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PROTOCOLOS ACTUALES DE CONGELACIÓN: ¿QUÉ Y CÓMO CONGELAR?
María Teresa Cañete ReinaE.S.H.R.E. Senior Clinical EmbryologistEmbryocenter Sevilla
CRIOPRESERVACIÓN
-CONGELACIÓN DE GAMETOS Y EMBRIONES A MUY BAJA TEMPERATURA:-80ºC A -196ºC-DISMINUCIÓN FUNCIONES VITALES-CONDICIONES DE VIDA SUSPENDIDAS-REACCIONES BIOQUÍMICAS DETENIDAS
-CONGELACIÓN Y ALMACENAMIENTO
CONGELACIÓN
•LOS EMBRIONES NO TRANSFERIDOS para uso posterior por:-fallo de embarazo
-segundo hijo
•TODOS LOS EMBRIONES por: -condiciones maternales adversas.
INDICADA PARA:•RETRASO MATERNIDAD por causas laborales ó sociales
•PACIENTES ONCOLÓGICAS (quimioterapia ó radioterapia)
•PACIENTES NO ONCOLÓGICAS ( tratamientos gonadotóxicos)
•CIRUGÍA REPETITIVA EN EL OVARIO COMO ENDOMETRIOSIS
•BANCO DE ÓVULOS
•POSPONER TRANSFERENCIA POR:
-RIESGO DE SHO-APARICIÓN PÓLIPOS ENDOMETRIALES-HIDROSÁLPINX-AUSENCIA DE ESPERMATOZOIDES-DIFICULTAD DE RECOGER LA MUESTRA DÍA DE PUNCIÓN-PACIENTES CON BAJA RESPUESTA PARA ACUMULAR OVOCITOS (DGP)
CONGELACIÓN LENTA
DAÑOS:
-CONGELACIÓN INTRACELULAR Y FORMACIÓN DE CRISTALES
-EFECTOS NOCIVOS DE LA SOLUCIÓN EN MEMBRANA CELULAR Y ORGÁNULOS CELULARES POR CONCENTRACIÓN DE ELECTROLITOS
FASES DEL PROCESO DE CONGELACIÓN:
PRECONGELACIÓN: Exposición y equilibrio a un crioprotector. Los crioprotectores modifican las propiedades físicas de una solución por bajar su punto de congelación.
-PRECONGELACIÓN-CONGELACIÓN-ALMACENAMIENTO
TIPOS DE CRIOPROTECTORES
• PERMEABLES ó INTRACELULARES: Bajo peso molecular
-Glicerol (G)-Dimetilsulfóxido (DMSO)-1,2 propanodiol-Etilenglicol (EG)-Propilenglicol (PG), -Polietilenglicol (PEG)-Etanol y otros alcoholes
FUNCIÓN-Entran en la célula -Reemplazan el agua intracelular-Modifican características fisico-químicas y respuesta frente al descenso de temperatura
MECANISMOS DE ACCIÓN:-Disminución punto de congelación de la suspensión.-Impiden formación de hielo
CRIOPROTECTORES• IMPERMEABLES O EXTRACELULARES: De alto peso molecular
-Polivinilpirrolidona (PVP)-Glucosa-Fructosa-Ficol-Dextrano -Sorbitol-Sucrosa-Lactosa-Trealosa, Rafinosa y otros azúcares
FUNCIÓN-Reducen agua intracelular por efecto osmótico
USO DE CRIOPROTECTORES EN EMBRIONES
• PRONÚCLEOS: Propanodiol y sacarosa
• 4-8 CÉLULAS: Dimetilsulfósido
• BLASTOCISTO: Glicerol
FASES CONGELACIÓN• CONGELACIÓN
• ALMACENAMIENTO
Pasos:
1EQUILIBRIO DE TEMPERATURAS entre la cámara de enfriamiento y el embrión
2ENFRIAMIENTO LENTO hasta llegar al punto de equilibrio de la congelación por debajo de la cual está la NUCLEACIÓN o formación primer cristal de hielo (-5ºC a -15ºC)
3SUPERENFRIAMIENTO:Diferencia entre el punto de equilibrio y nucleación.
-Cristalización espontanea del medio-Aumento de la temperatura debido al
desprendimiento de calor latente- Se puede bajar por “SEEDING” físico inducido cerca
del punto de equilibrio aprox 2ºC por debajo pto congelación
SEEDING :INDUCCIÓN NUCLEACIÓN-CERCA DELPUNTO DE EQUILIBRIO APROX 2ºC POR DEBAJO PTO CONGELACIÓN-TOCAR PARED EXTERIOR TUBO MUESTRA DONDE ESTÁ EMBRIÓN CON PINZAS PREENFRIADAS.-ENFRIAMIENTO DE LA SOLUCIÓN LOCALMENTE A UNA TEMPERATURA POR DEBAJO DE -20ºC NUCLEACIÓN ESPONTANEA-EMBRIÓN COMO OSMÓMETRO Y SE DESHIDRATA.
PLANER KRYO 10 serie II versión 1.7• UNIDAD DE SEEDING AUTOMÁTICA para aprox 16 embriones
• MODULO PELTIER TERMOELÉCTRICO que actúa como bomba de calor
• SUPERENFRIAMIENTO LOCAL
• INDUCCIÓN A LA NUCLEACIÓN
NICOOL MS21 SEEDING MANUAL
VITRIFICACIÓN
CARACTERÍSTICAS- ENFRIAMIENTO MUY RÁPIDO
- SOLUCIÓN ALTAMENTE CONCENTRADA QUE NO CRISTALIZA DURANTE LA CONGELACIÓN
- SU VISCOSIDAD AUMENTA CON EL DESCENSO DE TEMPERATURA HASTA LA FORMACIÓN DE UN ESTADO SÓLIDO AMORFO
- VOLUMEN MÍNIMO DE MEDIO (MENOS DE 0,1 MICROLITROS)
VITRIFICACIÓN ESPERMATOZOIDES
VITRIFICACIÓN:VENTAJAS
• No hay cristalización del embrión.
• Utiliza altas concentraciones de crioprotector que disminuye el período de exposición del embrión a éstos.
• El uso de pequeños volúmenes provee un incremento significativo en la tasa de enfriamiento.
• Tasas de enfriamiento entre 15.000 y 30.000ºC/min(0,3ºC/min en la congelación lenta)
• Se minimizan el daño por cambios osmóticos.
• Se reduce el tiempo del procedimiento (2-10´).
• Protocolo muy sencillo.
• Se eliminan los costos de adquisición de equipos.
• Al haber una mayor posibilidad de que un embrión implante, podemos transferir un menor número de embriones y con ello reducimos el riesgo de embarazo múltiple sin perder efectividad.
USO DE LAS DOS TÉCNICAS EN EMBRYOCENTER
• Congelación lenta: Embriones en estadío de desarrollo de día 1.
• Vitrificación: desde ovocitos hasta embriones en cualquier estadio de desarrollo (desde día 2 hasta blastocisto).
MI EXPERIENCIA EN CONGELACIÓN LENTA/ VITRIFICACIÓN
PUBLICACIÓN EN AÑO 1990 EN REVISTA para pacientes
PUBLICACIÓN EN BOLETÍN INFORMATIVO
INTRODUCCIÓN: La vitrificación en triploides es un método de congelación en el que, debido a la alta concentración de crioprotectores y ultrarrápida velocidad de enfriamiento, cuando se congela el sistema embrión-medio, las moléculas se disponen de manera similar a las del vidrio (tiene igual disposición molecular e iónica que el líquido), solidificando sin formación de cristales de hielo;ésta tiene ventajas frente a la congelación tradicional, pero el principal problema para la aplicación a gran escala ha sido el control estricto del tiempo de exposición de los embriones al crioprotector, ya que debido a la alta concentración requerida del mismo, existen problemas de disminución de la viabilidad embrionaria.
Un buen crioprotector debe tener alta solubilidad y baja toxicidad a altas concentraciones y, si es penetrante, bajo peso molecular para entrar fácil y rápidamente a la célula y obtener el máximo efecto protector.Para que los crioprotectores no penetrantes expresen al máximo sus carcterísticas deben ser mezclados con crioprotectores penetrantes.
OBJETIVO: Probar el método de vitrificación en triploides para ver la viabilidad de éstos y poderlos aplicar en la práctica clínica.
MATERIAL Y MÉTODOS: Se emplearon 15 embriones en día +2 procedentes de zigotos triploides.Estos se expusieron secuencialmente a las soluciones de vitrificación que llevaban etilenglicol como crioprotector intracelular o penetrante, trehalosa como crioprotector extracelular o no penetrante de bajo peso molecular, para la deshidratación de las células, y hialuronato, crioprotector macromolecular para incrementar la viscosidad.Se usaron pajuelas de congelación convencionales de 0.3 ml rellenadas con 30-50 microlitros de la gota de solución de vitrificación con los embriones.Los embriones se almacenaron en nitrógeno líquido durante 30-60 minutos, y se descongelaron rápidamente en un baño a 37 grados centígrados.El contenido de las pajuelas se llevó a un medio tamponado con Hepes suplementado con 0.3 M de sacarosa.RESULTADOS: 13 (86%) de los 15 embriones triploides preservaron una morfología normal en todas las blastómeras y no mostraron signos de daño tras la descongelación; 1 embrión (7%) tuvo una sola blastómera dañada combinada con 3-5 blastómeras supervivientes; 1 embrión (7%) tuvo viabilidad en menos de la mitad de sus células.12 embriones (80%) incluyendo el embrión con una sola blastómera dañada continuaron con la división celular.
VITRIFICACIÓN EN TRIPLOIDES.
M.T. Cañete, M. Esbert, E. Moreno, C. Martinez.C.I.V.T.E. (Centro de Inseminación in Vitro y Transferencia Embrionaria) Sevilla
EMBRIONES NO DAÑADOS EMBRIONES DAÑADOS
EMBRIONES MUY DAÑADOS
86%
7% 7%
CRIOPROTECTORES PENETRANTES NO PENETRANTESALTO PESO MOLECULAR - Ficoll, Polivinilpirrolidona, etc...
BAJO PESO MOLECULAR Glicerol, Etilenglicol, etc.. Sacarosa, trehalosa, etc...
CONCLUSIÓN: El método de vitrificación con hialuronato podría ser un eficiente y simple método de criopreservación en embriones humanos.
VITRIFICACIÓN EN TRIPLOIDES
HIALURONATO
MEDIOS DE VITRIFICACIÓN/DESVITRIFICACIÓN
-Basic Solution (BS): 1 X 1.5ml vial (only for Oocyte Vitrification) -Equilibration Solution (ES): 1 X 1.5ml vial -Vitrification Solution (VS): 2 X 1.5ml vials 1 Cryotop stores up to 5 Oocytes or 4 Embryos as a recommendation.
- Thawing Solution (TS): 2 x 4.0ml -Diluent Solution (DS)- Washing-Solution (WS)
Composition ・ HEPES within Basic Culture Medium ・ Trehalose ・ Hydroxypropyl
Cellulose
DESVITRIVITRI
Composition ・ HEPES within Basic Culture Medium ・ Ethylene Glycol ・ DimethylSulfoxide ・ Trehalose ・ Hydroxypropyl Cellulose
PROTOCOLO VITRIFICACIÓN
ES VS
PROTOCOLO DESVITRIFICACION
VITRIFICACION OVOCITOS
PROTOCOLO VITRIFICACIÓN PARA EMBRIONES
CONCLUSIONESSOBRE VITRIFICACIÓN
• MEJOR CONSERVACIÓN DE LA ULTRAESTRUCTURA Y MENOR LESIÓN DE LA FISIOLOGÍA OVOCITARIA Y EMBRIONARIA.
• PROPORCIÓN DE EMBARAZO ES SIMILAR A LA COMUNICADA PARA CICLOS EN FRESCO
• NACIDOS PARA LA VITRIFICACIÓN DE OVOCITOS PARECE TENER UNA INCIDENCIA DE ANOMALÍAS CONGÉNITAS (2.5%) NO MAYOR A LA COMUNICADA PARA LOS NACIDOS DE EMBARAZOS ESPONTÁNEOS EN MUJERES FECUNDAS O DE CICLOS FRESCOS DE FECUNDACIÓN IN VITRO.
• PROPORCIONA ELEVADA SUPERVIVENCIA OVOCITARIA, FECUNDACIÓN, DESARROLLO EMBRIONARIO Y EMBARAZO.
• ES UNA TÉCNICA SENCILLA Y ALTAMENTE REPRODUCIBLE QUE PUEDE BENEFICIAR A PAREJAS CON NECESIDAD DE POSTERGAR LA POSIBILIDAD DE EMBARAZO, INCLUIDAS LAS PACIENTES ONCOLÓGICAS.
GRACIAS POR SU
ATENCIÓN