Recolección y Obtención del frijol Garbancillo.

Se busca el frijol garbancillo, cuidadosamente se excavaban las raíces y se

colocan en bolsas de polietileno para transportarlas al laboratorio de

Microbiología. Al final de la recolección de las raíces se obtuvieron los nódulos.

Los nódulos seleccionados pasan por un lavado para su limpieza y esterilización

con: agua destilada hasta eliminar la tierra y lodo proveniente del cultivo, una

gota de lejía diluida en 1 litro de agua para lavarla y dejarla en reposo durante 3

minutos, lavarla con alcohol de 70° durante 1 minuto para su esterilización y

por ultimo enjuagar con agua destilada 3 veces.

Una vez lavados, se muelen los nódulos esterilizados en un mortero hasta formar

una pasta para luego ser sembradas en las placas Petri.

Identificación y aislamiento de la bacteria Rhizobium Sp.

Para poder identificar la bacteria Rhizobium Sp. se prepara el medio de cultivo

ELMARC, éste medio de cultivo contiene los nutrientes específicos para el crecimiento

y la reproducción de la bacteria; para la preparación del medio de cultivo se necesita: D

– manitol (10 gr/L), K2HPO4 (0.5 gr/L), MgSO4.7H2O (0.2 gr/L), NaCl (0.1 gr/L),

CaCO3 (3 gr/L), Extracto de Levadura (0.4 gr/L), Agar (15 gr/L), Rojo de congo (10 ml)

y Agua Destilada (1000 ml).

Después de pesar los nutrientes del medio, se calienta hasta disolverlo para luego ser

autclavado por un tiempo de 1.5 horas y a una temperatura de 120 °C para

posteriormente servirlo en placas Petri esterilizadas y dejarlo enfriar por un tiempo de

15 minutos.

El sembrado se realiza empleando una aza bacteriológica estéril haciendo un

estriado en placas Petri esterilizadas; dichas placas fueron llevadas a la

incubadora para el crecimiento de la bacteria, las condiciones de operación para

la incubación fueron de 25°C y por un tiempo de 48 horas; observando cada 12

horas si había un crecimiento bacteriológico para su posterior identificación de

la bacteria Rhizobium Sp.

Una vez observado el crecimiento bacteriológico se escogían las colonias más

puras para la identificación de la Rhizobium Sp. y se colocaron en unas

laminillas porta objetos para realizar la coloración o tinción de Gram. La tinción

de Gram es una técnica de laboratorio que se utiliza para diferenciar diferentes

grupos de bacterias para así poder estudiarlas y clasificarlas, la cual se aplica

para bacterias del tipo gran negativas como es la bacteria Rhizobium Sp.

Se coloca en el portaobjetos una gota de agua estéril y se extrajo una colonia con

la aza bacteriológica, luego se procedió a secar la muestra en la llama (flama) del

mechero sin que se haya efectuado un calentamiento excesivo. Posteriormente se

cubrió el área del frotis con violeta de genciana por un minuto, transcurrido el

minuto se lavó con agua destilada y se escurrió. Seguidamente se agregó lugol

por un minuto y se lavó con agua destilada. Se agregó alcohol etílico por 30

segundos y por último se cubrió con safranina durante cinco minutos y se lavó

con agua destilada y se dejó secar. Se observó al microscopio agregándole una

gota de aceite de inmersión.

.

Fig. 3.6.- Tinción de Gram para la identificación de Rhizobium Sp.

Fig. 3.7. Identidicación de la bacteria Rhizobium Sp. en el microscopio para su

aislamiento.

PREPARACIÓN DEL INÓCULO

La reproducción de la bacteria Rhizobium Sp. en el medio ELMARC se

encuentra en pH 6 - 7 ligeramente ácido y neutro; las condiciones de operación

para las pruebas de biodegradación se realizaron a pH 11 (básica), para ello se

acondiciono la bacteria aumentando periódicamente hasta llegar a 11.5.

Inicialmente se aumentó el pH de 7 a 8 agregándole 0.1 ml de hidróxido de

sodio al 10 % al medio de cultivo, se cultivó la bacteria en frascos esterilizados y

se llevó a incubar por 48 horas a 25 °C; transcurrido el tiempo se observó el

crecimiento microbiano, observando así la adaptación y reproducción de la

bacteria a las nuevas condiciones.

Posteriormente se aumenta el pH de 8 – 9 y de 9 -10 agregándole 0.2 y 0.3 ml de

hidróxido de sodio al 10 % al medio de cultivo, se cultivó la bacteria en frascos

esterilizados y se llevó a incubar por 48 horas a 25 °C; transcurrido el tiempo se

observó el crecimiento microbiano a pH 9 - 10, observando así la adaptación y

reproducción de la bacteria a las nuevas condiciones.

Continuando con la adaptación de la bacteria, al aumentar el pH de 10 – 11.5 se

observó que al término de 48 horas de incubación a 25 °C, la reproducción de la

bacteria fue lenta o nula. Esto se puede dar a múltiples factores, donde nos llevó

a una serie de interrogantes del porque no crecía la bacteria al pH que se

necesitaba; una de las posibles respuestas se dedujo después de hacer una prueba

en donde se volvió a preparar el medio de cultivo a pH 11.5, pero esta vez las

condiciones de incubación fueron distintas: 3 placas Petri fueron puestas en la

incubadora a 25 °C por un tiempo de 48 horas y 3 placas Petri se pusieron a

temperatura ambiente durante 48 horas. Al término de las 48 horas se pudo

observar que en las placas que se colocó en la incubadora no había una

reproducción microbiana; mientras que en las placas que se encontraban a

temperatura ambiente sí se observó una reproducción de la bacteria. Para

corroborar el crecimiento de la bacteria y que no esté contaminada se realizó una

tinción de Gram, donde efectivamente se pudo observar que el crecimiento de la

bacteria era uniforme y pura.

Una vez obtenida la bacteria a las condiciones requeridas, se procedió a la

reproducción de la biomasa. Para ello se preparó 1 litro del medio de cultivo en

frascos de pírex esterilizados y se realizó el sembrado de la bacteria en dichos

frascos. Después de realizar el sembrado se dejó a temperatura ambiente (25 °C)

por un tiempo de 3 semanas para su reproducción, paralelamente para la

reproducción de la bacteria se iba controlando cada 24 horas para ver que se

encuentre en un ambiente limpio y libre de una posible contaminación.

Una vez transcurrido las 3 semanas se observó una notable reproducción de la

bacteria que se encontraba pura y libre de una contaminación, para verificar que

la bacteria estaba pura se realizó una tinción de Gram, después de realizar dicha

tinción se comprobó efectivamente que las condiciones de la biomasa de la

bacteria eran adecuadas.

Conteo celular para la prueba de biodegradación de cianuro libre

Una vez obtenida la biomasa se procedió a preparar 100 ml de solución salina, se

agregó 3 ml de la solución en 9 tubos de ensayo de 10 x 150 mm y se introdujo

azadas de la bacteria en los tubos de ensayo para realizar el conteo celular; éste

procedimiento se realizó 3 veces ya que se necesitaba 9 tubos de ensayo con una

concentración bacteriana de 2 x 108 cel/ml para 24 horas, 9 tubos de ensayo de 4

x 108 cel/ml para 48 horas y 9 tubos de ensayo de 6 x 108 cel/ml para 72 horas.

Para realizar el conteo celular se llevaron las muestras de tubos de ensayo al

laboratorio escalabs, aquí se usó el equipo “Densimat Biomerieux”:

Preparación de la muestra y Agitación en el shaking incubator

Para la prueba de biodegradación de cianuro libre se contó con una solución

cianurada que tenía una concentración de 150 ppm de cianuro libre (CN-) y se

acondicionó a pH 11; para la primera prueba de biodegradación se usaron 9

matraces de 300 ml, en ellos se agregó 200 ml de solución cianurada,

posteriormente se agregó a 3 matraces una concentración de 2 x 108 cel/ml del

inóculo de la bacteria, a otros 3 matraces una concentración de 4 x 108 cel/ml y

por ultimo a 3 matraces una concentración de 6 x 108 cel/ml para colocarlos en

agitación en el shaking incubator por un tiempo de 24 horas y a temperatura de

25 °C y a 100 rpm , Este procedimiento se repitió para la agitación de 9 matraces

en un tiempo de 48 horas y 72 horas.

Para cada prueba se hizo un monitoreo del pH, cada 4 horas durante las primeras

12 horas, y después cada 12 horas. Para ver si disminuía el pH y evitar la

formación del gas cianhídrico (HCN) el cual se forma a partir de pH 9.5 a

menos, el cual es muy tóxico.

Muestras para el análisis volumétrico y espectrofotométrico

Las muestras que se sacaron para el análisis volumétrico (titulación de la

solución cianurada) fueron cada 8 horas; se sacaban los matraces que se

encontraban en el shaking incubator y se ponían en reposo por 5 minutos y se

extraían 10 ml de solución de cada uno y se regresaban a poner en agitación, de

la muestra que se obtenía se monitoreaba el pH y se filtraba con los filtros para

viales de 0.2 µm para obtener una solución libre de bacterias y evitar que sea un

interferente a la hora de la titulación debido a que se usa nitrato de plata para la

titulación; se agregaba 3 gotas de yoduro de potasio (indicador) y se titulaba con

nitrato de plata (N= 0,00147) hasta obtener un color verde limón; este

procedimiento se realizó para las 24, 48 y 72 horas a una concentración de 2 x

108 cel/ml, 4 x 108 cel/ml y 6 x 108 cel/ml.

Una vez obtenido los datos de los gastos de la titulación se procedió a calcular

los ppm de cianuro libre para cada muestra; a continuación se muestran los

resultados obtenidos por el método volumétrico para la biodegradación de

cianuro libre.