61
PROTEOMICA PROTEOOM = alle proteïnen die tot expressie worden gebracht door het genoom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof op een bepaald ogenblik Tweedimensionele electroforese (Tweedimensionele chromatografie) Massaspectrometrie Technieken

PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

PROTEOMICA

PROTEOOM = alle proteïnen die tot expressie worden gebracht door

het genoom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof op een bepaald ogenblik

Tweedimensionele electroforese

(Tweedimensionele chromatografie)

Massaspectrometrie

Technieken

Page 2: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

2-D gel electrophoresis

(1) charge

(2)

size

Proteinmixture

Protein separation according to :

Page 3: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

HART “mastergel”

German Heart Institute Berlin (2002)

Page 4: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Controle Rat serum

Acute ontsteking(turpentine)

E. Gianazza (2002)

Page 5: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

ionenbron

massa analyzer

detector

vacuüm

Massaspectrometer

Iontrap

Electrospray (ESI)

Page 6: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 7: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

iontrap

Page 8: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

ionenbron

iontrap + helium

1- 4 kV

electrospray

Page 9: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 10: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 11: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 12: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 13: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

mz

Page 14: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Onze strategie

Scheiding van eiwitmengsel dmv 2DE gelspot optimaal slechts 1 eiwit

eiwit in gel trypsine-behandeling specifieke knipplaatsen

[het maximaal aantal eiwitstukjes (= peptiden) is voorspelbaar]

[hoe groter het eiwit, des te meer peptiden ] complex mengsel

Verdere scheiding van peptidenmengsel dmv chromatografie

trypsine

peptiden A B C D E F G

eiwit

Chromatografie

A E B F G C massa-spectrometer

peptiden-mengsel

Stroomrichting over chromatografiekolom

ruwe data

Page 15: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

intensiteit

m/z

massaspectrum van de kolomuitstroom is weliswaar minder complex maar blijft toch nog te complex voor de massaspectrometer:

Kan wel alle ionen die op een bepaald ogenblik uit de kolom stromen “wegen”, maar kan er geen verdere “sequentieinformatie” uithalen, behalve uit de drie meest intense ionen (instrumentele beperking er gaat mogelijks veel informatie verloren)

Sequentieinformatie wordt bekomen dmv fragmentatie van het peptide C ion het bekomen massaspectrum noemt men een fragmentatiespectrum

Per full scan spectrum krijgen we maximaal 3 fragmentatiespectra (volledige cycle time: ca 1.5 sec)

Fictief massaspectrum op ogenblik dat peptide Cuit de kolom stroomt

“gewicht” van peptide C

(full scan spectrum)

Page 16: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Peptide sequentiebepaling met MS/MS

NH2 COOH

C-R-I-S-T-A

C-R-I-S-T-A-L

C-R-I-SC-R-I

C-R-I-S-T

C-RC

S-T-A-LI-S-T-A-L

T-A-L A-L

R-I-S-T-A-LC-R-I-S-T-A-L

L

b-ionen y-ionenm/z

763.67

104.01 660.67260.11 504.57

373.20 391.49

460.23 304.45

561.27 202.98

632.31 131.94

MS/MS

Page 17: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Sequentie-ionen

P. Roepstorff & J. Fohlman, Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)

Page 18: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

chromatogram

een parent-ion(één van de vele)

m/z = 806.8 z = 2+

(806.8 * 2)-2=1611.2 Damassa neutraal peptide

Page 19: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Parentm/z = 806.8

MS/MS spectrum

y3

y4

y5

y6

y7

y8

y9

y10 y11

y12

Page 20: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

m/z 1386.4 1271.5 1157.4 971.4 856.2 769.4 670.2 569.1 482.3 381.0

m/z 

114.9115.03

114.1114.04

186.0186.08

115.2115.03

86.887.03

99.299.07

101.1101.05

86.887.03

101.3101.05

      

    

        

    

    

    

    

   

sequentie D N W D S V T S T

 

Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr

RHFWQQDEPP QSPWDRVKDL ATVYVDVLKD SGRDYVSQFE GSALGKQLNL

KLLDNWDSVT STFSKLREQL GPVTQEFWDN LEKETEGLRQ EMSKDLEEVK

AKVQPYLDDF QKKWQEEMEL YRQKVEPLRA ELQEGARQKL HELQEKLSPL

GEEMRDRARA HVDALRTHLA PYSDELRQRL AARLEALKEN GGARLAEYHA

KATEHLSTLS EKAKPALEDL RQGLLPVLES FKVSFLSALE EYTKKLNTQ

Apolipoproteïne A1

Page 21: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

b) Dataverwerking

1 ruwe datafile per analyse (per gel spot)

a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1)

Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentaitiespectra)

dta-file format (alleen fragmentatiespectra)

Mascot Sequest

Rapport 1 Rapport 2

(. dat file) (.out file)

search

Page 22: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Van ruwe data tot identificatie van eiwit

Page 23: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 24: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 25: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 26: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Welke ruwe datafile moet er verwerkt worden ?

Page 27: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Ruwe datafile (verzameling van full scan spectra en fragmentatiespectra)

omvormen naar een set bestaande uit enkel fragmentatiefiles = dta-format

( 1 fragmentatiespectrum = 1 dta.file)

Page 28: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 29: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 30: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

search-engine Mascot “publiek”: zonder licentie enkel te bevragenmet maximaal 300 dta.files

Page 31: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 32: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 33: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 34: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 35: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 36: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Na kopieren van merge programma (afkomstig van Mascot-website) in de juiste folder (hier peptide2975 met 299 dta files)wordt 1 grote tekst-file aangemaakt

Page 37: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Text-file aanbieden in Mascot

Page 38: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

invoeren van text-file

Welke databank ?

Hoe specifiek kan/moet de search zijn?

Page 39: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

... en na een 1-2 minuten...

Page 40: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 41: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 42: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 43: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 44: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 45: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 46: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 47: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 48: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 49: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Opnieuw dta-fles aanmaken :omdat a) minimizer had enkel de 300 meest intense fragmentatiespectra weerhouden en b) voor slechts een beperkt gebied van het chromatogram

nu verder werken met alle dta-files van het volledige chromatogram

Page 50: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 51: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 52: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 53: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

Alles wat hier ingevuld wordt, wordt weggeschreven in een parameter-file in de folderwaar ook de dta-files zich bevinden (vhpeptide2975)

Page 54: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 55: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 56: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 57: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 58: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 59: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof
Page 60: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

b) Dataverwerking

1 ruwe datafile per analyse (per gel spot)

a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1)

Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentatiespectra)

dta-file format (alleen fragmentatiespectra)

Mascot Sequest

Rapport 1 Rapport 2

(. dat file) (.out file)

search

(Sequest)

AutomatiserenMogelijk ?

In welke mate ?Op welke manier ?

Transparantie ?

Vraagstelling:

Page 61: PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof

.dat file en .out file: twee rapporten-> 1 rapport

DTAselect software bruikbaar om één rapport te maken (HTML file en een text file als output)

? Kunnen we DTAselect rapport makkelijker manipuleerbaar maken (bv. verwijderen van items en de counter aanpassen,... )

? Kunnen we DTAselect rapport publicatie-vriendelijk maken

? Automatiseren van download van databanken en extractie van subdatabanken met automatische logboekregistratie (download datum, versie, aantal items per databank)

? Kan Sequest-search vlotter verlopen (geïndexeerde databanken?)

[Validatie van identificaties (dmv Lutefisk de novo sequentie-software): belangrijk voor identificaties gebaseerd op slechts één peptide]

[Info vervat in full scan spectra]

Nauw hierbij aansluitend:

Andere vraagstellingen: