Pruebas bioquimicas

Introducción

Las pruebas bioquímicas consisten en distintos test químicos aplicados a medios biológicos, los cuales,conocida su reacción, nos permiten identificar distintos microorganismos presentes.

Su sistema de funcionamiento generalmente consiste en determinar la actividad de una via metabólica a partirde un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer incorpora o no.

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de multiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo alas exigencias del microorganismo en estudio.

De la amplia variedad de pruebas bioquímicas, nosotros en laboratorio utilizaremos 10, aplicados a 5 especiesde microorganisos.

Además estudiaremos los resultados que estos test arrojan, comparando resultados experimentales entre losdistintos grupos de trabajo de nuestro laboratorio.

Objetivos

Realizar el experimento adecuadamente y poder identificar −aplicando éste método− distintosmicroorganismos.

•

Debemos conocer cual de los test que componen las pruebas bioquímcas es o son el (los) adecuado(s)de acuerdo a la circunstancia que necesitemos estudiar.

•

Entender los principios bioquimicos de las pruebas.•

Ser capaces de interpretar adecuadamente los resultados entregados por laspruebas bioquímias•

Conocer el uso de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos•

Identificar errores de procedimiento en el laboratorio al realizar los experimentos y poder reconoceren que partes del procedimiento se cometió el o los errores, para así, mediante el desarrolloexperimental conocer mas profundamente las pruebas bioquímicas.

•

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE CHILE

FACULTAD TECNOLOGICA

TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

Microbiología

Pruebas Bioquímicas

Autor:

Lab N° 4

Cod. 06

1

Bibliografía

Microbiología / Thomas D. Brock, Michael T. Madigan•

2a. ed. en español, 1993. México ; Englewood Cliffs : Ed. Prentice Hall Hispanoamericana.

Microbiología / Michael J. Pelczar, Jr., Roger D. Reid•

2a. ed. en español., 1982. México : Ed. McGraw−Hill.

Tratado de microbiología : con inclusión de inmunología y•

genética molecular / Bernard D. Davis

2a. ed., 1978. Barcelona : Ed. Salvat.

Internet:

http://bilbo.edu.uy/~microbio/RMVP.html•

http://bilbo.edu.uy/~microbio/indol.html•

http://bilbo.edu.uy/~microbio/citrato.html•

http://edicion−micro.usal.es/web/identificacion/AyudaPruebas.html•

Prueba de la Oxidasa•

El objetivo de la prueba Oxidasa es buscar la presencia de la enzima Citocromo C oxidasa.

Se trata de un enzima que oxida el citocromo C de la cadena transportadora de e−. Este se detecta utilizando eltetra para fenilendiamina: el reactivo de oxidasa contiene este compuesto que va a ser oxidado por lacitocromo C oxidasa. En estado reducido es incolora, pero cuando se oxida vira a púrpura.

Procedimiento:

Con un pequeño papel de filtro añadimos reactivo de Kovacs, lo impregnamos y a partir del tubo con labacteria problema tomamos un poco con el asa de platino y ponemos en el papel. Tras unos 30 segundos,observamos si ha ocurrido algún cambio.

Las bacterias que dan positivo a esta prueba tienen generalmente un ciclo respiratorio oxidativo.

Se considera positva esta prueba cuando toma un color púrpura la muestra.

Resultados:

(+) Pseudomonas aeruginosa

( − ) Escherichia coli

Prueba de la Catalasa•

2

El Objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa

El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste uncompuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 −>H2O + ½ O2).

Prodecimiento:

Agregamos aproximadamente 5 ml. de peróxido de hidrógeno al 3% a un tubo de ensayo previamenteesterilizado a continuacion tomamos una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar y la introducimospor el tubo de ensayo, la muestra solamente debe acercrse a la muestra de la solucion liíquida de peróxido dehidrogeno y debemos observar la reacción de esta.

La prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

Resultados:

(+) Staphylococcus aureus

( − ) Streptococcus spp.

Prueba de la Coagulasa•

La coagulasa es un enzima capaz de desnaturalizar la bibrina del plasma. El objetivo es buscar en factor deaglutinación de los microorganismos cuando estos se mezclan con el plasma. Esta prueba se utiliza paradiferenciar microorganismos del genero Staphylococcus.

Procedimiento:

Preparamos una mezcla de 0,1 ml. de CCC (caldo cerebro corazon) y 0,3 ml. de plasma de conejo en un tubode ensayo previamente esterilizado. La muestra ya contiene cepas de St. Aureus. Tapamos el tubo de ensayocon algodón hidrofílico y lo llevamos a baño María a 37° C durante una hora, observando la muestra cada 15minutos. Al completa la hora, sacamos las muestras y observamos sus resultados.

Resultados:

Estratificaremos los resultados en 4 distintos niveles:

1: pequeños coágulos no oganizados

2: pequeños coágulos oganizados

3: gran coágulo organizado

4: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando invierte el tubo.

Se consideran positivos los niveles 3 y 4.

(+) Staphylococcus aureus

3

( − ) Staphylococcus epidermis.

Prueba MIO (Motility−Indole−Ornitine ó Motilidad−Indol−Ornitina)•

Esta prueba bioquímica permite identificar bacterias de acuerdo a su motilidad a la reacción de Indol a ladescarboxilación de la ornitina.

Procedimiento:

Inocular en picada las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación

Enturbiamiento del

Agar.Hay movilidad

Agar transparente de−

sarrollo solo en picadaNo hay movilidad

Azul (alcalino) Descarboxila ornitina

Coloración Amarilla (ácido) No descarboxila

Rojo (anillos) Indol (+)

Amarillo (anillos) Indol ( − )

Prueba TSI (Triple Sugar Iron ó Triple Azúcar Hierro)•

El TSI es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de producción de ácido y gas apartir de glucosa, sacarosa y lactosa en un único medio. Tambien permite la identificación de la producción deSH2.

Esta es una prueba específica para la identificación a nivel de género en la familia Enterobacteriaceae, conobjetivo de diferenciar entre:

bacterias fermentadoras de la glucosa• bacterias fermentadoras de la lactosa• bacterias fermentadoras de sacarosa• bacterias aerogénicas• bacterias productoras de SH2 a partir de sustancias orgánicas que contengan azufre.•

Prodedimiento:

Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm. del fondo deltubo. Tras retirar el alambre del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35°durante 24 horas. Posteriormente se debe medir el pH de los cultivos.

Resultados:

Pico alcalino/fondo alcalino : no hay fermentación de azucares. Característica de bactrias nofermentadoras como Pseudomonas sp.

•

Pico alcalino/fondo ácido : Glucosa fermentada,lactosa ni sacarosa fermentadas. Shigella spp.•

4

Pico alcalino/fondo negro : Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, producción deácido sulfhídrico. Salmonela spp.

•

Pico ácido/fondo ácido: Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse SH2 o no.Escherichia coli.

•

A estos resultados se les agrega el resultado de la producción de gas.

Prueba LIA (Lysine Iron Agar ó Agar Lisina Hierro)•

Esta prueba permite diferenciar los microorganimos que producen descarboxilación o desaminación de lalisina. Se pude detectar ademas la produccion de SH2 y es más sensible que el TSI para la detección de SH2.Es muy utilizado par descartar Salmonella de aislamientos primaros.

Procedimiento:

Inocular en forma de estría las cepas de micro organimos en el medio de cultivo e incubar por 24 horas a 37° .

Interpretación y Resultados:

Reacción Interpretación

Azul (alcalino) Hay movilidad

Rojo No hay movilidad

Engrecimiento Descarboxila ornitina

Ruptura del Agar No descarboxila

Fondo Amarillo y

Tendido púrpuraDescarboxilación de lisina

Pruebas Bioquímicas IMViC:

Agar Citrato•

La utilización de citrato como única fuente de carbono es una prueba útil en la identificación deenterobacterias. La utilización de citrato como única fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo concitrato como única fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinización del medio. Este aumento depH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

Procedimiento:

Se inocula el agar inclinado en una sola estría en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio sólido ycuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partirdel medio de cultivo del inóculo. Incubar a 35°C durante 4 días. El ensayo es positivo cuando se observacrecimiento a lo largo de la estría, acompañado o no de un viraje del indicador al azul.

Resultados:

(+)Klebsiella spp.

( − ) Escherichia Coli

Indol•

5

El indol es uno de los productos de degradación metabólica del aminoácido triptofano. Las bacterias queposeen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producción de indol, ácidopirúvico y amoníaco. La producción de indol es una característica importante para la identificación de muchasespecies de microorganismos. La prueba de indol está basada en la formación de un complejo rojo cuando elindol reacciona con el grupo aldehído del p−dimetilaminobenzaldehído. Este es el principio activo de losreactivos de Kovacs y Ehrlich. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Procedimiento:

Inocular el caldo triptofano con el organismo en estudio e incubar a 35°C durante 18 a 24 horas. Al finalizareste período, añadir 5 gotas de reactivo de Kovacs por la pared interior del tubo. El desarrollo de un vivo colorrojo fucsia en la interfase del reactivo y el caldo, segundos después de añadir el reactivo indica la presencia deindol y una prueba positiva.

Resultados:

(+) Escherichia coli

( − ) Klebsiella pneumoniae

Rojo Metilo•

Una de las características taxonómicas que se utilizan para identificar los diferentes géneros de enterobacteriaslo constituyen el tipo y la proporción de productos de fermentación que se originan por la fermentación de laglucosa. Se conocen 2 tipos generales: La fermentación ácido−mixta y la fermentación del 2,3 butanodiol. Enla fermentación ácido mixta se forman fundamentalmente láctico, acético y succínico, además de etanol, H2 yCO2. En la vía del butanodiol se forman cantidades menores de ácido (acetato y succinato) y los principalesproductos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza paravisualizar la producción de ácidos por la vía de fermentación ácido mixta.

Procedimiento:

Inocular el caldo Rojo Metilo con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio.Incubar a 35°C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación agregar unas gotas del reactivode rojo de metilo. La prueba es positiva si se desarrolla de un color rojo estable. Esto indica que la producciónde ácido es suficiente para producir el viraje del indicador y el microorganismo fermentó la glucosa por la víade ácido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

Resultados:

(+) Escherichia coli( − ) Enterobacter aerogenes

Vogues Proskauer•

En la prueba de Voges−Proskauer se determina la vía de fermentación del butanodiol descripta en la pruebade rojo de metilo. El acetil−metil−carbinol (o acetoína) es un producto intermediario en la producción debutanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxígeno la acetoína es oxidada a diacetilo. Este se revela enpresencia de alfa−naftol dando un color rojo−fucsia.

6

Procedimiento:

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no más de 24 horas del microorganismo en estudio. Incubar a35°C durante 24 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubación transferir 1 ml del caldo RM/VP a untubo limpio y agregar 0,6 ml de alfa−naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40%. Agitar el tubo cuidadosamentepara exponer el medio al oxígeno atmosférico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. El desarrollo de uncolor rojo−fucsia luego de 15 minutos indica la presencia de diacetilo, producto de oxidación de la acetoína ypor lo tanto una prueba VP positiva.

Resultados:

(+) Enterobacter aerogenes

(−)Escherichia coli

Microorganismos utilizados en las Pruebas Bioquímicas

MICROORGANISMO FAMILIA TINCION FORMA MOVILIDAD

PSEUDOMONA SPP. ENTEROBACTER GRAM −

BACILOSCORTOS,CURVADOS ORECTOS

POSEEFLAGELOSPOLARES

SALMONELLA ENTEROBACTER GRAM −BACILOSCORTOS

FLAGELOSPERÍTRICOS

SHIGUELLA SPP. ENTEROBACTER GRAM − BASTONCILLOSNO TIENE

ESCHERICHIA COLI ENTEROBACTER GRAM −BACILOSCORTOS NOESPORULADOS

FLAGELOSPERÍTRICOS

STAPHYLOCOCCUSAUREUS

MICROCACEAE GRAM + COCACEA NO TIENE

Resultados Experimentales

Grupo 1: Sebastián Leyton − Carlos Vera

Grupo 2: Yuri Gálvez − David Fuica

Grupo 3: Graciela Quintero − Carolina

Grupo 4: Carolina Iribarra − Jessica Pizarro

Oxidasa

MICROORGANISMO GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

PSEUDOMONA SPP. + + + +

SALMONELLA + + + +

SHIGUELLA SPP. − − − −

ESCHERICHIA COLI + + + +

STAPHYLOCOCCUS AUREUS − − − −

7

Catalasa


PSEUDOMONA SPP. + + + +

SALMONELLA + + + +

SHIGUELLA SPP. − + − +


STAPHYLOCOCCUS AUREUS + + + +

Coagulasa


STAPHYLOCOCCUS AUREUS + + + +

Indol



Agar Citrato


ESCHERICHIA COLI − − − −

Vogues−Proskauer


ESCHERICHIA COLI − − − −

Rojo Metilo



LIA

MICROORGANISMO(S)

DETECTADO(S)GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

SALMONELLADESCARBOXILACIONDE ORNITINA

DESCARBOXILACIONDE ORNITINA



SHIGUELLA SPP.DESCARBOXILACIONDE LISINA

DESCARBOXILACIONDE LISINA



MIO

MICROORGANISMO(S) GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

8

DETECTADO(S)

PSEUDOMONA

SPP.





ST. AUREUSNO DESCARBOXILA

ORNITINA

NO DESCARBOXILA

ORNITINA

NO DESCARBOXILA

ORNITINA

NO DESCARBOXILA

ORNITINA

TSI

MICROORGANISMO(S)

DETECTADO(S)GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4

SALMONELLA

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

PRODUCCION

DE ACIDO

SULFHIDRICO

SHIGUELLA SPP.

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

GLUCOSA

FERMENTADA

LACTOSA NI

SACAROSA

FERMENTADAS

Diagrama de flujo realización de Pruebas Bioquímicas

RECOLECCIÓN DE MATERIALES A UTILIZAR EN PRUEBAS BIOQUÍMICAS

PREPARACION DE MATERIAL DE LABORATORIO

REALIZACION DEL PROCEDIMINTO PARA PRUEBAS BIOQUIMICAS

INCUBACION DE MUESTRAS

ANOTAR RESULTADOS

ANALISIS DE RESULTADOS

9

COMPARACION DE RESULTADOS EXPERIMENTALES Y TEORICOS

EVALUACION Y RESULTADOS FINALES DE PRUEBAS BIOQUIMICAS

10

Documents

Pruebas bioquimicas