PROYECTO MULTIDISCIPLINARIO SIP 1329: CAMBIOS EN ESTRUCTURA DE

LOS COMPUESTOS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE CHILE DEBIDO A

TRATAMIENTOS ENZIMÁTICOS O TÉRMICOS.

VARIACIÓN GENÉTICA DE LOS DIFERENTES CULTIVARES DE CHILE Y SU

RELACIÓN CON EL PERFIL DE CAROTENIDES Y FENOLES. PROYECTO SIP

20113514

DETERMINACIÓN DE LOS CAMBIOS ESTRUCTURALES DE LOS

COMPUESTOS CON ACTIVIDAD BIOLÓGICA EN CHILE, ASOCIADOS AL

TRATAMIENTO TÉRMICO POR ESPECTROSCOPÍA INFRAROJA. SIP

20120453

RESUMEN

El presente informe comprende los avances de investigación sobre la asociación del contenido de carotenoides, fenoles y peroxidasas de muestras comerciales de chiles

(Capsicum annum). Se trabajó con muestras de chiles jalapeños, serranos y manzano

adquiridas en diferentes lugares de la República Mexicana, a las cuales se les determinó el

contenido de fenoles, carotenoides y peroxidasas. Se llevó a cabo el estudio de fenoles y

carotenoides por HPLC, espectroscopía infraroja y análisis quimiométrico, encontrando la

asociación en dos grupos en los perfiles y contenido de fenoles, con aquellos provenientes

de la zona norte y los de la zona centro-sur. Por otra parte, el análisis con el marcador

molecular RAPD permitió diferenciar entre especies, más no entre cultivares, asimismo, se

encontró relación entre el marcador molecular RAPD con el perfil de carotenoides. Para el

estudio de las peroxidasas, se procesaron chiles frescos en solución amortiguadora de

fosfatos para la obtención de proteínas totales, las cuales se fraccionaron con sulfato de

amonio. Después de una serie de fraccionamientos adicionales mediante diferentes soportes

cromatográficos se obtuvo una preparación con al menos 4 proteínas de diferente tamaño

molecular que presentan actividad de peroxidasa en un gel de poliacrilamida. El

rendimiento final fue del 21% con una purificación de 25 veces. Al momento se está

estandarizando el protocolo para la obtención de las enzimas puras para su caracterización

bioquímica, enzimática y molecular.

INTRODUCCIÓN

El chile (Capsicum annum), es un fruto del género Capsicum perteneciente a la familia de

las solanáceas que comprende 25 especies silvestres y 5 domesticadas: Capsicum

annuum, Capsicum frutescens, Capsicum chínense, Capsicum baccatum y Capsicum

pubescens con más de 200 variedades (Pino y col. 2007, Conforti y col. 2007). El chile se

ha estudiado por su contenido de pigmentos naturales, además de su efecto antioxidante

(Suna K y col. 2006). Dependiendo no solo del genotipo, sino también de las condiciones

medioambientales, el chile puede contener perfiles y proporciones de carotenoides y

compuestos fenólicos diferentes (Vega Gálvez y col. 2009).

Para la conservación, manejo y mejora de las diferentes especies, la estimación de los

niveles de variación genética dentro de cada especie se ha convertido en una herramienta

fundamental. Actualmente, en la búsqueda de mejores resultados, se han empleado a los

marcadores fitoquímicos combinados con las técnicas moleculares. Silva y col. (2006)

correlacionaron el contenido de flavonoides de plantas medicinales de Brasil con

marcadores moleculares de RAPD.

Por lo anterior, el objetivo del presente trabajo fue determinar la relación de marcadores

bioquímicos como el perfil de carotenoides y fenoles entre diferentes cultivares

comerciales de chile de diferentes lugares de procedencia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material biológico

Se emplearon muestras de Capsicum annum (jalapeño y serrano) y Capsicum chinense,

(habanero) en estado verde y maduro procedentes del centro, noreste y noroeste de

México. Las muestras fueron lavadas con agua y almacenadas a -70°C.

Determinación de carotenoides por HPLC

Se empleó la técnica descrita por Jaramillo et al., 2005.

Determinación de fenoles libres

Se empleó la técnica de Adom y Liu, 2002.

Análisis estadístico

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA), utilizando la prueba de Student-Newman-

Keuls, por medio del programa SigmaStat para Windows versión 3.5.

Extracción de ADN

Todas las muestras de chile fueron lavadas, previamente con agua, para luego

someterlas a siete lavados de desinfección, los dos primeros con hipoclorito de sodio al

10 y al 30% respectivamente, los siguientes dos lavados se realizaron con etanol al 70% y

los últimos tres con agua destilada durante 20 minutos cada uno, las muestras fueron

maceradas en morteros y almacenadas a -70°C, todo se realizó bajo condiciones de

esterilidad. Las muestras fueron trituradas con ayuda de nitrógeno líquido, a 30 mg,

aproximadamente, se le añadió 400 μL de buffer de lisis (200 mM Tris-HCl pH 6.5, 70 mM

EDTA pH 8, 2 mM NaCl, 2% PVP 40, 20 mM de metabisulfito de sodio, 1 % de Triton X,

24 mM de MgCl2/MgSO4, 0.1% de espermina y 0.1% de espermidina), calentado

previamente a 60°C. Se agitó el contenido de la mezcla y se incubó a 60°C durante 60

min. Posteriormente, se transfirió en hielo y se le agregó 400 μL de PVP 10%, se mezcló

por inversión y se dejó 60 min a -20°C. Después, se centrifugó a 4000 rpm durante 30 min

y se transfirieron 400 μL de cada sobrenadante a tubos nuevos, agregando 5 μL de

RNasa (10 mg/mL) durante 10 min a temperatura ambiente. En seguida, los

sobrenadantes se precipitaron con 200 μL de acetato de amonio 10 M y 600 μL de

isopropanol frío, se mezcló por inversión y se incubó a -20°C toda la noche. Para finalizar,

se centrifugó a 4000 rpm durante 30 min a 10°C, y se eliminó el isopropanol, para lavar la

pastilla con 1 mL de etanol 70% frío, centrifugando, nuevamente, durante 10 min, en las

mismas condiciones, eliminando de nuevo el etanol y dejando secar alrededor de 20 min.

Los pellets se resuspendieron en 200 μL de Tris 10 mM pH 8 y el ADN se precipita de

nuevo con 200 μL de PEG 8000 30% / NaCl 1.2 M en hielo durante 60 min, a continuación

se centrifugó una vez más 30 min a 4000 rpm a 10°C. Los sobrenadantes de PEG se

desecharon y el pellet de ADN se lavó con 1.5 mL de etanol al 70% frío, centrifugando por

última vez, durante 15 min a 4000 rpm. Se eliminó el etanol y se dejó secar el pellet de

ADN, para finalmente resuspender en 200 μL de tris 10 mM pH 8. Referencia

La pureza del ADN extraído se determinó por espectroscopia (Varian 50Conc), tomando

la relación de absorbancia a 260 nm y 280 nm, considerando un DNA de buena calidad

aquel que presentó una relación mayor a 1.8. El ADN se cuantificó por su As280, la

concentración de DNA se calculó de la siguiente manera: A260 X dilución de la muestra de

DNA X 50 g/ml= g/mL de DNA (Lekha D y col. 2001).

Amplificación RAPD

Para la amplificación del ADN se utilizó la técnica descrita por Stratagene Eagle Eye.

Construcción de la matriz de datos y desarrollo del dendograma

Las bandas polimórficas y los picos de los cromatogramas fueron considerados como

presentes o ausentes en una matriz de similaridad. Se utilizó el método de agrupación

promedio UPGMA determinado mediante el análisis Cluster con el programa

Paleontological Statistics (PAST), versión 2.10, tomando en cuenta el coeficiente de

similitud de Dice y la distancia euclidiana.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Determinación de tamaño y peso

Las muestras con mejores características morfológicas (color, tamaño, textura, peso,

tamaño) fueron las provenientes de la zona norte. Las tres variedades de chile mostraron

diferencias tanto de peso como en tamaño, destacando mayores similitudes entre la

misma especie, (jalapeño y serrano) y entre aquellos cultivados en zonas cercanas.

Contenido de carotenoides totales

El contenido de carotenoides en los chiles verdes osciló en el intervalo desde no

detectables hasta 0.99 mg/g DB, mientras que en los chiles maduros se presentó entre

0.44 0.69 hasta 13.85 mg/g DB, el incremento del contenido de carotenoides del estado

verde a maduro fue de acuerdo a lo esperado en relación con el proceso de biosíntesis de

pigmentos conforme se va madurando el fruto (Marín y col. 2004).

Determinación de fenoles totales

Las concentraciones de fenoles en los chiles verdes muestran valores desde 30.2 hasta

1284 µg/g, mientras que en los chiles maduros van desde 38.6 hasta 297.8 µg/µL, en

base seca, notando, en la mayoría de los chiles, un incremento al madurar, coincidiendo

con los resultados de Deepa (2007), aunque otros estudios como los de Oboh (2007) y

Zhang (2003) muestran que el contenido de los compuestos fenólicos son

significativamente mas altos en los chiles verdes, que en los maduros. Por lo que los

principales factores que intervienen en la variación del contenido de fenoles son el estado

de maduración, además de la edad de la planta. (Deepa, et al. 2007)

Análisis RAPD

El oligonucleótido que detectó mayores polimorfismos fue el OPE-18, generando 18

bandas en total. En la muestra HT se observó la banda 15, ligeramente arriba de las que

aparece las demás muestras, identificándola como un fragmento diferente de 450pb.

Mientras que la banda de menor peso (100pb), sólo se presentó en los chiles JJ.

A partir de las bandas se conformó la matriz de similitudes para obtener los dendogramas,

observando, con el oligonucleótido OPE-18., por medio de la distancia euclídea, es decir,

tomando en cuenta las diferencias, una clara separación de los chiles habaneros con el

resto de las muestras, con un coeficiente de 2.60, mostrando que estos chiles tienen

diferencias importantes con los demás, al igual que al utilizar todos los oligonucleótidos,

pero esta vez mediante el coeficiente de Dice, es decir, tomando en cuenta sólo las

coincidencias, encontrando un coeficiente de similitud de 0.3, por lo que podemos decir

que los chiles habaneros no presentan mucha similitud con los jalapeños y serranos. Por

lo tanto, los marcadores RAPD nos permitieron diferenciar sólo entre especies, es decir la

c. chínense (habaneros) con la c. annuum (jalapeños y serranos).

Análisis genético con perfiles cromatográficos.

De acuerdo al dendograma conjuntado con las amplificaciones del oligo OPE-18 y el perfil

cromatográfico de carotenoides en chiles maduros, encontramos nuevamente la

separación entre los chiles habaneros de los jalapeños y serranos, con un coeficiente de

similitud de 0.53, lo que nos demuestra que los chiles pertenecientes a la especie C.

chinense difieren de los de la especie C. annuum, no sólo morfológicamente, como se

mencionó con anterioridad, sino también por sus componentes, en este caso los

carotenoides, manteniendo una separación y diferenciación entre las especies, lo que no

paso en el caso de los fenoles, por lo tanto, podemos decir que los carotenoides pueden

servir como un marcador bioquímico para diferenciar entre especies de chiles maduros,

aunque por el momento, no se haya logrado identificar los chiles dentro de una misma

especie o una asociación entre regiones, como en el estudio de Amorim y col. en el 2009,

donde el contenido de carotenoides y el uso de marcadores moleculares en diferentes

genotipos de plátanos, proporcionaron información útil en la selección de parentesco por

cruces entre diversos genotipos y para el desarrollo de variedades nuevas con

propiedades funcionales.

CONCLUSIONES

El presente trabajo consiguió hacer una separación y diferenciación entre las especies de

chile C. annuum y C. chinese por medio de la técnica molecular RAPD, con diferentes

iniciadores. De la misma manera, conjuntando el perfil de RAPD con el perfil

cromatográfico de los carotenoides, los chiles habaneros lograron separarse a los chiles

jalapeños y serranos, mostrando diferencias entre estos, indicándonos, que estos

compuestos pudieran servir como marcadores bioquímicos para la identificación de

especies.

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Análisis de carotenos y fenoles de chile de diferentes regiones del pais

mediante espectroscopias vibracionales y métodos quimiometricos.

Director de proyecto:

Dr. Marlon Rojas López

Adscripción: CIBA-Tlaxcala

RESUMEN

Se analizaron muestras de fenoles y carotenoides de chile (variedades jalapeño y serrano) de diferentes lugares del país mediante espectroscopia

infrarroja y métodos de análisis multivariado. El análisis PLS-FTIR permitió determinar una curva de calibración que predice el contenido de

beta-caroteno presente en muestras de carotenoides. Por otra parte la aplicación del análisis de componentes principales (PCA) a las mediciones de absorción infrarroja permitió observar las direcciones de variación de

acuerdo a la covarianza espectral correspondiente a cada región analizada.

INTRODUCCION

En los últimos años se han aplicado diversas técnicas analíticas para la

identificación y cuantificación de compuestos nutraceuticos tales como los

carotenoides y los fenoles en frutas y verduras. En particular, la

composición compleja de los carotenoides es separable mediante

cromatografía de líquidos (HPLC) (1), aunque hasta ahora la

espectrofotometría UV-visible es todavía el método más conveniente debido

a la absorción a diferentes longitudes de onda (2, 3). Otras técnicas como

resonancia magnética nuclear, y espectroscopia de masas también han

mostrado ser útiles en la identificación de carotenoides.

Sin embargo, a pesar de la eficacia de las técnicas analíticas mencionadas

para la determinación y cuantificación de carotenoides, existen

metodologías alternativas basadas en el análisis de la absorción infrarroja

y dispersión Raman (espectroscopias vibracionales), cuyos resultados son

además procesados mediante técnicas de análisis multivariado (4-7). Dicha

metodología alternativa permite realizar el análisis en un tiempo menor,

reduciendo además el uso de reactivos y de procedimientos de

manipulación de las muestras.

OBJETIVO Y METAS CUMPLIDAS

Se aplicó una metodología quimiométrica basada en técnicas vibracionales (espectroscopia infrarroja) para el análisis de muestras de fenoles y

carotenoides de chile recolectados de diferentes ubicaciones geográficas del país.

Las metas cumplidas fueron:

Determinación del contenido de beta-caroteno, así como la obtención de

una curva de calibración que relaciona la respuesta espectral FTIR con valores de referencia del contenido de beta-caroteno obtenidos mediante

espectrofotometría UV-visible. Lo anterior se realizó aplicando el método de mínimos cuadrados parciales a las curvas de absorción infrarroja (PLS-FTIR).

Mediante el análisis de componentes principales (PCA), se encontró la

existencia de aglomerados o grupos que clasifican a los fenoles de muestras de chile de acuerdo a la región geográfica del país.

MATERIALES Y METODOS

Los espectros de absorción infrarroja fueron obtenidos usando un espectrómetro de transformada de Fourier (FTIR), Bruker Vertex 70 en la

modalidad de muestreo por reflectancia total atenuada (ATR) en el rango infrarrojo medio (650–4000 cm-1). Se utilizo una alícuota de 20 microlitros

(fenoles y carotenoides) colocada sobre el cristal ATR de selenuro de zinc, el cual proporciona la reflectividad de la luz infrarroja de la muestra. Posteriormente se ingresaron las absorbancias FTIR de las muestras de

carotenoides y fenoles a una tabla para formar una matriz a la cual se le aplicaron los procedimientos de análisis de componentes principales (PCA)

y mínimos cuadrados parciales (PLS). El primer procedimiento involucra el uso de los programas Origin, Exel y Minitab, mientras que el segundo

procedimiento involucra el uso del programa OPUS-QUANT.

RESULTADOS

Se obtuvieron los espectros FTIR típicos de carotenoides extraídos de

chiles jalapeño y serrano maduros de diferentes regiones geográficas, para el rango de número de onda: 920–980 cm-1. Se puede observar que el

conjunto de espectros presentan una forma de línea común, la cual es atribuida a la absorción infrarroja debida al beta-caroteno (6).

Una vez que se ha medido la absorción infrarroja, se aplica la rutina PLS

del programa OPUS para determinar el mejor modelo que optimice el coeficiente de correlación R2 y los errores estándar de calibración y

predicción respectivamente. Las curvas de calibración PLS obtenidas del análisis quimiométrico, predicen el contenido de beta-caroteno presente en

las muestras de caroteniodes como una función de valores de referencia obtenidos por alguna técnica estándar, que para este caso fue UV-visible. Una de las ventajas que posee esta metodología quimiométrica es que solo

se requiere medir los valores de referencia (HPLC, UV-visible, etc) solo una vez, y posteriormente el modelo PLS-FTIR puede utilizarse cuantas veces

sea necesario para un grupo diferente de muestras de carotenoides.

Por otra parte se aplicó el análisis de componentes principales (PCA) a la

absorción infrarroja de los fenoles de chile de diferentes orígenes geográficos del país. Esto se realizó mediante los programas Origin, Exel y

Minitab. Los resultados muestran cuatro agrupaciones con características

químicas similares de acuerdo a su absorción infrarroja vía compuestos fenólicos. El método de análisis de componentes principales permite así

observar las direcciones de variación de acuerdo a la covarianza espectral correspondiente a cada región analizada. Se observa que los especímenes de la región de Puebla muestran un eje de variación paralelo a las regiones

de Tlaxcala y Veracruz. La dirección de estos ejes es casi perpendicular a la de los ejes de las regiones de Sinaloa, Tamaulipas y Jalisco.

CONCLUSIONES E IMPACTO DE LA INVESTIGACION Se ha realizado un análisis quimiométrico en muestras de carotenoides y fenoles de chile (variedades jalapeño y serrano) provenientes de distintas

regiones del país. Los resultados de la aplicación de método PLS-FTIR permitieron determinar una curva de calibración que predice el contenido

de beta-caroteno presente en muestras de carotenoides. Por otra parte la aplicación del análisis de componentes principales (PCA) permitió observar

las direcciones de variación de acuerdo a la covarianza espectral correspondiente a cada región analizada. Esta metodología puede ser aplicada en el análisis y caracterización de compuestos funcionales de

productos agrícolas de gran importancia nutricional como lo es el chile, de una manera práctica.

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Aislamiento, purificación y caracterización de una peroxidasa del chile (Capsicum annuum)

Clave del Proyecto: 20113595 Dr. César Augusto Sandino Reyes López

ENMyH-IPN

RESUMEN Las peroxidasas son enzimas que pertenecen al grupo de las oxidorectasas que catalizan las reacciones en las cuales el peróxido de hidrógeno actúa como receptor de hidrógenos y otro compuesto (fenólico) actúa como donador de átomos de hidrógeno. Son utilizadas ampliamente en bioquímica clínica para la determinación y cuantificación de diversos metabolitos, en inmunoensayos para la detección antígenos, y como biocatalizador para la generación de productos de interés biotecnológico. De acuerdo a su pI pueden ser ácidas, neutras o básicas y según su localización o función biológica en los organismos que las producen se clasifican en peroxidasas de clase I (intracelulares), de clase II (ligninasas) y de clase III (extracelulares). Contienen un grupo hemo de protoporfirina IX unido a un átomo de Fe+2 y estas enzimas pueden existir en forma soluble o unidas a membranas y están involucradas en muchas funciones. Debido a su aplicación en procesos biotecnológicos, el estudios de las peroxidasas de plantas son de gran interés. Se conoce muy poco de la naturaleza de estas enzimas en el chile (Capsicum annuum) y de su potencial en la aplicación en biosítesis y biotransformaciones, por lo que este trabajo está enfocado a Identificar y caracterizar estructural y bioquímicamente a una de las peroxidasa del chile (Capsicum annuum). Se procesaron chiles frescos en solución amortiguadora de fosfatos para la obtención de proteínas totales, las cuales se fraccionaron con sulfato de amonio. Después de una serie de fraccionamientos adicionales mediante diferentes soportes cromatográficos se obtuvo una preparación con al menos 4 proteínas de diferente tamaño molecular que presentan actividad de peroxidasa en un gel de poliacrilamida. El rendimiento final fue del 21% con una purificación de 25 veces. Al momento se está estandarizando el protocolo para la obtención de las enzimas puras para su caracterización bioquímica, enzimática y molecular. Objetivos General Identificar y caracterizar estructural y bioquímicamente a una de las peroxidasa del chile (Capsicum annuum) Objetivos Específicos Comparar la actividad de peroxidasa de 5 tipos diferentes de chile y seleccionar a la especie que mayor actividad enzimática presente.

Caracterización de la estructura en solución de una de las peroxidasas más abundantes o con mayor actividad enzimática. Obtener los parámetros catalíticos de una de las peroxidasas que se haya purificado. Purificación de la peroxidasa de chile. A partir de 100 gramos de chiles, de 5 de las principales especies comerciales del país, se realizarán extractos proteicos mediante la homogenización de este material en un amortiguador de fosfatos. El material insoluble se separaró mediante centrifugación y las proteínas se precipitaron saturando la solución a diferentes concentraciones de sulfato de amonio. Para determinar la presencia de peroxidasas en los diferentes precipitados se realizaron ensayos de actividad usando como sustrato la tetrametilbencidina. Los precipitados con mayor actividad se utilizaron para el aislamiento parcial de la peroxidasa empleando técnicas cromatográficas. La pureza de las preparaciones se analizó mediante electroforesis en geles de poliacrilamida. Resultados Se realizó la extracción de proteínas totales de 7 diferentes chiles, y se determinó el perfil electroforético de cada extracto en geles de poliacrilamida, observándose que éste es muy parecido entre todos los extractos. Las proteínas mas abundantes es todos ellos fueron las de 12, 20, 35, 100, 150 y 200 kDa. En el cado del chile serrano no se observó una proteína de 45 kDa presente en el resto de los chiles, como una de las principales diferencias entre estos extractos. Para cada uno de los extractos se determinó la cantidad proteína por el método del ácido bicinconínico (BCA) (PIERCE) y se evaluó la actividad de peroxidasa en presencia de peróxido de hidrógeno y tetrametilbencidina (TMB). El extracto del chile jalapeño fue el que presentó una mayor cantidad de proteínas totales (3.2 mg/mL), seguidos de los extractos de los chiles chilaca y serrano (2.2 y 2.1 mg/mL de proteínas totales respectivamente). El chile de árbol fue el que presentó una menor cantidad de proteínas, apenas 0.14 mg/mL. Con lo que respecta a la actividad de peroxidasa, se observó que los extractos con mayor actividad fueron los de los chiles chilaca, de agua y serrano. Del extracto proteico de estos 3 chiles se realizó una precipitación fraccionada con sulfato de amonio al 20, 60 y 80 %. Las fracciones con mayor actividad de peroxidasa fueron las de sulfato de amonio al 80%. A partir de este punto se trabajó con los extractos proteicos de chile serrano por contar con mayor actividad de peroxidasa en los precipitados con sulfato de amonio al 60 y al 80%. Para eliminar los restos de clorofila y otros pigmentos presentes en los extractos, estos fueron fraccionados en una columna de exclusión molecular Biogel P-30 (BIO-RAD). Se

observó que en las primeras fracciones (de la 1 a la 6) es en donde se eluye la mayor cantidad de proteínas y en donde se presenta la mayor actividad de peroxidasa. Las fracciones de la 1 a la 6 se mezclaron y las proteínas se separaron en una columna de intercambio catiónico High S (BIO-RAD) en donde se obtuvieron 3 fracciones con actividad de peroxidasa, la primera en los tubos 1 al 10, la segunda en los tubos 46 al 59 y la última en los tubos 64 al 72. Una muestra de cada paso de purificación primero fue separada y visualizada en un gel desnaturalizante de poliacrilamida, teñida con azul de coomasie y otro gel idéntico se reveló con diaminobencidina (DAB) y peróxido de hidrógeno para una prueba de actividad de peroxidasa. En el gel revelado para actividad de peroxidasa se puede identificar al menos 4 bandas cuyos pesos moleculares oscilan entre los 50 y 35 kDa siendo las más abundante la proteína de 50 kDa. Hasta el momento no sabemos si estas bandas corresponden a proteínas diferentes o son la misma proteína pero con diferentes modificaciones postraduccionales, o una mezcla de las dos. A la fecha, se está realizando la estandarización de otras técnicas cromatográficas (afinidad) para el aislamiento y purificación final de la peroxidasa del chile serrano. Al momento se cuenta con un rendimiento de purificación del 21% con una purificación de 25 veces de las peroxidasas de chile serrano. Durante el segundo periodo del desarrollo del proyecto se contempla obtener alguna de las peroxidasas mas abundantes del chile serrano purificada a homogeneidad para su caracterización bioquímica, enzimática y molecular.