme der unterschiedlichen Seren sollen in der Gruppe verglichen und mögliche

Ursachen für deren Abweichungen von der Norm diskutiert werden.

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VERSUCHSDURCHFÜHRUNG UND VERSUCHSPROTOKOLL

Um einen Vergleich der relativen Abundanzen relevanter Serumproteine zu ermöglichen, sollen

zwei Standards pro Bankreihe (ein Standard pro Gruppe) aufgetrennt werden. Dabei handelt es

sich um Albumin und -Globuline. Die Konzentration von Albumin im Serum von gesunden

Menschen liegt bei etwa 35-50 g/l, während die Konzentration der -Globuline mit etwa 8-18 g/l

deutlich niedriger ist.

Da die Konzentration der hier verwendeten Standardlösungen nicht bekannt ist, soll zunächst

eine Proteinbestimmung erfolgen.

Für die Proteinbestimmung werden Reagenz A und Reagenz B gemischt (Farbreagenz). Der

Standard mit unbekannter Proteinkonzentration wird 1:100 in PBS-Puffer1 verdünnt. 50 µl der

verdünnten Standard-Lösung werden mit 1 ml des Farbreagenzes vermischt und für 15

Minuten bei 60°C inkubiert. Als Leerwert für die photometrische Messung werden 50 µl PBS-

Puffer mit 1 ml des Farbreagenzes vermischt und ebenfalls für 15 Minuten bei 60°C inkubiert.

Anschließend werden die Proben in Küvetten überführt. Das Photometer wird mit dem

Leerwert auf null geeicht. Anschließend werden die beiden Standardproben bei 562 nm

gemessen.

Die Proteinkonzentration wird durch das Lambert-Beer-Gesetz ermittelt:

A = ε Percent ∙ c ∙ d

A = Absorption

εPercent = Prozentualer Extinktionskoeffizient [100 ml . g-1 . cm-1], hier 19 (100 ml . g-1 . cm-1)

d = Schichtdicke der Küvette [cm], hier 1 cm

c = Konzentration (g/100 ml)

Achtung!!! Verdünnung der Proteinlösung nicht vergessen!

Nachdem die Konzentration der Standard-Lösung ermittelt wurde, erfolgt die Einstellung der

Konzentrationen durch Verdünnung mit PBS1 (40 g/l für BSA und -Globuline).

Anschließend wird der Standard in das Well rechts neben die Serumproben gefüllt (20 µl).

1 PBS: Phosphate-buffered saline

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ELEKTROPHORESE

Die Elektrodenräume des Elektrophorese Gefäßes werden mit je etwa 400 ml ATX-Puffer2 bis

zur Markierung gefüllt. Die restlichen 100 ml werden in eine Plastikschale gefüllt, wo sie zum

Befeuchten der Folien dienen. Die Folien, von denen jede zum Auftragen von 3 Proben

geeignet ist, können im trockenen Zustand mit Kugelschreiber beschriftet werden. Die Streifen

werden flach auf die Oberfläche des restlichen Puffers in die Glasschale fallen gelassen und

erst bei vollständiger Benetzung vorsichtig untergetaucht. Nach etwa 5 min werden die

Membranen wieder aus der Lösung genommen und zwischen zwei Filterpapierstreifen von

überschüssiger Flüssigkeit befreit. Die Folien dürfen dabei weder gepresst werden noch

austrocknen. Mit der Pinzette (!) werden sie anschließend so in die Streifenträger eingesetzt,

dass die Stifte der Folienhalterung in die Perforationslöcher der Folie greifen und die

Streifenenden in die Pufferlösungen eintauchen. Diese zuletzt genannten Handgriffe vom

Ablöschen der Folien an müssen rasch durchgeführt werden, damit die Streifen nicht wieder

trocknen, was durch das Auftreten weißer Flecken angezeigt wird.

Die aufzutrennenden Proteingemische liegen in einer Füllkammer mit verschiedenen Wells

vor. Durch Eintauchen des Mikroauftragestempels in die gefüllten Wells wird eine geringe, je

nach Stempelgröße definierte Menge der Lösung aufgenommen und kurz auf die Folie fallen

lassen überstempelt. Zwischen den einzelnen Auftragungen ist der Stempel mit Aqua dest.

(Spritzflasche) zu reinigen und durch Auftupfen auf Filterpapier abzutrocknen. Zur

Verminderung der Diffusion sollen die Proben in rascher Folge aufgetragen werden. Nach dem

Entfernen der Auftragsbrücke und dem Aufsetzen des Deckels wird an das Gerät für 20

Minuten eine Spannung von 220 Volt gelegt.

Nach Beendigung der Elektrophorese werden die Folien sofort für 7 Minuten in die

Färbelösung gelegt. Ein Übereinanderliegen der Folien sollte durch die Wahl einer

entsprechend großen Schale vermieden werden. Nach der Färbung erfolgt unter leichtem

Schütteln die Inkubation in Entfärbelösung (2 Minuten). Zum völligen Entfärben der Folien wird

ein zweites anschließendes Entfärbebad genutzt.

Nachdem der Folienhintergrund völlig weiß ist, werden die Folien ½ -1 Minute in Klärlösung

getaucht. Danach werden diese luftblasenfrei auf einen Objektträger aufgezogen.

Überstehende Folienenden werden abgeschnitten und der Objektträger auf einer Heizplatte

(Stufe 6) so lange inkubiert, bis der Folienhintergrund durchsichtig ist.

2 Handelsname der Firma Biotec Fischer; ATX steht für „atoxisch“.

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AUSWERTUNG UND FEHLERDISKUSSION

Das Bandenmuster auf den Folien wird mittels eines Durchlichtscanners in digitale s/w Bilder

umgewandelt. Diese Dateien werden im Folgenden softwaregestützt densitometrisch

ausgewertet. Es erfolgt die Messung der Proben über die gesamte Laufstrecke. Das

Programm misst die Graufärbung der einzelnen Banden und stellt sie in einem Graphen dar.

Hohe Signale entsprechen dabei einer starken – niedrige Signale einer schwachen Färbung

bzw. Proteinkonzentration. Diesen Signalen sollen die entsprechenden Serumfraktionen

zugeordnet werden. Die Daten der einzelnen Gruppen sollen verglichen und Veränderungen

in der Zusammensetzung der Seren und deren mögliche Ursachen diskutiert werden.

SCHLUSSFOLGERUNGEN

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KURZANLEITUNG BEI CELLULOSEACETATMEMBRANEN/ FOLIE

Gruppennummer beachten!

1. ATX Puffer in die dazugehörige Plastikschalen füllen

2. Eine Celluloseacetatfolie beim Assistenten abholen.

3. Die Folie mit Kugelschreiber oberhalb der Perforation mit Gruppenkürzel beschriften

4. Folie in die Schale mit ATX-Puffer geben und vorsichtig mit der Pinzette untertauchen,

bis die Folie vollständig durchnäßt ist. Mindestens 20 min stehen lassen

5. Reagenz A und Reagenz B mischen (Farbreagenz)

6. 5µl der Proteinstandardlösung in einem Eppi 1:100 mit PBS verdünnen

7. 50 µl der verdünnten Proteinstandardlösung mit 1 ml des in Schritt 1 angesetzten

Farbreagenzes mischen

8. 50 µl PBS-Puffer in einem Eppi mit 1 ml Farbreagenz versetzen (Leerwert)

9. Die zwei Proben für 15 min bei 60°C im Heizblock inkubieren

10. Proben kurz abkühlen lassen

11. Proben in Küvetten überführen

12. Photometer mit Leerwertprobe (PBS + Reagenz) auf null eichen (562 nm)

13. Probe messen

14. Konzentration berechnen 1. Schritt (wie im Skript angegeben)

Weitere Rechenschritte:

2. Schritt:

C(gewollt) * V (gewollt) = C(gemessen) * V (benötigt)

3.Schritt:

V(benötigt) + y µl PBS = 20 µl

15. Proteinstandard (unverdünnt) mit PBS verdünnen (Zielkonzentration ist 40 mg/ml)

16. 20 µl dieses Proteinstandards in das Well rechts neben den vorgelegten Serumproben

pipettieren (Gruppennummer beachten)

17. Folie zwischen zwei Filterstreifen legen und von der überschüssigen Flüssigkeit

befreien. Achtung, die Folie darf dabei nicht austrocknen (dies erkennt man daran, dass

eine weiße Oberfläche entsteht). Ansonsten Schritt 4 wiederholen

18. Folie mit der Pinzette in der Halterung des Streifenträgers befestigen und in die

Elektrophoresekammer einsetzen. Wichtig: die Enden der Folie müssen in den Puffer

eingetaucht sein

19. Der Mikroauftragestempel, auch Auftragebrücke genannt, wird nun in die Füllkammer

aufgesetzt und wieder herausgezogen, dabei bleibt circa 1µl der Probe am Kamm

hängen

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20. Nun wird der Kamm auf die in der Elektrophoresekammer befindliche Folie

fallengelassen (mittleres Einschubraster)

21. Elektrophoresekammer mit dem Deckel verschließen (Pole beachten!!)

Anmerkung: Serum ist negativ geladen und fließt zur Anode (+-Pol)

22. Über einen Zeitraum von 20 min wird eine Spannung von 220 V, ca. 6 mA angelegt

und die Serumbestandteile können sich im elektrischen Feld auftrennen

23. Färben der Folie: Folie für 7 min in die Färbelösung legen

24. Entfärben der Folie: Folie für 2 min ins Endfärbebad legen, bis der Folienhintergrund

wieder weiß ist. Falls nötig den Vorgang wiederholen

25. Klärlösung: Folie 1 min in die Klärlösung tauchen

26. Folie luftblasenfrei mit dem Folienroller auf den Objektträger ziehen

27. Überstehende Enden abschneiden

28. Objektträger solange auf die Heizplatte (Stufe 6) legen, bis der Hintergrund der

Membran wieder durchsichtig ist (Schutzbrille tragen, dauert ca. 3 min)

29. Objektträger abkühlen lassen

30. Gruppennummer unten auf den Objektträger links mit Edding schreiben

31. Zum Scanner gehen und dem Assistenten geben

32. Scanergebnisse werden im Seminar besprochen

Anmerkung: Färbelösung in den Färbeschalen bitte nicht wegschütten, alle anderen

Lösungen werden aus den Schalen entsorgt.