PROTEOMICSPROTEOMICS

Yirminci yYirminci yüüzyzyıılda bilimsel lda bilimsel kekeşşiflerin baiflerin başş ddööndndüürrüüccüüilerleyiilerleyişşi gi güünlnlüük k yayaşşamlaramlarıımmııza da za da öönemli nemli etkiler yaptetkiler yaptııEndEndüüstrilestrileşşmimişş üülkelerde lkelerde ggöörrüülen hayat beklentisi len hayat beklentisi ve yave yaşşam kalitesindeki am kalitesindeki artartışış ttııp ve biyolojik p ve biyolojik biimlerdekibiimlerdeki kekeşşiflerle iflerle babağğlantlantııllııddıır r

Yirminci yYirminci yüüzyzyııllıın ban başışında,tnda,tııp ve biyoloji p ve biyoloji makroskopikmakroskopik fenomenleri anlamayfenomenleri anlamayııamaamaççlayan tanlayan tanıımlaymlayııccıı bilimlerdi bilimlerdi YYüüzyzyııllıın bitin bitişşiyle birlikte, bu bilimler iyle birlikte, bu bilimler yayaşşamlaramlarıımmıızdaki biyolojik szdaki biyolojik süürereççlerde lerde etkileri daha etkileri daha ççok anlaok anlaşışılan lan mikroskopikmikroskopik ve ve nanoskopiknanoskopik ddüünyalara girinyalara girişş yaptyaptıılar lar Yeni binyYeni binyııllıın don doğğuuşşu u genomikgenomik bilginin de bilginin de ççok fazla birikmesiyle birlikte, karmaok fazla birikmesiyle birlikte, karmaşışık k ççokgenli hastalokgenli hastalııklarklarıın ve sistem n ve sistem biyolojisinin anlabiyolojisinin anlaşışılmaslmasıı iiççin yeni bir in yeni bir paradigmayparadigmayıı ggüündeme getirmindeme getirmişştir.tir.

YYüüzyzyııllıın son n son ççeyreeyreğğinde bazinde bazıı bilim bilim adamlaradamlarıınnıın DNA sekans dizisinin n DNA sekans dizisinin ççııkarkarıılabilecelabileceğğini ini ööngngöörmesiyle yeni bir rmesiyle yeni bir ççaağğ babaşşladladıı..Teknolojinin geliTeknolojinin gelişşmesi ve yeni aramesi ve yeni araççlarlarıın n kekeşşfiyle genom fiyle genom ççalalışışmalarmalarıı bbüüyyüük bir hk bir hıız z kazandkazandıı..

ÖÖzellikle, bzellikle, büüyyüük genomlark genomlarıın daha uygun n daha uygun ssüürelerde relerde sekanslamassekanslamasıınnıı yapabilmek iyapabilmek iççin in araaraçç ve gereve gereççler geliler gelişştirildi(tirildi(DovichiDovichi,1997). ,1997). Bu araBu araçç ve gereve gereççler, biyolojiyi ve ler, biyolojiyi ve hastalhastalııklarklarıı daha iyi anlamamdaha iyi anlamamıızzıısasağğlayacak kapsamllayacak kapsamlıı yaklayaklaşışımlarmlarıın n iskeletini oluiskeletini oluşşturmamturmamıızzıı sasağğladladııDaha da Daha da öönemlisi biyolojik snemlisi biyolojik süürereççlerin lerin sadece sadece genomikgenomik sekanslamaylasekanslamaylaçöçözzüülemeyecelemeyeceğği i ççok kok kıısa bir ssa bir süürede rede anlaanlaşışıldldıı

Daha sonra bakDaha sonra bakışışlar RNA ekspresyon lar RNA ekspresyon seviyelerine seviyelerine ççevrildi.evrildi.RibonRibonüükleikkleik asitinasitin ekspresyon seviyelerinin ekspresyon seviyelerinin kantitatif analizlerinin hkantitatif analizlerinin hıızlzlıı bir bir şşekilde ekilde yapyapıılmaslmasıınnıı sasağğlayacak olan bir dizi aralayacak olan bir dizi araççkullankullanııma sokulmuma sokulmuşştur. tur. DNA/RNA DNA/RNA arrayarray teknolojisinin ve gen teknolojisinin ve gen ekspresyonunun seri analizi (SAGE) ekspresyonunun seri analizi (SAGE) ninninortaya ortaya ççııkkışıışı RNA RNA altbirimlerininaltbirimlerinin ve ve tamamtamamıınnıın kantitatif ekspresyon n kantitatif ekspresyon profillerinin elde edilmesini profillerinin elde edilmesini kolaylakolaylaşşttıırmrmışışttıır. r.

Bu teknikler kullanBu teknikler kullanıılarak farkllarak farklıı RNA RNA ekspresyon profilleri elde edilebileceekspresyon profilleri elde edilebileceğği gibi, i gibi, hhüücreler farklcreler farklıı bir durumdayken ya da farklbir durumdayken ya da farklııhhüücreler karcreler karşışılalaşşttıırrııllıırken genlerin rken genlerin upup ya da ya da downdown regregüülele edildikleri tespit edilebilir. edildikleri tespit edilebilir. RNA RNA ççalalışışmalarmalarııyla inanyla inanıılmaz blmaz büüyyüüklklüükte kte bilgi ortaya bilgi ortaya ççııkarkarıılmlmışışttıır. r.

Bununla birlikte, RNA ekspresyonunun tek Bununla birlikte, RNA ekspresyonunun tek babaşışına gen ina gen işşlevlerini ve biyolojik levlerini ve biyolojik prosesleri aprosesleri aççııklamakta yetersiz olduklamakta yetersiz olduğğu u ortaya ortaya ççııktktııRNA ekspresyonunun protein seviyesinde RNA ekspresyonunun protein seviyesinde meydana gelen demeydana gelen değğiişşikliklerle zayikliklerle zayııf bir f bir dodoğğrusal ilirusal ilişşkiye sahip oldukiye sahip olduğğu farklu farklııççalalışışma gruplarma gruplarıı taraftarafıından elde edilen ndan elde edilen kankanııtlarla ortaya konurken tlarla ortaya konurken

Maya genomu Maya genomu üüzerinde yeni yapzerinde yeni yapıılmlmışışgenigenişş ööllççekli bir ekli bir ççalalışışma DNA ma DNA chipchipsonusonuççlarlarıı ve protein ve protein ekpresyonlarekpresyonlarııarasarasıında zaynda zayııf bir ilif bir ilişşki bulunduki bulunduğğunu unu aaççııkkçça ga gööstermistermişştir. tir. Bu Bu ççalalışışmada,bir genle bamada,bir genle bağğlantlantııllıı olan olan protein protein sevitesindesevitesinde öönemli derecedeki nemli derecedeki dedeğğiişşim, RNA ekspresyon seviyesinde bir im, RNA ekspresyon seviyesinde bir dedeğğiişşim olmadan genim olmadan gen--altucundakialtucundaki ((downdown--streamstream) reg) regüülasyon mekanizmalarlasyon mekanizmalarııyla yla gergerççekleekleşştirilebilecetirilebileceğği bulunmui bulunmuşştur.tur.

Protein Protein ççalalışışmalarmalarıı, k, kıısmen proteinin smen proteinin yapyapııssıınnıı kesin ve kolay bir kesin ve kolay bir şşekilde ekilde tantanıımlayacak olan mlayacak olan metodlarmetodlarıınneksiklieksikliğğinden dolayinden dolayıı her zaman kher zaman küçüüçük k ööllççeklerde yapeklerde yapıılmlmışışttıır r 2 boyutlu jel 2 boyutlu jel elektroforezielektroforezi tipik olarak tipik olarak proteomikproteomik ççalalışışmalarmalarıında profil nda profil ççııkartmak kartmak iiççin kullanin kullanııllıır, ve bu yr, ve bu yööntemin en ntemin en öönemli nemli iişşlevi farkllevi farklıı kokoşşullarda ifade edilen ullarda ifade edilen proteinlerin farklproteinlerin farklıı ggöösterimleridir sterimleridir

HalihazHalihazıırda kullanrda kullanıılan protein lan protein ekstraksiyonekstraksiyonprotokolleri tprotokolleri tüüm biyolojik m biyolojik öörneklerin rneklerin hepsine uygulanamamaktadhepsine uygulanamamaktadıır, ve r, ve ekstrakteekstrakte edilmiedilmişş olan olan proteomdakiproteomdakiproteinin gproteinin göösterilebilmesi anlamsterilebilmesi anlamıında da nda da ssıınnıırlrlııllııklarklarıı vardvardıır r HidrofobikHidrofobik proteinler kolaylproteinler kolaylııkla kla ekstrakteekstrakteedilemez ve 2D jel edilemez ve 2D jel üüzerinde gzerinde göösterilemez sterilemez Bir Bir proteomdaproteomda beklenen proteinlerin beklenen proteinlerin öönemli bir miktarnemli bir miktarıı hidrofobiktirhidrofobiktir

2D 2D elektroforezielektroforezi ve kve küütle spektrometresi ile tle spektrometresi ile tantanıımlanan proteinlerden elde edilen bilgi mlanan proteinlerden elde edilen bilgi öönemli miktarda nemli miktarda hidrofobikhidrofobik proteinin eksik proteinin eksik olduolduğğunu gunu gööstermektedir. stermektedir. Son ySon yııllarda, llarda, RabilloutRabillout ve grubunun ve grubunun öönemli nemli ççabalarabalarıı hidrofobikhidrofobik proteinlerin tekrar proteinlerin tekrar eldesieldesi (geri kazan(geri kazanıımmıı) i) iççin kullanin kullanıılabilecek labilecek geligelişştirilmitirilmişş kimyasallar ve protokoller kimyasallar ve protokoller sasağğlamlamışışttıır r Buna raBuna rağğmen, men, proteomikproteomik ççalalışışmalarmalarıında nda hidrofobikhidrofobik proteinlerin proteinlerin ekstraksiyonuekstraksiyonu halen halen öönemli bir hedeftir.nemli bir hedeftir.

ProteomProteom ççalalışışmalarmalarıında nda öözellikle her biri zellikle her biri kendi kendi proteomunaproteomuna sahip, farklsahip, farklıı safhalarda safhalarda bulunan birbulunan birççok farklok farklıı hhüücreden olucreden oluşşan an dokularla dokularla ççalalışıışıldldığıığında problemler ortaya nda problemler ortaya ççııkmaktadkmaktadıır.r.Doku parDoku parççalaralarıınnıın n lizelize edilmesi sonucunda edilmesi sonucunda bir bir proteomproteom ççorbasorbasıı meydana gelir.meydana gelir.Bu sorunu bertaraf etmek iBu sorunu bertaraf etmek iççin hin hüücre cre kküültltüürrüüyle yle ççalalışıışılmaya balmaya başşlanmlanmışışttıır.r.

Bitki, hayvan ve klinik Bitki, hayvan ve klinik öörneklerden de rneklerden de proteomikproteomik ççalalışışmlarmlarıı yapyapıılmlmışışttıır.r.Dokulardan elde edilen hDokulardan elde edilen hüücrelerin crelerin fraksiyonlara ayrfraksiyonlara ayrıılmaslmasıı proteomunproteomunkarmakarmaşışıklklığıığınnıı azaltazaltıır.r.

Belli hBelli hüücre tiplerine cre tiplerine öözgzgüü immobilizeimmobilizeantibadilerantibadiler kullankullanıılarak, larak, proteomikproteomikççalalışışmalarmalarıı iiççin hin hüücre cre populasyonlarpopulasyonlarıınnııayayııracak racak immimmüünomagnetiknomagnetik teknikler teknikler kekeşşfedilmifedilmişştir. tir.

İİki boyutlu Jel ki boyutlu Jel ElektroforeziyleElektroforeziyleProtein AyrProtein Ayrışışttıırrıılmaslmasıı

ProteomlarProteomlarıınn bazbazıılarlarıı, di, diğğerleri binlerce erleri binlerce protein taprotein taşışırken , birkarken , birkaçç yyüüz ya da daha az z ya da daha az protein taprotein taşışıyan gyan gööreceli olarak daha kreceli olarak daha küçüüçük k proteomlardproteomlardıırr. . ProteomicsProteomics ççalalışışmalarmalarıında, 2D jel nda, 2D jel elektroforezindeelektroforezinde en sen sıık yapk yapıılan lan şşey, birinci ey, birinci boyutta proteinleri boyutta proteinleri pIpI larlarıınana ggööre daha re daha sonra da ikinci boyutta sonra da ikinci boyutta MAMA’’larlarıınana ggööre re ayayıırmaktrmaktıır r

AAççııkkççasasıı, , pIpI ve MA bazve MA bazıında aynda ayıırmanrmanıın n kombinasyonu yapkombinasyonu yapııldldığıığında donda doğğru bir ru bir ayayıırrıım vermekte ve bu durum 2D jel m vermekte ve bu durum 2D jel elektroforezininelektroforezinin eeşşsiz siz çöçözme(ayzme(ayıırma) rma) ggüüccüünnüü yansyansııtmaktadtmaktadıır. r. Her ne kadar 2D Her ne kadar 2D elektroforezelektroforez sistemi gsistemi güçüçllüübir ayrbir ayrışışttıırma teknirma tekniğği olsa da, bai olsa da, başşlanglangııççta ta oldukoldukçça kullana kullanışışssıızdzdıı8080’’lerin ortalarlerin ortalarıında nda immobilizeimmobilize pHpHgradiyentigradiyenti (IPG (IPG stripstrip) ortaya konarak bu ) ortaya konarak bu teknik ticari olarak kullanteknik ticari olarak kullanıılabilir hale geldi labilir hale geldi

19801980’’lerin ortalarlerin ortalarıında, nda, amfolitamfolit öözellikteki zellikteki akrilamidakrilamid monomerleriylemonomerleriyle akrilamidinakrilamidinddüüşşüük k ççapraz baapraz bağğlarla larla kopolimerlerizekopolimerlerizeedilmesiyle edilmesiyle pHpH gradiyentiningradiyentinin stabilize ve stabilize ve immobilizeimmobilize olabileceolabileceğği gi göörrüülmlmüüşşttüür r

Uygun bir IPG Uygun bir IPG şşerit elde edildierit elde edildiğğinde, inde, protein protein ekstraktekstraktıı ve yve yüükleme tamponu kleme tamponu karkarışıışımmıı bu bu şşeride yeride yüüklenir klenir ŞŞerit boyunca kerit boyunca küçüüçük bir elektrik akk bir elektrik akıımmıınnıın n verilmesi proteinlerin IPG verilmesi proteinlerin IPG şşeride eride transferini arttransferini artıırrıır r ŞŞerit tam olarak yerit tam olarak yüüklendiklendiğğinde, daha inde, daha bbüüyyüük bir alank bir alanıı IPG IPG şşeridi boyunca eridi boyunca uygulanuygulanıır r

Pozitif yPozitif yüüklenen proteinler katoda doklenen proteinler katoda doğğru ru hareket ederler ve hareket ederler ve pIpI’’larlarıınana ulaulaşşana kadar ana kadar artan artan pHpH’’lala karkarşışılalaşışırlar rlar Negatif yNegatif yüüklenen proteinler ise anoda klenen proteinler ise anoda dodoğğru hareket ederler ve ru hareket ederler ve pIpI’’larlarıınana ulaulaşşana ana kadar azalan kadar azalan pHpH’’aa maruz kalmaruz kalıırlar rlar Her bir protein kendilerine ait Her bir protein kendilerine ait pIpI’’larlarıındandaodaklanodaklanıırlar. rlar.

İİkiki--Boyutlu Jel Boyutlu Jel ElektroforeziyleElektroforeziyleAyrAyrıılmlmışış Proteinlerin TespitiProteinlerin Tespiti

Jel Jel elektroforeziyleelektroforeziyle ayrayrışışttıırrıılmlmışış proteinleri proteinleri ggöörrüüntntüülemek ilemek iççin yin yııllar boyu farklllar boyu farklıımetodlarmetodlar geligelişştirilmitirilmişştir. tir. Her ne kadar farklHer ne kadar farklıı kimyasallar kullankimyasallar kullanıılsa lsa da, kullanda, kullanıılan lan metodmetod ya birinci boyuttan ya birinci boyuttan sonra proteinlerin etiketlenmesini ya da sonra proteinlerin etiketlenmesini ya da ikinci boyuttan sonra proteinlerin ikinci boyuttan sonra proteinlerin etiketlenmesini ietiketlenmesini iççerir erir

2D jel 2D jel elektroforezindenelektroforezinden öönce nce gergerççekleekleşştirilen protein tirilen protein öönetiketlenmesinetiketlenmesissııklklııkla bkla büüyyüüme ortamme ortamıına na radyoizotopikradyoizotopikolarak etiketlenmiolarak etiketlenmişş amino asitlerin amino asitlerin eklenmesiyle gereklenmesiyle gerççekleekleşştirilir tirilir Proteinlerin Proteinlerin öönetiketlenmesindenetiketlenmesinde kullankullanıılan lan babaşşka bir yaklaka bir yaklaşışım m nnöötraltral kvalentkvalent babağğlanan lanan floresanfloresan boyalar kullanboyalar kullanıılmaslmasııddıır r

Bu boyalar 2D jel Bu boyalar 2D jel elektroforeziindenelektroforeziinden öönce nce proteinlere proteinlere kovalentkovalent olarak baolarak bağğlanlanıır r YYüüklklüü olmadolmadııklarklarıından dolayndan dolayıı, boyalar , boyalar proteinlerin proteinlerin izoelektrikizoelektrik noktalarnoktalarıınnıı minimal minimal bozmalarbozmalarıı avantajavantajıınnıı tataşışırlar rlar

Bununla birlikte, bu yaklaBununla birlikte, bu yaklaşışımmıın duyarln duyarlııllığıığıabsorpsiyonunabsorpsiyonun zayzayııflflığıığından dolayndan dolayıı kkööttüüetkilenmektedir etkilenmektedir

Yeni elde edilmiYeni elde edilmişş floresanfloresan boyalar 2D jel boyalar 2D jel elektroforeziyleelektroforeziyle ayrayrıılmlmışış proteinler iproteinler iççin in nanogram seviyesinde hassasiyet nanogram seviyesinde hassasiyet kazandkazandıırmrmışışttıır r Bu yaklaBu yaklaşışımmıın dezavantajn dezavantajıı ise bir ise bir floresanfloresantespit sisteminin ve her bir protein tespit sisteminin ve her bir protein lekesinin daha ileri prosesleri ilekesinin daha ileri prosesleri iççin in otomatizeotomatize edilmiedilmişş bir leke toplaybir leke toplayııccııya ya gerek duyulmasgerek duyulmasııddıır r

Proteinlerin Proteinlerin seperasyonseperasyon sonrassonrasıı tespiti,2Dtespiti,2D--jelde jelde ayrayrıılmlmışış proteinlerin gproteinlerin göörrüüntntüülenmesinde en lenmesinde en ççok ok tercih edilen yoldur tercih edilen yoldur ÖÖzellikle, kullanzellikle, kullanıımlarmlarıınnıın kolayln kolaylığıığı ve ve duyarlduyarlııllııklarklarıından dolayndan dolayıı koloidal koloidal komasikomasi boyama boyama ve gve güümmüüşş boyama tercih edilen boyama tercih edilen metodlardmetodlardıırrKoloidal Koloidal komasikomasi boyama genellikle 25 ila 50 boyama genellikle 25 ila 50 ngngcivarcivarıında proteinlerin tespitini sanda proteinlerin tespitini sağğlarken, glarken, güümmüüşşboyama 5ng seviyesindeki proteinlerin tespitine boyama 5ng seviyesindeki proteinlerin tespitine izin verir.izin verir.