Prüfung der Biokompatibilität von Implantatwerkstoffen mit ... · Danksagung iv Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei Allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit in

Prüfung der Biokompatibilität von

Implantatwerkstoffen mit Methoden

der digitalen Bildverarbeitung

Dissertation

zur Erlangung des akademischen Grades

DOKTOR–INGENIEUR

der Fakultät für

Mathematik und Informatik

der FernUniversität

in Hagen

von

Sven Buhl M.Sc.

Menden

Hagen 2015

Kurzfassung ii

Kurzfassung

Die vorliegende Dissertation beschreibt die Entwicklung einer vielseitig einsetz-

baren Zellanalysesoftware für die Biokompatibilitätsprüfung von Medizinproduk-

ten. Derzeit besteht ein hoher Bedarf an Zellanalysesystemen mit automati-

scher Auswertung im Rahmen der Biokompatibilitätsprüfung, da die Prüfungen

manuell und somit sehr kostenintensiv sowie fehleranfällig durchgeführt wer-

den. Im Rahmen der Arbeit werden die zwei Zelltypen L929 und MC3T3 unter-

sucht. Die Herausforderung liegt zum einen in der starken morphologischen

Variation der Zelltypen und die vergleichsweise kontrastschwache May-

Grünwald Zellfärbung. Die Linie L929 findet im Gegensatz zum Typ MC3T3 im

Bereich der Biokompatibilitätsprüfungen häufig Anwendung. Der Typ MC3T3

weist hingegen eine andere morphologische Erscheinung auf und dient zur

Verallgemeinerung der Analysealgorithmen. Die Aufnahme der May-Grünwald

angefärbten Zellen auf metallischen Oberflächen erfolgt mit einem Olympus

Bx51M bei 100-facher Vergrößerung. Für Zellen auf dem Material Polystyrol

kommt das Durchlichtmikroskop CKX41 ebenfalls von Olympus zum Einsatz.

Die Bilder für die automatische Zellauswertung werden mit der Farbkamera

Olympus XC10 mit einer Auflösung von 1376x1032 Pixel aufgenommen. Die

vorliegenden Bilder können aufgrund des Prozesses der Probenaufbereitung

Kratzer und Verunreinigungen enthalten, die im Rahmen der Bildvorverarbei-

tung zunächst reduziert werden. Die anschließende Segmentierung der Zellbe-

reiche erfolgt abhängig vom gewählten Mikroskopkontrast mit einem Schwell-

wertverfahren oder einer histogrammbasierten Methode. Zur Bestimmung des

Biokompatibilitätsgrades eines untersuchten Materials ist die Proliferationsrate

ein wichtiges Kriterium. Daher ist eine Erfassung agglomerierter Zellen uner-

lässlich. Zur Trennung zusammengewachsener Zellen kommen abhängig vom

Zelltyp verschiedene Verfahren zum Einsatz. Liegen Zellen vor, die meistens

Einschnürungen an den Zellkontaktstellen aufweisen, z.B. der Typ L929, kommt

ein Separationsverfahren auf Basis der dominanten Konturpunkte zum Einsatz.

Große und meist flächige Agglomerate, z.B. beim Typ MC3T3, werden hinge-

gen mit einer Wachstumssimulation ausgehend von den mit dem Histogram

Backprojection Algorithmus detektierten Kernbereichen aufgetrennt. Eine kon-

textbasierte Trennfunktion mit automatischer Parameterfestlegung durch einen

genetischen Algorithmus kommt zum Einsatz um die benötigte Rechenzeit zu

reduzieren und die Genauigkeit der Zellzählung zu erhöhen. Die Software ist so

konzipiert, dass die Auswahl des passenden Zellsegmentierungs- und Separa-

tionsverfahrens automatisch erfolgen kann. Die Abweichung der automatischen

Zellzahlbestimmung zur Referenzzählung liegt mit durchschnittlich 1,27% für

den Zelltyp L929 und 3,5% für den Typ MC3T3 im akzeptablen Bereich für die

Biokompatibilitätsprüfung.

Abstract iii

Abstract

This thesis describes the development of a versatile applicable cell analysis

software regarding the biocompatibility testing of medical products. At present

there is a high demand for cell analysis systems with automatic evaluation in

the field of biocompatibility testing due to the expansive and error-prone manual

process. In the context of this thesis the two cell types L929 and MC3T3 are

investigated. The challenge is the strong morphological variation of the cell

types and the comparative low contrast May-Grünwald cell staining. In contrast

to the type MC3T3 the type L929 is often used for biocompatibility tests. The

type MC3T3 is characterized by another morphological appearance and is used

to generalize the algorithms. The image acquisition of the May-Grünwald

stained cells on top of the metallic surface is done by a Olympus Bx51M at

magnification factor 100. Cells on top of polystyrol are analyzed by the Olympus

transmitted-light microscope CKX41. The images used for the automatic cell

analysis are acquired by the color camera Olympus XC10 with a resolution of

1376x1032 pixels. The images are containing scratches caused by the process

of the sample preparation which are in a first step reduced by an image prepro-

cessing step. The following cell segmentation is done depending on the chosen

microscope contrast with a threshold method or a histogram based algorithm.

The proliferation rate is an important criterion to determine the grade of biocom-

patibility. Therefor a detection of clustered cells is essential. Connected cells

are divided depending of the cell type with different methods. If cells have to be

analyzed which have joints at their contact areas the separation method based

on dominant contour points is used. Big Clusters without joints at their contact

areas are divided by a growth simulation starting from the cell nuclei detected

by the histogram backprojection algorithm. To reduce the calculation time and

to improve the cell count accuracy a context based separation method with au-

tomatic parameter adjustment done by a genetic algorithm is used. The choice

of the suitable cell segmentation and separation method can be done automati-

cally. The difference of the automatic cell count to the reference cell count is on

average 1.27% for the type L929 and 3.5% for the type MC3T3 which is ac-

ceptable in the field of biocompatibility testing.

Danksagung iv

Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei Allen bedanken, die zum Gelingen dieser

Arbeit in Form von fachlichen Ratschlägen, Diskussionen und Motivation beige-

tragen haben.

Mein Dank gilt auch Prof. Dr. Jürgen Jahns, der es mir ermöglichte, dieses Vor-

haben an der FernUniversität Hagen umzusetzen und mit Rat zur Seite stand

sowie Prof. Dr. Wolfram Schiffmann für seine konstruktiven Ratschläge. Insbe-

sondere möchte ich Prof. Dr. Burkhard Neumann danken, der mir in zahlreichen

Diskussionen stets mit seinem äußerst umfangreichen Fachwissen zur Seite

stand und mir darüber hinaus neue Sichtweisen über Problemstellungen im

Rahmen des Projektes eröffnete. Des Weiteren möchte ich allen im Rahmen

des Forschungsprojektes wirkenden Personen dafür danken, dass ich ein sehr

interessantes Thema bearbeiten durfte. Durch die interdisziplinäre Aufstellung

des Projektteams und den sich daraus ergebenen fachübergreifenden Diskus-

sionen hat sich mein zu Beginn sehr eingeschränktes Vorwissen auf dem Ge-

biet der Biotechnologie deutlich erweitert. Ebenso möchte ich Anna Severing

meinen Dank aussprechen, dafür dass sie mit starkem Engagement zahlreiche

biotechnologische Versuche durchgeführt und mir in vielen Projektbesprechun-

gen die Welt der Biotechnologie näher gebracht hat. Darüber hinaus bedanke

ich mich bei Martin Föller und Sebastian Christopher Schäfer, die im Rahmen

des Forschungsprojektes bei der Softwareentwicklung mitgewirkt haben.

Beim BMBF bedanke ich mich für die Finanzierung des interdisziplinären For-

schungsprojektes „Computer Vision zur Biokompatibilitätsprüfung von Implan-

tatwerkstoffen“ (Förderkennzeichen: 17033X10).

Des Weiteren möchte ich mich bei meinen ehemaligen Kollegen an der FH

Südwestfalen, insbesondere Herrn Friedhelm Krause für die sehr angenehmen

Jahre der Zusammenarbeit bedanken.

Ebenso bedanke ich mich bei den Herren Bernd Dippel und Christian Schäfer

für das Korrekturlesen der Arbeit.

Von Herzen möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, ohne Euch hätte ich

das nie geschafft! Auch meiner Freundin Senada Mulalic gilt mein Dank für ihre

Unterstützung, ihr Verständnis und ihre Geduld.

Inhaltsverzeichnis v

Inhaltsverzeichnis

Kurzfassung ........................................................................................................ ii

Abstract .............................................................................................................. iii

Danksagung ....................................................................................................... iv

Inhaltsverzeichnis ................................................................................................ v

Symbolverzeichnis ............................................................................................. ix

Tabellenverzeichnis ............................................................................................. x

Abbildungsverzeichnis .................................................................................... xviii

1. Einleitung ........................................................................................................ 1

1.1 Motivation und Zielsetzung .................................................................. 3

1.2 Gliederung der Arbeit ........................................................................... 6

2. Stand der Forschung ...................................................................................... 8

2.1 Segmentierungsverfahren für biomedizinische Anwendungen ............ 8

2.2 Verfahren zur Separation agglomerierter Zellen ................................ 10

2.3 Bestehende Zellanalysesysteme ....................................................... 12

2.4 Schlussfolgerung ............................................................................... 13

3. Vorbereitungen für die Biokompatibilitätsanalyse ......................................... 16

3.1 Probenaufarbeitung ........................................................................... 16

3.2 Zellkultivierung ................................................................................... 17

3.2.1 Vergleich der Färbemethoden ............................................ 19

4. Verwendete Hard- und Software .................................................................. 21

4.1 Visual Studio 2010 ............................................................................. 21

4.2 Halcon Bildverarbeitungsbibliothek .................................................... 21

4.3 Softwarearchitektur ............................................................................ 22

4.3.1 Dynamisches Einbinden von Programmmodulen ............... 22

4.3.2 Grundlegender Programmablauf ........................................ 24

4.4 Mikroskop und Kamera ...................................................................... 26

5. Segmentierung zytochemisch gefärbter Zellbereiche ................................... 27

5.1 Bildvorverarbeitung ........................................................................... 27

5.1.1 Reduktion von Bildartefakten durch Ausnutzung besonderer

Farbwertbeziehungen im RGB-Farbraum ........................... 27

5.1.2 Ergebnisse ......................................................................... 29

5.2 Untersuchung verschiedener Verfahren zur Segmentierung der

Zellbereiche ....................................................................................... 35

5.2.1 Schwellwertverfahren ............................................................... 35

5.2.1.1 Ergebnisse ............................................................................. 39

Inhaltsverzeichnis vi

5.2.2 Histogrammbasierte Methode ............................................ 41

5.2.2.1 Ergebnisse ............................................................................. 43

5.2.3 Histogram-Backprojection-Algorithmus .............................. 44

5.2.3.1 Ergebnisse ............................................................................. 46

5.3 Diskussion der Ergebnisse zur Segmentierung zytochemisch gefärbter

Zellbereiche ....................................................................................... 46

6. Separation agglomerierter Zellen ................................................................. 52

6.1 Kontextbasiertes Trennverfahren ....................................................... 54

6.1.1 Ergebnisse ......................................................................... 64

6.2 Klassifizierung segmentierter Zellbereiche ........................................ 66

6.2.1 Ergebnisse ......................................................................... 67

6.3 Zellkerndetektion ................................................................................ 68

6.3.1 Zellkerndetektion mit Hilfe eines Künstlich Neuronalen

Netzes (KNN) ...................................................................... 68

6.3.1.1 Datenerzeugung für das KNN ................................................ 69

6.3.1.2 Verbesserung der Klassifikationsleistung .............................. 70

6.3.1.3 Architektur und Lernparameter des KNN ............................... 71

6.3.1.4 Ergebnisse ............................................................................. 72

6.3.2 Zellkerndetektion auf Basis des Histogram-Backprojection-

Algorithmus ......................................................................... 73

6.3.2.1 Separation der Zellkernbereiche zur Optimierung der

Kerndetektion.................................................................... 77

6.3.2.2 Ergebnisse ............................................................................. 79

6.3.3 Diskussion der Ergebnisse ................................................. 80

6.4 Zellseparation in Clustern mit Verengungen an Zellkontaktstellen ..... 83

6.4.1 Lokalisierung der Verengungen an den Zellkontaktstellen . 83

6.4.2. Berechnung der kürzesten Pfade zwischen benachbarten

Zellkernbereichen ............................................................... 85

6.4.3 Generierung der Zellseparationslinien innerhalb der Cluster87

6.4.4 Ergebnisse ......................................................................... 89

6.5 Zellseparation in Clustern ohne Verengungen an Zellkontaktstellen . 91

6.5.1 Wachstumssimulation ........................................................ 91

6.5.2 Ergebnisse ......................................................................... 98

6.6 Zellseparation in Clustern mit Verengungen an Zellkontaktstellen ohne

Berücksichtigung der Zellkerne ......................................................... 99

6.6.1 Ergebnisse ....................................................................... 100

6.7 Randzellenbehandlung .................................................................... 101

6.7.1 Ergebnisse ....................................................................... 104

6.8 Diskussion der Ergebnisse zu den Separationsverfahren ................ 105

7. Automatisierung der Algorithmenauswahl .................................................. 112

7.1 Automatische Auswahl der geeigneten Zellsegmentierungsmethode113

7.2 Automatische Auswahl der geeigneten Zellseparationsmethode ..... 115

Inhaltsverzeichnis vii

8. Automatische Parametereinstellung ........................................................... 118

8.1 Automatische Parametereinstellung für die Zellsegmentierung ....... 118

8.2 Automatische Parametereinstellung für die CBS Methode .............. 123

8.2.1 Ergebnisse zur automatischen Parametereinstellung für die

CBS Methode ................................................................... 125

8.3 Diskussion der Ergebnisse zu den automatischen

Parametereinstellungen ................................................................... 126

9. Bewertung des Biokompatibilitätsgrades .................................................... 129

9.1 Quantitative Bewertung der Biokompatibilität................................... 129

9.2 Untersuchung verschiedener Stichprobenumfänge zur Berechnung der

durchschnittlichen Zellanzahl einer Probe ....................................... 132

9.3 Simulation unterschiedlich bioverträglicher Materialien ................... 136

9.4 Qualitative Bewertung der Biokompatibilität ..................................... 138

9.5 Diskussion der Ergebnisse zur Bewertung des

Biokompatibilitätsgrades .................................................................. 140

10. Ergebnisse und Diskussion ...................................................................... 142

10.1 Generalisierungsleistung der Software .......................................... 149

11. Zusammenfassung und Ausblick .............................................................. 155

12. Literaturverzeichnis .................................................................................. 158

13. Anhang ..................................................................................................... 165

13.1 Untersuchung zur Farbverteilung von Korrosionserscheinungen auf

dem Material Titan* ......................................................................... 165

13.2 Untersuchung zur Farbzusammensetzung der verwendeten

Materialien ....................................................................................... 168

13.3 Bewertung der in Kap. 5.2 vorgestellten Verfahren zur

Segmentierung von Zellen ............................................................... 171

13.4 Untersuchung zur Klassifizierung der Zellbereiche mit Hilfe

geometrischer Merkmale ................................................................. 176

13.5 Untersuchung zur Farbzusammensetzung der Kernbereiche und der

restlichen Zelle ................................................................................ 177

13.6 Untersuchung zur Zellzählung vor Anwendung der

Separationsverfahren ...................................................................... 181

13.7. Zellzählung mit dem Algorithmus aus Kap. 6.4 bei vorgeschalteter

CBS und ohne CBS ......................................................................... 183

13.8. Vergleich der automatischen Kernzählung auf Basis eines KNN zur

Referenz .......................................................................................... 184

13.9 Vergleich der automatischen Kernzählung auf Basis des HB-

Algorithmus mit der Referenzzählung .............................................. 185

13.10 Zellzählung mit der Wachstumssimulation im Vergleich zur

Referenzzählung ............................................................................. 189

Inhaltsverzeichnis viii

13.11 Zellzählung mit dem Algorithmus aus Kap. 6.6 und Vergleich mit der

Referenzzählung ............................................................................. 191

13.12 Bewertung der in Kap. 6 vorgestellten Verfahren zur Separation

zusammengewachsener Zellen ....................................................... 192

13.13 Bewertung der in Kap. 8 vorgestellten Methoden zur automatischen

Parametereinstellung ....................................................................... 194

13.14 Untersuchung verschiedener Stichproben der Probenoberfläche 197

13.15 Untersuchung zur manuellen Zellzählung in Suspension und auf der

Probenoberfläche ............................................................................ 198

13.16 Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate ........................ 200

13.17. Elimination von Ausreißern mit Hilfe des Grubbs-Tests .............. 201

Publikationsliste .............................................................................................. 204

Lebenslauf ...................................................................................................... 206

Eidesstattliche Erklärung ................................................................................ 208

Symbolverzeichnis ix

Symbolverzeichnis

L929: mouse connective tissue fibroblast established from the normal subcuta neous areolar and adipose tissue of a male C3H/An mouse MC3T3: MC3T3- E1 mouse embryo/fetus calvaria fibroblasts Titan*: Cp- Titan grade2, commercially pure Stahl*: rostfreier Stahl 14404 εB(Z): Erosion des Bildbereiches Z mit einem Strukturelement B Epithel: Bei diesem Begriff handelt es sich um eine Sammelbezeichnung für Deckgewebe und Drüsengewebe. Das Epithel ist neben Muskel-, Nerven- und Bindegewebe eine der vier Grundgewebearten. BHK-21: Baby Hamster Kidney – Nierenzellen vom Hamster L132: humane Lungenendothelzellen

Tabellenverzeichnis x

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Kriterien für die in vitro-Biokompatibilität in Zell- und

Gewebekulkulturen (3) ............................................................................... 2

Tabelle 2: Durchzuführende Schleif- und Polierschritte .................................... 17

Tabelle 3: Materialspezifische Einwirkzeiten der Kristallviolett und May-

Grünwald Färbung ................................................................................... 19

Tabelle 4: Berechnung des Jaccard-Koeffizient für 25 ausgewählte Zellen mit

naheliegenden Artefakten, deren Segmentierungsergebnis durch die

Bildvorverarbeitung manipuliert wird. Als Segmentierungsmethode dient

das Schwellwertverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1 ............................. 31

Tabelle 5: Vergleich der Zellzählung mit der vorgestellten Bildvorverarbeitung

(1) und ohne Bildvorverarbeitung (2) zur Referenzzählung bei

Verwendung des Materials Stahl* und Titan*. Eingesetzt wird hier das

Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1 und das

Separationsverfahren, beschrieben in Kap. 6.4 mit vorgeschalteter CBS

(Kap. 6.1); AZ: Automatische Zellzählung; FP: Falsch-positiv (zuviel)

Detektion; FN: Falsch-negativ (vergessen) Detektion; KD: Korrekte

Detektion (AZ-FP); REF: Referenzzählung; RFP: Relative Falsch-positiv

Detektion (FP / REF * 100); RFN: Relative falsch-negativ Detektion (FN /

REF * 100); ERR: Relativer Fehler (((REF – AZ) / REF) * 100) ............... 32

Tabelle 6: Vergleich der Zellzählung mit (1) der vorgestellten

Bildvorverarbeitung und ohne (2) Bildvorverarbeitung zur Referenzzählung

bei Verwendung des Materials Aluminium. Verwendung findet hier das

Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1 und das

Separationsverfahren, beschrieben in Kap. 6.4; Zeichenerklärung siehe

Tabelle 5 .................................................................................................. 34

Tabelle 7: Schwellwerte zur Segmentierung der L929- und MC3T3-Zellbereiche

bei unterschiedlichen Materialien; SO,R: Oberer Schwellwert des

Rotkanals; SU,R: Unterer Schwellwert des Rotkanals; SO,G: Oberer

Schwellwert des Grünkanals; SU,G: Unterer Schwellwert des Grünkanals;

SO,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; SU,B: Unterer Schwellwert des

Blaukanals ............................................................................................... 36

Tabelle 8: Schwellwerte zur Segmentierung der Materialbereiche innerhalb der

bereits erfassten Zellbereiche; SO,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals;

SU,R: Unterer Schwellwert des Rotkanals; SO,G: Oberer Schwellwert des

Grünkanals; SU,G: Unterer Schwellwert des Grünkanals; SO,B: Oberer

Schwellwert des Blaukanals; SU,B: Unterer Schwellwert des Blaukanals 38

Tabelle 9: Bewertung der Qualität des Schwellwertverfahrens für

unterschiedliche Zelllinien, Materialien und Mikroskopkontraste mit Hilfe

des Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auflicht- Hellfeld; A-DF: Auflicht-

Tabellenverzeichnis xi

Dunkelfeld; D-HF: Durchlicht- Hellfeld; D-PK: Durchlicht- Phasenkontrast

................................................................................................................. 40

Tabelle 10: Bewertung der Qualität des histogrammbasierten

Schwellwertverfahrens für unterschiedliche Zelllinien und

Mikroskopkontraste mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auflicht-

Hellfeld; A-DF: Auflicht-Dunkelfeld; D-HF: Durchlicht-Hellfeld; D-PK:

Durchlicht-Phasenkontrast ....................................................................... 43

Tabelle 11: Bewertung der Qualität des Histogram-Backprojection-Verfahrens

für unterschiedliche Zelllinien und Mikroskopkontraste mit Hilfe des

Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auflicht-Hellfeld; A-DF: Auflicht-Dunkelfeld;

D-HF: Durchlicht-Hellfeld; D-PK: Durchlicht-Phasenkontrast ................. 46

Tabelle 12: Benötigte Rechenzeit der in Kap. 5.2.1 bis Kap. 5.2.3 vorgestellten

Segmentierungsverfahren auf Basis eines Intel Core i7, 3.2GHz ............ 47

Tabelle 13: Vergleich der Jaccard-Koeffizienten der in Kap. 5.2.1 – 5.2.3

vorgestellten Zellsegmentierungsverfahren für die Zelltypen L929 und

MC3T3 bei unterschiedlichen Materialien und Mikroskopkontrasten; Die

grün hinterlegten Tabellenzellen zeigen das für den aktuell betrachteten

Mikroskopkontrast am besten geeignete Segmentierungsverfahren ....... 48

Tabelle 14: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung mit dem

Segmentierungsverfahren aus Kap. 5.2.1 vor Anwendung der

Separationsmethoden .............................................................................. 51

Tabelle 15: Schematische Darstellung möglicher Objektgeometrien an einer

Kontaktstelle ............................................................................................ 61

Tabelle 16: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen Zählung

von 2376 L929-Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche Werte

des Parameters r1 .................................................................................... 62

Tabelle 17: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen Zählung

von 2376 L929-Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche Werte

des Parameters a ..................................................................................... 63

Tabelle 18: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen

Zellzählung von 2376 Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche

Werte des Parameters x .......................................................................... 63

Tabelle 19: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen

Zellzählung von 2376 Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche

Werte des Parameters y .......................................................................... 63

Tabelle 20: Vergleich der Rechenzeit für den Separationsalgorithmus (Kap. 6.4)

ohne CBS und mit CBS auf einer i7 3,2GHz CPU mit Parallelverarbeitung.

................................................................................................................. 64

Tabelle 21: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung mit dem

Separationsverfahren aus Kap. 6.4 ohne und mit vorgeschalteter CBS .. 65

Tabelle 22: Vergleich der automatischen Klassifizierung der Zellbereiche in

Einzelzellen mit der Klassifizierung durch einen Experten; REF: Anzahl

klassifizierter Zellen durch einen Experten; FK: Anzahl falsch klassifizierter

Tabellenverzeichnis xii

Zellbereiche durch die Software; Relativer Fehler: Relativer Fehler der

Klassifikation durch die Software ............................................................. 67

Tabelle 23: Statistische Daten zur automatischen Kernzählung auf Basis eines

KNN ......................................................................................................... 73

Tabelle 24: Parametereinstellungen für die verwendeten Farbtemplates zur

Zellkerndetektion mittels HB-Algorithmus; ACMin: Minimal zulässige

Kernfläche; c: Anzahl der verwendeten Farben bei der Unterabtastung der

verwendeten 24bit-RGB Bilder (2563 Farben) zur Reduktion der

Rechenzeit, vgl. (55) ................................................................................ 75

Tabelle 25: Statistische Daten zur automatischen Kernzählung auf Basis des

HB-Algorithmus ........................................................................................ 79

Tabelle 26: Statistische Daten zur automatischen Kernzählung auf Basis des

HB-Algorithmus mit anschließender Kernseparation ............................... 79

Tabelle 27: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung unter

Verwendung des in Kap. 6.4 beschriebenen Verfahrens ......................... 90


Verwendung des in Kap. 6.4 beschriebenen Verfahrens mit

vorgeschalteter CBS ................................................................................ 91

Tabelle 29: Vergleich der Flächenapproximation von 100 MC3T3 Zellen innerhalb

verschiedener Cluster bei unterschiedlichen maximalen

Wachstumsgeschwindigkeiten p .................................................................. 97

Tabelle 30: Durchschnittlicher Jaccard-Koeffizient für die Separation von 100

L929- und 100 MC3T3 Zellen mit Hilfe des in Kap. 6.5 vorgestellten

Separationsverfahrens ............................................................................. 98

Tabelle 31: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung mit der

Wachstumssimulation .............................................................................. 99


Verwendung des in Kap. 6.6 beschriebenen Verfahrens ....................... 101

Tabelle 33: Vergleich der automatischen Zellzählung ohne

Randzellenbehandlung mit der Referenzzählung; AZ: Computergestützte

Zellzählung; REF: Referenzzellzählung durch einen Experten; ERR:

Relative Abweichung der automatischen Zellzählung von der

Referenzzählung .................................................................................... 104

Tabelle 34: Vergleich der Rechenzeiten zwischen den drei

Separationsverfahren für einen Probenausschnitt der Linie L929 auf einer

Intel Core i7 3,2GHz CPU ...................................................................... 106

Tabelle 35: Vergleich des Jaccard-Koeffizienten für 3 verschiedene

Separationsverfahren auf Basis von 200 Zellen (100 L929- und 100

MC3T3 Zellen) ....................................................................................... 107

Tabelle 36: Vergleich der durchschnittlichen Abweichungen der automatischen

Zellzählung zur Referenzzählung für die Separationsverfahren aus Kap.

6.4 – 6.6 für die Linien L929 und MC3T3 unter Berücksichtigung eines

Konfidenzintervalls von 99%. Untersucht wurden pro Zelllinie 100

Tabellenverzeichnis xiii

Probenausschnitte mit insgesamt ca. 20.000 L929 Zellen und ca. 10.000

MC3T3 Zellen ........................................................................................ 110

Tabelle 37: Schwellwerte zur Segmentierung der L929- und MC3T3-

Zellbereiche bei unterschiedlichen Materialien; S1O,R: Oberer Schwellwert

des Rotkanals; S1U,R: Unterer Schwellwert des Rotkanals; S1O,G: Oberer

Schwellwert des Grünkanals; S1U,G: Unterer Schwellwert des Grünkanals;

S1O,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; S1U,B: Unterer Schwellwert des

Blaukanals ............................................................................................. 118

Tabelle 38: Schwellwerte zur Segmentierung der Materialbereiche innerhalb der

bereits erfassten Zellbereiche; S2O,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals;

S2U,R: Unterer Schwellwert des Rotkanals; S2O,G: Oberer Schwellwert des

Grünkanals; S2U,G: Unterer Schwellwert des Grünkanals; S2O,B: Oberer

Schwellwert des Blaukanals; S2U,B: Unterer Schwellwert des Blaukanals

............................................................................................................... 120

Tabelle 39: Schwellwerte zur Segmentierung der L929- und MC3T3-

Zellbereiche bei unterschiedlichen Materialien; S1O,R: Oberer Schwellwert

des Rotkanals; S1U,R: Unterer Schwellwert des Rotkanals; S1O,G: Oberer

Schwellwert des Grünkanals; S1U,G: Unterer Schwellwert des Grünkanals;

S1O,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; S1U,B: Unterer Schwellwert des

Blaukanals ............................................................................................. 121

Tabelle 40: Automatische Parameterfestlegung des genetischen Algorithmus

10-mal hintereinander ausgeführt ............................................... 126

Tabelle 41: Bewertung der Qualität des Schwellwertverfahrens mit manueller

und automatischer Parameterfestlegung für unterschiedliche Zelllinien,

Materialien und Mikroskopkontraste mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten; A-

HF: Auflicht-Hellfeld; A-DF: Auflicht-Dunkelfeld; D-HF: Durchlicht-Hellfeld;

D-PK: Durchlicht-Phasenkontrast .......................................................... 126

Tabelle 42: Zytotoxische Einteilung der Prüfmaterialien laut DIN ISO Norm

10993-5 (5) ............................................................................................ 129

Tabelle 43: Zuordnung der Zellproliferation zu den vier Stufen der Zytotoxizität

............................................................................................................... 132

Tabelle 44: Verschiedene Stichprobenumfänge mit der jeweiligen Abweichung

zum Referenzwert. Für jeden Stichprobenumfang wurden 10 Versuche

durchgeführt. Zeichenerklärung: Abw.: Die maximale positive und negative

Abweichung der durchschnittlichen Zellanzahl vom Referenzwert [%] .. 133

Tabelle 45: Anpassung der Zellproliferationsgrenzen für die Einordnung in die

Zytotoxizitätsstufe „nicht zytotoxisch“ unter Berücksichtigung der

Gesamtabweichung bei Verwendung einer Stichprobe mit 15 Bildern und

bei Verwendung der vollständigen Probe für die Zellzählung ................ 136

Tabelle 46: Formaldehyd-Verdünnungsreihe mit einer Konzentration von 0,0

µg/ml bis 0,5 µg/ml in 0,1 µg/ml Schritten für die Linie L929 und bis 1,0

µg/ml für MC3T3 Zellen auf dem Material Polystyrol. Abhängig von der

Tabellenverzeichnis xiv

Proliferationsrate erfolgt eine Interpretation des zytotoxischen Zustandes

der Zellen ............................................................................................... 137

Tabelle 47: Auswertung der morphologischen Merkmale für eine Formaldehyd-

Verdünnungsreihe mit einer Konzentration von 0,0 µg/ml bis 0,5 µg/ml in

0,1 µg/ml Schritten für die Linie L929 und bis 1,0 µg/ml für MC3T3 Zellen

auf dem Material Polystyrol. Bei den in der Tabelle angegebenen Daten

handelt sich jeweils um Durchschnittswerte aus 15 verschiedenen

Probenausschnitten; ∆K: Relative Abweichung zur Kompaktheit bei einer

Formaldehydkonzentration von 0,0 µg/ml .............................................. 139

Tabelle 48: Übersicht der statistischen Daten zur Genauigkeit der Zellzählung

der verschiedenen Separationsverfahren .............................................. 146

Tabelle 49: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für korrodierte

Artefakte ................................................................................................ 166

Tabelle 50: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für den

Hintergrundbereich ohne korrodierte Artefakte ...................................... 167

Tabelle 51: Farbzusammensetzung des Materials Titan* bei May-Grünwald-

Färbung unter Verwendung eines Auflichtmikroskopes im Hellfeldkontrast

............................................................................................................... 168

Tabelle 52: Farbzusammensetzung des Materials Stahl* bei May-Grünwald-

Färbung unter Verwendung eines Auflichtmikroskopes im Hellfeldkontrast

............................................................................................................... 169

Tabelle 53: Farbzusammensetzung des Materials Polystyrol bei May-Grünwald-

Färbung unter Verwendung eines Durchlichtmikroskopes im

Hellfeldkontrast ...................................................................................... 170

Tabelle 54: Bewertung der Segmentierungsleistung der Verfahren TF:

Schwellwertverfahren, Kap. 5.2.2; TB: Histogrammbasierte Methode, Kap.

5.2.3; HB: Histogram-Backprojection-Algorithmus Kap. 5.2.4 für die

verschiedenen Mikroskopkontraste A-HF: Auflicht-Hellfeld und A-DF:

Auflicht-Dunkelfeld. Die L929-Zellen befinden sich auf dem Substrat Stahl*

und Titan*, daher kommt das Durchlichtmikroskop nicht zum Einsatz ... 172

Tabelle 55: Zeichenerklärung siehe Tabelle 46. Die L929-Zellen befinden sich

auf dem transparenten Substrat Polystyrol, daher kommt das

Auflichtmikroskop nicht zum Einsatz ...................................................... 173

Tabelle 56: Zeichenerklärung siehe Tabelle 46. Die MC3T3-Zellen befinden sich

auf dem Substrat Stahl* und Titan*, daher kommt das Durchlichtmikroskop

nicht zum Einsatz ................................................................................... 174

Tabelle 57: Zeichenerklärung siehe Tabelle 46. Die MC3T3-Zellen befinden sich

auf dem transparenten Substrat Polystyrol, daher kommt das


Tabelle 58: Histogrammschwerpunkte Rs, Gs und Bs des Rot- Grün- und

Blaukanals für 50 verschiedene MC3T3 Zellen...................................... 179

Tabelle 59: Histogrammschwerpunkte Rs, Gs und Bs des Rot- Grün- und

Blaukanals für 50 verschiedene L929 Zellen ......................................... 180

Tabellenverzeichnis xv

Tabelle 60: Vergleich der automatischen L929-Zellzählung mit dem


Separationsmethoden im Vergleich zur Referenzzählung; AZ:

Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte

Referenzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR:

Relativer Fehler (((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100) ............. 181

Tabelle 61: Vergleich der automatischen MC3T3-Zellzählung mit dem


Separationsmethoden im Vergleich zur Referenzzählung; AZ:




Tabelle 62: Vergleich der automatischen L929-Zellzählung mit dem Algorithmus

aus Kap. 6.4 bei vorgeschalter CBS (1) und ohne CBS (2); AZ:




Tabelle 63: Vergleich der automatischen Kernzählung auf Basis eines KNN mit

der Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF:

Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm:

Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer Fehler (((REF Norm

– AZ Norm) / REF Norm) * 100) ............................................................. 184

Tabelle 64: Vergleich der automatischen L929-Kernzählung auf Basis des HB-

Algorithmus mit der Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung;

REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm:


– AZ Norm) / REF Norm) * 100) ............................................................. 185

Tabelle 65: Vergleich der automatischen MC3T3-Kernzählung auf Basis des

HB-Algorithmus mit der Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung;

REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm:


– AZ Norm) / REF Norm) * 100). ............................................................ 186

Tabelle 66: Automatische L929-Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus mit

anschließender Kernseparation im Vergleich zur Referenzzählung; AZ:




Tabelle 67: Automatische MC3T3-Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus

mit anschließender Kernseparation im Vergleich zur Referenzzählung; AZ:




Tabellenverzeichnis xvi

Tabelle 68: Vergleich der L929-Zellzählung (1) sowie der MC3T3-Zellzählung

(2) mit der Wachstumssimulation zur Referenzzählung; AZ 1:

Automatische L929-Zellzählung; AZ 2: Automatische MC3T3-Zellzählung;

REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ 1

Norm: Normierte automatische L929-Zellzählung; AZ 2 Norm: Normierte

automatische MC3T3-Zellzählung; ERR 1: Relativer Fehler für den Typ

L929 (((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100); ERR 2: Relativer

Fehler für den Typ MC3T3 ..................................................................... 189

Tabelle 69: L929-Zellzählung auf Basis des Algorithmus in Kap. 6.6 im

Vergleich zur Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF:

Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm:


– AZ Norm) / REF Norm) * 100) ............................................................. 191

Tabelle 70: Berechnung des Jaccard-Koeffizienten für 100 separierte L929-

Zellen aus 10 verschiedenen Probenausschnitten. Verfahren A: Kap. 6.4;

Verfahren B: Kap. 6.5; Verfahren C: Kap. 6.6 ........................................ 192

Tabelle 71: Berechnung des Jaccard-Koeffizienten für 100 separierte MC3T3-

Zellen aus 10 verschiedenen Probenausschnitten. Verfahren A: Kap. 6.4;

Verfahren B: Kap. 6.5; Verfahren C: Kap. 6.6 ........................................ 193

Tabelle 72: Bewertung der Segmentierungsleistung des in Kap. 8.1

beschriebenen Verfahrens für die verschiedenen Mikroskopkontraste A-

HF: Auflicht-Hellfeld und A-DF: Auflicht-Dunkelfeld. Die L929-Zellen

befinden sich auf dem Substrat Stahl* und Titan*, daher kommt das

Durchlichtmikroskop nicht zum Einsatz .................................................. 194



HF: Auflicht-Hellfeld und A-DF: Auflicht-Dunkelfeld. Die L929-Zellen

befinden sich auf dem Substrat Polystyrol, daher kommt das

Auflichtmikroskop nicht zum Einsatz ..................................................... 195



HF: Auflicht-Hellfeld und A-DF: Auflicht-Dunkelfeld. Die MC3T3-Zellen

befinden sich auf dem Substrat Stahl* und Titan*, daher kommt das

Durchlichtmikroskop nicht zum Einsatz .................................................. 195



HF: Auflicht-Hellfeld und A-DF: Auflicht-Dunkelfeld. Die MC3T3-Zellen

befinden sich auf dem Substrat Polystyrol, daher kommt das


Tabelle 76: Verschiedene Stichprobenumfänge mit der jeweiligen Abweichung

zum Referenzwert. Für jeden Stichprobenumfang wurden 10 Versuche

durchgeführt. Die zufälligen Stichproben umfassen 50, 30 und 10 Bilder,

die gezielt ausgewählten Stichproben hingegen 15, 10 und 5 Bilder.

Tabellenverzeichnis xvii

Zeichenerklärung: Ø: Durchschnittliche Zellanzahl der Stichprobe; σ:

Standardabweichung der Stichprobe; ∆REF: relative Abweichung der

durchschnittlichen Zellanzahl der Stichprobe zum Referenzwert; Abw.: Die

maximale positive und negative Abweichung der durchschnittlichen

Zellzahl vom Referenzwert [%] .............................................................. 197

Tabelle 77: Manuell ermittelte Zellanzahl für 6 Proben in Suspension. Pro Probe

wurden 10 Zählungen durchgeführt und der Mittelwert gebildet ............ 198

Tabelle 78: Manuell ermittelte Zellanzahl auf der Oberfläche von 3 Proben .. 199

Tabelle 79: Manuell ermittelte Zellanzahlen für 6 Proben in Suspension

(Versuchsreihe A) und 3 Proben unter dem Mikroskop, zunächst manuell

(Versuchsreihe B) und dann computergestützt gezählt (Versuchsreihe C).

Für jede Probe in Suspension wurden 10 Zählungen eines bestimmten

Volumens durchgeführt und auf das Gesamtvolumen hochgerechnet. Aus

den 10 Messungen wird schließlich der Mittelwert gebildet. .................. 200

Tabelle 80: Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate. Es werden 4

verschiedene Methoden der Prüfung vorgestellt. A: Manuelle Zellzählung

mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer; B: Computergestützte

Zellzählung anhand einer Stichprobe mit einem Umfang von 15

Probenausschnitten; C: Computergestützte Zellzählung der vollständigen

Probe; D: Computergestützte Zellzählung ebenfalls von der vollständigen

Probe, wobei hier die Probe im Gegensatz zur Methode C automatisch

durch ein an das Mikroskop installiertes Achssystem abgescannt wird. Die

Rechenzeiten in der Spalte „Automatische Zellzählung“ sind in Klammern

gesetzt, da es sich hier ausschließlich um automatisierte Arbeitsschritte

handelt ................................................................................................... 200

Tabelle 81: Testwerte des Grubbs-Tests für die Versuchsreihen A, B und C zur

Identifikation von Ausreißern. Als Signifikanzniveau wurde α = 5%

gewählt. Aus der Grubbs-Tabelle (84) erhält man für n = 6 Messwerte und

α=5% einen Schwellwert SA = 1,82. Für n = 3 Messwerte und ebenfalls

α=5% resultiert ein Schwellwert SB = SC = 1,15. .................................... 202

Abbildungsverzeichnis xviii

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Zellmorphologische Änderung bei Abnahme der Biokompatibilität

(3) .............................................................................................................. 2

Abbildung 2: Links: Agglomerierte L929 Zellen auf dem Material Stahl*. Sie

bilden oft Verengungen an den Zellkontaktstellen. Rechts: Kompakt

zusammenhängende Zellen vom Typ MC3T3 auf dem Material Titan*. Die

Bilder wurden im Biotechnologielabor der Fachhochschule Südwestfalen

aufgenommen ............................................................................................ 4

Abbildung 3: Zellkernfärbung mit DRAQ5

Abbildung 4: Zellfärbung mit May- Grünwald...................................................... 6

Abbildung 5: Ablauf bei der Aufarbeitung der Proben ...................................... 16

Abbildung 6: Kristallviolett gefärbte MC3T3-Zellen ........................................... 19

Abbildung 7: May-Grünwald gefärbte MC3T3-Zellen ....................................... 19

Abbildung 8: Architektur der Halcon Bibliothek (Quelle: MVTec GmbH) .......... 22

Abbildung 9: Programmablauf zur dynamischen Einbindung von

Programmmodulen .................................................................................. 23

Abbildung 10: Aktivitätsdiagramm zum allgemeinen Programmablauf bei der

Zellanalyse ............................................................................................... 25

Abbildung 11: L929 Zellen auf dem Substrat Titan mit einigen Bildartefakten.

Der vergrößerte Ausschnitt zeigt eine Zelle im Teilungsprozess mit

benachbarter Störquelle q. Diese Störquelle wird als Teil der Zelle erfasst

(grüne Kontur). ......................................................................................... 28

Abbildung 12: Links: Segmentierter Zellbereich ohne Bildvorverarbeitung;

Rechts: Segmentierter Zellbereich mit Bildvorverarbeitung .................... 29

Abbildung 13: a: Zwei Objekte liegen übereinander. Der Jaccard-Koeffizient

beträgt 1; b: Zwei Objekte überlappen sich teilweise. Der Jaccard-

Koeffizient beträgt 0,33; c: Zwei Objekte besitzen keine gemeinsame

Schnittmenge. Der Jaccard-Koeffizient ist 0 ............................................ 30

Abbildung 14: MC3T3-Zellen auf dem Substrat Aluminium. Es liegen starke

Korrosionserscheinungen im Bild vor ....................................................... 33

Abbildung 15: Ergebnis der Bildvorverarbeitungsmethode nach Anwendung auf

den in Abb. 14 dargestellten MC3T3-Probenausschnitt ........................... 34

Abbildung 16: Verschiedene Zellbereiche ........................................................ 36

Abbildung 17: Links: Zellcluster ohne Detektion der eingeschlossenen Titan*-

Bereiche. Rechts: Die im Zellbereich erfassten Titan*-Flächen (orange

markiert) ................................................................................................... 37

Abbildung 18: Schematischer Ablauf der Zellsegmentierung mit Hilfe der

Schwellwertmethode für alle Farbkanäle eines RGB-Bildes .................... 39

Abbildung 19: MC3T3 Zellen auf dem Material Stahl unter Verwendung des

Hellfeldkontrastes beim Durchlichtmikroskop. Die große Zelle mittig im Bild

Abbildungsverzeichnis xix

weist einen teilweise sehr schwachen Kontrastunterschied zum Substrat

auf. Dies beeinflusst die Segmentierungsgenauigkeit. ............................. 40

Abbildung 20: Ablaufdiagramm zur automatischen Bestimmung der

Schwellwertgrenzen SO und SU ................................................................ 42

Abbildung 21: Ablauf der Zellsegmentierung nach der histogrammbasierten

Methode ................................................................................................... 43

Abbildung 22: L929-Zellen auf dem Substrat Stahl* bei 100-facher

Vergrößerung ........................................................................................... 44

Abbildung 23: Farbtemplate für den HB Algorithmus ....................................... 45

Abbildung 24: Ergebnis des HB mit Hilfe des Farbtemplates aus Abb. 22 ....... 45

Abbildung 25: Links: Hellfeldbild von ungefärbten Hefezellen (57); Rechts:

Gradientenbild von Abb. 24 Links ............................................................ 49

Abbildung 26: Zellen des Typs L929 auf dem Material Stahl*. Vereinzelnd

können Agglomerate (grüne Kontur) auftreten ......................................... 52

Abbildung 27: Zellen des Typs MC3T3 auf dem Material Stahl*. Diese Zelllinie

neigt zur Clusterbildung (grüne Kontur) ................................................... 52

Abbildung 28: Ablaufdiagramm zur Zellvereinzelung. Nähere Erläuterungen

siehe Text ................................................................................................ 53

Abbildung 29: Links: Die Kontur des Objektes RC wird mit einem kreisförmigen

Strukturelement C1 abgefahren. Mitte: Der in C1 liegende Hintergrund B

wird durch RA,n in zwei Teilmengen B1 und B2 aufgeteilt. Rechts: Mit Hilfe

von C1 und CR wird geprüft, ob eine Verengung vorliegt .......................... 55

Abbildung 30: Ergebnis der Objekttrennung nach 3 Separationsvorgängen. Es

resultieren 3 neue Objektbereiche RS,1, RS,2, RS,3. Die Objektbereiche RA,2

und RA,3 sind zufällig dem separierten Objekt RS,3 und der Objektbereich

RA,1 des getrennten Objektes RS,1 zugeordnet worden ............................ 56

Abbildung 31: Unregelmäßigkeiten bei einer Objektkontur die dazu führen dass

1BR und 2BR deutlich unterschiedliche Flächenanteile besitzen. ........... 57

Abbildung 32: Programmablaufplan zur Auftrennung eines Objektes RC an

seinen n Engpässen. Erläuterung im Text. .............................................. 58

Abbildung 33: Programmablaufplan zur CBS ................................................... 59

Abbildung 34: Links: 2 Objekte; Mitte: Zwei verbundene Objekte; Rechts: Zwei

verbundene Objekte, wobei ein Objektbereich in C1 hineinragt, der zum

linken Objekt gehört. ................................................................................ 61

Abbildung 35: Links: Die Abtrennung eines Zellausläufers von seiner Zelle ist

nicht erwünscht; Rechts: Die Aufspaltung eines Zellausläufers ist ebenfalls

unerwünscht............................................................................................. 64

Abbildung 36: Die cyan gefärbte Kontur repräsentiert den ursprünglichen

Zellbereich Zi. Die grün gefärbten Konturen repräsentieren Zi,13 (das

Ergebnis nach 13 Iterationen der Erosion). .............................................. 67

Abbildung 37: Durchlauf des Zellbereiches mit einem Fenster der Größe 20s20

Pixel zur Ermittlung der vier Inputinformationen für das KNN .................. 70

Abbildungsverzeichnis xx

Abbildung 38: Links: Prüfbereich zur Klassifizierung des eingeschlossenen

Zellareals; Rechts: Aufteilung des Prüfbereiches bei nicht eindeutiger

Klassifizierung .......................................................................................... 71

Abbildung 39: Ausgewählte Netzarchitektur für die Klassifizierung der

verschiedenen Zellbestandteile................................................................ 72

Abbildung 40: Trainings- und Validierungsfehler in Abhängigkeit der Lernzyklen

................................................................................................................. 72

Abbildung 41: MC3T3-Zellen auf dem Substrat Titan* bei 100-facher

Vergrößerung mit vergrößerten Bildausschnitten verschiedenfarbiger

Kernbereiche............................................................................................ 74

Abbildung 42: L929-Zellen auf dem Substrat Stahl* bei 100-facher

Vergrößerung mit vergrößerten Bildausschnitten verschiedenfarbiger

Kernbereiche............................................................................................ 74

Abbildung 43: Vergrößerte Darstellung der erstellten Farbtemplates für die

Detektion der Zellkernbereiche mittels HB-Algorithmus. Links: Template 1

zur Detektion dunkler Kernbereiche; Rechts: Template 2 zur Detektion

vergleichsweise heller Kernbereiche ........................................................ 74

Abbildung 44: a: Segmentierter Zellbereich (grüne Kontur); b: Ergebnisbild E1

des HB-Algorithmus mit Template 1; c: Ergebnisbild E2 des HB-

Algorithmus mit Template 2; d: Ergebnis der Zellkerndetektion nach der

Weiterverarbeitung von c. Bei den schwarz eingekreisten Kernbereichen

handelt es sich jeweils um zwei Kerne, die jedoch nur als ein Kernbereich

erkannt wurden ........................................................................................ 76

Abbildung 45: Ergebnis der Markergenerierung für MC3T3-Kernbereiche, die

Kontur der ursprünglichen Kernbereiche ist gelb, die generierten Marker

grün dargestellt ........................................................................................ 77

Abbildung 46: Flussdiagramm zum schematischen Ablauf der

Kernbereichdetektion mit Hilfe des HB Algorithmus ................................. 78

Abbildung 47: a: Zellcluster vom Typ MC3T3; b: Kerndetektion mit Hilfe des

Histogram Backprojection Algorithmus und anschließendem Closing. Nicht

korrekt detektierte Kernbereiche sind durch rote Pfeile gekennzeichnet; c:

Inverse Distanztransformation von b; d: Wasserscheidentransformation

angewendet auf c (Schwellwert: 10). Übersegmentierte Bereiche sind

durch Pfeile gekennzeichnet; e: Inverse Distanztransformation von b; d:

Wasserscheidentransformation angewendet auf c (Schwellwert: 15). Nicht

alle Kernbereiche wurden korrekt separiert, gekennzeichnet durch die

Pfeile; f: Segmentierte Kernbereiche mit der Methode beschrieben in Kap.

6.3.2 ......................................................................................................... 82

Abbildung 48: Links: Segmentierter L929-Cluster (blaue Kontur); Rechts:

Ermittelte DCPs (blaue Kreisstrukturen) für den im Bild segmentierten

Cluster (orange Kontur). Der rote Pfeil kennzeichnet einen für die

Separation ungeeigneten DCP ................................................................ 84

Abbildungsverzeichnis xxi

Abbildung 49: Definition eines Konturpixels als lokaler maximaler Abstand zum

Rand. Zunächst liegen n Konturpunkte vor dem Maximum, deren

Abstände sich zur linken Seite des umschließenden Rechtecks

vergrößern. Nach dem Maximum folgen n Konturpunkte, deren Abstände

sich zur linken Rechteckseite verkleinern ................................................ 84

Abbildung 50: Mit dem A*-Algorithmus berechneter Pfad (weiß gefärbt) durch

die Zellkernschwerpunkte (schwarze Kreuze) im Cluster ........................ 85

Abbildung 51: Ausgangssituation für die Berechnung des kürzesten Pfades von

der Startposition (grünes Quadrat) zur Zielposition (rotes Quadrat) unter

Berücksichtigung von nicht passierbaren Hindernissen (blaue Quadrate).

Für jedes Nachbarfeld werden die Kosten F, G und H angegeben. ......... 86

Abbildung 52: Berechneter Pfad vom Ausgangspunkt (grünes Quadrat) zum

Zielpunkt (rotes Quadrat) unter Berücksichtigung nicht passierbarer

Hindernisse (blaue Quadrate). Die zu dem kürzesten Pfad gehörenden

Felder sind durch einen roten Kreis gekennzeichnet. .............................. 87

Abbildung 53: Separation zweier zusammengewachsener Zellen.

Zeichenerklärung siehe Text .................................................................... 87

Abbildung 54: Flussdiagramm zum schematischen Ablauf der Zellseparation mit

der in Kap. 6.4 beschriebenen Methode .................................................. 89

Abbildung 55: L929 Zellen auf dem Material Stahl*. Bei den gelb markierten

Bereichen handelt es sich um Zellen, die sich gerade in einem

Teilungsprozess befinden ........................................................................ 90

Abbildung 56: Zwei Objektcluster mit jeweils unterschiedlicher Anzahl an

Objektmerkmalen im Bild ......................................................................... 92

Abbildung 57: Links: Die Objektmerkmale C1,1 und C1,2 befinden sich im

Wachstumsprozess. Der Parameter p ist auf p = 2 gesetzt. Bei

Verwendung von Gl. 21 resultiert p1,1 = 2 und p1,2 = 1. Rechts: Zweite

Iteration des Wachstums. Die weiße Linie repräsentiert die Grenze der

beiden Objekte, nachdem kein Wachstum mehr möglich ist. ................... 93

Abbildung 58: Schematischer Ablauf des Wachstumsprozesses. Die in Li

enthaltenen Objektmerkmale werden durch numerische Werte für jeden

Iterationsschritt repräsentiert. Die Pfeile zeigen auf das nach dem

Wachstumsprozess neu entstandene Objektmerkmal. Weiterführende

Erklärungen sind im nachfolgenden Text enthalten ................................. 95

Abbildung 59: a: Zusammengewachsene MC3T3-Zellen auf dem Material Titan;

b: Ergebnis des HB-Algorithmus zur Kerndetektion; c: Der segmentierte

Zellbereich ist grün umrandet, die detektierten Kernbereiche schwarz

umrandet. Teilweise wurden zwei Kerne als ein Bereich segmentiert; d:

Detektierte Kernbereiche mit starken Verengungen wurden aufgetrennt,

da es sich wahrscheinlich um zwei unterschiedliche Kernbereiche handelt.

................................................................................................................. 96

Abbildung 60: Die Kernbereichflächen (V), aufgetragen über die

Gesamtzellflächen (U) ............................................................................. 97

Abbildungsverzeichnis xxii

Abbildung 61: Ergebnis der Wachstumssimulation. Die Zellgrenzen sind grün

und die Kernbereiche schwarz dargestellt. .............................................. 98

Abbildung 62: MC3T3 Zellen auf dem Material Stahl*; Zellen, die sich nur

teilweise im Bild befinden (rot umrandet), müssen eliminiert werden ..... 101

Abbildung 63: Schematischer Probenausschnitt; Generierung einer

Rechteckkontur (schwarze Kontur) als Hilfsmittel zur Bestimmung der

Randzellen ............................................................................................. 102

Abbildung 64: Ablaufdiagramm zur Randzellenbehandlung nach der

Zellsegmentierung ................................................................................. 103

Abbildung 65: Allgemeine Vorgehensweise bei der Bildanalyse .................... 112

Abbildung 66: Punktdiagramm zur Standardabweichung der Grauwerte für 100

Bilder, aufgenommen am Auflichtmikroskop (blau) und 100 Bilder,

aufgenommen am Durchlichtmikroskop( rot) ......................................... 113

Abbildung 67: Dichtefunktionen der Standardabweichungen von Graustufen in

100 Auflichtbildern (blau) und 100 Durchlichtbildern (rot) ...................... 114

Abbildung 68: Anzahl der Zellkerne pro Cluster im Vergleich für die Zelltypen

L929 und MC3T3 ................................................................................... 115

Abbildung 69: Dichtefunktion des Merkmals KA für den Zelltyp L929 ............ 116

Abbildung 70: Dichtefunktion des Merkmals KA für den Zelltyp MC3T3 ........ 116

Abbildung 71: Histogramm des Rotkanals eines Zellbildes. Die Zellen sind vom

Typ L929, May-Grünwald gefärbt und auf dem Material Stahl aufgebracht.

Das globale Maximum liegt auf dem Index 229 mit 161.299 Pixeln ....... 119

Abbildung 72: Flussdiagramm zum Ablauf der automatischen

Parametereinstellung ............................................................................. 121

Abbildung 73: Zwei Histogramme von Bildern mit Zellen jeweils vom Typ L929,

May-Grünwald gefärbt, aufgenommen am Auflichtmikroskop. Das zweite

Bild ist etwas heller, es besitzt ein leicht nach rechts verschobenes

Histogramm (unten) ............................................................................... 122

Abbildung 74: Beispielhafte fitnessproportionale Aufteilung von 10 Individuen

auf einer Scheibe. Ein Zufallswert im Bereich 1 bis 360 (schwarzer Pfeil)

wählt ein Individuum für die Reproduktion aus....................................... 124

Abbildung 75: Vergleich der Arbeitsschritte der herkömmlichen

Zellzahlbestimmung mit Hilfe von Zählkammern (Verfahren A) mit der

computergestützten Auswertung der Zellbilder (Verfahren B). Erklärung

siehe Text. ............................................................................................. 130

Abbildung 76: Suspensionsmethode zum Aufbringen der Zellen auf die

Probenoberfläche ................................................................................... 131

Abbildung 77: Links: L929-Zellen auf dem Material Stahl mit vergleichsweise

schwacher Zelldichte. Rechts: Deutlich höhere Zelldichte auf derselben

Probe an einer anderen Position ............................................................ 133

Abbildung 78: Zellanzahl für 96 verschiedene Ausschnitte einer Probe (blaue

Raute). Die durchschnittliche Zellanzahl aller Probenausschnitte beträgt

477,23 Zellen (rotes Quadrat) ................................................................ 134

Abbildungsverzeichnis xxiii

Abbildung 79: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei den

Bildaufnahmen der vollständigen Probe. Die Aufnahmen beginnen am

rechten unteren und enden am linken oberen Probenbereich ............... 135

Abbildung 80: Morphologieänderung von L929-Zellen bei unterschiedlichen

Formaldehyd-Konzentrationen. Die unteren Strahlen besitzen einen

farblichen Verlauf von grün (bioverträglich) nach rot (biounverträglich). Der

obere Strahl zeigt die Bioverträglichkeit für den Zelltyp MC3T3 und der

untere Strahl für den Typ L929. Die gestrichelte Linie zeigt ab welcher

Formaldehydkonzentration eine stark zytotoxische Wirkung auf die Zellen

vorliegt ................................................................................................... 141

Abbildung 81: Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate. Es werden 4

verschiedene Methoden der Prüfung vorgestellt. Methode A: Manuelle

Zellzählung mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer; Methode B:

Computergestützte Zellzählung anhand einer Stichprobe mit einem

Umfang von 15 Probenausschnitten; Methode C: Computergestützte

Zellzählung der vollständigen Probe; Methode D: Computergestützte

Zellzählung ebenfalls von der vollständigen Probe, wobei hier die Probe

im Gegensatz zu den Methoden B und C automatisch durch ein an das

Mikroskop installiertes Achssystem abgerastert wird. ............................ 142

Abbildung 82: Versuchsreihe A: Durch einen Experten ermittelte

durchschnittliche Zellanzahl von jeweils 6 Proben (A1 bis A6) des gleichen

Materials mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer. ....................... 144

Abbildung 83: Vergleich der computergestützten vollständigen Zellzählung von

3 Proben (C1 bis C3) mit einer durch einen Experten durchgeführten

Referenzzählung (B1 bis B3). ................................................................ 144

Abbildung 84: Links: Durchschnittliche Zellanzahl der Versuchsreihen A-C vor

Ausschluß der Ausreißer; Rechts: Durchschnittliche Zellanzahl der

Versuchsreihen A-C nach Ausschluss der mit Hilfe des Grubbs-Tests

ermittelten Ausreißer .............................................................................. 145

Abbildung 85: Visualisierung der in Tabelle 48 hinterlegten statistischen Daten

zur Zellzählung der verschiedenen Separationsverfahren. Auf der x-Achse

sind jeweils für die 4 im Vergleich stehenden Verfahren die

Konfidenzintervalle 95%, 99%, 99,9% und 99,99% aufgetragen. Der y-

Wert repräsentiert die Abweichung zur Referenzzählung. Die farbige

Markierung innerhalb der jeweiligen Toleranzbereiche repräsentiert den

Mittelwert. .............................................................................................. 147

Abbildung 87: Links: Segmentierungsergebnis von kristallviolett gefärbten

MC3T3-Zellen; Rechts: Segmentierungsergebnis von May-Grünwald

gefärbten MC3T3-Zellen ........................................................................ 151

Abbildung 88: Links: Segmentierungsergebnis von zweifach

fluoreszenzgefärbten MC3T3 Zellen. Die Zellkerne sind mit dem

Fluoreszenzfarbstoff DAPI und der restliche Zellbereich mit dem

Fluoreszenzfarbstoff Phalloidin angefärbt. Rechts:

Abbildungsverzeichnis xxiv

Segmentierungsergebnis von DAPI-fluoreszenzgefärbten Kernbereichen

humaner Hautzellen ............................................................................... 151

Abbildung 89: Links: Segmentierung von BHK-21 Zellen; Rechts:

Segmentierung von L132 Zellen. Zellflächen weisen eine blaue und

Kernbereiche eine grüne Kontur auf ...................................................... 152

Abbildung 90: Segmentierung von in Suspension befindlichen L929 Zellen. Die

Suspension befindet sich in einer Zählkammer, daher ist das Raster im

Bild sichtbar. .......................................................................................... 153

Abbildung 91: Links: Kalibrierung der Software mit Hilfe eines

Referenzobjektes, hier der bei 10mm eingestellte Messschieber. Rechts:

Vermessung eines 30mm Endmaßes .................................................... 154

Abbildung 92: Zellen vom Typ L929 auf dem Substrat Titan*. Bildartefakte,

hervorgerufen durch Korrosionsprozesse, sind rot und

Hintergrundbereiche ohne Artefakte weiß markiert. ............................... 165

Abbildung 93: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für 10

verschiedene Bildartefakte, hervorgerufen durch Materialkorrosion ...... 166

Abbildung 94: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für 10

verschiedene Hintergrundbereiche ohne Artefakte, hervorgerufen durch

Materialkorrosion ................................................................................... 167

Abbildung 95: Summe der relativen Abweichungen des Rot- und Blaukanals

vom Grünkanal für 10 verschiedene Artefakt- sowie Hintergrundbereiche

............................................................................................................... 168

Abbildung 96: Berechnung der Farbzusammensetzung des Materials Titan* auf

Basis der 5 in grün markierten Bildbereiche .......................................... 169

Abbildung 97: Berechnung der Farbzusammensetzung des Materials Stahl* auf

Basis der 5 in grün markierten Bildbereiche .......................................... 170

Abbildung 98: Berechnung der Farbzusammensetzung des Materials Polystyrol

auf Basis der 5 in grün markierten Bildbereiche .................................... 171

Abbildung 99: Vergleich der Fläche von 100 Einzelzellen und 100 Zellcluster

aus fünf unterschiedlichen Proben der Linie L929 ................................. 176

Abbildung 100: Vergleich der Kompaktheit von 100 Einzelzellen und 100

Zellcluster aus fünf unterschiedlichen Proben der Linie L929 ................ 176

Abbildung 101: Die Kompaktheit aufgetragen über die Zellfläche für 100

Einzelzellen (blau) und 100 Zellcluster (rot) ........................................... 177

1. Einleitung 1

1. Einleitung

Der Einsatz von Implantaten im menschlichen Körper ist ein wichtiger Bestand-

teil der modernen Medizin. So führen beispielsweise Gelenkprothesen zur Stei-

gerung der Lebensqualität, wenn die Funktionalität eines oder mehrerer Gelen-

ke nicht mehr gegeben ist. Darüber hinaus können Stents oder Herzschrittma-

cher die Lebensdauer erkrankter Menschen verlängern.

Untersuchungen zur demographischen Entwicklung (1) zeigen, dass die durch-

schnittliche Lebenserwartung der Bevölkerung stetig anwächst. Dies führt zu

einer steigenden Nachfrage an Implantaten, da im fortgeschrittenen Alter ver-

mehrt Ermüdungserscheinungen verschiedener Körperteile, z.B. des Hüftge-

lenks auftreten, die teilweise durch geeignete Implantate kompensiert werden

können. Ein weiterer Grund für die zunehmende Nachfrage an Implantatwerk-

stoffen liegt in der ständigen Erweiterung des Anwendungsspektrums. So

kommen derzeit z.B. auch Materialien zur Behandlung von arteriellen Erkran-

kungen (2) zum Einsatz.

Die eingesetzten Biomaterialien müssen einerseits die gewünschte Funktion

(Biofunktionalität) erfüllen, z.B. die Übertragung von Lasten. Andererseits ist die

Sicherstellung der Körperverträglichkeit (Biokompatibilität) zu gewährleisten (3).

Der Grad der Biokompatibilität für Knochenimplantate wird nach Schenk (4) in

Inkompatibel, Biokompatibel, Bioinert, Bioaktiv, Induktiv und Konduktiv unter-

teilt. Inkompatible Materialien setzen bestimmte Substanzen in toxischen Men-

gen frei, die Abwehrreaktionen des Körpers hervorrufen und im schlimmsten

Fall zu einer Abstoßung des eingesetzten Implantates führen können. Um dies

zu verhindern, erfolgt vor dem Einsatz eines Implantates eine mehrstufige Bio-

kompatibilitätsprüfung des zugrundeliegenden Materials. Die erste Stufe um-

fasst in-vitro1-Untersuchungen mit isolierten Zellen, die auch Gegenstand der

vorliegenden Arbeit sind. In der zweiten Stufe werden Tierversuche (in-vivo-

Tests) und in der letzten Stufe klinische Untersuchungen am Menschen durch-

geführt (3).

Damit die von unterschiedlichen Laborfachkräften durchgeführte Biokompatibili-

tätsprüfung möglichst einheitlich umgesetzt wird, muss die Durchführung der in-

vitro-Versuche nach der Norm EN ISO 10993-5 (5) erfolgen. Bei der Bewertung

1 In-vitro: Hierbei handelt es sich um organische Vorgänge die außerhalb des lebenden Orga-

nismus stattfinden, z.B. Experimente mit Reagenzgläsern

1. Einleitung 2

der Biokompatibilität wird die Interaktion des Werkstoffs u.a. mit adhärent2

wachsenden Zellen analysiert. Dabei haben sich verschiedene Zellmerkmale

als geeignete Indikatoren für die Bewertung des zugrundeliegenden Materials

herausgestellt (Tabelle 1) (3).

Tabelle 1: Kriterien für die in vitro-Biokompatibilität in Zell- und Gewebekulkulturen (3)

Kriterium (Zellverhalten)

schlecht biokompatibel -> gut biokompatibel

Wachstum / Zelldichte Zellen sterben ab Zellen vermehren sich

Morphologie Abgekugelt Ausgebreitet

Adhäsion Schwach Stark

Benetzung Schlecht Gut

Stoffwechselprodukte Verändert Unverändert

Im Allgemeinen breiten sich Zellen auf einem biokompatiblen Material wesent-

lich stärker aus als auf einem weniger biokompatiblen Werkstoff. Ebenso ver-

ändert sich die Zellmorphologie mit abnehmender Biokompatibilität von flächi-

gen über spindelförmigen bis hin zu kleinen kugelförmigen Zellbereichen (Abb.

1).

Abbildung 1: Zellmorphologische Änderung bei Abnahme der Biokompatibilität (3)

Bei der Durchführung von in-vitro-Tests sollten möglichst die gleichen Zelllinien3

verwendet werden, die auch bei den in-vivo-Tests am Tier oder Mensch im di-

rekten Kontakt mit dem eingesetzten Implantat stehen (3). So ist die Wechsel-

wirkung zwischen dem später eingesetzten Werkstoff und dem umgebenen

Zellgewebe absehbarer. Ein gängiger Zelltyp bei der Biokompatibilitätsprüfung

ist die Linie L929. Dabei handelt es sich um Fibroblasten, die den Bindege-

webszellen zugeordnet sind und ein Implantat im Muskel oder unter der Haut

umgeben können (2).

2 Adhärent wachsende Zellen: Die Zellen haften auf der Probenoberfläche und beginnen zu

wachsen 3 Zelllinie: Ein bestimmter Typ einer Zelle, z.B. L929

1. Einleitung 3

1.1 Motivation und Zielsetzung

In-vitro-Prüfungen werden derzeit meist durch geschulte Laboranten durchge-

führt. Die in Tabelle 1 dargestellten Kriterien zur Beurteilung der Biokompatibili-

tät werden teilweise visuell bestimmt. Der Vorteil einer Sichtprüfung durch La-

borfachkräfte liegt in der Anwendung des großen Erfahrungsschatzes, der

durch ein computergestütztes Verfahren kaum zu ersetzen ist. Nachteile sind

zum einen der größere Zeitaufwand sowie die Fehleranfälligkeit bei den manu-

ell durchgeführten Prüfungen (6; 7; 8). Der Einsatz einer Analysesoftware als

Assistenzsystem für die Laborfachkraft bringt einige Vorteile mit sich. Zu nen-

nen sind die Reduktion der Prüfzeit, u.a. bei der Zellzählung, und die damit ein-

hergehende Kostenreduktion sowie eine objektive Zellanalyse mit reproduzier-

baren Ergebnissen. Mit Hilfe dieser Voruntersuchungen wäre es möglich, die

Kosten für den Prüfaufwand durch ein zertifiziertes Labor zu reduzieren, indem

einige Werkstoffe bereits im Vorfeld ausgeschlossen werden können. Darüber

hinaus können verschiedene Zellmerkmale, z.B. die durchschnittliche Einzel-

zellfläche oder die Kompaktheit bestimmt werden, die von Laborfachkräften oh-

ne zusätzliche Hilfsmittel nicht quantitativ erfassbar sind. Unter der Kompaktheit

ist wie üblich in der Bildverarbeitung

2

4

LK

A (9) zu verstehen. (Gl. 1)

L entspricht der Konturlänge des Objektes und A der Objektfläche.

Das Ziel dieser Arbeit umfasst die Entwicklung einer flexibel einsetzbaren Ana-

lysesoftware, um die genannten Vorteile in den Prozess der Biokompatibilitäts-

prüfung einfließen zu lassen. Unter flexibel ist hier zu verstehen, dass die Soft-

ware nicht nur bei einer bestimmten Zelllinie Anwendung findet, sondern bei

morphologisch unterschiedlichen Zelltypen eine genaue Analyse gewährleisten

soll. Aus diesem Grund wird neben der Zelllinie L929 auch der Typ MC3T3 bei

der Entwicklung der Analysemethoden berücksichtigt. Somit kann das compu-

tergestützte Verfahren neben der Biokompatibilitätsprüfung auch für andere

Applikationen eingesetzt werden, z.B. die Detektion von Korrosionserscheinun-

gen oder das Auswerten von Suspensionskulturen.

Aufgrund der genannten Ziele ergibt sich ein Anforderungsprofil an die zu ent-

wickelnde Software. Sie sollte eine Analyse von Zellen des Typs L929 und

MC3T3 auf unterschiedlichen Materialien wie Glas, Kunststoff oder Metall er-

möglichen. Eine Analyse weiterer Zelllinien ist wünschenswert. Innerhalb der

Zellen ist eine Segmentierung der Zellkerne sowie die genaue Bestimmung der

1. Einleitung 4

Zellanzahl innerhalb des Probenausschnittes zu gewährleisten und auf die ge-

samte Probe hochzurechnen. Des Weiteren ist es erforderlich die Zelldichte und

geometrische Charakteristika wie die Zellfläche und Rundheit im Probenaus-

schnitt zu bestimmen. Für eine individuelle Zellauswertung müssen zu einem

Zellcluster zusammengewachsene Zellen getrennt werden. Neben den automa-

tischen Analysemethoden soll der Anwender die Möglichkeit besitzen im Zwei-

felsfall manuell die Analyse zu optimieren, z.. durch entfernen, editieren oder

trennen von segmentierten Objektbereichen. Eine Stapelverarbeitung soll die

automatisierte Auswertung von mehreren Bildern ermöglichen und Ergebnisda-

ten sowie Bilder zur Laufzeit des Programms abspeichern.Zur späteren Analy-

se von bereits gespeicherten Daten ist eine Importfunktion vorzuse-

henWünschenswert ist eine einfach zu bedienende Benutzeroberfläche auf der

notwendige Parametereinstellungen für die Algorithmen auf separater Ebene

von dafür autorisierten Personen vorgenommen werden.

Die vorliegende Aufgabe beinhaltet einige besondere Herausforderungen. Wäh-

rend des Zellwachstums auf dem zu untersuchenden Material bilden sich oft

agglomerierte Zellbereiche. Zur exakten Zellzahlbestimmung und der Auswer-

tung bestimmter Merkmale wie z.B. der durchschnittlichen Einzelzellfläche oder

Kompaktheit müssen die Zellen separiert vorliegen. Zusammenhängende Zell-

bereiche weisen jedoch unterschiedliche morphologische Charakteristika zwi-

schen verschiedenen Zelllinien auf (Abb. 2).

Abbildung 2: Links: Agglomerierte L929 Zellen auf dem Material Stahl*. Sie bilden oft Veren-

gungen an den Zellkontaktstellen. Rechts: Kompakt zusammenhängende Zellen vom Typ

MC3T3 auf dem Material Titan*. Die Bilder wurden im Biotechnologielabor der Fachhochschule

Südwestfalen aufgenommen

Abb. 2 zeigt links agglomerierte Zellen der Linie L929 mittig im Bild. Sie sind oft

durch Verengungen an den Zellkontaktstellen gekennzeichnet. Hingegen

wachsen Zellen des Typs MC3T3 oft flächig zusammen und bilden kompakte

1. Einleitung 5

Formen. Diese Eigenschaften müssen bei der Analyse berücksichtigt werden,

denn eine hinreichend genaue Zellseparation ist Voraussetzung für eine

korrekte Beurteilung der Biokompatibilität des Substrates.

Darüber hinaus variiert die Morphologie der Zellen relativ stark, so dass die

Klassifikation in vitale und abgestorbene Zellen erschwert wird. Eine weitere

Herausforderung stellt die verwendete Färbemethode dar. Allgemein wird eine

Zellfärbung zur optischen Kennzeichnung verschiedener Bereiche wie z.B. dem

Zellkern durchgeführt, damit eine visuelle Überprüfung der gefärbten Zellareale

möglich ist. Dazu stehen verschiedene Färbemethoden zur Verfügung. Bei der

Fluoreszenzfärbung wird ein Protein der Zelle mit einem fluoreszierenden

Farbstoff (Fluorchrom) markiert. Nach Anregung des Fluorchroms mit Licht

eines definierten Wellenlängenintervalls emittiert es ebenfalls Licht. Das Protein

ist vermehrt in einem bestimmten Zellareal vorzufinden, z.B. dem

Zellkernbereich. Nach diesem Prinzip ist auch eine Mehrfachmarkierung

verschiedener Proteine möglich. Die Visualisierung verschiedener

Zellbestandteile geschieht dann mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops (10).

Vorteil dieser Färbemethode ist der starke Kontrast im Bild, der die

Zellsegmentierung mittels Bildverarbeitungsmethoden einfach gestaltet.

Nachteil ist der im Vergleich zu konventionellen Auflichtmikroskopen hohe

Anschaffungspreis eines Fluoreszenzmikroskopes und ebenfalls höhere Kosten

für die Farbstoffe. Darüber hinaus ist eine dauerhafte Präparation der Zellen

nicht möglich. Im Rahmen dieser Arbeit werden die Bilder mit Hilfe einer

zytochemischen4 Färbung ohne Fluoreszenz analysiert. Zum Einsatz kommt die

so genannte May-Grünwald Färbung (10). Vorteile gegenüber der

Fluoreszenzfärbung sind zum einen die optische Hervorhebung verschiedener

Zellbereiche mit nur einem Färbevorgang. Zum anderen ist die Durchführung

des Färbeprozesses weniger aufwendig und für die Visualisierung kommt ein

konventionelles Durchlicht/- Auflichtmikroskop zum Einsatz. Allerdings fällt der

Bildkontrast bei dieser Färbemethode im Vergleich zum fluoreszenzbasierten

Verfahren geringer aus.

4 Zytochemische Färbung: Die Zellen werden durch eine chemische Reaktion angefärbt

1. Einleitung 6

Abbildung 3: Zellkernfärbung mit DRAQ5 Abbildung 4: Zellfärbung mit May- Grünwald

an lebenden HEK- Zellen (10) an L929 Zellen

In Abb. 3 erscheinen die Zellkerne mit Hilfe einer Fluoreszenzfärbung rot. Auf-

fällig ist der starke Kontrast zum Bildhintergrund. In Abb. 4 sind die Zellen mit

der May-Grünwald Färbung präpariert worden. Bei den größeren Zellen treten

die verschiedenen Zellbereiche durch unterschiedliche Farben auf Kosten eines

geringeren Kontrastes hervor. Folglich wird die Zellsegmentierung bei Verwen-

dung der May-Grünwald Färbung erschwert.

1.2 Gliederung der Arbeit

Nach der Einleitung in das Thema der Biokompatibilitätsprüfung und den Erläu-

terungen zur Problemstellung (Kap. 1.1) leiten sich daraus die Ziele für diese

Arbeit ab. Im folgenden Kapitel (Kap. 2) wird der Stand der Forschung im Be-

reich der Zellsegmentierung sowie Zellseparation beschrieben und daraus ge-

folgert, welche bekannten Verfahren zur Lösung der vorliegenden Aufgabe bei-

tragen könnten und demnach umfassender untersucht werden und für welche

Problemstellungen die Entwicklung neuer Methoden sinnvoll erscheint. Es folgt

die Erläuterung der für die Zellanalyse notwendigen Vorbereitungen. Diese um-

fassen die Probenaufbereitung und die Zellkultivierung (Kap. 3). Anschließend

werden die Softwareanforderungen und das Konzept der Programmarchitektur

vorgestellt (Kap. 4). Im Anschluss daran werden geeignete Verfahren für die

automatische Analyse der untersuchten Zelltypen vorgestellt und diskutiert. Ge-

genstand sind zum einen verschiedene Segmentierungsalgorithmen (Kap. 5)

zur Erfassung der Zellen ebenso wie unterschiedliche Methoden zur Separation

agglomerierter Zellen (Kap. 6). Es schließt sich ein Konzept zur Automatisie-

rung der Algorithmenauswahl (Kap. 7) und zur automatischen Festlegung der

Algorithmenparameter (Kap. 8) an. Die Beurteilung des Biokompatibilitätsgra-

des geschieht unter Zuhilfenahme verschiedener Merkmale der segmentierten

Zellen, wobei geeignete Merkmale in Kap. 9 ausgearbeitet werden. Im Ergeb-

nis- und Diskussionsteil (Kap. 10) wird das computergestützte Verfahren zur

1. Einleitung 7

Beurteilung der Biokompatibilität mit dem konventionellen Verfahren verglichen

und die Vor- und Nachteile diskutiert. Darüber hinaus werden weitere Anwen-

dungsmöglichkeiten mit Hilfe der Zellanalysemethode vorgestellt. Den Schluss

der Arbeit bildet die Zusammenfassung mit einer kurzen Erläuterung von der

Motivation über die Umsetzung der geforderten Ziele bis zu den Ergebnissen.

Die in Kap. 3.1 und Kap. 3.2 beschriebenen Vorgänge zur Probenaufbereitung

sowie Allgemein die Arbeitsschritte vom Aufbringen der verwendeten Zellen auf

die Probenoberfläche bis hin zum Färbeprozess werden im Rahmen des inter-

disziplinären Projektes „BioCV“ von Mitarbeitern des Labors für Biotechnologie

an der FH Südwestfalen durchgeführt.

2. Stand der Forschung 8

2. Stand der Forschung

Die Bildverarbeitung nimmt in der modernen Medizintechnik einen immer höhe-

ren Stellenwert ein und ist für viele Anwendungsbereiche ein wichtiges Werk-

zeug geworden (11; 12). So hat sich eine programmtechnische Auswertung z.B.

zur Detektion von Tumorgewebe (13) oder in der Radiologie zur Unterstützung

des Arztes bei der Diagnosestellung bereits etabliert (3). Hingegen wird die in-

vitro Biokompatibilitätsprüfung von Implantatmaterialien derzeit nach einem

standardisierten Verfahren mit dem geschulten Auge von Laborfachkräften

durchgeführt (5). Zur Unterstützung der Laborfachkräfte bei der Biokompatibili-

tätsprüfung muss ein computergestütztes System zunächst analog zu anderen

biomedizinischen Anwendungsgebieten Zellen in mikroskopischen Bildern

segmentieren können. Dazu finden sich in der Literatur verschiedene Verfahren

(Kap. 2.1).

2.1 Segmentierungsverfahren für biomedizinische Anwendungen

Für die Segmentierung von Zellen in mikroskopischen Bildern steht eine Viel-

zahl an Methoden zur Verfügung. Diese werden typischerweise in die Katego-

rien pixel-, kanten-, regionen-, modell- und texturbasierte Verfahren eingeteilt.

Die in (14; 15; 16; 17) aufgeführten Verfahren stellen beispielsweise verschie-

dene pixelbasierte Schwellwertmethoden vor, die für die Zellsegmentierung

eingesetzt werden können. M. Sezgin et al. (18) haben ca. 40 verschiedene

schwellwertbasierte Verfahren, abhängig von der genutzten Information (z.B.

histogrammbasierte- oder lokalbasierte Schwellwertbildung), in sechs Gruppen

kategorisiert und für verschiedene Anwendungen auf ihre Leistungsfähigkeit hin

getestet. Das Ergebnis zeigt, dass, abhängig vom Anwendungsgebiet, unter-

schiedliche Schwellwertverfahren am besten für die Segmentierung geeignet

sind und keine Methode ausreichend genaue Ergebnisse für alle geprüften An-

wendungsfälle liefert. In (19) werden Zellen mit Hilfe eines Region-Growing-

Algorithmus segmentiert. Nach Auswahl der benötigten Startpunkte innerhalb

grob vorsegmentierter Zellbereiche werden die Nachbarpixel nacheinander auf

Homogenität geprüft. Homogenitätskriterien sind in diesem Fall die Abweichung

des Grauwertes und des Gradientenbetrags zu dem durchschnittlichen Grau-

wert und Gradientenbetrag aller Pixel aus der Vorsegmentierung. Sind die Ho-

mogenitätskriterien erfüllt, wird der benachbarte Pixel der Region hinzugefügt.

Modellbasierte Verfahren werden in (8; 20; 21; 22) vorgestellt. Sie verwenden

zur Objektdetektion im Vorfeld generierte formbasierte Modelle des zu suchen-


den Objektes. Da dieses nicht immer die gleiche Form im Bild aufweist, können

unter Zuhilfenahme deformierbarer Templates (23; 24; 25) morphologisch leicht

variierende Objekte segmentiert werden. Swain und Ballard (26) entwickelten

den Histogram-Backprojection-Algorithmus. Dabei werden nicht formbasierte

Merkmale, sondern Farbwerte im Modell hinterlegt. Auf Basis der Farbhisto-

gramme des Modells und des Bildes, in dem das Objekt gesucht wird, kann auf

die Position des Objektes im Bild geschlossen werden.

In der medizinischen Bildauswertung haben hybride Segmentierungsverfahren

einen großen Stellenwert erlangt (27). Diese Methoden stellen eine Mischung

der Algorithmen aus den o.g. Segmentierungskategorien dar und versuchen die

jeweiligen Vorteile für eine bessere Segmentierung zu kombinieren. Die Wass-

erscheidentransformation ist eine Mischform von regionenbasierter- und kan-

tenbasierter Segmentierung, die in der medizinischen Bildverarbeitung zum

Einsatz kommt.

T. Pommerencke et al. (28) beschreiben ein Verfahren, das mit Hilfe der Wass-

erscheidentransformation Zellkerne und Zellen in mehrfach fluoreszenzgefärb-

ten Gewebeschnitten detektiert. Nach einer Kontrasterhöhung und anschlie-

ßender Gewebesegmentierung erfolgt die Detektion der Zellkerne mit einem

adaptiven Schwellwertverfahren. Überschreiten die Kerne eine bestimmte Flä-

che, wird angenommen, dass es sich um einen Cluster handelt. Die enthaltenen

Kerne werden mit der Wasserscheidentransformation auf Basis lokaler Intensi-

tätsmaxima segmentiert. Die anschließende Ermittlung der Zellgrenzen erfolgt

ebenfalls mit der Wasserscheidentransformation.

Ein weiteres hybrides Segmentierungsverfahren stellen die aktiven Konturen,

auch Snakes genannt, dar (29; 30; 31; 32; 33). Tscherepanow et al. (30) stellen

ein auf aktiven Konturen basierendes Verfahren zur Segmentierung ungefärbter

Zellen in Hellfeld-Mikroskopbildern vor. Im ersten Schritt erfolgt die Generierung

der für die Snakes notwendigen Startkonturen mit Hilfe morphologischer Opera-

tionen und der Distanz-Transformation. Im nächsten Schritt werden die Zellen

mit Hilfe aktiver Konturen segmentiert. Die Vorgehensweise ist dem Balloon-

Verfahren von Cohen (34) sehr ähnlich. Der Unterschied besteht jedoch darin,

dass nicht die Normalenvektoren, sondern die Entfernung der Snakes zur Start-

kontur berücksichtigt wird. Dadurch vermeidet man laut Tscherepanow eine

Konturüberlappung beim Wachstum konkaver Startkonturen.

Mit Methoden aus dem Bereich der Computational Intelligence (CI) stehen wei-

tere Verfahren zur Zellsegmentierung zur Verfügung (35; 36; 37; 38). Die CI ist

ein Teilgebiet der künstlichen Intelligenz und beinhaltet die Fuzzy-Logik, Evolu-

tionäre Algorithmen und Künstliche Neuronale Netze (KNN), die nach dem Vor-


bild der Natur versuchen technische Probleme zu lösen (39). S. Colantonio et

al. (35) entwickelten ein fuzzy-neuronales Verfahren zur Segmentierung von

Kernen der Lymphzellen in mikroskopischen Bildern. Zunächst werden mit ei-

nem fuzzy-c-means basierenden Algorithmus grob die Zellen und der Hinter-

grund segmentiert. Anschließend kommt ein KNN zum Einsatz, dass die vor-

segmentierten Zellen in verschiedene Bereiche, z.B. die Zellkontur oder das

Zytoplasma, klassifiziert. Dazu ist das KNN im Vorfeld mit korrekt klassifizierten

Daten auf die Problemstellung zu trainieren. Zur Klassifizierung einer vorseg-

mentierten Zelle dienen dem KNN die Werte geeigneter Bildmerkmale, z.B. der

durchschnittliche Farbwert oder der Gradientenbetrag, als Inputdaten.

R. Q. Feitosa et al. (37) bieten mit Hilfe eines genetischen Algorithmus zur au-

tomatischen Bestimmung von Parametern eines regionenbasierten Segmentie-

rungsverfahrens eine wissensbasierte Lösung an. Die Wissensbasis besteht

aus im Vorfeld korrekt segmentierten Bildsegmenten. Nach einer zufälligen Ini-

tialisierung der Parameterwerte werden diese in einem evolutionären Prozess

optimiert. Der Prozess endet nach einer vorgegebenen Anzahl an Iterationen

mit der Segmentierung des Bildes unter Verwendung des zuletzt generierten,

entsprechend der vorgegebenen Fitnessfunktion, optimalen Parametersatzes.

Metzler et al. (40) verwenden mit Hilfe eines evolutionären Algorithmus eben-

falls ein wissensbasiertes Verfahren, hier nicht zur automatischen Parametrisie-

rung eines vorgegebenen Segmentierungsverfahrens, sondern zur direkten

Segmentierung verschiedener Gehirnareale in MR-Aufnahmen.

Reham Mohammed et al. (41) stellen ein Verfahren zur Segmentierung von ge-

färbten Leukemie Krebszellen vor. Dazu werden die Farbbilder zunächst in den

C-Y Farbraum transformiert und die Zellsegmentierung auf Basis des Y-Bild-

Histogramms durchgeführt. Zur Bildnachbearbeitung kommt ein Medianfilter

zum Einsatz, anschließend erfolgt die Rücktransformation in den RGB-

Farbraum.

2.2 Verfahren zur Separation agglomerierter Zellen

Die Auswertung von geeigneten Zellmerkmalen bei der Biokompatibilitätsprü-

fung ist ein elementarer Bestandteil, denn die Merkmale dienen zur Beurteilung

des Biokompatibilitätsgrades. Aus diesem Grund müssen möglichst alle im Bild

vorhandenen Zellen segmentiert werden. Allerdings können diese, abhängig

vom Toxizitätsgrad des verwendeten Substrates und vom Zelltyp selbst, im Ver-


lauf ihres Wachstums agglomerieren. Daher ist es notwendig, diese Bereiche

durch geeignete Methoden zu vereinzeln.

B. Nilsson und A. Heyden (42) segmentieren dicht besiedelte Leukozyten aus

dem Knochenmark in mikroskopischen Bildern mit Hilfe der Wasserscheiden-

transformation. Nach einer Segmentierung der Kernbereiche über ein Schwell-

wertverfahren wird eine grauwertbasierte Distanztransformation durchgeführt.

Daran schließt sich eine Wasserscheidentransformation zur Separation sich

teilweise überschneidender Zellkerne an. Um einer durch die Wasserscheiden-

transformation verursachten Übersegmentierung entgegenzuwirken, folgt eine

Zusammenfassung benachbarter Segmente. Das betrifft die Segmente, deren

Durchmesser einen vorgegebenen Schwellwert unterschreiten.

Yung-Kuan Chang et al. (43) segmentieren HEp-2 Zellen in fluoreszenzgefärb-

ten Bildern und trennen zusammengewachsene Zellen voneinander. Zunächst

erfolgt eine Bildvorverarbeitung zur Transformation der Farbbilder in Graustufen

und zur Reduzierung des Rauschens. Die Zellkonturen werden über ein Gradi-

entenverfahren bestimmt und überlappende Zellbereiche auf Basis einer Wass-

erscheidentransformation mit anschließender Distanztransformation separiert.

U. Pal et al. (44) nutzen die bei manchen Zellagglomeraten auftretenden Ver-

jüngungen an den Kontaktstellen zur Separation der Einzelzellen aus. Diese

Verengungen spiegeln sich in den lokalen Minima richtungsabhängigen Ab-

standsfunktionen wider. Unter Einbeziehung eines zellspezifischen Regelwer-

kes werden die resultierenden dominanten Konturpunkte miteinander verbun-

den und separieren die zusammenhängenden Zellen.

M. Grobe et al. (45) stützen sich für die Separation neben den Verengungen an

den Zellkontaktstellen noch auf Farbunterschiede im Überlappungsbereich der

Zellen. Die Zellen sowie deren Kerne werden mit Hilfe eines histogrammbasier-

ten Schwellwertverfahrens aus zwei verschiedenen fluoreszenzgefärbten Bil-

dern segmentiert. Die Separation erfolgt analog mit Hilfe eines histogrammba-

sierten Schwellwertverfahrens unter den Prämissen, dass die überlappenden

Zellbereiche dunkler erscheinen als sich nicht überlappende Bereiche. Des

Weiteren muss jeder Überlappungsbereich durch zwei Einschnürungspunkte in

der Kontur gekennzeichnet sein.

In (46) und (47) werden weitere Separationsmethoden vorgestellt, die auf Basis

der Konturverengungen die zusammenhängenden Zellen aufspalten.

V. Metzler e t al. (38) entwickelten ein Verfahren zur Trennung von agglomerier-

ten L929 Zellen basierend auf morphologischen Operationen. Mit Hilfe eines auf

der Erosion beruhenden Algorithmus generieren sie zuerst Marker für die Identi-


fizierung der einzelnen Zellen in den Zellverbänden. Die Rekonstruktion der

Zellen erfolgt daraufhin mit Hilfe eines erweiterten Dilatationsprozesses.

2.3 Bestehende Zellanalysesysteme

Die Cognition Network Technology (CNT) (48) und Gipsy (49) sind Software-

programme, die zur Lösung des vorgestellten Problems geeignet sein könnten.

Bei der CNT handelt es sich um ein objektbasiertes Bildanalysesystem für bio-

medizinische Fragestellungen, das von der Firma Definiens AG 1996 entwickelt

wurde. Das Konzept basiert darauf, die Analyse nicht ausschließlich pixelbasiert

zu betrachten, sondern Objekthierarchien (z.B. Zellkernbereiche) erzeugen und

bearbeiten zu können. Zur Zellerfassung stehen verschiedene Segmentie-

rungsverfahren zur Verfügung, die applikationsabhängig zum Einsatz kommen.

Ein interaktives Fuzzy- Klassifikationssystem ermöglicht dem Anwender, Bildbe-

reiche in unterschiedliche Objektklassen einzuordnen (3). Das CNT-System ist

in dem Softwarepaket „Definiens Developer XD“ integriert und kommerziell er-

hältlich.

Gipsy wurde für die optische Inspektion von Materialien in Echtzeit entwickelt

und verfolgt einen wissensbasierten Ansatz. Im Vorfeld erstellte Trainingsdaten

enthalten die für die Anwendung benötigten Objektklassen sowie deren Merk-

malswerte. Die Generierung dieser Daten erfolgt durch einen anwendungsspe-

zifischen Bildverarbeitungsalgorithmus. Lernverfahren erzeugen daraus ein se-

mantisches Netzwerk, wobei der Anwender bei Bedarf Modifikationen am Netz,

z.B. das Hinzufügen oder Entfernen von Merkmalen, vornehmen kann.

A. Rao und E.A. Vaisberg (50) haben sich 2007 ein Verfahren zur automati-

schen Analyse von gefärbten Leberzellen patentieren lassen. Zur Visualisierung

unterschiedlicher Zellareale dienen verschiedene Farbstoffe. Die Segmentie-

rung der durch die Farbstoffe markierten Zellbereiche wird mit Hilfe von

schwellwert- und kantenbasierten Verfahren sowie einem Algorithmus basie-

rend auf der Wasserscheidentransformation durchgeführt. Durch eine anschlie-

ßende Charakterisierung der erfassten Zellbereiche können Aussagen über

verschiedene medizinische Fragestellungen, z.B. das aktuelle Stadium einer

Erkrankung, getroffen werden.

Mit TissueQuest und HistQuest stehen zwei weitere Softwareanalyseprogram-

me der Firma TissueGnostics GmbH zur Analyse von fluoreszenz- und zyto-

chemisch gefärbten Zellen zur Verfügung. Da es sich um kommerziell vertrie-

bene Produkte handelt, sind die für die Zellanalyse verwendeten Algorithmen

nicht bekannt.


2.4 Schlussfolgerung

Bis heute wurde kein universell einsetzbares computergestütztes Verfahren

entwickelt, das allen biomedizinischen Anforderungen gerecht wird (3) (27). Die

Gründe dafür sind vielseitig. Zum einen existieren verschiedene Bilderzeu-

gungssysteme (z.B. MRT, Ultraschall, REM, CCD Kameras,…), die Bildmaterial

mit stark unterschiedlichen Kontrasten liefern. Teilweise ist auch das Experten-

wissen einer erfahrenen Fachkraft zur Analyse notwendig. Die Integration des

Expertenwissens in ein computergestütztes Verfahren ist allerdings nur schwer

möglich und erfordert eine fachübergreifende Zusammenarbeit von Experten.

Nach Wintermantel (3) ist die Leistungsfähigkeit einer automatischen Bildaus-

wertung z.B. für eine automatische Diagnosestellung nach Auswertung eines

CT-Bildes „…noch weit entfernt von der kognitiv-diagnostischen Expertise eines

erfahrenen Radiologen“.

Die in Kap. 2.3 genannten Softwaretools CNT und Gipsy könnten zur Bearbei-

tung des vorliegenden Problems aufgrund ihres objekt- und wissensbasierten

Ansatzes sowie des hohen Funktionsumfanges geeignet sein. Die Untersu-

chungen in (7) zeigen jedoch, dass die Zellsegmentierung von anderen Verfah-

ren im Vergleich zur CNT bessere Ergebnisse liefern. Weitere Schwachpunkte

sind die unübersichtliche Programmoberfläche, die viel Zeit zur Einarbeitung

benötigt sowie des Umstandes, dass die Software nur kommerziell erhältlich ist.

Die Verwendung des automatischen Inspektionssystems Gipsy erfordert im

Vorfeld die Erzeugung vieler Trainingsdatensätze, um eine möglichst gute Wis-

sensbasis zu erhalten. Zudem werden keine Erweiterungsmöglichkeiten der

enthaltenen Algorithmen für komplexe Problemstellungen erläutert und es er-

scheint fraglich, ob eine Quantisierung von Merkmalswerten in vier Stufen für

verschiedene Analyseanforderungen hinreichend genau ist.

Das im Patent (50) beschriebene Zellanalyseverfahren ist für die Lösung der

vorliegenden Problemstellung ebenfalls nicht geeignet. Die Anwendung kon-

zentriert sich auf die Analyse von Leberzellen und benötigt verschiedene Fluo-

reszenzfarbstoffe zur Markierung unterschiedlicher Zellareale und ist somit nicht

für Anwendungen im Rahmen histologisch gefärbter Zellen einsetzbar. Eine in

der Patentschrift hinterlegte Skizze lässt außerdem darauf schließen, dass es

sich bei den untersuchten Zellen um eine morphologisch einfache Zellstruktur

handelt.

Die zu untersuchenden Zelltypen besitzen eine starke morphologische sowie

farbliche Variation, so dass der Einsatz von Segmentierungsmethoden, basie-

rend auf Wasserscheidentransformation, Kantenfiltern und geometrischen


Merkmalen ungeeignet erscheint. Hingegen sollte eine Untersuchung verschie-

dener Schwellwertmethoden aufgrund ihrer Schnelligkeit sowie der aktiven Kon-

turen wegen ihrer robusten Segmentierung auch in kontrastarmen Bildern für

die vorliegende Problemstellung erfolgen. Ebenso sinnvoll erscheint der Einsatz

eines Künstlichen Neuronalen Netzes (KNN) zur Segmentierung unterschiedli-

cher Zellbereiche, da KNNs gut auf Klassifikationsprobleme ansprechen.

Viele Verfahren zur Zellseparation in mikroskopischen Bildern stützen sich auf

sehr spezielle Zellcharakteristika. So werden oft runde oder elliptische Zellgeo-

metrien (46; 47; 51) oder Farbunterschiede im Überlappungsbereich der Zellen

(45) für die Separation vorausgesetzt. Diese Verfahren lassen sich dadurch auf

keine oder wenige andere Zelllinien erweitern. Zum Beispiel die von Yung-Kuan

Chan et al. (43) vorgestellte Methode beschränkt sich ausschließlich auf die

Segmentierung und Separation von fluoreszenzgefärbten HEp-2 Zellen, wobei

die Zellmorphologie dieses Typs aufgrund fehlender Zellausläufer und der rela-

tiv runden Geometrie einfacher automatisch zu analysieren ist im Vergleich zum

Typ L929 und MC3T3. Im Ergebnisteil der vorgestellten Methode ist für 20

Testbilder mit insgesamt 1242 Zellen eine Abweichung von 5% zur Referenz-

zellzahl angegeben. Es ist davon auszugehen dass sich bei der hier vorliegen-

den komplexeren Zellmorphologie sowie der kontrastärmeren May-

Grünwaldfärbung schlechtere Ergebnisse einstellen die zu einer ungenauen

automatischen Bestimmung des Zytotoxizitätsgrades eines vorliegenden Mate-

rials führen.

Das Zellsegmentierungsverfahren von Reham Mohammed et al. (41) eignet

sich gut für die Segmentierung von Zellen die sich farblich deutlich vom Hinter-

grund unterscheiden. Die gezeigten Krebszellen weisen einen starken Kontrast

und eine andere Farbgebung zu den übrigen Bildbereichen auf. Durch die

Transformation in den C-Y Farbraum und die Verwendung des Y-Bildes liegen

die Krebszellen relativ isoliert im Bild vor. Der Einsatz dieser Methode eignet

sich jedoch nur für die Segmentierung fluoreszenzgefärbter Zellen da die ge-

färbten Zellbereiche im Vergleich zu der hier verwendeten May-

Grünwaldfärbung einen deutlich stärkeren Kontrast zur Umgebung aufweisen.

Das Separationsverfahren von U. Pal et al. (44) zur Detektion von Konturveren-

gungen liefert hingegen einen guten Ansatz für die Trennung agglomerierter

Zellen, die Verengungen an den Zellkontaktstellen aufweisen. Eine Erweiterung

des Verfahrens, so dass trotz teilweisem Ausbleiben von Konturverengungen

weiterhin aus biologischer Sicht korrekte Zelltrennungen möglich sind, erscheint

hier zweckmäßig, da die L929 Zellen nicht an allen Zellkontaktstellen solche


Verengungen aufweisen. Für die Separation von agglomerierten MC3T3 Zellen

sowie ähnlichen Typen sind die vorgestellten Verfahren ungeeignet, denn die

Agglomerate weisen kaum Verengungen in der Kontur auf und sind oft durch

eine große kompakte geflechtartige Struktur gekennzeichnet. Hier erscheint die

Entwicklung eines Verfahrens zur Separation zusammengewachsener Zellen

ohne Verengungen an den Zellkontaktstellen zweckmäßig.

Des Weiteren ist die Entwicklung eines Verfahrens zur automatischen Auswahl

des passenden Zelltrennungsverfahrens für die Separation verschiedener Zell-

linien sinnvoll. So kann die Software bei noch unbekannten Zelltypen anhand

definierter Kriterien das am besten geeignetste Trennverfahren selbstständig

ausführen.

3. Vorbereitungen für die Biokompatibilitätsanalyse 16

3. Vorbereitungen für die Biokompatibilitätsanalyse

Die zu prüfenden Substrate erfordern vor Durchführung der Zellanalyse zuerst

eine Oberflächenbehandlung, damit sie über eine einheitliche Oberflächenbe-

schaffenheit verfügen und so gleiche Voraussetzungen für das Zellwachstum

erfüllen. Nach der Probenaufarbeitung sollten möglichst wenige Schleif- und

Polierkratzer vorliegen, da mit steigendem Anteil an Bildartefakten die automa-

tische Zellanalyse zu ungenauen Ergebnissen führen kann.

3.1 Probenaufarbeitung

Der Arbeitsablauf bei der Probenaufarbeitung ist in Abb. 5 dargestellt.

Abbildung 5: Ablauf bei der Aufarbeitung der Proben

Die Aufbereitung der Metallproben beginnt mit dem Einbetten des Materials.

Dieser Schritt ist für den anschließenden Schleifprozess notwendig. Dazu wird

das Kalteinbettmittel „VariKwick“ verwendet, das einen Kunststoffmantel um das

Substrat bildet. Der Schleifprozess erfolgt manuell mit einer Schleifmaschine

bei 300 Umdrehungen pro Minute unter ständiger Wasserzufuhr. Es kommen,

angefangen mit der gröbsten Körnung, fünf verschiedene Feinheitsgrade der

Siliciumcarbid (SiC) Schleifscheiben zum Einsatz (Tabelle 2). Das anschließen-

de Polieren mit Hilfe einer Diamantsuspension dient zur Herstellung einer spie-

gelpolierten Oberfläche.


Tabelle 2: Durchzuführende Schleif- und Polierschritte

Schritt Aufarbeitungsmittel Ziel

1 240er SiC Planschleifen

2 500er SiC Grobes Schleifen

3 800er SiC Mittleres Schleifen

4 1000er SiC Feines Schleifen

5 2500er SiC Sehr feines Schleifen

6 3µm Polierscheibe Polieren

Im weiteren Verlauf werden die polierten Proben aus dem Kunststoff ausgebet-

tet und nacheinander jeweils 8 Minuten in Aceton, Ethanol und dest. Wasser

von Verunreinigungen wie z.B. Fettfilmen gesäubert. Der letzte Aufbereitungs-

schritt umfasst das Autoklavieren5. Dieser Prozess sterilisiert die Proben unter

genormten Bedingungen bei 121°C und 1,2bar in einem Autoklaven. Der Sterili-

sationsvorgang dauert 25 Minuten.

3.2 Zellkultivierung

Die in-vitro Kultivierung von bestimmten Zelllinien und Geweben ist ein wesent-

licher Bestandteil der modernen Zellbiologie. Mit dieser Methode ist es möglich,

ganze Biosysteme außerhalb des Körpers (in vitro) heranzuzüchten. Die Zellen

wachsen dabei in Kulturflaschen, die unter speziellen Bedingungen (5% CO2-

Begasung, 37°C) in einem Brutschrank lagern und nach Bedarf für die jeweili-

gen Versuche zur Verfügung stehen. Da bei der in-vitro Zellkultivierung keine

Blutgefäße zur Nährstoffversorgung und kein Immunsystem für die natürliche

Abwehr vorhanden sind, erfüllt hier das Nährmedium diese Aufgabe (52; 53).

In den Kulturflaschen wachsen die Zellen je nach Typ 2-5 Tage, bis ca. 85%

des Flaschenbodens mit einem Zellrasen bedeckt sind. In diesem Fall besitzen

die Zellen eine optimale Ausgangsvoraussetzung für das Wachstum auf der

Probenoberfläche.

Um die Vitalität der Kultur aufrecht zu erhalten, müssen die Zellen in regelmä-

ßigen Abständen passagiert werden. Das Passagieren umfasst das Ablösen

der Zellen von der Kulturflasche und das verdünnte Aussäen in neue Zellkultur-

gefäße (53). Das enzymatische Ablösen der Zellen vom Flaschenboden ge-

schieht unter Zugabe einer Trypsin-Lösung und einer kurzen Einwirkzeit im

Brutschrank. Der Ablösevorgang wird durch ein Kulturmedium gestoppt und das

5 Autoklav: Ein Autoklav ist ein verschließbarer Druckbehälter. Die darin befindlichen Materialien

werden zur Sterilisation einer thermischen Behandlung unterzogen


Gemisch in ein Zentrifugenröhrchen gegeben und zentrifugiert, so dass die Zel-

len getrennt von den flüssigen Substanzen vorliegen. Anschließend erfolgt das

Resuspendieren des entstandenen Zellpellets unter Verwendung von frischem

Nährmedium. Zur Bestimmung der Zellanzahl wird ein bestimmtes Volumen der

Lösung entnommen und mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Zählkammer6 manuell

unter dem Mikroskop ausgezählt. Der Passagiervorgang endet mit der verdünn-

ten Zugabe des resuspendierten Zell-Nährmedium-Gemisches in eine neue

Kulturflasche. Auf diese Weise bleibt die Zellkultur erhalten und kann für neue

Versuche verwendet werden. Nach einer zelltypabhängigen Anzahl an Passa-

giervorgängen ist die maximale Teilungsrate der Zellkultur erreicht, und es

müssen neue Zellen herangezogen werden.

Für den eigentlichen Versuchsansatz wird anschließend die erforderliche Zell-

zahl auf die Proben ausgesät. Experimentelle Untersuchungen haben gezeigt,

dass mit einer Startpopulation von ca. 25.000 Zellen auf biokompatiblem Mate-

rial eine für die automatische Zellanalyse gut auswertbare Zelldichte entsteht.

Substrate mit geringerer Biokompatibilität stellen aufgrund der dünneren Be-

siedlungsdichte kein Problem bei der automatischen Zellanalyse dar. Nach Zu-

gabe von jeweils 25.000 Zellen auf die Probe werden diese für drei Tage in den

Brutschrank inkubiert7. Innerhalb dieser Zeit haften die Zellen an dem Proben-

material an und beginnen, abhängig vom Toxizitätsgrad des verwendeten Sub-

strates, unterschiedlich schnell zu wachsen und sich auszubreiten.

Das Zellwachstum dauert drei Tage. Nach Absaugen des Nährmediums werden

die Proben anschließend mit einer speziellen Pufferlösung (PBS, phosphat-

gepufferte Salzlösung) gewaschen. Abschließend erfolgt die Anfärbung der Zel-

len, wobei hier die histologische May-Grünwald Färbemethode aus im nachfol-

genden Absatz näher erläuterten Gründen zum Einsatz kommt. Zu den Zellen

wird eine probenabhängige Menge an Farblösung gegeben. Die Einwirkdauer

hängt vom verwendeten Material ab. Zuletzt gibt man den Proben die gleiche

Menge an destilliertem Wasser hinzu und lässt dieses ebenso eine materialab-

hängige Zeitspanne einwirken (Tabelle 3: Materialspezifische Einwirkzeiten der

Kristallviolett und May-Grünwald Färbung).

6 Fuchs-Rosenthal-Zählkammer: Bei der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer handelt es sich um ein

Messgerät bestehend aus einem optischen Spezialglas. Damit kann unter dem Mikroskop die

Zellanzahl in Suspension ermittelt werden. Hilfreich für den Zählvorgang sind die 16 großen

Zählkammern, die jeweils aus 16 kleinen Zählkammern bestehen. Das Volumen einer kleinen

Zählkammer beträgt 3,2µl. 7 Inkubieren: Unter inkubieren ist das heranzüchten der Zellen bei bestimmten Aussenbedin-

gungen (5% CO2-Begasung, 37°C) im Inkubator (Brutschrank) zu verstehen.


Tabelle 3: Materialspezifische Einwirkzeiten der Kristallviolett und May-Grünwald Färbung

Probenmaterial Färbemethode Einwirkzeit Farbstoff

Einwirkzeit dest. H2O

Polystyrol Kristallviolett 9:30min 0:00min

Polystyrol May-Grünwald 4:30min 9:00min

Metall Kristallviolett 8:00min 0:00min

Metall May-Grünwald 3:30min 7:00min

3.2.1 Vergleich der Färbemethoden

Es wurden zwei verschiedene Färbeverfahren untersucht, die Kristallviolett-

(Abb. 6) und die May-Grünwald (Abb. 7) Färbemethode.

Abbildung 6: Kristallviolett gefärbte MC3T3-Zellen

Abbildung 7: May-Grünwald gefärbte MC3T3-Zellen


Bei der Kristallviolett Färbemethode werden die Zellen im Vergleich zur May-

Grünwald Färbetechnik dunkler angefärbt. Abb. 6 zeigt, dass in den meisten

Fällen der Farbunterschied zwischen verschiedenen Zellbereichen sehr gering

ist, teilweise erscheinen kleine Zellen vollständig schwarz und können so mit

Korrosionspartikeln oder abgestorbenen Zellen verwechselt werden. Da bei den

untersuchten Fibroblasten-Zellen eine starke Variation der Morphologie vorliegt

und eine Separation der Zellen, nur auf Basis geometrischer Eigenschaften, zu

ungenau ist, muss eine farbliche Unterscheidung verschiedener Zellbereiche,

wie beispielsweise Kernbereiche und Zytoplasma, ermöglicht werden. Diese

Anforderungen erfüllt die May-Grünwald Färbung. Der Farbunterschied zwi-

schen den Kernbereichen und den übrigen Zellen ist zwar relativ gering, aber

für eine optische Differenzierung verschiedener Zellbereiche ausreichend.

Da sich ein schwacher Farbunterschied verschiedener Zellareale maßgeblich

auf die Komplexität der zu entwickelnden Analyseverfahren auswirkt, ist der

Einsatz einer multiplen Fluoreszenzfärbung für die Anfärbung verschiedener

Zellbereiche denkbar. Auf diese Weise entstehen kontrastreiche Bilder mit star-

ken Farbunterschieden verschiedener Zellbereiche, die eine automatische Ana-

lyse im Vergleich zur May-Grünwald Färbung vereinfachen. Dafür wird jedoch,

wie in Kap. 1.1 bereits erwähnt, ein teures Fluoreszenzmikroskop benötigt, das

nicht zwingend zur Ausrüstung eines Standard-Labors gehört. Ebenfalls ist die

Färbetechnik im Vergleich zur May-Grünwald Färbung aufwändiger und die

Zellpräparation nicht dauerhaft, so dass im Rahmen dieses Projektes die May-

Grünwald Färbung gewählt wurde.

4. Verwendete Hard- und Software 21

4. Verwendete Hard- und Software

Dieses Kapitel stellt neben den verwendeten Hard- und Softwarekomponenten

das Konzept der Programmarchitektur sowie den geplanten Programmablauf

vor.

4.1 Visual Studio 2010

Das Zellanalyseprogramm wurde mit der Entwicklungsumgebung Visual Studio

2010 von der Firma Microsoft entwickelt und basiert auf dem .NET-Framework8

4. Bei der Programmierung mit Visual Studio 2010 kann zwischen verschiede-

nen Sprachen gewählt werden (C++, C#, VisualBasic, F#), wobei hier die Spra-

che C# zum Einsatz kam.

4.2 Halcon Bildverarbeitungsbibliothek

Bildverarbeitungsbibliotheken finden oft bei der Entwicklung bildverarbeitender

Applikationen Verwendung. Diese bieten eine Zusammenstellung verschiede-

ner Standardfunktionen, z.B. Schwellwertmethoden, Kantenfilter, morphologi-

sche Filter, etc., so dass die Entwicklungszeit der Software im Vergleich zur

Programmierung aller benötigten Operatoren signifikant reduziert wird. Für die

Entwicklung der Zellanalysesoftware kam die Bibliothek Halcon der Firma

MVTec zum Einsatz.

8 .NET Framework: Bei dem .NET Framework handelt es sich um eine von der Fa. Microsoft

entwickelte Softwareplattform. Sie umfasst bereits eine Sammlung an Funktionen, die für die

Entwicklung eigener Programme verwendet werden können


Abbildung 8: Architektur der Halcon Bibliothek (Quelle: MVTec GmbH)

Abb. 8 zeigt die Architektur der Halcon Software. Sie baut auf einer Bibliothek

mit ca. 1600 Bildverarbeitungsoperatoren auf, die durch so genannte Extension

Packages mit selbst erstellten Funktionen erweiterbar ist. Über verschiedene

Interfaces können Bilder von Kameras mit unterschiedlichen Kommunikations-

schnittstellen (USB, IEEE 1394, etc.) aufgenommen werden. Halcon lässt sich

in Hochsprachen wie C, C++, C#, Visual Basic usw. integrieren. Da die Zellana-

lysesoftware auf Basis des .NET-Frameworks in C# entwickelt wird, handelt es

sich somit um eine kompatible Bildverarbeitungsbibliothek. Halcon liefert mit

dem Programm HDevelop ein Tool zur Entwicklung von Bildverarbeitungsalgo-

rithmen. Durch die Visualisierung von Zwischenergebnissen eines Algorithmus

ist schnell die Eignung des Algorithmus für die Problemstellung bestimmbar. Bei

Bedarf lässt sich der entwickelte Algorithmus exportieren und in die gewünschte

Entwicklungsumgebung einbinden.

4.3 Softwarearchitektur

4.3.1 Dynamisches Einbinden von Programmmodulen

Für die Zellanalysesoftware wurde eine modulare Architektur gewählt. Auf diese

Weise bleibt die Hauptanwendung übersichtlich, denn komplexe Algorithmen

werden in ein Programmmodul, auch Assembly genannt, gekapselt. Das

Hauptprogramm bindet beim Programmstart alle in einem bestimmten Ver-

zeichnis liegenden Assemblies dynamisch ein. Unter dynamisch ist hier zu ver-

stehen, dass die Anzahl der zu ladenden Assemblies nicht festgelegt ist, son-


dern variieren kann. Darüber hinaus müssen die verwendeten öffentlichen Ty-

pen9 innerhalb der Assemblies für die Einbindung in die Software im Vorfeld

nicht bekannt sein. Das Ablaufdiagramm (Abb. 9) zeigt detailliert den Prozess

der dynamischen Assembly-Einbindung.

Abbildung 9: Programmablauf zur dynamischen Einbindung von Programmmodulen

9 Öffentliche Typen: Im Kontext der Programmierung versteht man unter öffentlichen Typen

Klassen deren Funktionen für andere Programmteile zugänglich gemacht sind.


Nach Anzeige der Benutzeroberfläche (GUI) werden alle in einem vorgegebe-

nen Verzeichnis vorhandenen Dateien ermittelt. Man erhält x Dateien f1, f2, …,

fx. Für jede Datei wird geprüft, ob ihr Datentyp einer Dynamic Link Library (DLL)

entspricht. In diesem Fall werden die in der DLL enthaltenen öffentlichen Typen

abgerufen. Es resultieren für jede Datei fi yi öffentliche Typen ti,1, ti,2, …, ti,yi mit i

= 1, 2, …, x. Entspricht der Typ ti,j mit j = 1, 2, …, yi einer DockableForm10, han-

delt es sich um eine zusätzliche Benutzeroberfläche, die nach Erstellung einer

Instanz11 von ti,j angezeigt werden soll. Auf die beschriebene Weise können nun

verschiedene Programmmodule mit oder ohne Benutzeroberflächen geladen

werden und stehen mit ihrer Funktionalität der Software zur Verfügung.

4.3.2 Grundlegender Programmablauf

Entsprechend den Anforderungen an die Software, vorgestellt in Kap 1.1, ergibt

sich der in Abb. 10 dargestellte Programmablauf.

10

DockableForm: Hierbei handelt es sich um einen Datentyp der es ermöglicht, das Programm-

fenster an das übergeordnete Steuerelement anzudocken 11

Instanz: Bei der Instanz handelt es sich um ein Objekt, dass aus einer Klasse zur Laufzeit

des Programms erstellt wird


Abbildung 10: Aktivitätsdiagramm zum allgemeinen Programmablauf bei der Zellanalyse


4.4 Mikroskop und Kamera

Das Auflichtmikroskop Olympus Bx51M nimmt die Zellen auf metallischen

Substraten bei 100-facher Vergrößerung auf. Für Zellen auf dem Material Poly-

styrol kommt das Durchlichtmikroskop CKX41 von Olympus zum Einsatz. Die

Bilder für die automatische Zellauswertung werden mit der Farbkamera Olym-

pus XC10 mit einer Auflösung von 1376x1032 Pixel aufgenommen.

5. Segmentierung zytochemisch gefärbter Zellbereiche 27

5. Segmentierung zytochemisch gefärbter

Zellbereiche

5.1 Bildvorverarbeitung

Durch den Prozess der Probenaufbereitung, beschrieben in Kap. 3.1, können

Polierkratzer auf der Probenoberfläche entstehen. Diese können die Segmen-

tierung von Zellen negativ beeinflussen, so dass eine Eliminierung der Kratzer

sinnvoll erscheint. Da es sich bei Polierkratzern um stark lokalisierte Artefakte

handelt, ist der Einsatz der Fourier-Transformation zur Elimination der Kratzer

denkbar. Untersuchungen haben jedoch ergeben, dass neben den Kratzern

auch viele Zellausläufer eliminiert werden, da sie sich im Frequenzbereich nicht

voneinander unterscheiden. Aus diesem Grund ist die Fourier-Transformation

keine geeignete Lösung zum Entfernen der Polierkratzer.

Während des Projektverlaufs wurde der Probenaufbereitungsprozess durch die

beteiligten Biotechnologen optimiert, so dass die Anzahl der Polierkratzer stark

reduziert wurde und somit keinen weiteren negativen Einfluss auf die Zellanaly-

se ausüben. Daher wird auf ein Verfahren zur Elimination von Polierkratzern

verzichtet.

Des Weiteren können Korrosionserscheinungen des verwendeten Materials die

Segmentierung der übrigen Zellen negativ beeinflussen. Kap. 5.1.1 stellt ein

Verfahren zur Reduktion dieser Artefakte vor.

5.1.1 Reduktion von Bildartefakten durch Ausnutzung besonderer

Farbwertbeziehungen im RGB-Farbraum

Bildartefakte in Form von Korrosionserscheinungen des zugrunde liegenden

Probenmaterials können die Segmentierung der Zellbereiche stören (Abb.11).


Abbildung 11: L929 Zellen auf dem Substrat Titan mit einigen Bildartefakten. Der vergrößerte

Ausschnitt zeigt eine Zelle im Teilungsprozess mit benachbarter Störquelle q. Diese Störquelle

wird als Teil der Zelle erfasst (grüne Kontur).

Abb. 11 zeigt Zellen der Linie L929 auf dem Material Titan*. Zu erkennen sind

einige Artefakte auf der Oberfläche, bei denen es sich wahrscheinlich um das

Resultat von Korrosionsprozessen des Substrates handelt. Diese können sich

in der unmittelbaren Nachbarschaft der Zellen befinden. Der vergrößerte Aus-

schnitt rechts in Abb. 11 stellt eine sich im Teilungsprozess befindliche Zelle

dar, wobei sich neben der Zelle ein Bildartefakt q befindet. Dieses wird bei der

Segmentierung der Zellen fälschlicherweise als Zellbestandteil erfasst. Die re-

sultierende Zellkontur nach der Segmentierung ist rechts unten in Abb. 11, grün

umrandet, dargestellt. Dies führt zu Beeinträchtigungen der folgenden Zellana-

lyse. Zum einen wird die Zellfläche nicht korrekt ermittelt und zum anderen geht

die Einschnürung zwischen den zwei aus dem Teilungsprozess resultierenden

Zellen auf einer Zellseite verloren, so dass die folgende automatische Zellsepa-

ration aufgrund zusätzlicher Berechnungen mehr Zeit in Anspruch nimmt. Zur

Verbesserung der Zellsegmentierung erscheint es somit sinnvoll, diese Korrosi-

onsartefakte im Rahmen der Bildvorverarbeitung zu eliminieren.

Dazu müssen sie zunächst lokalisiert werden. In Abb. 11 ist zu erkennen, dass

die Artefakte einen erhöhten Grünanteil aufweisen. Untersuchungen der farbli-

chen Zusammensetzung der Artefakte (Kap. 13.1) bestätigen diese Beobach-

tung. Der Rotanteil weicht im Durchschnitt um VA = -3,2% und der Blauanteil

durchschnittlich um VB = -8,4% vom Grünanteil ab. Bei VA handelt es sich um

die durchschnittliche relative Abweichung der Intensitätswerte des Rotkanals zu

q


den Intensitätswerten des Grünkanals. VB gibt die durchschnittliche relative Ab-

weichung der Intensitätswerte des Blaukanals zu den Intensitätswerten des

Grünkanals an. Hingegen ist bei der farblichen Zusammensetzung des Hinter-

grundbereiches festzustellen, dass der Rotanteil im Vergleich zum Grünanteil

mit VA = 1,4% leicht höher ausfällt. Der Blaukanal weist mit VB = 0,2% Abwei-

chung vom Grünkanal ähnliche Werte auf. Mit dieser Beobachtung kann über

eine einfache Regel die Zugehörigkeit eines Pixelfarbwertes zum Hintergrund

oder Artefakt festgelegt werden. Es wird SA = VA + VB berechnet und geprüft ob

SA ≤ -1.0% ist. In diesem Fall wird der Pixel aufgrund des dominierenden Grün-

anteils als Artefaktpixel, ansonsten als Hintergrundpixel definiert. Zur Eliminie-

rung eines Artefaktes muss der Farbwert der zugehörigen Pixel neu gesetzt

werden. Dazu wird der häufigste im Bild vorkommende Farbwert ermittelt und

die Artefaktpixel auf diesen Farbwert gesetzt. Dieser Vorgang beruht auf der

Annahme, dass der häufigste Farbwert des Bildes dem Hintergrund (Substrat)

zugeordnet werden kann.

Abb 12. (links) zeigt die Zellsegmentierung vor, Abb. 12 (rechts) die Zellseg-

mentierung nach der Bildvorverarbeitung. Die Zellfläche wird nach der Bildvor-

verarbeitung genauer bestimmt und vereinfacht die spätere Zellseparation

durch die resultierende „Hantelform“.

5.1.2 Ergebnisse

Zur Bewertung der Effizienz des vorgestellten Verfahrens wurden aus 10 Pro-

ben der Linie L929 auf dem Material Stahl* und Titan* die Anzahl der Zellen mit

und im Vergleich dazu ohne Bildvorverarbeitung bestimmt und mit der von ei-

nem Experten ermittelten Zellzahl verglichen. Im Rahmen der automatischen

Zellzählung kommen für die Zellsegmentierung das Schwellwertverfahren, be-

schrieben in Kap. 5.2.1, und für die Separation agglomerierter Zellen das Ver-

fahren, beschrieben in Kap. 6.4, zum Einsatz. Mit Hilfe des Jaccard-

Abbildung 12: Links: Segmentierter Zellbereich ohne Bildvorverarbeitung; Rechts: Segmen-

tierter Zellbereich mit Bildvorverarbeitung


Koeffizienten (54) wird eine geeignete Methode zur Bestimmung der Segmen-

tierungsgenauigkeit vorgestellt. Dieser beschreibt den Anteil der gemeinsamen

Schnittmenge zweier Punktmengen A und B an der Gesamtmenge:

,A B

J A BA B

(Gl. 2)

Zur Veranschaulichung dient Abb. 13.

Abbildung 13: a: Zwei Objekte liegen übereinander. Der Jaccard-Koeffizient beträgt 1; b: Zwei

Objekte überlappen sich teilweise. Der Jaccard-Koeffizient beträgt 0,33; c: Zwei Objekte

besitzen keine gemeinsame Schnittmenge. Der Jaccard-Koeffizient ist 0

Abb. 13a zeigt zwei Objekte, die genau übereinander liegen. Der Jaccard-

Koeffizient beträgt 1. Dieser kann Werte zwischen 0 und 1 annehmen, wobei

ein Koeffizient von 1 bedeutet, dass die gemeinsame Schnittmenge der beiden

zu vergleichenden Objekte 100% der Gesamtfläche entspricht. Abb. 13b zeigt

zwei Objekte deren gemeinsame Schnittmenge einen Anteil von 33% zur Ge-

samtfläche annimmt (Jaccard-Koeffizient: 0,33). In Abb. 13c werden zwei Ob-

jekte gezeigt, die keine gemeinsame Schnittmenge aufweisen, der Jaccard-

Koeffizient beträgt 0.

Der Jaccard-Koeffizient wurde von 25 Zellen aus verschiedenen Probenaus-

schnitten, bei denen sich Artefakte in unmittelbarer Nachbarschaft befinden, zur

Bewertung der Segmentierungsgenauigkeit mit und ohne erfolgter Bildvorverar-


beitung berechnet und einer Referenzsegmentierung durch einen Experten ge-

genübergestellt. Die Anzahl der untersuchten Zellen zur Berechnung des Jac-

card-Koeffizienten ist hier mit 25 Zellen sehr gering. Der Grund liegt darin, dass

nur vereinzelt Zellflächen auf dem Material Stahl* oder Titan* durch Korrosions-

erscheinungen gestört sind.

Die Referenzsegmentierung wird durch eine Laborfachkraft erstellt, indem sie

ein Zellbild in das Programm lädt und die Zellkonturen nachzeichnet. Die erstell-

ten Zellkonturen werden als Referenz abgespeichert. Es folgt die Ausführung

der automatischen Zellsegmentierung, worauf die computergenerierten Zellkon-

turen resultieren. Der Anwender lädt nun die Referenzkonturen in das Pro-

gramm und lässt den Jaccard-Koeffizienten zwischen den automatisch gene-

rierten Zellkonturen und den dazugehörigen Referenzkonturen berechnen. Aus

dieser Vorgehensweise resultieren die in Tabelle 4 gezeigten Daten.

Tabelle 4: Berechnung des Jaccard-Koeffizient für 25 ausgewählte Zellen mit naheliegenden

Artefakten, deren Segmentierungsergebnis durch die Bildvorverarbeitung manipuliert wird. Als

Segmentierungsmethode dient das Schwellwertverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1

Zellnummer Jaccard-Koeffizient mit

Bildvorverarbeitung Jaccard-Koeffizient ohne

Bildvorverarbeitung

1 0,81 0,75

2 0,80 0,73

3 0,87 0,80

4 0,86 0,85

5 0,83 0,80

6 0,88 0,86

7 0,85 0,80

8 0,86 0,78

9 0,88 0,82

10 0,89 0,79

11 0,86 0,81

12 0,85 0,80

13 0,81 0,78

14 0,86 0,79

15 0,80 0,74

16 0,88 0,83

17 0,85 0,76

18 0,88 0,78

19 0,87 0,83

20 0,82 0,86

21 0,88 0,79

22 0,84 0,79

23 0,81 0,82

24 0,86 0,79

25 0,89 0,83

Durchschnitt 0,85 0,80


Ein Vergleich der Zellzählung mit und ohne Bildvorverarbeitung geht aus der nachfolgenden

Tabelle 5 hervor.

Tabelle 5: Vergleich der Zellzählung mit der vorgestellten Bildvorverarbeitung (1) und ohne

Bildvorverarbeitung (2) zur Referenzzählung bei Verwendung des Materials Stahl* und Titan*.

Eingesetzt wird hier das Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1 und das Separa-

tionsverfahren, beschrieben in Kap. 6.4 mit vorgeschalteter CBS (Kap. 6.1); AZ: Automatische

Zellzählung; FP: Falsch-positiv (zuviel) Detektion; FN: Falsch-negativ (vergessen) Detektion;

KD: Korrekte Detektion (AZ-FP); REF: Referenzzählung; RFP: Relative Falsch-positiv Detekti-

on (FP / REF * 100); RFN: Relative falsch-negativ Detektion (FN / REF * 100); ERR: Relativer

Fehler (((REF – AZ) / REF) * 100)

Probe AZ 1

FP 1

FN 1

KD 1

AZ 2

FP 2

FN 2

KD 2

REF RFP

1 (%)

RFN 1

(%)

RFP 2

(%)

RFN 2

(%)

ERR1

(%)

ERR 2

(%)

Probe 1 104 0 1 104 104 0 1 104 105 0,0 1,0 0,0 1,0 1,0 1,0

Probe 2 82 1 2 81 82 1 2 81 83 1,2 2,4 1,2 2,4 1,2 1,2

Probe 3 93 1 1 92 92 0 1 92 93 1,1 1,1 0,0 1,1 0,0 1,1

Probe 4 91 3 3 88 92 4 3 88 91 3,3 3,3 4,4 3,3 0,0 1,1

Probe 5 99 1 1 98 101 3 1 98 99 1,0 1,0 3,0 1,0 0,0 2,0

Probe 6 91 1 0 90 91 1 0 90 90 1,1 0,0 1,1 0,0 1,1 1,1

Probe 7 92 3 0 89 91 2 0 89 89 3,4 0,0 2,2 0,0 3,4 2,2

Probe 8 73 2 4 71 74 1 2 73 75 2,7 5,3 1,3 2,7 2,7 1,3

Probe 9 61 1 2 60 61 1 2 60 62 1,6 3,2 1,6 3,2 1,6 1,6

Probe 10 94 0 2 94 93 0 3 93 96 0,0 2,1 0,0 3,1 2,1 3,1

Probe 11 81 1 3 80 84 1 0 83 83 1,2 3,6 1,2 0,0 2,4 1,2

Probe 12 100 0 1 100 99 0 2 99 101 0,0 1,0 0,0 2,0 1,0 2,0

Probe 13 77 1 0 76 77 2 1 75 76 1,3 0,0 2,6 1,3 1,3 1,3

Probe 14 89 2 2 87 91 3 1 88 89 2,2 2,2 3,4 1,1 0,0 2,2

Probe 15 91 3 6 88 91 0 3 91 94 3,2 6,4 0,0 3,2 3,2 3,2

Probe 16 92 0 1 92 92 1 2 91 93 0,0 1,1 1,1 2,2 1,1 1,1

Probe 17 102 2 3 100 105 2 0 103 103 1,9 2,9 1,9 0,0 1,0 1,9

Probe 18 75 0 2 75 75 2 4 73 77 0,0 2,6 2,6 5,2 2,6 2,6

Probe 19 81 1 0 80 82 3 1 79 80 1,3 0,0 3,8 1,3 1,3 2,5

Probe 20 88 0 0 88 88 0 0 88 88 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Probe 21 72 0 0 72 72 1 1 71 72 0,0 0,0 1,4 1,4 0,0 0,0

Probe 22 66 2 5 64 67 1 3 66 69 2,9 7,2 1,4 4,3 4,3 2,9

Probe 23 95 1 2 94 96 0 0 96 96 1,0 2,1 0,0 0,0 1,0 0,0

Probe 24 92 0 0 92 93 2 1 91 92 0,0 0,0 2,2 1,1 0,0 1,1

Probe 25 86 1 0 85 87 2 0 85 85 1,2 0,0 2,4 0,0 1,2 2,4

Ø Fehler 1,3 1,6

Tabelle 5 zeigt eine minimale Verbesserung der automatischen Zellzahlbe-

stimmung durch Anwendung der beschriebenen Bildvorverarbeitung. Mit akti-

vierter Bildvorverarbeitung sinkt die durchschnittliche Abweichung der automati-

schen Zellzählung von 1,6% auf 1,3% im Vergleich zur Referenzzählung. Der

Grund liegt darin, dass die in Abb. 11 gezeigten Korrosionserscheinungen in

unmittelbarer Nachbarschaft einer Zelle zum einen nicht häufig auftreten und

zum anderen wenig Einfluss auf die Separation zusammenhängender Zellen

besitzen. Die Qualität der Segmentierung von Zellen mit benachbarten Korrosi-

onsartefakten wird unter Verwendung der Bildvorverarbeitung verbessert, der


Jaccard-Koeffizient steigt durchschnittlich von 0,80 auf 0,85 im Vergleich zur

Referenzsegmentierung (Tabelle 4).

Führt man die Bildvorverarbeitungsfunktion bei Verwendung anderer Substrate

aus, können vergleichsweise signifikantere Verbesserungen bei der automati-

schen Zellsegmentierung resultieren. Abb. 14 zeigt L929-Zellen auf dem Mate-

rial Aluminium, wobei die Oberfläche starke Korrosionserscheinungen aufweist.

Abbildung 14: MC3T3-Zellen auf dem Substrat Aluminium. Es liegen starke Korrosionserschei-

nungen im Bild vor

Abb. 15 zeigt zum Vergleich den gleichen Probenausschnitt der in Abb. 14 dar-

gestellt ist, nachdem die Bildvorverarbeitung durchgeführt wurde. Die Korrosi-

onsartefakte wurden zum Großteil eliminiert. Es bleiben lediglich kleine und

schmale Konturbereiche der ursprünglichen Korrosionsflächen übrig, die die

Segmentierung der Zellen kaum beeinflussen.


Abbildung 15: Ergebnis der Bildvorverarbeitungsmethode nach Anwendung auf den in Abb. 14

dargestellten MC3T3-Probenausschnitt

Der Vergleich der automatisch ermittelten Zellzahl mit und ohne Bildvorverar-

beitung mit der Referenzzählung zeigt, dass die Bildvorverarbeitung in diesem

Fall zu einer deutlichen Verbesserung der automatischen Zellzählgenauigkeit

beiträgt (Tabelle 6).

Tabelle 6: Vergleich der Zellzählung mit (1) der vorgestellten Bildvorverarbeitung und ohne (2)

Bildvorverarbeitung zur Referenzzählung bei Verwendung des Materials Aluminium. Verwen-

dung findet hier das Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1 und das Separations-

verfahren, beschrieben in Kap. 6.4; Zeichenerklärung siehe Tabelle 5

Probe AZ 1

FP 1

FN 1

KD 1

ACC 2

FP 2

FN 2

KD 2

REF RFP

1 (%)

RFN 1

(%)

RFP 2

(%)

RFN 2

(%)

ERR 1

(%)

ERR 2

(%)

Probe 1 61 9 2 52 203 151 2 52 54 16,7 3,7 279,6 3,7 13,0 275,9

Probe 2 72 10 5 62 161 99 5 62 67 14,9 7,5 147,8 7,5 7,5 140,3

Probe 3 46 10 4 36 117 81 4 36 40 25,0 10,0 202,5 10,0 15,0 192,5

Probe 4 63 7 5 56 146 90 5 56 61 11,5 8,2 147,5 8,2 3,3 139,3

Probe 5 64 26 2 38 177 139 2 38 40 65,0 5,0 347,5 5,0 60,0 342,5

Probe 6 94 46 6 48 176 128 6 48 54 85,2 11,1 237,0 11,1 74,1 225,9

Probe 7 34 7 3 27 172 145 3 27 30 23,3 10,0 483,3 10,0 13,3 473,3

Probe 8 85 32 8 53 133 80 8 53 61 52,5 13,1 131,1 13,1 39,3 118,0

Probe 9 86 35 4 51 180 129 4 51 55 63,6 7,3 234,5 7,3 56,4 227,3

Probe 10 70 7 4 63 156 93 4 63 67 10,4 6,0 138,8 6,0 4,5 132,8

Probe 11 68 7 2 61 163 105 5 58 63 11,1 3,2 166,7 7,9 7,9 158,7

Probe 12 77 10 3 67 148 80 2 68 70 14,3 4,3 114,3 2,9 10,0 111,4

Probe 13 52 5 1 47 173 129 4 44 48 10,4 2,1 268,8 8,3 8,3 260,4

Probe 14 65 13 3 52 121 72 6 49 55 23,6 5,5 130,9 10,9 18,2 120,0

Probe 15 58 10 4 48 139 90 3 49 52 19,2 7,7 173,1 5,8 11,5 167,3

Probe 16 80 8 5 72 173 101 5 72 77 10,4 6,5 131,2 6,5 3,9 124,7

Probe 17 68 20 2 48 162 114 2 48 50 40,0 4,0 228,0 4,0 36,0 224,0

Probe 18 44 17 4 27 183 160 8 23 31 54,8 12,9 516,1 25,8 41,9 490,3

Probe 19 40 9 6 31 158 125 4 33 37 24,3 16,2 337,8 10,8 8,1 327,0


Probe 20 51 11 4 40 126 85 3 41 44 25,0 9,1 193,2 6,8 15,9 186,4

Probe 21 55 6 2 49 184 139 6 45 51 11,8 3,9 272,5 11,8 7,8 260,8

Probe 22 49 8 5 41 162 119 3 43 46 17,4 10,9 258,7 6,5 6,5 252,2

Probe 23 62 10 4 52 190 137 3 53 56 17,9 7,1 244,6 5,4 10,7 239,3

Probe 24 76 15 2 61 183 124 4 59 63 23,8 3,2 196,8 6,3 20,6 190,5

Probe 25 47 7 3 40 181 140 2 41 43 16,3 7,0 325,6 4,7 9,3 320,9

Ø Fehler 20,1 228,1

Tabelle 6 zeigt, dass sich bei Verwendung der Bildvorverarbeitung die automa-

tische Zellzahlbestimmung auf dem Substrat Aluminium von 228,1% auf 20,1%

Abweichung zur Referenzzählung reduziert. Die sehr hohe Abweichung ohne

Verwendung der Bildvorverarbeitung kommt dadurch zustande, dass viele Kor-

rosionsbereiche irrtümlich als Zellflächen segmentiert werden.

5.2 Untersuchung verschiedener Verfahren zur Segmentierung der

Zellbereiche

Dieses Kapitel stellt drei verschiedene Segmentierungsverfahren (Kap. 5.2.1 bis

Kap. 5.2.3) vor, mit denen die untersuchten Zelllinien auf den Materialien Stahl*,

Titan* und Polystyrol bei verschiedenen Mikroskopkontrasten detektierbar sind.

Im Anschluss werden in Kap. 5.3 die Vor- und Nachteile der vorgestellten Ver-

fahren diskutiert und begründet, warum andere in der Literatur bekannte Ver-

fahren hier nicht zum Einsatz kommen.

5.2.1 Schwellwertverfahren

Die Schwellwertmethode ist ein Verfahren zur Segmentierung von Objektberei-

chen im Bild, die sich aufgrund ihres Intensitätswertes vom Hintergrund unter-

scheiden. Allgemein ist für die Schwellwertmethode eine obere und untere

Schwellwertgrenze SO und SU im Intervall [0, 1, ..., 255] festzulegen. Pixel die

einen Grauwert ≥ SU und ≤ SO aufweisen werden für die weitere Verarbeitung

übernommen, die restlichen Pixel ignoriert.

Durch Verwendung einer zytochemischen Färbung der Zellen resultiert in mik-

roskopischen Zellaufnahmen ein ausreichender Kontrast zwischen den Zellen

und dem verwendeten Substrat zur Zellsegmentierung mit Hilfe eines Schwell-

wertverfahrens.


Abbildung 16: Verschiedene Zellbereiche

Da die Zellen je nach Vitalitätszustand unterschiedlich stark ausgeprägte Endo-

und Ektoplasmabereiche besitzen, die jeweils durch unterschiedliche Farben

repräsentiert werden (Abb. 16), ist eine getrennte Schwellwertoperation im Rot-,

Grün- und Blaukanal des Bildes sinnvoll. Für die Linien L929 und MC3T3 haben

sich für die Materialien Stahl* und Titan* die in Tabelle 7 enthaltenen Schwell-

werte als geeignet herausgestellt. Zur Bestimmung geeigneter Schwellwerte

zeichnet ein Experte zunächst 50 Konturen verschiedener Zellen in das Bild.

Dieselben Zellen werden daraufhin automatisch mit den Start-Schwellwerten TR

= TG = TB = 128 segmentiert. Mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten kann die Ähn-

lichkeit der automatisch generierten Zellfläche mit der Referenzzellfläche ge-

messen werden. Die automatische Zellsegmentierung erfolgt nun iterativ für

verschiedene Schwellwerte wobei schließlich die Schwellwerte mit dem größten

Jaccard-Koeffizienten verwendet werden.

Tabelle 7: Schwellwerte zur Segmentierung der L929- und MC3T3-Zellbereiche bei unter-

schiedlichen Materialien; SO,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals; SU,R: Unterer Schwellwert

des Rotkanals; SO,G: Oberer Schwellwert des Grünkanals; SU,G: Unterer Schwellwert des

Grünkanals; SO,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; SU,B: Unterer Schwellwert des Blauka-

nals

Proben- material

SO,R SU,R SO,G SU,G SO,B SU,B

L929 Stahl* 210 0 210 0 215 0

Titan* 190 0 190 0 190 0

Polystyrol 175 0 175 0 180 0

MC3T3

Stahl* 210 0 210 0 215 0

Titan* 185 0 185 0 190 0

Polystyrol 170 0 170 0 180 0

Äußeres Endoplasma

Zellkernbereich (Endoplasma)

Ektoplasma


Die drei resultierenden Binärbilder BR, BG und BB werden dann zu einem Bild

BGes = R G BB B B vereinigt und einem Labeling12 unterzogen, damit nicht

zusammenhängende Zellflächen individuell auswertbar sind. Die segmentierten

Zellbereiche müssen eine Mindestfläche AMin aufweisen, andernfalls werden sie

von der weiteren Verarbeitung ausgeschlossen. Zur Bestimmung der minimalen

Zellfläche AMin des Typs L929 wurden die Zellen in 50 Bildern automatisch

segmentiert und ihre Zellfläche berechnet. Anschließend erfolgt eine manuelle

Prüfung des Ergebnisses daraufhin ob es sich bei den segmentierten Bereichen

um Zellen oder Artefakte von der Substratoberfläche handelt. Der kleinste seg-

mentierte Zellbereich weist eine Fläche von CMin = 276 Pixel auf und das größte

segmentierte Bildartefakt besitzt eine Fläche von EMax = 102 pixel. AMin ent-

spricht dem Mittelwert des kleinsten Zellbereiches und des größten Artefaktbe-

reiches:

189

2

Min MaxMin

C EA pixel

Eine Zelle kann mehrere eingeschlossene Bereiche des zugrundeliegenden

Materials besitzen (Abb. 17).

Abbildung 17: Links: Zellcluster ohne Detektion der eingeschlossenen Titan*-Bereiche. Rechts:

Die im Zellbereich erfassten Titan*-Flächen (orange markiert)

Abb. 17 zeigt einen segmentierten Zellcluster, der mehrere nicht zusammen-

hängende Bereiche des Materials Titan* enthält, hier durch die orangene Kontur

gekennzeichnet. Diese Bereiche müssen ebenfalls segmentiert werden, da sie

die anschließende Zellseparation vereinfachen und die Genauigkeit der Zellflä-

chenbestimmung erhöhen. Dazu wird innerhalb des bereits segmentierten Zell-

12

Labeling: Nicht zusammenhängende segmentierte Bildbereiche werden gelabelt, damit sie für

die weitere Verarbeitung individuell erfasst werden können. Das Label kann z.B. ein Grauwert

oder ein nummerischer Wert sein.


bereiches ebenfalls eine getrennte Schwellwertoperation im Rot-, Grün- und

Blaukanal, entsprechend Tabelle 8, vorgenommen. Die Schwellwerte wurden

auf Basis der in Kap. 13.2 vorgestellten Ergebnisse der Untersuchung zur Farb-

zusammensetzung verschiedener Materialien gewonnen.

Tabelle 8: Schwellwerte zur Segmentierung der Materialbereiche innerhalb der bereits erfassten

Zellbereiche; SO,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals; SU,R: Unterer Schwellwert des Rotka-

nals; SO,G: Oberer Schwellwert des Grünkanals; SU,G: Unterer Schwellwert des Grünkanals;

SO,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; SU,B: Unterer Schwellwert des Blaukanals

Proben- material

SO,R SU,R SO,G SU,G SO,B SU,B

Stahl* 255 215 255 215 255 220

Titan* 255 195 255 195 255 195

Polystyrol 255 180 255 180 255 185

Es resultieren drei Binärbilder MR, MG und MB, von denen die gemeinsame

Schnittmenge MSchnitt = R G BB B B ermittelt wird. Nach dem Labeling von

MSchnitt werden Regionen mit einer Fläche kleiner 75 Pixel für die weitere Verar-

beitung ignoriert. Bei den verbleibenden Bereichen handelt es sich nun um die

gesuchten Materialareale innerhalb der Zelle. Das nachfolgende Flussdia-

gramm Abb. X veranschaulicht das beschriebene Segmentierungsverfahren.


Abbildung 18: Schematischer Ablauf der Zellsegmentierung mit Hilfe der Schwellwertmethode

für alle Farbkanäle eines RGB-Bildes

5.2.1.1 Ergebnisse

Zur Beurteilung der Qualität des in Kap. 5.2.1 vorgestellten Segmentierungsver-

fahrens ist eine Referenzsegmentierung notwendig. Dazu sind durch einen Ex-

perten pro Zelllinie und Mikroskopkontrastart jeweils 50 Zellen manuell segmen-

tiert worden. Mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten kann nun eine Aussage über

die durchschnittliche Abweichung der automatisch generierten Zellkonturen zu

den Referenzkonturen erfolgen. Die kompletten Daten sind in Kap. 13.3 aufge-


listet, Tabelle 9 beinhaltet den Durchschnittswert des Jaccard-Koeffizienten auf

Basis von 50 Zellen jeweils für einen Mikroskopkontrast.

Tabelle 9: Bewertung der Qualität des Schwellwertverfahrens für unterschiedliche Zelllinien,

Materialien und Mikroskopkontraste mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auflicht- Hellfeld;

A-DF: Auflicht- Dunkelfeld; D-HF: Durchlicht- Hellfeld; D-PK: Durchlicht- Phasenkontrast

Materi-

al L929 MC3T3

A-HF A-DF D-HF D-PK A-HF A-DF D-HF D-PK

Stahl*

/Titan* 0,89 0,85 --- --- 0,87 0,90 --- ---

Poly-

styrol --- --- 0,87 0,60 --- --- 0,76 0,53

Grundsätzlich wird für Bildaufnahmen von metallischen Proben (Stahl*, Titan*)

ein Auflichtmikroskop und für transparente Materialien (Polystyrol) ein Durch-

lichtmikroskop eingesetzt.

Bei Anwendung des schwellwertbasierten Verfahrens resultieren für Zellen des

Typs L929 und MC3T3 auf dem Material Stahl*/Titan* ähnliche Ergebnisse

(0,85 – 0,9) für die beiden Auflichtkontrastarten.

Für die Linien L929 und MC3T3 ist beim Einsatz von Polystyrolproben die

schwellwertbasierte Methode lediglich für den Durchlicht-Hellfeldkontrast geeig-

net. Hier unterscheiden sich die Ergebnisse bzgl. des Jaccard-Koeffizienten für

die beiden Zelllinien. Der Grund liegt darin, dass die im Vergleich zur Linie L929

flächiger gewachsenen MC3T3 Zellen im Randbereich kontrastärmer erschei-

nen (Abb. 18) und somit die Differenzierung des Hintergrundes schwieriger ist.

Abbildung 19: MC3T3 Zellen auf dem Material Stahl unter Verwendung des Hellfeldkontrastes

beim Durchlichtmikroskop. Die große Zelle mittig im Bild weist einen teilweise sehr schwachen

Kontrastunterschied zum Substrat auf. Dies beeinflusst die Segmentierungsgenauigkeit.

Unter Verwendung des Durchlicht-Phasenkontrastes resultieren keine verwert-

baren Ergebnisse da sowohl Zellen als auch das Substrat teilweise die gleiche

Farbgebung aufweisen und durch global einstellbare Schwellwerte somit nicht


mehr hinreichend genau zwischen Vorder- und Hintergrund unterschieden wer-

den kann.

5.2.2 Histogrammbasierte Methode

Die histogrammbasierte Methode ist ein Verfahren, dass Objekte auf Basis des

Bildhistogramms segmentiert. Zunächst erfolgt die Bestimmung der oberen und

unteren Schwellwertgrenze SO und SU zur Segmentierung des Substrates. Da-

für ist die Berechnung des relativen Histogramms HR des Bildes notwendig. Da-

raufhin wird iterativ mit einem Fenster der Breite m über HR gefahren und in

jedem Iterationsschritt die Summe Si des relativen Bildanteils innerhalb des

Fensters berechnet,

( )i m

i R

j i

S H j

mit i = 0, 1, …, 255-m. (Gl. 3)

Die Untersuchung zur Farbverteilung unterschiedlicher Materialien (Kap. 13.2)

zeigt, dass bei Einsatz eines Durchlichtmikroskopes im Hellfeldkontrast das zu

untersuchende Substrat (Polystyrol) eine homogene Farbverteilung aufweist.

Da hingegen die verschiedenen Zellbereiche, z.B. Ekto- oder Endoplasma,

durch unterschiedliche Farben repräsentiert werden, erscheint in diesem Fall

die Segmentierung des Substrates sinnvoll, denn mit dem Segmentierungser-

gebnis kann anschließend durch Differenzbildung vom ursprünglichen Bild auf

die Zellbereiche geschlossen werden.

Zu Beginn erfolgt die Bestimmung der oberen und unteren Schwellwertgrenze

SO und SU zur Segmentierung des Substrates. Dafür ist die Berechnung des

relativen Histogramms HR des Bildes notwendig. Dann wird iterativ mit einem

Fenster der Breite m über HR gefahren und in jedem Iterationsschritt die Sum-

me Si des relativen Bildanteils innerhalb des Fensters berechnet,

( )i m

i R

j i

S H j

mit i = 0, 1, …, 255-m. (Gl. 3)

Zu Beginn wird eine Hilfsvariable SMax = 0 initialisiert. Nach jeder Iteration wird

geprüft, ob Si > SMax. In diesem Fall erhält SMax den Wert von Si und der obere

Schwellwert SO den Wert SO = j. Die untere Segmentierungsschwelle SU wird

mit SU = SO – m festgelegt. So wird genau der Histogrammausschnitt mit der

Breite m ermittelt, in dem sich die meisten Pixel befinden. Das nachfolgende

Ablaufdiagramm beschreibt die automatische Berechnung der Schwellwert-

grenzen SO und SU (Abb. 19).


Abbildung 20: Ablaufdiagramm zur automatischen Bestimmung der Schwellwertgrenzen SO und

SU

Mit Hilfe der ermittelten Schwellwerte SO und SU erfolgt nun die Segmentierung

des Hintergrundbereiches, man erhält das Binärbild T1. Eine weitere Schwell-

wertoperation mit der unteren Schwelle 0 und der oberen Schwelle 255, ange-

wendet auf das Ausgangsbild, liefert ein Binärbild T2 des gesamten Bildberei-

ches. Daraufhin wird der Hintergrundbereich T1 vom gesamten Bildbereich T2

subtrahiert, man erhält TD = T2 \ T1. TD wird nun einem Closing (59) und einem

Labeling unterzogen, man erhält x segmentierte Objekte O1, O2,..., Ox.

Histogrammbasierte Methode zur Detektion von Zellbereichen:

Die Untersuchung zur Farbverteilung unterschiedlicher Materialien (Kap. 13.2)

zeigt, dass bei Einsatz eines Durchlichtmikroskopes im Hellfeldkontrast das zu

untersuchende Substrat (Polystyrol) eine homogene Farbverteilung aufweist.

Da hingegen die verschiedenen Zellbereiche, z.B. Ekto- oder Endoplasma,

durch unterschiedliche Farben repräsentiert werden, erscheint in diesem Fall

die Segmentierung des Substrates sinnvoll, denn mit dem Segmentierungser-

gebnis kann anschließend durch Differenzbildung vom ursprünglichen Bild auf

die Zellbereiche geschlossen werden. Die segmentierten Zellkandidaten müs-

sen eine Mindestfläche AMin aufweisen, andernfalls werden sie verworfen, wobei

für die im Rahmen des Projektes untersuchten Zelllinien, wie bereits in Kap.

5.2.1 erläutert, AMin = 189 Pixel eine gute Wahl ist. Nach Ausschluss der Objek-


te mit einer Fläche < AMin resultieren y Zellbereiche Z1, Z2, …, Zy. Das Ablaufdi-

agramm (Abb. 20) fasst die beschriebene Segmentierung der Zellen zusam-

men.

Abbildung 21: Ablauf der Zellsegmentierung nach der histogrammbasierten Methode

5.2.2.1 Ergebnisse

Die Beurteilung der Qualität des in Kap. 5.2.2 vorgestellten Segmentierungsver-

fahrens folgt der Vorgehensweise in Kap. 5.2.1.1. Die vollständigen Daten sind

in Kap. 13.3 aufgelistet. Tabelle 10 zeigt den Durchschnittswert des Jaccard-

Koeffizienten.

Tabelle 10: Bewertung der Qualität des histogrammbasierten Schwellwertverfahrens für unter-

schiedliche Zelllinien und Mikroskopkontraste mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auf-

licht-Hellfeld; A-DF: Auflicht-Dunkelfeld; D-HF: Durchlicht-Hellfeld; D-PK: Durchlicht-

Phasenkontrast

Materi-

al L929 MC3T3


Stahl*

/Titan* 0,86 0,80 --- --- 0,86 0,85 --- ---

Poly-

styrol --- --- 0,87 0,77 --- --- 0,82 0,82


Analog zum Kap. 5.2.1.1 gilt auch hier, dass grundsätzlich für Bildaufnahmen

von metallischen Proben (Stahl*, Titan*) ein Auflichtmikroskop und für transpa-

rente Materialien (Polystyrol) ein Durchlichtmikroskop eingesetzt wird.

Unter Einsatz der histogrammbasierten Schwellwertmethode resultieren für alle

Kontrastarten bei beiden Zelllinien verwertbare Ergebnisse.

5.2.3 Histogram-Backprojection-Algorithmus

Der Histogram-Backprojection-Algorithmus dient zur Lokalisierung von Objekten

in einem Bild auf Basis ihrer Farbwerte (26). Dazu muss im Vorfeld ein Farb-

template erzeugt werden, dass die Farben des zu suchenden Objektes beinhal-

tet. Das Verfahren kann mit Hilfe der Farbtemplates auf beliebige Objekte an-

gewandt werden. Zur Beschleunigung der Methode wird über einen Parameter

der Grad der Unterabtastung der Farbkanäle vorgenommen.

Abb. 21 zeigt, dass die Zellen einen farblichen Kontrast zum Hintergrundbereich

aufweisen. Hier bietet sich mit dem Histogram-Backprojection-Verfahren eine

geeignete Segmentierungsmethode an.

Abbildung 22: L929-Zellen auf dem Substrat Stahl* bei 100-facher Vergrößerung

Das Ergebnis des Histogram-Backprojection-Algorithmus (HB) ist mit Hilfe des

im Vorfeld erzeugten Templates (Abb. 22) in Abb. 23 dargestellt.


Abbildung 23: Farbtemplate für den HB Algorithmus

Abbildung 24: Ergebnis des HB mit Hilfe des Farbtemplates aus Abb. 22

Für die Durchführung des HB-Algorithmus ist die Einstellung definierter

Parameter notwendig. Um eine Übersegmentierung der Zellen zu verhindern,

wird eine Mindestfläche ACMin für die segmentierten Zellbereiche festgelegt.

Dabei ist für die Zelltypen L929 und MC3T3, wie bereits in Kap. 5.2.1 erläutert,

ACMin = 189 Pixel eine gute Wahl. Wie in (55) beschrieben, wird aus

Geschwindigkeitsgründen meist eine Unterabtastung der Farbkanäle

vorgenommen. In diesem Fall ist mit c = 16 Farben eine optimale

Unterabtastung für die untersuchten Zelllinien eingestellt.

Im weiteren Verlauf wird das in Abb. 23 gezeigte Ergebnis mit der standard

Bildverarbeitungsoperation Closing (56) bearbeitet, um kleine

Segmentierungslücken zu schließen. Daraufhin erfolgt ein Labling, damit

zusammenhängende Flächen individuell auswertbar sind.


5.2.3.1 Ergebnisse

Die Vorgehensweise zur Beurteilung der Qualität des in Kap. 5.2.3 vorgestellten

Segmentierungsverfahrens erfolgt analog zu Kap. 5.2.1.1 und Kap. 5.2.2.1. Die

vollständigen Daten sind in Kap. 13.3 aufgelistet, Tabelle 11 beinhaltet auch

hier den Durchschnittswert des Jaccard-Koeffizienten.

Tabelle 11: Bewertung der Qualität des Histogram-Backprojection-Verfahrens für unterschiedli-

che Zelllinien und Mikroskopkontraste mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auflicht-

Hellfeld; A-DF: Auflicht-Dunkelfeld; D-HF: Durchlicht-Hellfeld; D-PK: Durchlicht-Phasenkontrast

Materi-al

L929 MC3T3


Stahl* /Titan*

0,78 0,80 --- --- 0,85 0,86 --- ---

Polystyrol --- --- 0,81 0,63 --- --- 0,78 0,58

Analog zum Kap. 5.2.2.1 gilt auch hier dass grundsätzlich für Bildaufnahmen

von metallischen Proben (Stahl*, Titan*) ein Auflichtmikroskop und für transpa-

rente Materialien (Polystyrol ) ein Durchlichtmikroskop eingesetzt wird.

Im Auflicht-Hellfeld (A-HF) und Auflicht-Dunkelfeld (A-DF) resultieren für beide

Zelltypen ähnliche Ergebnisse.

Bei Verwendung von Polystyrolproben resultieren auch für die Durchlicht-

Hellfeldaufnahmen (D-HF) ähnliche Ergebnisse für beide Zelllinien. Im Durch-

licht-Phasenkontrast (D-PK) ergibt sich für beide Zelllinien eine geringere Über-

einstimmung der automatisch generierten Zellflächen zu den Referenzzellen

(Jaccard-Koeffizient: 0,63 und 0,58). Der Grund liegt darin, dass das erstellte

Template nicht alle Farbvariationen der Zellen abdeckt und so teilweise Zellbe-

standteile nicht segmentiert werden.

5.3 Diskussion der Ergebnisse zur Segmentierung zytochemisch

gefärbter Zellbereiche

Es wurden 3 Verfahren zur Segmentierung von May-Grünwald gefärbten L929-

und MC3T3 Zellen in mikroskopischen Bildaufnahmen (Kap. 5.2) vorgestellt.

Vorteile der schwellwertbasierten Methode, beschrieben in Kap. 5.2.1, sind zum

einen die geringe Rechenzeit. Für die Segmentierung eines Bildes der Größe

1376 x 1032 Pixel werden mit einem handelsüblichen PC (Intel Core i7 CPU)

50ms benötigt. Zum anderen ist die Parametrisierung der Methode einfach, es

muss zur Zellsegmentierung lediglich pro Zelllinie und Materialtyp ein Schwell-


wert für den R-, G-, und B- Kanal gewählt werden. Durch die separate Einstel-

lung der Schwellwerte für jeden Farbkanal und der anschließenden Vereinigung

der Binärbilder ist die Segmentierung von Objekten, die sich aus unterschiedli-

chen Farben zusammensetzen, möglich.

Ein Nachteil dieser Methode ist die Anfälligkeit gegenüber Helligkeits- und Far-

bänderungen im Bild. Daher ist ein reproduzierbarer Färbevorgang der Zellen

Voraussetzung für eine gute Segmentierung. Da es sich bei der Zellfärbung im

Rahmen des Projektes um einen standardisierten Prozess handelt, beschrieben

in Kap. 3.2, ist die Voraussetzung für dieses Verfahren hier erfüllt.

Das histogrammbasierte Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.2,

benötigt eine moderate Rechenzeit. Sie liegt bei 1,26s für die Zellsegmentie-

rung innerhalb eines Bildes der Größe 1376 x 1032 Pixel. Eine Parametrisie-

rung durch den Anwender ist hierbei nicht erforderlich, da der für die Segmen-

tierung benötigte Schwellwert automatisch aus den Histogrammdaten des Bil-

des berechnet wird. So ist die Methode in der Lage, Helligkeits- und Farbände-

rungen von einem Bild zum nächsten Bild zu kompensieren. Voraussetzung für

eine gute Segmentierung ist jedoch, dass das Substrat eine homogene Färbung

in einem Bild aufweist. Dies ist idealerweise beim Durchlichtkontrast gegeben,

z.B. bei der Analyse von Polystyrolproben. Im Auflichtkontrast liefert dieses Ver-

fahren aufgrund farblich inhomogener Hintergrundbereiche schlechtere Ergeb-

nisse im Vergleich zur Methode aus Kap. 5.2.1.

Mit dem Histogram-Backprojection-Algorithmus (Kap. 5.2.3), ist durch iterative

Ausführung mit mehreren Farbtemplates die Segmentierung verschiedenfarbi-

ger Objekte in einem Bild möglich. So können z.B. unterschiedlich angefärbte

Zellen ohne Anpassung der Parameter segmentiert werden. Ein Nachteil ist die

im Vergleich zu den Verfahren aus Kap. 5.2.1 und Kap. 5.2.2 benötigte relativ

hohe Rechenzeit von über 2s (Tabelle 12).

Tabelle 12: Benötigte Rechenzeit der in Kap. 5.2.1 bis Kap. 5.2.3 vorgestellten Segmentie-

rungsverfahren auf Basis eines Intel Core i7, 3.2GHz

Segmentierungsverfahren

Durchschnittliche Rechenzeit für die Zellsegmentierung eines Pro-

benausschnittes der Größe 1376x1032 Pixel

Schwellwertbasierte Methode (Kap. 5.2.1)

50ms

Histogrammbasiertes Verfahren (Kap. 5.2.2)

1,26s

Histogram-Backprojection-Algorithmus (Kap. 5.2.3)

2,25s


Damit ist diese Methode ca. doppelt so langsam im Vergleich zum histogramm-

basierten Schwellwertverfahren (Kap. 5.2.2) und ca. 40-mal langsamer als das

Schwellwertverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1.

Des Weiteren ist im Vorfeld eine Templateherstellung für jede Zelllinie und Ma-

terialtyp notwendig. Dieser Vorgang ist mit einer Bearbeitungszeit im Minuten-

bereich deutlich zeitaufwändiger als die Ausführung des Algorithmus. Allerdings

ist dieser Vorgang nur einmalig durchzuführen, da die erzeugten Templates zur

weiteren Verwendung gespeichert werden.

Die beschriebenen Segmentierungsverfahren werden entsprechend ihrer Vor-

und Nachteile jeweils für unterschiedliche Kontrastarten ausgewählt (Tabelle

13).

Tabelle 13: Vergleich der Jaccard-Koeffizienten der in Kap. 5.2.1 – 5.2.3 vorgestellten Zellseg-

mentierungsverfahren für die Zelltypen L929 und MC3T3 bei unterschiedlichen Materialien und

Mikroskopkontrasten; Die grün hinterlegten Tabellenzellen zeigen das für den aktuell betrachte-

ten Mikroskopkontrast am besten geeignete Segmentierungsverfahren

L929 MC3T3

Stahl* / Titan* Polystyrol Stahl* / Titan* Polystyrol


Algo Kap. 5.2.1

0,89 0,85 0,87 0,60 0,87 0,90 0,76 0,53

Algo Kap. 5.2.2

0,86 0,80 0,87 0,77 0,86 0,85 0,82 0,82

Algo Kap. 5.2.3

0,78 0,80 0,81 0,63 0,85 0,86 0,78 0,58

Tabelle 13 veranschaulicht, dass bei Verwendung eines Auflichtmikroskopes im

Hellfeld- und im Dunkelfeldkontrast das Schwellwertverfahren (Kap. 5.2.1) am

besten geeignet ist. Dies trifft sowohl bei den L929- als auch MC3T3-Zellen zu.

Die Abweichungen zu den Jaccard-Koeffizienten des histogrammbasierten Ver-

fahrens (Kap. 5.2.2) sind jedoch gering, so dass diese Methode ebenfalls für die

Zellsegmentierung einsetzbar ist.

Für die Analyse von Polystyrolproben im Durchlicht-Hellfeldkontrast (D-HF) sind

die schwellwertbasierte Methode (Kap. 5.2.1) sowie das histogrammbasierte

Schwellwertverfahren für Zellen der Linie L929 gleichermaßen geeignet, die

automatisch rekonstruierten Zellflächen weichen in beiden Fällen um 13% von

den Referenzzellflächen ab. Bei der Untersuchung von MC3T3-Zellen können

ebenfalls die Schwellwertmethode sowie das histogrammbasierte Verfahren


eingesetzt werden, wobei dass histogrammbasierte Verfahren (Kap. 5.2.2)

leicht besser abschneidet.

Bei Verwendung eines Durchlichtmikroskops im Phasenkontrast (D-PK) ist so-

wohl für L929- als auch MC3T3 Zellen nur das histogrammbasierte Verfahren

(Kap. 5.2.2) geeignet. Der Grund liegt darin, dass dieses Verfahren zunächst

die Substratfläche segmentiert, und da das verwendete Material Polystyrol eine

homogene Färbung aufweist, erfolgt eine vergleichsweise sichere Segmentie-

rung. Durch die anschließende Subtraktion des detektierten Hintergrundes vom

Gesamtbild werden die Zellbereiche indirekt ermittelt. Die Zellfärbung variiert im

Phasenkontrast so stark, dass die übrigen Segmentierungsverfahren keine ak-

zeptablen Segmentierungsergebnisse liefern.

Das Histogram-Backprojection-Verfahren liefert für keinen Mikroskopkontrast

bessere Ergebnisse als die anderen Methoden, so dass dieser Algorithmus für

die Segmentierung von L929- und MC3T3 Zellen unter Verwendung der ge-

nannten Mikroskopkontraste nicht zum Einsatz kommt.

Neben den bereits vorgestellten Verfahren wurden auch andere Algorithmen

aus der Literatur auf ihre Eignung als Zellsegmentierungsverfahren untersucht.

Eine Methode basierend auf Kantenfilter ist in (57) zu finden. Dort werden Zel-

len zwar mit Hilfe eines standard Schwellwertverfahrens segmentiert, allerdings

auf Basis des Gradientenbildes, das zuvor mit Hilfe geeigneter Kantenfilter be-

rechnet wird. Diese Vorgehensweise ist für das in (57) verwendete Bildmaterial

geeignet (Abb. 24), da sich die Zellgrenzen mit gutem Kontrast von dem Hinter-

grund abheben und so ein verwertbares Gradientenbild entsteht.

Abbildung 25: Links: Hellfeldbild von ungefärbten Hefezellen (57); Rechts: Gradientenbild von

Abb. 24 Links

Das Bildmaterial im Rahmen dieses Projektes weist hingegen keine vergleich-

bar kontrastreichen Übergänge von Zelle zu Hintergrund auf und außerdem

erscheinen die Zellen aufgrund der unterschiedlich gefärbten Zellbereiche we-


sentlich inhomogener als die in (57) bearbeiteten Zellen. Aus diesen Gründen

ist eine Segmentierung auf Basis von Kantenalgorithmen für die vorliegende

Aufgabenstellung nicht geeignet.

In (28) wird die Wasserscheidentransformation zur Zellsegmentierung einge-

setzt. Nach einer Fluoreszenzanfärbung von Zellmembran und Zellkernen wird

das Epithel nach einer Kontrasterhöhung mit Hilfe eines Schwellwertverfahrens

und morphologischen Operationen segmentiert. Die Detektion der Zellkerne

erfolgt ebenfalls über eine adaptive Schwellwertmethode mit anschließender

Wasserscheidentransformation. Die Erkennung der Zellgrenzen erfolgt auch mit

Hilfe einer Wasserscheidentransformation. Im Ergebnis resultiert laut (28) eine

Übersegmentierung der Zellen von ca. 7% im Vergleich zu einer Referenzzäh-

lung. Durch die 3-fache Fluoreszenzanfärbung verschiedener Zellbereiche liegt

ein optimaler farblicher Kontrast zur Segmentierung der gewünschten Zellberei-

che vor. In diesem Fall kann die Wasserscheidentransformation eingesetzt

werden, da sich die Zellkonturen kontrastreich im Bild hervorheben. Dennoch

resultiert bereits in diesem Fall eine Übersegmentierung von ca. 7%. Im Rah-

men dieses Projektes wird statt einer Fluoreszenzfärbung eine zytochemische

May-Grünwald Zellfärbung eingesetzt. Im Vergleich zur Fluoreszenzfärbung

resultiert ein schlechterer Kontrast zur Unterscheidung zwischen verschiedenen

Zellbestandteilen oder agglomerierten Zellen im Bildmaterial. Infolgedessen ist

von einem schlechten Segmentierungsergebnis auf Basis einer Wasserschei-

dentransformation auszugehen. Somit ist die Anwendung eines Verfahrens ba-

sierend auf diesem Algorithmus hier nicht sinnvoll.

Darüber hinaus werden aktive Konturen, auch Snakes genannt, bei der

Zellsegmentierung eingesetzt (29; 30; 31; 32; 33).

Aktive Konturen bieten den Vorteil, dass sie bei kontrastarmen und teilweise

verrauschten Bildern im Vergleich zu Schwellwertverfahren akzeptable Seg-

mentierungsergebnisse liefern.

Nachteil dieses Verfahrens ist die schlechte Anpassung an topologische

Veränderungen und die sehr hohe Rechenzeit. Für die Segmentierung einer

Zelle werden bereits 1-5s benötigt. Die Zellzahl in einem Probenausschnitt der

Linie L929 beträgt bei mittlerer Zelldichte ca. 200-300 Zellen, so dass für die

Zellsegmentierung eines Bildes mehrere Minuten benötigt werden. Ein anderer

Nachteil ist die notwendige Initialisierung einer Startkontur nahe der zu

suchenden realen Objektkontur. Die Startkontur muss entweder interaktiv durch

den Softwarebediener erstellt werden oder es werden weitere Algorithmen für

eine automatische Bestimmung der Startkonturen benötigt. Aus diesen


Gründen ist der Einsatz von Snakes für dieses Projekt nicht zweckmäßig, da

eine möglichst automatische und schnelle Zellanalyse angestrebt wird.

Die in Kap. 5 vorgestellten Segmentierungsverfahren können die zu Agglomera-

ten verbundenen Zellen nicht individuell erfassen. Cluster werden demnach

fälschlicherweise als eine Zelle erkannt. Ein Vergleich der automatischen Zell-

zählung auf Basis des Schwellwertverfahrens (Kap. 5.2.1) zur Referenzzählung

durch einen Experten (Kap. 13.6) zeigt, dass Maßnahmen zur Erhöhung der

Zellzählgenauigkeit erforderlich sind. Die statistische Auswertung ist in Tabelle

14 hinterlegt.

Tabelle 14: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung mit dem Segmentierungsverfah-

ren aus Kap. 5.2.1 vor Anwendung der Separationsmethoden

L929 Zellzählung Mittlere Abweichung

zur Referenz [%]

Standard- Abweichung

[%]

Standard- fehler [%]

Konfidenz- intervall

Toleranz um Mittelwert

13,70 9,22 0,92

1,96 (95%) 1,81

2,576 (99%) 2,38

3,29 (99,9%) 3,03

3,87 (99,99%) 3,57

MC3T3 Zellzählung

Mittlere Abweichung zur Referenz

[%]


[%]



Toleranz um Mittelwert

61,55 22,51 2,25

1,96 (95%) 4,41

2,576 (99%) 5,80

3,29 (99,9%) 7,41

3,87 (99,99%) 8,71

Tabelle 14 zeigt, dass sich unter Verwendung einer Stichprobe von 100 Pro-

benausschnitten für die Linie L929 im Durchschnitt eine Abweichung von 13,7%

+/- 2,38% bei einem Konfidenzintervall (58) von 99% zur Referenz einstellt. Für

Zellen des Typs MC3T3 ergibt sich unter Verwendung einer Stichprobe von 100

Probenausschnitten eine Abweichung von 61,55% +/- 5,8% bei einem Kon-

fidenzintervall von 99%. Die höhere Abweichung für die MC3T3 Zellen im Ver-

gleich zum Typ L929 liegt an der vermehrten Bildung von Agglomeraten, die mit

dem Segmentierungsverfahren aus Kap. 5.2.1 jeweils nur als ein Zellbereich

detektiert werden.

Die Bewertung der Biokompatibilität eines Materials setzt jedoch eine genaue

Erfassung der Zellanzahl zur Bestimmung der Proliferationsrate13 voraus, so

dass eine individuelle Auswertung der verbundenen Zellen notwendig ist. Aus

diesem Grund müssen die zusammenhängenden Zellen des zugrunde liegen-

13

Proliferationsrate: Wachstums- bzw. Vermehrungsverhalten von Zellen.

6. Separation agglomerierter Zellen 52

den Materials separiert werden. Mögliche Verfahren zur Zelltrennung werden in

Kapitel 6 vorgestellt.

6. Separation agglomerierter Zellen

Zellen der Typen L929 (Abb. 26) und insbesondere MC3T3 (Abb. 27) bilden

Agglomerate aus, die im Allgemeinen Voraussetzungen für die Gewebebildung

sind.

Abbildung 26: Zellen des Typs L929 auf dem Material Stahl*. Vereinzelnd können Agglomerate

(grüne Kontur) auftreten

Abbildung 27: Zellen des Typs MC3T3 auf dem Material Stahl*. Diese Zelllinie neigt zur Clus-

terbildung (grüne Kontur)


Für die Separation von L929 und MC3T3 Cluster sowie Zelltypen mit ähnlicher

Morphologie werden in diesem Kapitel geeignete Separationsverfahren vorge-

stellt. Das Konzept des Separationsvorgangs ist in Abb. 28 dargestellt.

Abbildung 28: Ablaufdiagramm zur Zellvereinzelung. Nähere Erläuterungen siehe Text

In Kap. 6.1 wird ein kontextbasiertes Trennverfahren (CBS) vorgestellt, das alle

Zellen an Verengungen, wie sie bei der Zelllinie L929 überwiegend an Zellgren-

zen innerhalb der Agglomerate vorzufinden sind, aufspaltet (59). Diese Metho-

de wird unabhängig vom verwendeten Zelltyp immer durchgeführt, da auch bei

Typen mit kompakter Clusterbildung, z.B. MC3T3, vereinzelnd Verengungen an

Zellkontaktstellen auftreten können. Zelltrennalgorithmen kommen zur Einspa-

rung von Rechenzeit nur für Zellbereiche, die als Agglomerate klassifiziert wur-


den, zum Einsatz. Eine geeignete Methode zur Klassifizierung der Zellbereiche

in Einzelzellen und Agglomerate wird in Kap. 6.2 erläutert. Im nächsten Schritt

erfolgt die Detektion der Kerne innerhalb der als Cluster definierten Zellbereiche

(Kap. 6.3). Werden Kernbereiche ermittelt, kommen, abhängig von der Zellmor-

phologie, zwei unterschiedliche Separationsverfahren zum Einsatz. Kap. 6.4

beschreibt ein Trennverfahren spezialisiert auf Zelltypen, die an den Kontakt-

stellen innerhalb der Agglomerate Verengungen an der Kontur aufweisen. Kap.

6.5 hingegen beschreibt ein Separationsverfahren, dass für Zelllinien mit kom-

pakter Clusterbildung ohne Verengungen an den Zellkontaktstellen zum Einsatz

kommt. Können keine Kernbereiche ermittelt werden, erfolgt die Separation der

Cluster mit Hilfe des in Kap. 6.6 beschriebenen Verfahrens.

Durch den Bildrand abgeschnittene Zellbereiche verfälschen die Analyse, z.B.

bei der Bestimmung der mittleren Zellfläche und müssen eliminiert werden. Ein

Verfahren zur Verarbeitung der Randzellen wird in Kap. 6.7 vorgestellt. Damit

ist die Erfassung der individuellen Zellbereiche abgeschlossen.

Die Auswahl der verschiedenen Verfahren wird von der Laborfachkraft im Vor-

feld einer Untersuchung festgelegt und in einer Parameterdatei gespeichert.

Liegen für die verschiedenen Kombinationen von Zelltyp und Substrat jeweils

Parameterdateien vor, so muss zu Beginn einer Analyse die passende Parame-

terdatei geladen werden. Weitere Parametereinstellungen sind nicht notwendig.

6.1 Kontextbasiertes Trennverfahren

Die CBS-Methode ist ein Verfahren zur Separation beliebiger zusammenhän-

gender Objekte (59). Die zusammenhängenden Objekte müssen zunächst mit

Hilfe eines geeigneten Verfahrens segmentiert werden, z.B. mit einer der Me-

thoden aus Kap. 5.2. Die Separation der segmentierten Objektbereiche erfolgt

im ersten Schritt mit Hilfe eines kreisförmigen Strukturelementes C1 mit Radius

r1, das die Kontur des Objektes RC abfährt (Abb. 29 Links). Da RC im weiteren

Verlauf des Algorithmus manipuliert wird, ist die Erstellung einer Kopie RC_Copy

von RC notwendig. Für jeden i-ten Konturpunkt wird geprüft, ob die von C1 ein-

geschlossene Hintergrundmenge B aus zwei voneinander getrennten Teilmen-

gen B1 und B2 besteht. B1 und B2 müssen durch die von C1 eingeschlossene

Objektregion getrennt sein (Abb. 29 Mitte). Hierbei handelt es sich um eine

notwendige Bedingung für eine lokale Verengung des Objektes. Sie ist durch

die Aufweitungen an den Enden gekennzeichnet. Um dies festzustellen, wird

zuerst eine zu C1 konzentrisch angeordnete Kreismaske C2 mit dem Radius r2 =

a • r1 generiert. Bei der Einstellung des Parameters a ist zu beachten dass die-


ser Abhängig von der Objektgröße ist. Liegen große Objekte im Bild vor, ist a

größer zu wählen als wenn kleinere Objekte vorliegen. Sollen in einem Bild un-

terschiedlich große Objekte getrennt werden kann die CBS iterativ mit ver-

schiedenen Einstellungen für den Parameter a ausgeführt werden. Mit Hilfe von

C1 und C2 wird dann die Kreisringmaske CR = C2 \ C1 berechnet und im weite-

ren Verlauf des Algorithmus bestimmt (Abb. 29 rechts).

Abbildung 29: Links: Die Kontur des Objektes RC wird mit einem kreisförmigen Strukturelement

C1 abgefahren. Mitte: Der in C1 liegende Hintergrund B wird durch RA,n in zwei Teilmengen B1

und B2 aufgeteilt. Rechts: Mit Hilfe von C1 und CR wird geprüft, ob eine Verengung vorliegt

Abb. 29 rechts zeigt, dass die Punktmenge RB aus 2 nicht überlappenden oder

angrenzenden Punktmengen 1BR und

2BR besteht. Die Entscheidungsfunkti-

on f1(x) wird durch Gl. 4 definiert. Wenn f1(x) den Wert true annimmt, liegt eine

Verengung vor.

1 21 , ,B A n B A nf x R R x R R x . (Gl. 4)

Das Symbol |..| steht für die Anzahl Bildpunkte einer Menge. Der Parameter x

gibt vor, um welchen Anteil 1BR und

2BR größer sein müssen als der von C1

eingeschlossene Objektbereich. Die Menge RB kann sich auch aus l nicht über-

lappenden oder angrenzenden Punktmengen zusammensetzen. Die Entschei-

dungsfunktion f1(x) erweitert sich und wird entsprechend Gl. 5 definiert. Nimmt

f1(x) den Wert true an, liegt eine Verengung vor.

1 21 , , ,...lB A n B A n B A nf x R R x R R x R R x . (Gl. 5)

Liefert f1(x) den Wert true, erfolgt die Objektseparation mit der Zuweisung

',\C C A nR R R

':C CR R .

Der Objektbereich RC wird überschrieben, um Mehrfachtrennungen an benach-

barten Konturpunkten zu vermeiden. RA,n wird als Element der Menge RA_Ges

hinzugefügt. Der beschriebene Separationsvorgang wird an den n Engstellen

des Objektclusters durchgeführt.

1BR 2BR

1 2B B BR R R


Abbildung 30: Ergebnis der Objekttrennung nach 3 Separationsvorgängen. Es resultieren 3

neue Objektbereiche RS,1, RS,2, RS,3. Die Objektbereiche RA,2 und RA,3 sind zufällig dem sepa-

rierten Objekt RS,3 und der Objektbereich RA,1 des getrennten Objektes RS,1 zugeordnet worden

Im dargestellten Objektcluster (Abb. 30) erhält man RS,1, RS,2 und RS,3 als Er-

gebnis des Labelings von RC, nachdem im Rahmen der 3 Separationsprozesse

RA,1, RA,2 und RA,3 von RC subtrahiert und das Ergebnis wieder RC zugewiesen

wurde. Da die in RA_Ges gespeicherten Objektbereiche Teilmengen des ur-

sprünglichen Objektbereiches RC_Copy sind, werden sie zufällig dem jeweils be-

nachbarten Bereich zugeordnet. In Abb. 30 wurden zwei der in RA_Ges gespei-

cherten Objektbereiche RS,3 und ein in RA_Ges gespeicherter Objektbereich RS,1

zugeordnet.

',3 ,3 ,1 ,3S S A AR R R R

',3 ,3:S SR R

',1 ,1 ,2S S AR R R

',1 ,1:S SR R

Es können Situationen vorliegen, bei denen Objekttrennungen nicht sinnvoll

sind, z.B. bei Unregelmäßigkeiten in der Objektkontur, aber f1(x) true als Ergeb-

nis hat. Aus diesem Grund wird die Entscheidungsfunktion f1(x) für eine Objektt-

rennung erweitert.

Eine Teilung unterbleibt für den Fall, wenn eine der beiden Regionen 1BR oder

2BR um das y-fache größer ist als die andere (Abb. 31).

RS,1 RS,3

RA,3

RA,1 RA,2

RS,2


Abbildung 31: Unregelmäßigkeiten bei einer Objektkontur die dazu führen dass 1BR und

2BR

deutlich unterschiedliche Flächenanteile besitzen.

Die erweiterte Entscheidungsfunktion lautet 1 2( , ) ( ) ( )f x y f x f y mit

1 2 2 12 B B B Bf y R y R R y R . (Gl. 6)

Liefert f1(x) den Wert true, liegt eine Verengung vor. Nimmt f2(y) den Wert true

an, ist sichergestellt, dass die Flächen von 1BR und

2BR weniger als das y-

fache voneinander abweichen, das Vorliegen einer Objektunregelmäßigkeit ist

unwahrscheinlich. Werden f1(x) und f2(x) logisch UND Verknüpft, liefert die er-

weiterte Entscheidungsfunktion f(x,y) ebenso den Wert true und eine Separati-

on wird durchgeführt. Der gesamte Programmablauf inklusive CBS ist in Abb.32

dargestellt.

2BR

1BR


Abbildung 32: Programmablaufplan zur Auftrennung eines Objektes RC an seinen n Engpässen.

Erläuterung im Text.

Das Objektcluster RC besitzt n verschiedene Engstellen RA,1, RA,2, …, RA,n. Die-

se werden nacheinander mit der CBS bearbeitet, in Abb. 32 dick umrandet dar-

gestellt. Es resultieren aus RC r neue Objektbereiche RS,1, RS,2, …, RS,r, die als

Elemente von OList gespeichert werden. Für den Fall r ≤ 1 wird RC_Copy als Ele-

ment von OList hinzugefügt. Die geschilderte Prozedur gilt für jedes segmentier-

te Agglomerat. Abb. 33 zeigt die CBS in Form eines Programmablaufplans.


Abbildung 33: Programmablaufplan zur CBS

Abb. 33 zeigt eine entscheidungsbasierte Struktur des Algorithmus, mit der die

möglichen geometrischen Variationen der Objekte bearbeitet werden. Nach Be-


rechnung von , 1A n CR C R mit anschließendem Labeling erhält man k separa-

te Punktmengen. Für den Fall k > 1, wird nur die Punktmenge behandelt, die

den Mittelpunkt von C1 beinhaltet. Wenn k = 1, folgt die Berechnung von

B R CR C R . RB wird einem Labeling unterzogen, wodurch l Teilmengen

1 2, ,...,

lB B BR R R entstehen, die, vereinigt mit RA,n, eine zusammenhängende Men-

ge bilden. Wenn l = 2, prüft die Entscheidungsfunktion f(x,y), ob die beiden

Teilmengen 1BR und

2BR eine Verengung repräsentieren. Im Fall l > 2 wird ge-

prüft, ob alle Teilmengen

max,

p

p p

B

B A n B

R

R x R Ry

mit p = 1, 2,..., l; x = 1.5; y = 3 (Gl. 7)

erfüllen, wobei die größte Teilmenge von 1 2, ,...,

lB B BR R R aus maxpBR Elemen-

ten besteht. Enthält 1 2, ,...,

lB B BR R R mindestens zwei Mengen, die problemspezifi-

sche Bedingungen (anschließender Abschnitt „Anwendung der CBS für die Se-

paration zusammengewachsener L929-Zellen“) erfüllen, wird der Trennungs-

prozess eingeleitet und es entstehen i separate Objektbereiche RS,1, RS,2,…,

RS,i. Existieren q Mengen in 1 2, ,...,

lB B BR R R , die die Bedingungen nicht erfüllen,

werden sie als Elemente in RBD hinzugefügt, RBD = 1 2, ,...,

qBD BD BDR R R . Nach

der Objekttrennung erfolgt mit Hilfe der in RBD vorhandenen Elemente die Er-

mittlung der unerwünscht abgetrennten Objektbereiche. Ein abgetrennter Ob-

jektbereich RS,j mit j = 1, 2,…, i gilt als unerwünscht, wenn für ,jt tU S j BDR R R

(mit t = 1, 2,…,q) |RUjt| > 0 erfüllt ist. Ist ein unerwünschter Objektbereich RS,j

ermittelt, wird dieser einem der übrigen Objektbereiche zugewiesen, wobei die

Auswahl zufällig erfolgt. Auf diese Weise kann eine Objektseparation auch dort

erfolgen, wo mehrere Objektbereiche zusammenlaufen, aber diese nicht alle

getrennt werden dürfen (Tabelle 15, Fall 5). Die für eine Objektseparation auf-

tretenden Fälle sind in Tabelle 15 aufgeführt. Abb. 34 dient als Zeichenerklä-

rung für Tabelle 15.


Abbildung 34: Links: 2 Objekte; Mitte: Zwei verbundene Objekte; Rechts: Zwei verbundene

Objekte, wobei ein Objektbereich in C1 hineinragt, der zum linken Objekt gehört.

Tabelle 15: Schematische Darstellung möglicher Objektgeometrien an einer Kontaktstelle

Schema Erklärung

Fall 1

Die Kreismaske C1 umfasst den Objektbereich RA,n, der die Hin-

tergrundpixel in zwei separate Mengen B1 und B2 teilt (Abb. 29

rechts). Der Kreisring CR beinhaltet mit RB zwei nicht aneinan-

dergrenzende Mengen 1BR und

2BR . Damit eine Objekttren-

nung erfolgt, muss f(x,y) für 1BR und

2BR den Wert true zurück-

geben sowie die problemangepassten Bedingungen erfüllt sein.

Fall 2

Innerhalb von C1 befinden sich zwei separate Objektbereiche.

Zur weiteren Bearbeitung wird nur der Objektbereich ausge-

wählt, der den Mittelpunkt von C1 in seiner Punktemenge bein-

haltet. Danach ergibt sich der Zustand in Fall 3.

Fall 3

Innerhalb von CR befindet sich ein separater Objektbereich, der

nicht in den Bereich von C1 eindringt. Dieser Objektbereich wird

für die weitere Bearbeitung ignoriert. Daraufhin ergibt sich der

Zustand wie in Fall 1.

Fall 4

Innerhalb von CR befindet sich ein separater Objektbereich, der

mit RA,n, aber nicht mit anderen Objektstellen verbunden ist. Für

alle drei in RB enthaltenen Teilmengen wird geprüft, ob f(x,y)

true zurückliefert sowie die Bedingungen erfüllt sind. Bleiben

mindestens zwei Teilmengen in RB übrig, die die Bedingungen

erfüllen, erfolgt die Trennung an dieser Stelle. Alle Teilmengen

in RB, die die Bedingungen nicht erfüllen, werden als Elemente

in RBD hinzugefügt, damit nach einer Trennung die falsch abge-

trennten Bereiche wieder mit dem Nachbarobjekt vereinigt wer-

den können.

Fall 5

Hier befinden sich, im Vergleich zu Fall 4, innerhalb von CR ein

oder mehrere separate Objektbereiche, die mit RA,n und mit an-

deren Teilen von RC verbunden sind. Für alle Teilmengen in RB

wird geprüft, ob f(x,y) true zurückliefert sowie die Bedingungen

RB

C1 CR C2

RA,n

2BR1BR


erfüllt sind. Bleiben mindestens zwei Teilmengen in RB übrig,

die die Bedingungen erfüllen, erfolgt die Abtrennung an dieser

Stelle. Alle Teilmengen in RB, die die Bedingungen nicht erfül-

len, werden analog zu Fall 4 als Elemente in RBD gespeichert,

damit nach einer Trennung die falsch abgetrennten Objektbe-

reiche wieder mit dem benachbarten Objekt vereinigt werden

können.

Die Anzahl der Objektbereiche innerhalb von C1 und CR kann variieren. Dies

wurde in Tabelle 15 der Übersichtlichkeit wegen nicht berücksichtigt. Ebenso

sind Mischformen der gezeigten Fälle möglich, wobei dies für den Algorithmus

keine Beeinträchtigung darstellt.

Anwendung der CBS für die Separation zusammengewachsener L929-Zellen:

Für die Anwendung der CBS auf Zellen vom Typ L929 sind die Parameter r1, x,

y und a festzulegen. Im Folgenden ist die manuelle Parameterfestlegung be-

schrieben. Ein Konzept zur automatischen Parameterfestlegung ist in Kap. 8.2

erläutert.

Tabelle 16 zeigt die durchschnittliche relative Abweichung der automatischen

Zellzählung von 2376 Zellen mit der Referenzzählung bei Variation des Para-

meters r1. Mit r1 = 15 erhält man die geringste Abweichung. Für den Fall r1 < 10

werden nicht alle potentiellen lokalen Verengungen gefunden so dass nicht alle

Zellen voneinander getrennt werden können. Im Gegensatz dazu entsteht mit r1

> 20 eine zu große Kreismaske die zu ungewollten Separationen führt.

Tabelle 16: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen Zählung von 2376 L929-

Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche Werte des Parameters r1

r1=5 r1=10 r1=15 r1=20 r1=25

Relative Abweichung

8,6% 2,9% 2,7% 4,2% 9,5%

Entsprechend der Tabelle 16 wird der Parameter r1=15 gewählt.

Tabelle 17 zeigt ebenfalls die durchschnittliche relative Abweichung der auto-

matischen Zellzählung von 2376 Zellen mit der Referenzzählung bei Variation

des Parameters a. Mit a = 2 erhält man die geringste Abweichung. Für den Fall

a < 1,5 werden nicht alle lokalen Verengungen gefunden so dass nicht alle Zel-

len voneinander getrennt werden können. Im Gegensatz dazu entsteht mit a >

2.75 eine Kreismaske die größer ist als die meisten Verengungen, dass zu un-

gewollten Separationen führt.


Tabelle 17: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen Zählung von 2376 L929-

Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche Werte des Parameters a

a=1,25 a=1,5 a=2,0 a=3,0 a=5,0

Relative Abweichung

8,6% 4,6% 2,7% 3,4% 6,3%

Aufgrund der in Tabelle 17 hinterlegten Daten ist a = 2,0 gesetzt.

Der Parameter x ist an das Problem angepasst, in diesem Fall ist x = 1,5. Auch

Tabelle 18 zeigt die durchschnittliche relative Abweichung der automatischen

Zellzählung von 2376 Zellen mit der Referenzzählung bei Variation des Para-

meters x. Ist x = 1,5 erhält man die geringste Abweichung von der Referenzzäh-

lung. Für den Fall dass x > 3,0 eingestellt ist, werden einige lokale Verengun-

gen nicht gefunden. Ist x zu klein eingestellt findet der Algorithmus zu viele lo-

kale Verengungen und die Fehlerrate erhöht sich ebenfalls.

Tabelle 18: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen Zellzählung von 2376

Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche Werte des Parameters x

x=1,25 x=1,5 x=2,0 x=2,5 x=3,0

Relative Abweichung

5,8% 2,7% 2,9% 3,8% 7,4%

Die folgende Tabelle 19 zeigt ebenfalls die durchschnittliche relative Abwei-

chung der automatischen Zellzählung von 2376 Zellen mit der Referenzzählung

bei Variation des Parameters y. Für y = 3 resultiert die geringste Abweichung

von der Referenzzählung. Wählt man y zu groß erfolgt teilweise die Separation

von Zellausläufern von dem Rest der Zelle. Im Unterschied dazu führt im Fall

eines zu kleinen Wertes für y der Algorithmus teilweise keine Trennung zu-

sammengewachsener Zellen aus.

Tabelle 19: Durchschnittliche relative Abweichung der automatischen Zellzählung von 2376

Zellen mit der Referenzzählung für unterschiedliche Werte des Parameters y

y=1,5 y=2 y=3 y=4 y=5

Relative Abweichung

26,7% 5,3% 2,7% 4,2% 8,1%

In manchen Fällen variiert die Breite eines langgestreckten Zellausläufers so stark, dass

f(1.5,3) den Wert true hat (Abb. 36 Rechts).


Abbildung 35: Links: Die Abtrennung eines Zellausläufers von seiner Zelle ist nicht erwünscht;

Rechts: Die Aufspaltung eines Zellausläufers ist ebenfalls unerwünscht

In Abb. 35 (Links) ist der Fall2 1

3B BR R skizziert. Damit ist f2(3) = false und

somit f(1.5,3) = false. Eine Trennung darf nicht erfolgen, denn es wurde ein zur

Zelle gehörender Zellausläufer erkannt. In manchen Fällen variiert die Breite

eines langgestreckten Zellausläufers so stark, dass f(1.5,3) den Wert true hat

(Abb. 35 Rechts). Auch dies ist eine offensichtliche Fehlentscheidung und muss

mit weiteren Bedingungen unterbunden werden.

Bedingung 1: Alle durch eine Trennung entstehenden Objektbereiche müssen

jeweils eine Mindestgröße Amin aufweisen, andernfalls erfolgt keine Trennung.

Bedingung 2: Bis zu einer maximalen Objektgröße Amax muss die Kompaktheit

aller Objektbereiche den Wert K a annehmen, mit a = 10 in diesem Fall.

Besitzt ein Element eine Fläche > Amax, handelt es sich um eine schmale lang-

gezogene Einzelzelle und eine Trennung ist korrekt.

6.1.1 Ergebnisse

Um die Effizienz des hier vorgestellten Verfahrens zu beurteilen, wurden, neben

einer Zeitmessung für 10 verschiedene L929-Probenausschnitte (Tabelle 20),

aus 100 Proben des Typs L929 auf dem Substrat Stahl* sowie Titan* die Anzahl

der Zellen mit dem Algorithmus aus Kap. 6.4 in Kombination mit der hier vorge-

stellten CBS bestimmt und mit der von einem Experten ermittelten Zellzahl ver-

glichen (Tabelle 21).

Tabelle 20: Vergleich der Rechenzeit für den Separationsalgorithmus (Kap. 6.4) ohne CBS und

mit CBS auf einer i7 3,2GHz CPU mit Parallelverarbeitung.

Probe Berechnungs-zeit ohne CBS

(s)

Berechnungs-zeit mit CBS (s)

Speed- Up

Probe 1 12,4 1,9 6,53

Probe 2 5,8 2,1 2,76

Probe 3 4,4 0,9 4,89

1BR

2BR 1BR

2BR


Probe 4 11,8 1,9 6,21

Probe 5 2,1 0,6 3,50

Probe 6 4,1 1,1 3,73

Probe 7 1,1 0,4 2,75

Probe 8 2,0 0,5 4,00

Probe 9 6,2 0,5 12,40

Probe 10 15,1 0,4 37,75

Ø Geschwindigkeitszuwachs 8,45

Tabelle 21: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung mit dem Separationsverfahren

aus Kap. 6.4 ohne und mit vorgeschalteter CBS

Zellzählung ohne vorgeschalteter CBS Mittlere Abweichung

zur Referenz [%] Standard-

Abweichung [%] Standard- fehler [%]

Konfidenz- Intervall

Toleranz um Abweichung

2,41 1,90 0,19

1,96 (95%) 0,37

2,576 (99%) 0,49

3,29 (99,9%) 0,63

3,87 (99,99%) 0,74

Zellzählung mit vorgeschalteter CBS

Mittlere Abweichung zur Referenz [%]

Standard- Abweichung [%]




1,27 0,87 0,09

1,96 (95%) 0,17

2,576 (99%) 0,22

3,29 (99,9%) 0,29

3,87 (99,99%) 0,34

Aus Tabelle 20 geht hervor, dass durch Vorschalten der CBS im Mittel ein

Speed-Up um den Faktor 8 im Vergleich zur Zellzählung ohne Einsatz der CBS

erzielt wird. Tabelle 21 zeigt, dass unter Verwendung einer Stichprobe von 100

Probenausschnitten für den Einsatz der CBS im Durchschnitt die Abweichung

von 2,41% +/-0,49% auf 1,27% +/-0,22% bei einem Konfidenzintervall von 99%

sinkt (Kap. 13.7).

Die für die Entscheidungsfunktion f(x,y) notwendigen Parameter wurden für die

Zelllinie L929 experimentell angepasst. Mit f(1.5,3) erhält man die geringste

Abweichung der automatisierten Zellzahlzählung im Vergleich zum Referenz-

wert. Die zellspezifischen Regeln zu Objektgröße und Kompaktheit (Kap. 6.1

Bedingung 1 und Bedingung 2) wurden speziell für die vorliegende Anwendung

aufgestellt und können bei Bedarf durch andere Regeln ersetzt werden, ohne

die Methode zu verändern. Hier dient das Verfahren als Ergänzung zu dem in

Kap. 6.4 vorgestellten Separationsverfahren, um die Rechenzeit zu verkürzen

sowie die Genauigkeit der Zellzählung zu steigern. Es können jedoch auch

Operationen an Objektverengungen unabhängig von anderen Algorithmen vor-

genommen werden, wobei in dem Fall die Rechenzeit im Millisekunden Bereich

liegt. Die CBS ist übertragbar auf andere Objekte und kann somit auch Ver-

wendung für andere Problemstellungen finden.


6.2 Klassifizierung segmentierter Zellbereiche

Nachdem die Zellen mit einer der in Kap. 5 beschriebenen Methoden segmen-

tiert und die CBS-Methode aus Kap. 6.1 ausgeführt wurde, erfolgt die Klassifi-

zierung der resultierenden Bereiche entweder als „Einzelzelle“ oder „Zellclus-

ter“. Die als „Zellcluster“ klassifizierten Zellbereiche werden dann abhängig vom

Zelltyp durch die in Kap. 6.4, 6.5 und 6.6 beschriebenen Trennverfahren sepa-

riert, damit sie individuell auswertbar sind. Untersuchungen zeigen, dass die

Klassifizierung mit Hilfe geometrischer Merkmale, z.B. Zellfläche oder Kom-

paktheit, nicht geeignet ist (Kap. 13.4). Ebenso ist eine farbliche Unterschei-

dung von Einzelzellen und Agglomeraten nicht möglich. Da Zellen der Linie

L929 oft Verengungen an den Zellkontaktstellen aufweisen, ist mit Hilfe einer

iterativen Ausführung der Erosion mit anschließendem Labeling eine Klassifizie-

rung der Zellbereiche durchführbar.

Die Klassifizierung erfolgt nacheinander für alle n segmentierten Zellbereiche

Z1, Z2, …, Zn, wobei jeder Zellbereich als endliche Pixelmenge aufgefasst wird.

Dazu wird ein Zellbereich Zi iterativ mit einem kreisförmigen Strukturelement B,

dessen Radius 1,5 Pixel beträgt, erodiert. Der erodierte Zellbereich

Zi,j+1 = ,( )B i jZ mit j = 0, 1,…, JMax (Gl. 8)

wird einem Labeling unterzogen. Resultieren mindestens zwei nicht zusam-

menhängende Zellbereiche mit einer Fläche ≥ AMin, bricht das Verfahren ab und

der Zellbereich wird als „Zellcluster“ eingestuft. Liefert das Labeling nur einen

zusammenhängenden Zellbereich, wird die Erosion mit anschließendem La-

beling wiederholt, bis zwei nicht zusammenhängende Zellbereiche entstehen

oder die maximale Anzahl Iterationen JMax erreicht ist. Bei JMax handelt es sich

um einen einstellbaren Parameter, wobei sich JMax = 25 als geeignet erweist.

Wenn die maximale Anzahl Iterationen erreicht wurde und nur ein zusammen-

hängender Zellbereich nach dem Labeling vorliegt, erfolgt die Klassifizierung

des Zellbereiches als „Einzelzelle“.


Abbildung 36: Die cyan gefärbte Kontur repräsentiert den ursprünglichen Zellbereich Z i. Die

grün gefärbten Konturen repräsentieren Zi,13 (das Ergebnis nach 13 Iterationen der Erosion).

Abb. 36 zeigt einen Zellbereich Zi,j, der nach 13 Iterationen der Erosion mit an-

schließendem Labeling zwei neue Zellbereiche liefert. Der Zellbereich wird folg-

lich als „Zellcluster“ klassifiziert.

Da sich agglomerierte Zellen vom Typ MC3T3 oft durch eine kompakte Geo-

metrie auszeichnen, ist eine Klassifizierung der Zellbereiche mit Hilfe der iterati-

ven Erosion nicht ideal. Durch Ergänzung der Methode mit nachfolgender Regel

lassen sich auch Zellbereiche des Typs MC3T3 in Cluster und Einzelzellen

klassifizieren.

Liegen nach der Kerndetektion, beschrieben in Kap. 6.3, mindestens 2 unter-

schiedliche Kernbereiche in einem als Einzelzelle klassifizierten Zellbereich vor,

wird nachträglich die Klassifikation in „Zellcluster“ geändert, da mit hoher Wahr-

scheinlichkeit eine Fehlklassifizierung vorliegt.

6.2.1 Ergebnisse

Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit der vorgestellten Klassifikationsmethode

wurden in 40 Probenausschnitten (20 L929 und 20 MC3T3 Bilder) die Zellberei-

che durch einen Experten in Zellcluster und Einzelzellen eingeteilt und der au-

tomatischen Klassifizierung gegenübergestellt (Tabelle 22).

Tabelle 22: Vergleich der automatischen Klassifizierung der Zellbereiche in Einzelzellen mit der

Klassifizierung durch einen Experten; REF: Anzahl klassifizierter Zellen durch einen Experten;

FK: Anzahl falsch klassifizierter Zellbereiche durch die Software; Relativer Fehler: Relativer

Fehler der Klassifikation durch die Software

Proben Nr.

REF FK Relativer

Fehler (%) Proben

Nr. REF FK

Relativer Fehler (%)

1 L929 198 1 0,5 11 L929 234 1 0,4

2 L929 197 5 2,5 12 L929 262 5 1,9


3 L929 207 1 0,5 13 L929 189 0 0,0

4 L929 188 0 0,0 14 L929 201 1 0,5

5 L929 214 5 2,3 15 L929 176 2 1,1

6 L929 174 2 1,1 16 L929 212 2 0,9

7 L929 189 1 0,5 17 L929 208 1 0,5

8 L929 200 6 3,0 18 L929 189 5 2,6

9 L929 182 6 3,3 19 L929 194 3 1,5

10 L929 261 2 0,8 20 L929 182 2 1,1

Ø Fehler 1,3

1 MC3T3 85 0 0,0 11 MC3T3 101 1 1,0

2 MC3T3 107 0 0,0 12 MC3T3 95 0 0,0

3 MC3T3 82 0 0,0 13 MC3T3 88 0 0,0

4 MC3T3 90 0 0,0 14 MC3T3 85 0 0,0

5 MC3T3 65 0 0,0 15 MC3T3 92 0 0,0

6 MC3T3 90 1 1,1 16 MC3T3 69 0 0,0

7 MC3T3 95 0 0,0 17 MC3T3 72 0 0,0

8 MC3T3 104 0 0,0 18 MC3T3 86 0 0,0

9 MC3T3 99 1 1,0 19 MC3T3 102 1 1,0

10 MC3T3 67 0 0,0 20 MC3T3 105 0 0,0

Ø Fehler 0,2

Tabelle 22 zeigt, dass die Fehlklassifikation für den Zelltyp L929 im Durch-

schnitt 1,3% und für die Linie MC3T3 0,2% beträgt. Mit diesem Ergebnis ist eine

hinreichend genaue Zellklassifikation gewährleistet. Die vergleichsweise gerin-

ge Fehlklassifikationsrate des Typs MC3T3 liegt darin begründet, dass der

überwiegende Anteil der Zellen zu großen Clustern verbunden ist und damit

eine sichere Klassifikation gewährleistet.

6.3 Zellkerndetektion

Die Detektion der Zellkernbereiche ist Voraussetzung für die in Kap. 6.4 und

Kap. 6.5 beschriebenen Separationsverfahren.

6.3.1 Zellkerndetektion mit Hilfe eines Künstlich Neuronalen Netzes (KNN)

Eine Möglichkeit zur Detektion der Zellkerne besteht in dem Einsatz eines

Künstlich Neuronalen Netzes. Sie bestehen aus künstlichen Neuronen, die mit-

einander vernetzt sind und Informationen austauschen. Motiviert durch das

Neuronale Netz von Säugetieren, bei dem analog viele Nervenzellen zur Infor-

mationsverarbeitung miteinander verbunden sind, findet heute das KNN in vie-

len Bereichen Anwendung, u.a. auch im technischen Bereich für Klassifikati-

onsprobleme. Weiterführende Informationen über die Funktionsweise von KNNs

finden sich z.B. in (60; 61).


Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung eines KNN zur Klassifizierung vor-

segmentierter Zellbereiche (Kap. 5.2) in drei Zellbestandteile, gemäß Kap.

5.2.2, untersucht (62). Dabei handelt es sich um das Ektoplasma (brauner

Randbereich der Zelle), äußere Endoplasma (hellblauer Zellbereich) und den

Kernbereich bzw. das Endoplasma, wobei sich im weiteren Projektverlauf her-

ausgestellt hat, dass nur die Information über die Position des Kernbereiches

benötigt wird.

6.3.1.1 Datenerzeugung für das KNN

Damit das KNN zwischen dem Kernbereich und der übrigen Zellfläche unter-

scheiden kann, müssen geeignete Merkmale gefunden werden. Untersuchun-

gen zeigen, dass die Farbzusammensetzung der Kernbereiche innerhalb eines

Bildes variiert, aber meistens einen Unterschied zur Färbung der restlichen Zel-

le aufweist (Kap. 13.5). Dem KNN werden vier Informationen zur Klassifizierung

bereitgestellt. Bei den ersten drei Merkmalen RGB

RV , RGB

GV , RGB

BV handelt es

sich um normierte Farbverhältnisse. Dazu werden die Schwerpunkte Rs, Gs und

Bs aus den lokalen Histogrammen nach folgender Vorschrift berechnet:

255

2550

0

1S k

kk

k

R m k

m k = 0 bis 255 (Gl. 9)

In (Gl. 9) entspricht mk der Anzahl Pixel an der Position k im Histogramm des

Rotkanals.

Die Schwerpunkte des Grün- und Blaukanals werden analog ermittelt. Die Nor-

mierung dient zur Kompensation von Helligkeitsschwankungen und erfolgt nach

der Vorschrift

RGB SR

S S S

RV

R G B , (Gl. 10)

RGB SG

S S S

GV

R G B , (Gl. 11)

RGB SB

S S S

BV

R G B. (Gl. 12)

Bei der vierten Inputinformation für das KNN handelt es sich um die Farbsätti-

gung S, da die Untersuchungen weiterhin zeigen, dass die Kernbereiche meis-

tens eine höhere Farbsättigung als die restliche Zellfläche aufweisen (Kap.


13.5). Eine Transformation in den HSV-Farbraum (63) ist hier vorteilhaft, da so

schnell auf die Farbsättigung eines Pixels zugegriffen werden kann.

Die vier Inputinformationen für das KNN werden in lokalen Fenstern mit der

Größe 20x20 Pixel berechnet (Abb. 37).

Abbildung 37: Durchlauf des Zellbereiches mit einem Fenster der Größe 20s20 Pixel zur Ermitt-

lung der vier Inputinformationen für das KNN

Dazu wird das kleinste umschließende Rechteck des aktuellen Zellbereiches

ermittelt und die Fenstermaske beginnend links oben iterativ durch diesen ver-

schoben. Bei jeder Iteration wird geprüft, ob mindestens 70% der Fensterfläche

durch Zellpixel gefüllt sind. Ist diese Bedingung erfüllt, werden die vier Inputin-

formationen für das KNN ermittelt, andernfalls erfolgt für diesen Fensterbereich

keine Klassifizierung. Die Fenstergröße ist variabel, jedoch für die vorliegende

Anwendung optimal mit 20x20 Pixel eingestellt. Die Verwendung eines kleine-

ren Fensters liefert zu wenige Pixel für eine sichere Klassifizierung, ein größerer

Bereich hingegen würde oftmals mehrere Zellbereiche beinhalten und so zu

keiner eindeutigen Klassifikation führen. Es lässt sich nicht vermeiden, dass

teilweise auch verschiedene Zellbereiche in einem Fenster der Größe 20x20

Pixel enthalten sind. Kap. 6.3.1.2 stellt eine Methode vor, so dass auch in die-

sem Fall eine eindeutige Klassifikation möglich ist.

6.3.1.2 Verbesserung der Klassifikationsleistung

Der Übergang verschiedener Zellbereiche, z.B. des Zellkerns zum umliegenden

äußeren Endoplasma, kann sich innerhalb eines Prüffensters befinden, so dass

ohne weitere Maßnahmen keine eindeutige Klassifizierung möglich ist, Abb. 38

(links).


Abbildung 38: Links: Prüfbereich zur Klassifizierung des eingeschlossenen Zellareals; Rechts:

Aufteilung des Prüfbereiches bei nicht eindeutiger Klassifizierung

In Abb. 38 (links) ist ein Prüfbereich dargestellt, in dem die für die Klassifizie-

rung benötigten Daten ermittelt werden. Da sowohl ein Teil dem Kernbereich

als auch dem äußeren Endoplasma zugeordnet ist, liefert das Netz keine ein-

deutige Klassifikation. Der Prüfbereich wird in diesem Fall automatisch in zwei

Bereiche aufgeteilt und erneut klassifiziert, Abb. 38 (rechts). Dieser Vorgang

wird maximal 2-mal wiederholt, da weitere Iterationen aufgrund zu kleiner Prüf-

bereiche zu unsicheren Klassifikationen führen. Auf diese Weise ist eine ge-

nauere Klassifizierung verschiedener Zellbestandteile, insbesondere an den

Übergängen verschiedener Zellbereiche, möglich.

6.3.1.3 Architektur und Lernparameter des KNN

Die Architektur eines KNN setzt sich standardmäßig aus einer Eingabe-, Aus-

gabe- und versteckten Schicht zusammen (64). Die Anzahl der Eingabeneuro-

nen ist durch die Anzahl der benötigten Merkmale zur Klassifizierung vorgege-

ben, in diesem Fall vier Neuronen, vgl. 6.3.1.1. Die Anzahl der Neuronen in der

Ausgabeschicht entspricht der Anzahl der vorliegenden unterschiedlichen Klas-

sen. Im Rahmen des Projektes sind es drei unterschiedliche Ausgabeneuronen,

vgl. 6.3.1. Zwischen Eingabe- und Ausgabeneuronen liegen zwei versteckte

Schichten mit jeweils vier Neuronen. Hierbei handelt es sich nach eingehenden

Untersuchungen um die optimale Topologie für diese Problemstellung (Abb.

39).


Abbildung 39: Ausgewählte Netzarchitektur für die Klassifizierung der verschiedenen Zellbe-

standteile

Das Training des KNN erfolgt mit 60 Trainings, 5 Validierungs- und 3 Testpat-

tern, die im Vorfeld erstellt wurden. Unter Einsatz des Backpropagation-

Lernverfahrens (65), einer Lernrate von η = 0.5, 2000 Lernzyklen und einer Va-

lidierung nach jedem 10. Schritt, resultiert das in Abb. 40 dargestellte Trainings-

sowie Validierungsergebnis.

Abbildung 40: Trainings- und Validierungsfehler in Abhängigkeit der Lernzyklen

Abb. 40 zeigt, dass nach 2000 Lernzyklen ein akzeptabler Trainings- und Vali-

dierungsfehler vorliegt. Zwar wäre es durch weitere Lernzyklen möglich, den

Trainings- und Validierungsfehler weiter zu reduzieren, jedoch besteht dann die

Gefahr, dass das KNN auswendig lernt und somit bei neuen Daten schlechte

Klassifizierungsergebnisse liefert.

6.3.1.4 Ergebnisse

Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit des eingesetzten KNN wurden die Zell-

kerne von MC3T3-Zellen in zwei Bildern durch einen Experten ermittelt und der

automatischen Detektion der Kerne gegenübergestellt (Tabelle 23).

Kernbereich

Äußeres Endoplasma

Ektoplasma


Tabelle 23: Statistische Daten zur automatischen Kernzählung auf Basis eines KNN

Klassifizierung von L929 Zellen

Mittlere Abweichung

zur Referenz [%]



Mittlere Rechenzeit



14,1 4,40 0,44 418s

1,96 (95%) 0,89

2,576 (99%) 1,13

3,29 (99,9%) 1,45

3,87 (99,99%) 1,70


benausschnitten für die Linie L929 (Kap. 13.8) im Durchschnitt eine Abwei-

chung von 14,1% +/- 1,13% bei einem Konfidenzintervall von 99% zur Referenz

einstellt. Die Rechenzeit hängt von der Anzahl der im Bild vorhandenen Zellen

bzw. deren Zellfläche ab, beträgt hier im Durchschnitt für 273 Zellen 418 Se-

kunden.

6.3.2 Zellkerndetektion auf Basis des Histogram-Backprojection-Algorithmus

Die Zellkerne der Linien MC3T3 und L929 können farblich variieren, weisen

aber meistens einen schwachen Kontrast zu ihrer lokalen Umgebung auf (Abb.

41 und 42). Daher erscheint eine Detektion der Kerne mit Hilfe des HB-

Algorithmus für diese Aufgabe sinnvoll, da der Algorithmus zur Lokalisierung

von Objekten auf Basis ihrer Farbwerte dient.


Abbildung 41: MC3T3-Zellen auf dem Substrat Titan* bei 100-facher Vergrößerung mit vergrö-

ßerten Bildausschnitten verschiedenfarbiger Kernbereiche

Abbildung 42: L929-Zellen auf dem Substrat Stahl* bei 100-facher Vergrößerung mit vergrößer-

ten Bildausschnitten verschiedenfarbiger Kernbereiche

Die vergrößerten Ausschnitte in Abb. 41 und Abb. 42 zeigen die Farbvariation

für die Zellkernbereiche innerhalb eines Probenausschnittes. Damit eine Detek-

tion verschiedenfarbiger Kerne möglich ist, muss der HB-Algorithmus iterativ mit

verschiedenen im Vorfeld erstellten Farbtemplates ausgeführt werden. Für die

May-Grünwald angefärbten Zellen des Typs MC3T3 und L929 kommen zwei

erstellte Farbtemplates für die Detektion der Kernbereiche zum Einsatz, in Abb.

43 vergrößert dargestellt.

Abbildung 43: Vergrößerte Darstellung der erstellten Farbtemplates für die Detektion der Zell-

kernbereiche mittels HB-Algorithmus. Links: Template 1 zur Detektion dunkler Kernbereiche;

Rechts: Template 2 zur Detektion vergleichsweise heller Kernbereiche

Für jedes Template werden analog zur Zellsegmentierung, beschrieben in Kap.

5.2.4, templatespezifische Parameter eingestellt. Tabelle 24 zeigt die für diese

Anwendung optimalen Parameter für jedes Template.


Tabelle 24: Parametereinstellungen für die verwendeten Farbtemplates zur Zellkerndetektion

mittels HB-Algorithmus; ACMin: Minimal zulässige Kernfläche; c: Anzahl der verwendeten Farben

bei der Unterabtastung der verwendeten 24bit-RGB Bilder (2563 Farben) zur Reduktion der

Rechenzeit, vgl. (55)

Template L929 MC3T3

ACMin c ACMin c

1 150 7 150 6

2 250 8 250 8

Nach Ausführung des HB-Algorithmus resultieren entsprechend der Anzahl der

verwendeten Templates (Abb. 43) zwei Ergebnisbilder E1 und E2 (Abb. 44b,

Abb. 44c). Diese werden jeweils zur Erfassung der einzelnen Kernbereiche mit

weiteren Bildverarbeitungsverfahren bearbeitet. Die Bildverarbeitungsoperation

Closing (56) dient zum Schließen kleiner Segmentierungslücken und das an-

schließende Labeling zur individuellen Auswertung zusammenhängender Kern-

bereiche. Es resultieren für E1 x Kernbereiche C11, C12, …, C1x und für E2 y

Kernbereiche C21, C22, …, C2y, wobei ein Kernbereich als endliche Pixelmenge

und die Größe eines Kernbereiches, z.B. C11, als die Anzahl der enthaltenen

Pixel 11C aufgefasst wird.


Abbildung 44: a: Segmentierter Zellbereich (grüne Kontur); b: Ergebnisbild E1 des HB-

Algorithmus mit Template 1; c: Ergebnisbild E2 des HB-Algorithmus mit Template 2; d: Ergebnis

der Zellkerndetektion nach der Weiterverarbeitung von c. Bei den schwarz eingekreisten Kern-

bereichen handelt es sich jeweils um zwei Kerne, die jedoch nur als ein Kernbereich erkannt

wurden

Im Vergleich zur Zellsegmentierung mit Hilfe des HB-Algorithmus (Kap. 5.2.3)

folgen hier nun weitere Schritte. Zunächst wird geprüft, ob Schnittmengen der

Kernbereiche aus E1 und E2 nach folgender Vorschrift existieren:

1 1

1 2 0yx

i j

i j

C C . (Gl. 13)

Ist dies der Fall, wird nur der größere der beiden Kernbereiche, entweder C1i

oder C2j, nach der Vorschrift

max 1 , 2i jC C (Gl. 14)

übernommen.

a

b c

d


Die schwarzen Markierungen in Abb. 44d zeigen, dass teilweise zwei benach-

barte Kernbereiche als ein großer Kernbereich (gelbe Kontur) detektiert wurden,

da sie keine farbliche Unterscheidung aufweisen und zusammenhängend sind.

Oft ist jedoch die Kontur zwischen zwei Kernen durch eine Einschnürung ge-

kennzeichnet, ähnlich wie bei zwei aneinandergrenzenden Zellen, z.B. des

Typs L929. Daher ist eine Separation der detektierten Kernbereiche mit ausge-

prägten Einschnürungen hilfreich, um die Kerndetektion zu optimieren.

6.3.2.1 Separation der Zellkernbereiche zur Optimierung der Kerndetektion

Die Separation der Kernbereiche erfolgt in 2 Schritten. Zuerst werden Marker

der separierten Kernbereiche generiert. Dies erfolgt analog zur Klassifikation

der segmentierten Zellbereiche (Kap. 6.2) mit Hilfe einer iterativen Erosion. Der

Unterschied zum Verfahren in Kap. 6.2 liegt darin, dass die iterative Erosion

nicht beendet wird, sobald nach dem Labeling mindestens zwei neue Bereiche

entstanden sind, da weitere Separationen eines bereits getrennten Kernberei-

ches in kleinere Kernbereiche möglich sind.

Abbildung 45: Ergebnis der Markergenerierung für MC3T3-Kernbereiche, die Kontur der ur-

sprünglichen Kernbereiche ist gelb, die generierten Marker grün dargestellt

Abb. 45 verdeutlicht die Markergenerierung für MC3T3-Zellkernbereiche. Am

Beispiel des Kernbereiches CA9 (gelbe Kontur) wird der Separationsprozess

erläutert. Nachdem CA9 n-mal einer Erosion mit anschließendem Labeling un-

terzogen wurde, entstehen zwei separate Kernbereiche CA9,1 und CA9,2 (grüne

Konturen). Eine iterative Erosion der Kernbereiche CA9,1 und CA9,2 führt zu kei-

nen weiteren Separationen, so dass es sich hier um zwei Marker handelt, die im

CA1

CA2

CA3

CA6

CA5

CA4

CA7

CA8

CA9

CA10

CA11 CA12

CA16

CA15

CA13

CA14

CA9,1

CA9,2


weiteren Verlauf für die Rekonstruktion der Kernfläche dienen. Die Rekonstruk-

tion der Kernbereiche ist notwendig, da durch die Erosion ein Teil der Kernflä-

che eliminiert wurde, die im nächsten Schritt wieder hergestellt werden muss

(weiße Schraffur in Abb. 45). Für die Rekonstruktion der Kernbereiche kommt

die in Kap. 6.6 beschriebene Wachstumssimulation zum Einsatz. Der Unter-

schied zu Kap. 6.6 liegt darin, dass keine Zellbereiche aus dem Wachstums-

prozess resultieren sondern die optimierten Kernbereiche für den anschließen-

den Separationsvorgang innerhalb der Agglomerate. Der Algorithmus muss je-

doch nicht geändert werden, so dass hier für eine detaillierte Beschreibung des

Rekonstruktionsprozesses auf Kap. 6.6 verwiesen wird. Das beschriebene Ver-

fahren ist abschließend mit Hilfe eines Flussdiagramms schematisch darge-

stellt.

Abbildung 46: Flussdiagramm zum schematischen Ablauf der Kernbereichdetektion mit Hilfe

des HB Algorithmus


6.3.2.2 Ergebnisse

Zur Bewertung der Leistungsfähigkeit des hier vorgestellten Verfahrens wurden

in jeweils 100 Proben von L929- und MC3T3-Zellen die Kernbereiche durch

einen Experten ermittelt und der automatischen Kerndetektion gegenüberge-

stellt (Kap. 13.9). Tabelle 25 zeigt die statistische Auswertung für die Kernde-

tektion ohne anschließende Kernseparation an engen Stellen, Tabelle 26 hin-

gegen mit anschließender Kernseparation.

Tabelle 25: Statistische Daten zur automatischen Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus

L929-Kernzählung Mittlere Abweichung





3,09 2,19 0,22

1,96 (95%) 0,43

2,576 (99%) 0,56

3,29 (99,9%) 0,72

3,87 (99,99%) 0,85

MC3T3-Kernzählung






7,58 4,12 0,41

1,96 (95%) 0,81

2,576 (99%) 1,06

3,29 (99,9%) 1,35

3,87 (99,99%) 1,59

Tabelle 26: Statistische Daten zur automatischen Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus

mit anschließender Kernseparation

L929-Kernzählung Mittlere Abweichung





2,06 1,72 0,17

1,96 (95%) 0,34

2,576 (99%) 0,44

3,29 (99,9%) 0,56

3,87 (99,99%) 0,66

MC3T3-Kernzählung






3,52 2,36 0,24

1,96 (95%) 0,46

2,576 (99%) 0,61

3,29 (99,9%) 0,78

3,87 (99,99%) 0,92


benausschnitten für die Linie L929 ohne anschließende Kernseparation im

Durchschnitt eine Abweichung von 3,09% +/- 0,56% bei einem Konfidenzinter-

vall von 99% zur Referenz einstellt. Für Zellen des Typs MC3T3 ergibt sich oh-

ne anschließende Kernseparation unter Verwendung einer Stichprobe von 100


Probenausschnitten eine Abweichung von 7,58% +/- 1,06% bei einem Kon-

fidenzintervall von 99%.

Anhand Tabelle 26 ist zu erkennen, dass sich unter Verwendung einer Stich-

probe von 100 Probenausschnitten für die Linie L929 mit anschließender Kern-

separation im Durchschnitt eine Abweichung von 2,06% +/- 0,44% bei einem

Konfidenzintervall von 99% zur Referenz einstellt. Für Zellen des Typs MC3T3

ergibt sich mit anschließender Kernseparation unter Verwendung einer Stich-

probe von 100 Probenausschnitten eine Abweichung von 3,52% +/- 0,61% bei

einem Konfidenzintervall von 99%.

6.3.3 Diskussion der Ergebnisse

Die Detektion der Zellkerne vom Typ L929 mit Hilfe eines KNN (Kap. 6.3.1)

weist mit 14,1% eine hohe Abweichung zum Referenzwert auf. Zwar wurden die

meisten Kernbereiche vom KNN ermittelt, jedoch werden benachbarte Kerne oft

in Form eines zusammenhängenden Bereiches zurückgegeben und somit nicht

einzeln detektiert. Die benötigte Rechenzeit ist ebenfalls hoch. Abhängig von

der Anzahl der Zellen in einem Bild sind ca. vier bis acht Minuten für die Zell-

kerndetektion notwendig. Die sehr hohe Rechenzeit liegt darin begründet, dass

in einem Bild sehr viele Klassifikationen mit dem KNN durchgeführt werden. Ein

zu klassifizierender Bereich beträgt 20x20 Pixel, wobei ein Bild insgesamt 1376

x 1032 Pixel beträgt, so dass theoretisch bis zu 3550 Klassifizierungen pro Bild

durchgeführt werden (66).

Ein weiterer Nachteil ist der Umstand, dass das KNN mit den in Kap. 6.3.1 vor-

gestellten Inputinformationen auf die hier verwendete Zellfärbung trainiert wur-

de. Kommt nun eine andere Färbemethode zum Einsatz ist ein erneutes Trai-

ning des KNN sehr wahrscheinlich notwendig.

Der Vorteil bei Verwendung eines KNN liegt darin, dass neben der Klassifizie-

rung von Kernbereichen auch andere Zellbereiche, z.B. das Ektoplasma, bei

Bedarf detektiert werden können, sofern dem Netz Merkmale zur Differenzie-

rung der unterschiedlichen Zellbereiche vorliegen. Die Ausführungsgeschwin-

digkeit würde sich dadurch nicht signifikant ändern.

Die Detektion der Zellkerne auf Basis des Histogram-Backprojection-

Algorithmus, beschrieben in Kap. 6.3.2, liefert für die Linie MC3T3 eine Abwei-

chung von 3,52% und für die Linie L929 eine Abweichung von 2,06% zum Refe-

renzwert. Bei den MC3T3-Zellen entsteht eine höhere Abweichung im Vergleich

zum Typ L929, da die Kernbereiche in großen, kompakten MC3T3-Clustern

größer ausfallen und einer stärkeren farblichen Variation unterliegen.


Im Vergleich zum Einsatz eines KNN liefert das Kerndetektionsverfahren auf

Basis des Histogram-Backprojection-Algorithmus jedoch deutlich bessere Er-

gebnisse, und darüber hinaus beträgt die Rechenzeit für einen Probenauss-

schnitt im Durchschnitt mit 10,7s nur 2,6% der Rechenzeit bei Verwendung ei-

nes KNN.

Eine weitere geeignete Methode zur Separation von Zellkernen ist die Wasser-

scheidentransformation (67) basierend auf der inversen Distanztransformation

der segmentierten Zellbereiche (68).

Das Verfahren ist gut auf Kernbereiche, die durch eine runde Geometrie ge-

kennzeichnet sind, anwendbar. Für Kernbereiche des Typs MC3T3 hingegen

resultieren aufgrund der starken Variation der Morphologie schlechtere Ergeb-

nisse im Vergleich zum Verfahren, beschrieben in Kap. 6.3.2 (Abb. 47).


Abbildung 47: a: Zellcluster vom Typ MC3T3; b: Kerndetektion mit Hilfe des Histogram Backpro-

jection Algorithmus und anschließendem Closing. Nicht korrekt detektierte Kernbereiche sind

durch rote Pfeile gekennzeichnet; c: Inverse Distanztransformation von b; d: Wasserscheiden-

transformation angewendet auf c (Schwellwert: 10). Übersegmentierte Bereiche sind durch

Pfeile gekennzeichnet; e: Inverse Distanztransformation von b; d: Wasserscheidentransformati-

on angewendet auf c (Schwellwert: 15). Nicht alle Kernbereiche wurden korrekt separiert, ge-

kennzeichnet durch die Pfeile; f: Segmentierte Kernbereiche mit der Methode beschrieben in

Kap. 6.3.2

Abb. 47a zeigt ein Cluster vom Typ MC3T3. Die Anwendung des Histogram

Backprojection Algorithmus gefolgt von der Closing-Methode führt zum Ergeb-

nis in Abb. 47b. Allerdings werden nicht alle Kerne korrekt detektiert, gekenn-

zeichnet durch die roten Pfeile. Das Ergebnis der Wasserscheidentransformati-

on (Abb. 47d) auf Basis der inversen Distanztransformation (Abb. 47c) zeigt

eine Übersegmentierung, ebenfalls durch rote Pfeile gekennzeichnet. Eine An-

passung des Wasserscheiden-Schwellwertes reduziert zwar die Übersegmen-

a b c

d e f


tierung, allerdings werden dann nicht mehr alle Kernbereiche voneinander ge-

trennt segmentiert (Abb. 47e, rote Pfeile).

Im Vergleich führt die Kerndetektion mit Hilfe des in Kap. 6.3.2 vorgestellten

Verfahrens zu keinen ungewollten Kernseparationen.

Aufgrund der Farbvariation und des geringen Kontrastes der Zellkerne zu um-

gebenden Zellbereichen sind Bildverarbeitungsverfahren wie z.B. Schwellwert-

verfahren, Kantenfilter und modellbasierte Verfahren für diese Aufgabenstellung

ungeeignet, da sie aufgrund ihrer Funktionsweise einen guten Kontrast des zu

detektierenden Objektes zur Umgebung voraussetzen. Im Gegensatz dazu ist

eine sichere Kerndetektion trotz variierender Farbgebung mit dem Histogram-

Backprojection-Algorithmus möglich, wenn mehrere Farbtemplates erstellt wur-

den, die die Farbvariation der Kerne abdecken.

6.4 Zellseparation in Clustern mit Verengungen an Zellkontaktstellen

Nach der Klassifikation der Zellbereiche in Einzelzellen sowie Cluster (Kap. 6.2)

und der Detektion der Kernbereiche, wird nun ein Verfahren vorgestellt, dass

mit Hilfe der ermittelten Kernbereiche die in den Clustern enthaltenen Zellen

separiert (69; 70). Voraussetzung für die erfolgreiche Separierung der zusam-

mengewachsenen Zellen ist, dass die zu untersuchende Zelllinie meistens Ver-

engungen an den Zellkontaktstellen bildet. Diese Bedingung ist z.B. von Zellen

der Linie L929 erfüllt, hingegen weisen die Agglomerate der Linie MC3T3 oft

keine Verengungen an den Zellkontaktstellen auf, so dass für diese ein anderes

Separationsverfahren erforderlich ist (Kap. 6.5).

6.4.1 Lokalisierung der Verengungen an den Zellkontaktstellen

Die Lokalisierung der Verengungen an den Zellkontaktstellen innerhalb der

Cluster geschieht über die Berechnung der so genannten dominanten Kontur-

punkte. Das in (44) beschriebene Verfahren wurde jedoch erweitert. Der erste

Schritt besteht in der Berechnung des Abstandes für jeden Konturpunkt eines

Clusters in eine vorgegebene Richtung zum umschließenden Rechteck. Des

Weiteren wird von jedem Konturpunkt der nächste Konturpixel daraufhin ge-

prüft, ob dieser in Richtung zur aktuell betrachteten Seite des umschließenden

Rechtecks Teil der Zelle ist. Ist dies der Fall, liefert die Prüffunktion den Wert

true, andernfalls false zurück. Somit werden nur die Punkte als dominante Kon-

turpunkte (DCP) definiert, die einerseits ein lokales Minimum der Abstandsfunk-

tion widerspiegeln und andererseits den Wert true von der Prüffunktion erhal-


ten. Die geschilderte Vorgehensweise wird für die übrigen drei Richtungen

(oben, unten, links) wiederholt.

Abbildung 48: Links: Segmentierter L929-Cluster (blaue Kontur); Rechts: Ermittelte DCPs

(blaue Kreisstrukturen) für den im Bild segmentierten Cluster (orange Kontur). Der rote Pfeil

kennzeichnet einen für die Separation ungeeigneten DCP

In Abb. 48 (Rechts) sind in der Farbe blau für alle vier Richtungen die ermittel-

ten DCPs eingezeichnet. Die Bestimmung der Maxima erfolgt hier im Vergleich

zu (44) jedoch anders. Es wird nur der Konturpixel als lokales Maximum defi-

niert, bei dem sich der Abstand von n vorherigen Konturpixeln zu einer Seite

des umschließenden Rechtecks monoton vergrößert und für die nachfolgenden

n Konturpunkte monoton verringert hat (Abb. 49).

Abbildung 49: Definition eines Konturpixels als lokaler maximaler Abstand zum Rand. Zunächst

liegen n Konturpunkte vor dem Maximum, deren Abstände sich zur linken Seite des umschlie-

ßenden Rechtecks vergrößern. Nach dem Maximum folgen n Konturpunkte, deren Abstände

sich zur linken Rechteckseite verkleinern

Die Vorgehensweise liegt darin begründet, dass die Clusterkontur aufgrund der

Segmentierung oft stufig aufgebaut ist und so eine Bestimmung der lokalen

Maxima durch digitale Ableitung unmöglich macht. Die Anzahl n der notwendi-

gen Stufen, bei denen sich monoton der Abstand zum umschließenden Recht-

eck vergrößern muss, ist parametrisiert und abhängig vom Zelltyp. Für den hier

vorliegenden Zelltyp L929 ist n=3 eine gute Wahl. So kann die Sensibilität des

Maximum

Abstand verkleinert sich n-mal

Abstand vergrößert sich n-mal

Ungeeigneter

DCP


Algorithmus festgelegt und je nach Bedarf mehr oder weniger DCPs erzeugt

werden. Wie in Abb. 48 zu sehen ist, kann der Fall eintreten, dass DCPs an

ungeeigneten Konturabschnitten erzeugt werden. Demnach wird eine Methode

zur Verbindung der korrekten DCPs benötigt.

6.4.2. Berechnung der kürzesten Pfade zwischen benachbarten

Zellkernbereichen

Die Herausforderung liegt nun darin, die DCPs an den aus biologischer Sicht

optimalen Stellen miteinander zu verbinden, so dass eine sinnvolle Zelltrennung

entsteht. Dazu werden zunächst von den gefundenen Zellkernen im Cluster die

Schwerpunkte berechnet. Ausgehend von dem links liegenden Schwerpunkt

wird der kürzeste Weg innerhalb des Zellbereiches zum nächstgelegenen Zell-

kernschwerpunkt bestimmt und so fortfahrend. Dazu dient der A*-Algorithmus

(71; 72), der häufig auch in der Spielebranche Anwendung findet (Abb. 50).

Abbildung 50: Mit dem A*-Algorithmus berechneter Pfad (weiß gefärbt) durch die Zellkern-

schwerpunkte (schwarze Kreuze) im Cluster

Dabei müssen mögliche Hindernisse wie z.B. innenliegende Löcher in der Zelle

berücksichtigt werden, denn der kürzeste Pfad soll Hindernisse nicht durch-

kreuzen. Der Algorithmus stellt ausgehend vom Startpunkt für alle Nachbarpixel

eine Kostenfunktion auf:

( , ) ( , ) ( , ) ( . 15)F x y G x y H x y Gl

G(x,y) beschreibt die Kosten, vom Startpunkt ausgehend zum aktuellen Punkt,

und H(x,y) die geschätzten Kosten vom aktuellen Punkt zum Zielpunkt. Abb. 51

und Abb. 52 zeigen anhand eines Beispiels die Vorgehensweise bei der Be-

rechnung des kürzesten Pfades zwischen zwei Punkten unter Berücksichtigung

von Hindernissen.


Abbildung 51: Ausgangssituation für die Berechnung des kürzesten Pfades von der Startpositi-

on (grünes Quadrat) zur Zielposition (rotes Quadrat) unter Berücksichtigung von nicht passier-

baren Hindernissen (blaue Quadrate). Für jedes Nachbarfeld werden die Kosten F, G und H

angegeben.

Abb. 51 zeigt anhand des Nachbarfeldes rechts vom Startpunkt die Zuordnung

der nummerischen Werte zu den Kosten F, G und H. Das Nachbarfeld erhält für

G den Wert 10, da es sich unmittelbar neben dem Startpunkt befindet. Diagonal

angrenzende Nachbarfelder erhalten hingegen den Wert G=14. H erhält den

Wert 30, da die geschätzte Distanz zum Zielpunkt 3 Felder beträgt. Die Kosten

für H(x,y) werden in diesem Fall über den Manhatten-Block Abstand berechnet,

da die Rechenzeit erheblich kürzer ist als im Vergleich zum euklidischen Ab-

stand. Somit ergeben sich für das Nachbarfeld rechts vom Startpunkt Gesamt-

kosten von F = 10 + 30 = 40. Nach Berechnung der Kosten für jeden Nachbar-

punkt wird der Nachbar mit den geringsten Gesamtkosten ausgewählt und die

Prozedur wiederholt. Ein wichtiger Aspekt ist, dass jeder untersuchte Punkt ei-

nen Zeiger auf seinen Vorgängerpunkt erhält. So kann der Weg vom Zielpunkt

zum Startpunkt zurückverfolgt werden. Der ermittelte Pfad vom Start- zum Ziel-

punkt ist in Abb. 52 durch die roten Kreise in den Feldern dargestellt.


Abbildung 52: Berechneter Pfad vom Ausgangspunkt (grünes Quadrat) zum Zielpunkt (rotes

Quadrat) unter Berücksichtigung nicht passierbarer Hindernisse (blaue Quadrate). Die zu dem

kürzesten Pfad gehörenden Felder sind durch einen roten Kreis gekennzeichnet.

Ist der kürzeste Pfad zwischen zwei Zellkernen berechnet, werden von den

Pfadpunkten nur die übernommen, die sich außerhalb der Zellkernbereiche be-

finden, da eine Zelltrennung durch einen vorhandenen Zellkern keinen Sinn

macht.

6.4.3 Generierung der Zellseparationslinien innerhalb der Cluster

Zuerst werden für die Pfadpunkte zwischen zwei Zellkernen die Abstände zu

allen DCPs des aktuellen Clusters berechnet und der erste DCP übernommen,

der den kürzesten Abstand zu einem Pfadpunkt außerhalb der Kernregion auf-

weist (Abb. 53, DCP 1). Der Pfadpunkt P und der Konturpunkt DCP1 bilden den

Anfangs- und Endpunkt des ersten Abschnittes der Trennlinie.

Abbildung 53: Separation zweier zusammengewachsener Zellen. Zeichenerklärung siehe Text

DCP1

Kern-Schwerpunkt 1

Erster Abschnitt der Trennlinie

Zweiter Abschnitt der Trennlinie

DCP2

Kern-Schwerpunkt 2 Pfadpunkt mit kleinstem

Abstand zu DCP 1

P


Der erste Abschnitt der Trennlinie muss allerdings die Bedingung erfüllen, kei-

nen Zellkernbereich zu schneiden. Schneidet der erste Linienabschnitt den

Kernbereich wird er wieder verworfen und das nächste Punktepaar (DCP und

Pfadpunkt) mit dem niedrigsten Abstand gesucht. Dieser Vorgang wiederholt

sich, bis ein gültiger erster Trennlinienabschnitt erzeugt wurde.

Nach Erzeugen des ersten Trennlinienabschnittes muss der zweite Trennlinien-

abschnitt, bestehend aus dem nächstgelegenen DCP auf der anderen Seite des

Pfades, gefunden werden, der mit demselben Pfadpunkt verbunden wird und

die Zelltrennung vervollständigt. Um zu prüfen, ob ein DCP auf der anderen

Seite des Pfades liegt, wird das Skalarprodukt der beiden potentiellen Tren-

nungsvektoren gebildet, mit der Bedingung, dass das Ergebnis < 0 sein muss.

Nicht in jedem Fall muss es einen passenden zweiten DCP geben. Es kann der

Fall eintreten, dass alle Trennlinien durch einen Zellkern führen und somit nicht

verwendet werden können. Alternativ wird dann der Pfadpunkt auf der Hälfte

des Weges zwischen den beiden Kernen selektiert und von dort aus der nächst

liegende Konturpunkt auf der einen Seite des Pfades sowie derjenige auf der

anderen Seite des Pfades bestimmt. Wenn die beiden Abschnitte der Trennlinie

keinen Zellkernbereich schneiden, handelt es sich um den neuen Grenzbereich

der Zellen, ansonsten werden die Trennlinienabschnitte zum nächstgelegenen

Konturpunkt geprüft, solange, bis eine gültige Trennlinie erzeugt wurde.

Für eine schematische Übersicht der beschriebenen Methode dient folgendes

Flussdiagramm.


Abbildung 54: Flussdiagramm zum schematischen Ablauf der Zellseparation mit der in Kap. 6.4

beschriebenen Methode

6.4.4 Ergebnisse

Zur Beurteilung der Genauigkeit bezüglich der generierten Einzelzellflächen

innerhalb von Agglomeraten des in Kap. 6.4 vorgestellten Separationsverfah-

rens ist eine Referenzsegmentierung notwendig. Dazu sind durch einen Exper-

ten aus 10 verschiedenen Proben 100 in verschiedene Cluster verbundene

L929 Zellen manuell segmentiert worden. Mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten

kann nun eine Aussage über die durchschnittliche Abweichung der automatisch

generierten Zellflächen zu den Referenzzellflächen erfolgen. Der Durch-

schnittswert des Jaccard-Koeffizienten auf Basis von 100 aus Clustern separier-

ten L929 Zellen für den Auflicht-Hellfeld Mikroskopkontrast beträgt 0,8. Vor der

Zellseparation in den Clustern müssen alle Zellbereiche zuvor mit einem der in

Kap. 5 vorgestellten Methoden segmentiert werden. Dazu kommt hier das

schwellwertbasierte Verfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1, zum Einsatz.

Zur Bewertung der Genauigkeit bezüglich der Zellzählung des vorgestellten Se-

parationsverfahrens wurden 100 verschiedene Probenausschnitte der Linie

L929 aufgenommen und die automatische Zellzählung der Referenzzählung


durch eine Laborfachkraft gegenübergestellt (Kap. 13.7). Die statistische Aus-

wertung ist in Tabelle 27 hinterlegt.

Tabelle 27: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung unter Verwendung des in Kap.

6.4 beschriebenen Verfahrens

L929-Zellzählung Mittlere Abweichung





2,41 1,90 0,19

1,96 (95%) 0,37

2,576 (99%) 0,49

3,29 (99,9%) 0,63

3,87 (99,99%) 0,74

Aus Tabelle 27 geht hervor, dass sich unter Verwendung einer Stichprobe von

100 Probenausschnitten für die Linie L929 im Durchschnitt eine Abweichung

von 2,41% +/- 0,49% zur Referenz bei einem Konfidenzintervall von 99% ein-

stellt. Die hier vorgestellte Separationsmethode weist Probleme beim Trennen

von Zellen auf, die sich gerade im Teilungsprozess befinden (Abb. 55, gelb um-

randete Zellen).

Abbildung 55: L929 Zellen auf dem Material Stahl*. Bei den gelb markierten Bereichen handelt

es sich um Zellen, die sich gerade in einem Teilungsprozess befinden

Diese Zellen weisen keinen oder einen sehr schwachen farblichen Kontrast des

Kernbereiches zu den umgebenen Zellarealen auf. Da die hier beschriebene

Methode für eine korrekte Separation der Cluster u.a. auf die darin vorhande-

nen Kernbereiche zugreifen muss, ist ein erkennbarer farblicher Kontrast der

Kernbereiche jedoch Voraussetzung für eine korrekte Separation. In Kombina-

tion mit der CBS-Methode (Kap. 6.1) können somit die sich im Teilungsprozess

befindlichen Zellen ebenso separiert werden, so dass dadurch eine Reduktion

der Abweichung zur Referenzzählung von 2,41% auf 1,27% erfolgt (Tabelle 28).



6.4 beschriebenen Verfahrens mit vorgeschalteter CBS






1,27 0,87 0,09

1,96 (95%) 0,17

2,576 (99%) 0,22

3,29 (99,9%) 0,29

3,87 (99,99%) 0,34


benausschnitten für die Linie L929 mit vorgeschalteter CBS im Durchschnitt

eine Abweichung von 1,27% +/- 0,22% zur Referenz bei einem Konfidenzinter-

vall von 99% einstellt.

6.5 Zellseparation in Clustern ohne Verengungen an

Zellkontaktstellen

6.5.1 Wachstumssimulation

Befinden sich mehrere Objekte mit einem visuell erfassbaren Merkmal in einem

Objektcluster und sind die einzelnen Objektkonturen von Interesse kann die hier

beschriebene Wachstumssimulation auf Basis der Objektmerkmale zum Einsatz

kommen.

Die Simulation des Zellwachstums erfolgt nacheinander für alle n im Bild klassi-

fizierten Objektcluster A1, A2, …, An, wobei jeder Cluster Ai als endliche Pixel-

menge aufgefasst wird. Die Klassifikation eines Objektbereiches als Cluster

erfolgt, wenn in diesem mehr als ein Objektmerkmal, z.B. Kerne, enthalten sind.

Für jedes Cluster wird ein Zielbild Ti zur Dokumentation des Wachstumsprozes-

ses erzeugt. Die Größe von Ti entspricht der Größe des kleinsten umschließen-

den Rechtecks von Ai. Allen Pixeln in Ti wird zu Beginn der Farbwert (R, G, B) =

(255, 255, 255) zugeordnet. Die Pixelmenge i i iS T A erhält den Farbwert (0,

0, 0). Innerhalb von Ai befinden sich mi nicht zusammenhängende Objektmerk-

malsbereiche ,1 ,2 ,, ,...,ii i i mK K K . Alle Mengen , ,i j i i jC T K mit j = 1, 2, …, mi sollen

Elemente von Li sein (Abb. 56).


Abbildung 56: Zwei Objektcluster mit jeweils unterschiedlicher Anzahl an Objektmerkmalen im

Bild

Allen Elementen in Li wird jeweils eine Marke zugeordnet, die aus dem Index j

wie folgt resultiert:

2( . 17)

256j

jR Gl

2mod 256( .18)

256j

jG Gl

2mod 256 mod 256 ( .19)jB j Gl

So ist eine Unterscheidung von maximal 3256 2 (16.777.214) Objekten in ei-

nem Cluster möglich.

Unter der Größe eines Objektmerkmalbereiches ,i jC ist die Anzahl der Bildpunk-

te ,i jC zu verstehen. Die in Li enthaltenen Elemente werden ihrer Größe nach

absteigend sortiert, so dass der Wachstumsprozess mit dem größten Objekt-

merkmal startet. Mit Hilfe eines Parameters p {1, 2, …, 10} lässt sich die

Wachstumsgeschwindigkeit pi,j für jedes Objektmerkmal abhängig von seiner

Größe mit

pi,j = , , , ,min max

, ,max min

i j i j i j i j

i j i j

p C C C C

C C

berechnen. (Gl. 20)

pi,j kann folgende Werte annehmen:

S1

S2 T1 T2

C1,1

C1,2

C1,3

C2,1

C2,2

C2,3

C2,4

C2,5

A1

A1


(Gl. 21)

Für den unwahrscheinlichen Fall, dass alle in einem Cluster enthaltenen Ob-

jektmerkmale die gleiche Größe aufweisen, wird die Wachstumsgeschwindig-

keit auf pi,j = 1 gesetzt.

Das Verfahren arbeitet iterativ und beginnt die Wachstumssimulation im Cluster

Ai mit dem größten Element ,1iC aus Li. Dazu werden in Ti die Nachbarpixel

aller Elemente von ,1iC in Form einer 4er-Nachbarschaftsbeziehung daraufhin

geprüft, ob sie innerhalb des Clusters Ai liegen und keinem Objektmerkmal zu-

geordnet sind. Erfüllen alle Nachbarpixel die Bedingungen bilden sie die

Punktmenge Ni,1,k mit k = 1, 2, …, pi,1. Die Bedeutung der Indizes von Ni,j,k ist

wie folgt:

i: Index des ausgewählten Objektclusters

j: Index des ausgewählten Objektmerkmals aus dem i.ten Cluster

k: Aktuelle Wachstumsiteration mit k = 1, 2, …, pi,j

Im Allgemeinen kann Ni,j,k als Flächenzuwachs von Ci,j gesehen werden, sche-

matisch in Abb. 57 dargestellt.

Abbildung 57: Links: Die Objektmerkmale C1,1 und C1,2 befinden sich im Wachstumsprozess.

Der Parameter p ist auf p = 2 gesetzt. Bei Verwendung von Gl. 21 resultiert p1,1 = 2 und p1,2 = 1.

Rechts: Zweite Iteration des Wachstums. Die weiße Linie repräsentiert die Grenze der beiden

Objekte, nachdem kein Wachstum mehr möglich ist.

Abb. 57 zeigt, dass die Nachbarpixel N1,1,1 des Objektmerkmals C1,1 die ge-

nannten Bedingungen erfüllen und Teil des neuen Objektmerkmals

C1,1 (4 pixel)

Agglomerat A1

N1,1,1

N1,1,2

C1,2 (2 pixel)

N1,2,1

C1,3 (25 pixel)

N1,3,1

N1,3,2

C1,4 (12 pixel)

N1,4,1

, , max

1, , , , ,min max

1 , , min

p für c ci j i j

p p p für C C Ci j i j i j i j i j

für C Ci j i j


1,3 1,1,1 1,1C N C werden. Das neue Objektmerkmal wächst ein weiteres Mal (p1,1

= 2), wobei das Ergebnis in C1,3 überschrieben wird.

1,3 1,1,2 1,3:C N C

Ist das Wachstum von 1,1C beendet, wird C1,3 als Element in Li hinzugefügt.

Danach beginnt das Wachstum von C1,2. Die Nachbarpixel N1,2,1 von C1,2 erfül-

len die genannten Bedingungen und werden Teil des neuen Objektmerkmals

1,4 1,2,1 1,2C N C . Die Wachstumsprozedur wird in diesem Fall nicht wiederholt

da p1,2 auf 1 gesetzt ist. Das Ergebnis C1,4 kommt als Element in Li hinzu. Li

beinhaltet nun 4 Elemente C1,2, C1,2, C1,3 und C1,4. Abb. 57 (Rechts) zeigt das

Wachstum von C1,3 und C1,4. Zunächst wächst C1,3 wieder in zwei Iterations-

schritten:

1,5 1,3,1 1,3C N C

1,5 1,3,2 1,5:C N C

wobei das Ergebnis C1,5 als Element in Li hinzugefügt wird. Daraufhin erfolgt

das Wachstum von C1,4. Das Ergebnis 1,6 1,4,1 1,4C N C wird ebenso als Ele-

ment in Li hinzugefügt. Nun ist kein weiteres Wachstum der beiden ursprüngli-

chen Objektmerkmale möglich, die weiße Linie in Abb. 57 repräsentiert die

Grenze der beiden gewachsenen Objekte.

Im Allgemeinen erfolgt die Wachstumssimulation nacheinander für die nächsten

Elemente aus Li, bis eine näher beschriebene Abbruchbedingung des Algorith-

mus erfüllt ist. Für den Abbruch des Verfahrens stehen zwei Variablen u und v

bereit. u wird mit mi (Anzahl nicht zusammenhängender Objektmerkmale von Ai)

und v mit 0 initialisiert. Erhält Li nach Prüfung aller Nachbarpixel ein neues Ele-

ment , 1ii mC , wird die Variable u um eins inkrementiert. Die Variable v erhöht

sich nach der Nachbarschaftsprüfung, unabhängig davon, ob Ci,j gewachsen ist,

immer um eins. Der Algorithmus bricht ab, wenn v den Wert von u angenom-

men hat. Abb. 58 zeigt schematisch den Ablauf des Wachstumsprozesses.


Abbildung 58: Schematischer Ablauf des Wachstumsprozesses. Die in Li enthaltenen

Objektmerkmale werden durch numerische Werte für jeden Iterationsschritt repräsentiert. Die

Pfeile zeigen auf das nach dem Wachstumsprozess neu entstandene Objektmerkmal.

Weiterführende Erklärungen sind im nachfolgenden Text enthalten

Abb. 58 verdeutlicht schematisch den Ablauf des Wachstumsprozesses. Zu

Beginn liegen beispielsweise zwei Elemente Ci,1 und Ci,2 in Li vor (Iterations-

schritt v=0). Bei jedem weiteren Iterationsschritt (v = 1, 2, …, x) entsteht ein

neues Objektmerkmal Ci,u+1, das in Li hinzugefügt wird. Bei v = x handelt es sich

um den letzten Iterationsschritt, bei dem beide Objektmerkmale wachsen. Li

enthält u = x + 2 Elemente und v = x. Vom Iterationsschritt v = x zum Schritt v =

x + 1 findet kein Wachstum statt, Li behält u = x + 2 Elemente und v erhält den

Wert v = x + 1. Ab dem Iterationsschritt v = x + 2 wächst das übrige wachstums-

fähige Objektmerkmal weiter an, bis nach v = y Iterationen kein Wachstum mehr

möglich ist. Li enthält nun u = y + 1 Elemente und v = y. Im Iterationsschritt v = y

+ 1 findet kein weiteres Wachstum mehr statt, Li erhält somit kein neues Ele-

ment und u behält seinen aktuellen Wert. Die Variable v wird jedoch bei jedem

Iterationsschritt um eins inkrementiert, so dass v letztlich den Wert von u an-

nimmt und die Abbruchbedingung des Algorithmus erfüllt ist.

Anwendung der beschriebenen Methode für die Wachstumssimulation von

MC3T3-Zellen:

Zellen der Linie MC3T3 bilden oft große kompakte Agglomerate, die an den

Zellkontaktstellen meist keine Verengungen aufweisen. Deshalb ist eine Zellse-

paration in Agglomeraten auf Basis geometrischer Überlegungen nicht zweck-


mäßig. Betrachtet man den Zellverbund in Abb. 59a, scheint die Fläche des

Kernbereiches mit der Fläche der Zelle in Zusammenhang zu stehen.

Abbildung 59: a: Zusammengewachsene MC3T3-Zellen auf dem Material Titan; b: Ergebnis des

HB-Algorithmus zur Kerndetektion; c: Der segmentierte Zellbereich ist grün umrandet, die de-

tektierten Kernbereiche schwarz umrandet. Teilweise wurden zwei Kerne als ein Bereich seg-

mentiert; d: Detektierte Kernbereiche mit starken Verengungen wurden aufgetrennt, da es sich

wahrscheinlich um zwei unterschiedliche Kernbereiche handelt.

Daraus leitet sich die Idee ab, die in den Agglomeraten enthaltenen individuel-

len Zellflächen auf Basis der detektierten Kernbereiche (Abb. 59d) durch eine

Wachstumssimulation zu approximieren (74). Betrachtet man die Gesamtfläche

einer Zelle als Merkmal U und die Fläche eines Kernbereiches als Merkmal V

mit jeweils q Merkmalswerten iu sowie iv mit i = 1, 2, …, q, gibt der Korrelati-

onskoeffizient (75)

1 2

2 21,

1 1

1

1 1; ; ( .16)

1 1

q

i i q qi

m m u i v i

i iu v

u u v vq

r s u u s v v Gls s q q

aufschluss über den linearen Zusammenhang zwischen der Zellfläche und der

Zellkernfläche.

2 Kernbereiche als eine große Region erfasst

Separierte Zellkernbereiche


Abbildung 60: Die Kernbereichflächen (V), aufgetragen über die Gesamtzellflächen (U)

Abb. 60 zeigt die Zellkernfläche, aufgetragen über die gesamte Zellfläche. Für

eine Stichprobe von 100 Zellen des Typs MC3T3 ergibt sich ein Korrelations-

wert , 0,86u vr . Für die Zelltypen L929 und L132 wurde ebenfalls der Korrelati-

onswert für eine Stichprobe von jeweils 100 Zellen berechnet. Es resultiert für

die Linie L929 ein Korrelationswert von 0,92 und für die Linie L132 ein Korrela-

tionswert von 0,95. Da die drei Zelltypen deutliche Unterschiede in ihrer Mor-

phologie aufweisen kann für weitere Zelltypen eine ähnliche Korrelation zwi-

schen Kernbereich und Zellfläche angenommen werden. Ein Test mit einem

weiteren Zelltyp bestätigt dies. Für Zellen des Typs BHK-21 resultiert ein Korre-

lationswert von 0,89. Auf Basis dieser Erkenntnisse erscheint eine Zellflächen-

approximation durch eine Wachstumssimulation, ausgehend von den Kernbe-

reichen, sinnvoll.

Das beschriebene Verfahren benötigt die Festlegung des Parameters p für die

maximale Wachstumsgeschwindigkeit der Objektmerkmale, in diesem Fall der

Zellkernbereiche. Tabelle 29 zeigt, dass für die Flächenapproximation von 100

in verschiedenen Clustern enthaltenen MC3T3 Zellen p = 5 eine gute Wahl ist.

Tabelle 29: Vergleich der Flächenapproximation von 100 MC3T3 Zellen innerhalb verschiedener Cluster

bei unterschiedlichen maximalen Wachstumsgeschwindigkeiten p

p=1 p=5 p=10

Durchschnittlicher Jaccard-Koeffizient

0,67 0,79 0,69

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

10000

0 10000 20000 30000 40000

Zell

kern

flä

ch

e (

Pix

el)

Gesamtzellfläche (Pixel)

Kernbereichflächen aufgetragen über die Gesamtzellflächen


6.5.2 Ergebnisse

Das Ergebnis der Zellseparation mit Hilfe der Wachstumssimulation ist in Abb.

61 zu sehen.

Abbildung 61: Ergebnis der Wachstumssimulation. Die Zellgrenzen sind grün und die Kernbe-

reiche schwarz dargestellt.

Um die Genauigkeit der hier angewendeten Zellflächenrekonstruktion innerhalb

von Clustern zu beurteilen, wurden 200 von einem Experten manuell festgeleg-

te Zellbereiche (100 L929- und 100 MC3T3 Zellen) mit den automatisch seg-

mentierten Zellbereichen verglichen (Kap. 13.12, Tabelle 70 und Tabelle 71).

Mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten kann eine Aussage über die durchschnittli-

che Abweichung der automatisch generierten Zellkonturen zu den Referenzkon-

turen erfolgen (Tabelle 30).

Tabelle 30: Durchschnittlicher Jaccard-Koeffizient für die Separation von 100 L929- und 100

MC3T3 Zellen mit Hilfe des in Kap. 6.5 vorgestellten Separationsverfahrens

Separation von L929 Cluster

Separation von MC3T3 Cluster

Jaccard-Koeffizient

0,79 0,79


Im Durchschnitt besitzen die untersuchten Zellen vom Typ L929 sowie vom Typ

MC3T3 einen Jaccard-Koeffizienten von 0,79.

Die Zellzahlbestimmung basiert hier auf der Anzahl der detektierten Kerne nach

der Methode, beschrieben in Kap. 6.3.2. Dazu wurden aus jeweils 100 Proben

der Linien L929 und MC3T3 auf den Substraten Stahl* sowie Titan* die automa-

tisch bestimmte Anzahl der Zellen mit der von einem Experten ermittelten kor-

rekten Zellanzahl verglichen (Kap. 13.10).

Tabelle 31: Statistische Daten zur automatischen Zellzählung mit der Wachstumssimulation






1,31 0,96 0,10

1,96 (95%) 0,19

2,576 (99%) 0,25

3,29 (99,9%) 0,31

3,87 (99,99%) 0,37

MC3T3-Zellzählung






3,50 2,36 0,24

1,96 (95%) 0,46

2,576 (99%) 0,61

3,29 (99,9%) 0,78

3,87 (99,99%) 0,92


benausschnitten für die Linie L929 im Durchschnitt eine Abweichung von 1,31%

+/- 0,25% bei einem Konfidenzintervall von 99% zur Referenz einstellt. Für Zel-

len des Typs MC3T3 ergibt sich unter Verwendung einer Stichprobe von 100

Probenausschnitten hingegen eine Abweichung von 3,50% +/- 0,61% bei einem

Konfidenzintervall von 99%. Der Grund für die höhere Abweichung bei dem

Zelltyp MC3T3 liegt in der stärkeren Ausbildung von Agglomeraten im Vergleich

zum Typ L929 und einer stärkeren Variation der Zellmorphologie, die den Pro-

zess der Separation erschweren.

6.6 Zellseparation in Clustern mit Verengungen an Zellkontaktstellen

ohne Berücksichtigung der Zellkerne

Im Rahmen dieses Projektes wird nach der Zellkultivierung eine zytochemische

Färbung zur farblichen Unterscheidung zwischen Zellkernbereich und dem üb-

rigen Zellarealen durchgeführt. Bei diesen Bedingungen sind die in Kap. 6.4

und Kap. 6.5 vorgestellten Separationsmethoden für eine Trennung agglome-


rierter Zellen mit und ohne Verengungen an den Zellkontaktstellen geeignet. Es

finden sich auch andere Anwendungen, bei denen ungefärbte Zellen detektiert

werden sollen, z.B. bei der Verfolgung von sich bewegenden Zellen (76; 77).

Für die Separation ungefärbter Zellagglomerate sind die in Kap. 6.4 und Kap.

6.5 vorgestellten Verfahren nicht geeignet.

Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung eines computergestützten Auswer-

teprogrammes, das für unterschiedliche Aufgaben eingesetzt werden kann. Da-

her wird eine weitere Zell-Separationsmethode vorgestellt, mit der, im Unter-

schied zu den zuvor genannten, ohne Berücksichtigung der Kernbereiche eine

Zelltrennung in Clustern erfolgt. (38) stellt ein dafür geeignetes Separationsver-

fahren vor, das auf Basis einer iterativen Erosion in Kombination mit einer Ope-

ning-Methode (78) zunächst Marker für die anschließende Rekonstruktion der

Zellbereiche generiert. Diese Marker werden anschließend mit Hilfe einer erwei-

terten Dilatationsmethode zu Zellbereichen rekonstruiert. Dieses Verfahren ist

für die Trennung zusammengewachsener Zellen nicht auf die Detektion der in

den Clustern enthaltenen Kernbereiche angewiesen. Das in (38) beschriebene

Verfahren wird als alternative Separationsmethode in dieser Arbeit übernom-

men. Da aus (38) keine Informationen zur Genauigkeit der Zellflächenrekon-

struktion sowie zur Genauigkeit bei der automatischen Zellzahlbestimmung her-

vorgehen, liefert Kap. 6.6.1 die fehlenden Untersuchungsergebnisse. Mit Hilfe

der Daten ist es anschließend möglich die in (38) beschriebenen Methode mit

den in Kap. 6.4 und 6.5 beschriebenen Separationsverfahren objektiv zu ver-

gleichen.

6.6.1 Ergebnisse

Zur Beurteilung der Genauigkeit bezüglich der generierten Einzelzellflächen

innerhalb von Agglomeraten des in Kap. 6.6 vorgestellten Separationsverfah-

rens ist eine Referenzsegmentierung notwendig. Dazu sind durch einen Exper-

ten aus 5 verschiedenen Proben 100 in verschiedene Cluster verbundene L929

Zellen manuell segmentiert worden. Mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten kann

nun eine Aussage über die durchschnittliche Abweichung der automatisch ge-

nerierten Zellflächen zu den Referenzzellflächen erfolgen. Der Durchschnitts-

wert des Jaccard-Koeffizienten auf Basis von 100 aus Clustern separierten

L929 Zellen für den Auflicht-Hellfeld Mikroskopkontrast beträgt 0,77. Vor der

Zellseparation in den Clustern müssen alle Zellbereiche zuvor mit einem der in

Kap. 5 vorgestellten Methoden segmentiert werden. Das geschieht mit Hilfe des

schwellwertbasierten Verfahrens, beschrieben in Kap. 5.2.1.


Die Bewertung der Leistungsfähigkeit bezüglich der Zellzählung des vorgestell-

ten Separationsverfahrens erfolgt durch Gegenüberstellung der automatischen

Zellzählung von 100 Probenausschnitten der Linie L929 mit einer Referenzzäh-

lung durch eine Laborfachkraft (Kap. 13.11). Die statistische Auswertung der

Daten ist in Tabelle 32 aufgeführt.


6.6 beschriebenen Verfahrens

Zellzählung Mittlere Abweichung





3,13 1,37 0,14

1,96 (95%) 0,27

2,576 (99%) 0,35

3,29 (99,9%) 0,45

3,87 (99,99%) 0,53


benausschnitten im Durchschnitt eine Abweichung von 3,13% +/- 0,35% bei

einem Konfidenzintervall von 99% zur Referenz einstellt. Da Zellen vom Typ

MC3T3 oft kompakte flächige Agglomerate ausbilden und demnach nicht durch

Verengungen an den Zellkontaktstellen gekennzeichnet sind, liegen hier keine

Ergebnisse vor.

6.7 Randzellenbehandlung

Bei der Aufnahme eines Probenausschnittes befinden sich oft nur Teilbereiche

von Zellen am Bildrand (Abb. 62 rot markiert), die übrigen zu den Zellen gehö-

renden Areale verlaufen über den Bildrand hinaus. Diese Zellbestandteile in-

nerhalb des Probenausschnittes werden im Folgenden Randzellen genannt.

Abbildung 62: MC3T3 Zellen auf dem Material Stahl*; Zellen, die sich nur teilweise im Bild be-

finden (rot umrandet), müssen eliminiert werden


Die geometrischen Merkmale der Randzellen, z.B. die Fläche oder Kompakt-

heit, können aufgrund des Umstandes, dass sich nur ein Teil der Zelle im Bild

befindet, die morphologische Analyse der Zellen innerhalb des Probenaus-

schnittes verfälschen. Des Weiteren ist eine standardisierte Zählweise notwen-

dig, damit die Ergebnisse der automatischen und manuellen Zellzählung ver-

gleichbar sind, z.B. zur Bewertung der Genauigkeit bei der automatischen Zell-

zählung. Aus diesen Gründen ist eine Elimination der Randzellen zweckmäßig.

Zunächst müssen von den n vorhandenen Zellbereichen Z = {Z1, Z2, …, Zn} im

Probenausschnitt die Randzellen klassifiziert werden. Dazu wird eine Recht-

eckkontur R mit der Größe des zugrundeliegenden Bildes und einer Dicke von

einem Pixel generiert, Abb. 63.

Abbildung 63: Schematischer Probenausschnitt; Generierung einer Rechteckkontur (schwarze

Kontur) als Hilfsmittel zur Bestimmung der Randzellen

Von R und jeder im Bild segmentierten Zelle Zi wird jeweils die gemeinsame

Schnittmenge i iS Z R ermittelt. Ist |Si| > 0, wird das Verhältnis

ii

i

ZLV

S (Gl. 22)

bestimmt, wobei ZLi hier als die Zellkonturlänge der Randzelle Zi aufzufassen

ist. Überschreitet Vi den Wert eines einstellbaren Parameters F, so wird die

Randzelle nicht direkt verworfen, da nur ein verhältnismäßig geringer Teil der

Zellkontur den Rand schneidet und somit von einem Experten bei einer Zellzäh-

lung wahrscheinlich gezählt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wird F = 30 gesetzt.

Nun erfolgt die Bestimmung der Kompaktheit Ki, Kreisförmigkeit KFi und die

Fläche Ai der Randzelle Zi. Untersuchungen haben gezeigt, wenn Ki > KMax ˄

KFi < KFMax ˄ Ai < AMax, dann handelt es sich bei Zi wahrscheinlich um einen

Zellausläufer. Sind die genannten Bedingungen erfüllt, wird Zi demnach ge-

löscht. Andernfalls ist Zi eine gültige Zelle für die Analyse. Für die Zelllinien

L929 und MC3T3 haben sich die Parameter KMax = 10, KFMax = 0.1 und AMax =

1500 Pixel bewährt, für andere Zelllinien können die Parameter entsprechend


angepasst werden. Die Randzellenverarbeitung ist zusammenfassend in Form

eines Ablaufdiagrammes erläutert (Abb. 64).

Abbildung 64: Ablaufdiagramm zur Randzellenbehandlung nach der Zellsegmentierung

Abb. 64 zeigt das Ablaufdiagramm der bereits beschriebenen Randzellenverar-

beitung. Die Dekrementierung der Laufvariablen i, für den Fall der Löschung

von Zi aus Z ist notwendig, da nach dem Löschen des Elementes an der Positi-


on i der Index aller nachfolgenden Elemente automatisch um eins dekrementiert

wird.

6.7.1 Ergebnisse

Zur Bewertung der Qualität der Randzellenbehandlung wurde die automatische

Zellzahlerkennung mit und ohne Randzellenbehandlung einer Referenzzählung

durch einen Experten gegenübergestellt (Tabelle 33).

Tabelle 33: Vergleich der automatischen Zellzählung ohne Randzellenbehandlung mit der Refe-

renzzählung; AZ: Computergestützte Zellzählung; REF: Referenzzellzählung durch einen Ex-

perten; ERR: Relative Abweichung der automatischen Zellzählung von der Referenzzählung

Probe AZ REF ERR (%)

L929 1 266 232 14,7

L929 2 418 369 13,3

L929 3 280 250 12,0

L929 4 235 199 18,1

L929 5 279 240 16,3

L929 6 225 199 13,1

L929 7 244 215 13,5

L929 8 240 210 14,3

L929 9 250 215 16,3

L929 10 316 280 12,9

Ø Fehler 14,9

MC3T3 1 108 85 27,1

MC3T3 2 122 107 14,0

MC3T3 3 98 82 19,5

MC3T3 4 117 90 30,0

MC3T3 5 87 65 33,8

MC3T3 6 110 90 22,2

MC3T3 7 112 95 17,9

MC3T3 8 123 104 18,3

MC3T3 9 110 99 11,1

MC3T3 10 88 67 31,3

Ø Fehler 22,5

Für den Typ L929 kommt das Verfahren, beschrieben in Kap. 6.4, für die Linie

MC3T3 hingegen die Methode, beschrieben in Kap. 6.5 zum Einsatz. Tabelle

32 belegt, dass die automatische Zellzahlbestimmung für den Typ L929 ohne

Randzellenbehandlung durchschnittlich 14,9% Abweichung zur Referenzzäh-

lung beträgt. Bei aktivierter Randzellenbehandlung sinkt die Abweichung von

14,9% auf 1,27% (Tabelle 28). Für Zellen der Linie MC3T3 resultiert im Durch-

schnitt eine Abweichung von 22,5% ohne Randzellenbehandlung und 3,50%

Abweichung mit der Randzellenbehandlung (Tabelle 31). Aus Tabelle 33 geht


weiterhin hervor, dass die Abweichung ohne Randzellenbehandlung beim Typ

MC3T3 im Vergleich zum Typ L929 um 7,6% höher ausfällt. Der Grund liegt

darin, dass die MC3T3 Cluster im Vergleich zu L929-Agglomeraten mehr Zel-

len beinhalten und die am Bildrand gelegenen Cluster teilweise vom Bildrand

durchschnitten werden. In Relation zur Linie L929 werden demnach häufiger

MC3T3 Randzellen verworfen, da sie sonst die Analyse verfälschen würden.

Wenn die computergestützte Randzellenbehandlung nicht ausgeführt wird, blei-

ben jedoch alle Randzellen erhalten. Da der Anteil an MC3T3-Randzellen im

Vergleich zum Anteil an L929-Randzellen größer ausfällt, führt dies beim Typ

MC3T3 im Durchschnitt zu einer größeren Abweichung zur Referenzzählung.

6.8 Diskussion der Ergebnisse zu den Separationsverfahren

Die in Kap. 6.1 vorgestellte Methode CBS findet Anwendung für die Separation

agglomerierter Zellen mit Verengungen an deren Kontaktstellen. Der Vorteil

dieser Methode wird deutlich, wenn sie dem Separationsverfahren, beschrieben

in Kap. 6.4, vorangestellt wird. Hierdurch kann die Abweichung der automati-

schen Zellzählung zur Referenzzählung von 2,3% auf 1,27% reduziert werden.

Außerdem wird eine Reduzierung der Rechenzeit um ca. Faktor 8 erzielt. Ein

weiterer Vorteil liegt in der Anwendbarkeit auf allgemeine Objekte, die an Ver-

engungen aufgetrennt werden sollen. Für Zelltypen deren Agglomerate keine

Verengungen aufweisen, z.B. Zellen der Linie MC3T3, ist dieses Verfahren un-

geeignet.

Die in Kap. 6.2 beschriebene Methode zur Klassifizierung der segmentierten

Zellbereiche auf Basis einer iterativen Erosion führt zu einer mittleren Fehlklas-

sifizierung von 1,3% für den Zelltyp L929 und von 0,2% für den Zelltyp MC3T3.

Eine Klassifizierung der L929-Zellbereiche in Einzelzellen oder Agglomerate

ausschließlich mit der Auswertung der Anzahl der Kerne, würde zu einer 0,9%

schlechteren Klassifikation im Vergleich zur eingesetzten Methode führen. Dies

ist darauf zurückzuführen, dass kleine Zellen, die gerade einen Teilungsprozess

abschließen, oft über keine optisch erkennbaren Zellkernbereiche verfügen und

so fälschlicherweise als Einzelzelle klassifiziert werden.

Kap. 6.4 stellt ein Separationsverfahren vor, das Zellen an Engstellen teilt. Es

handelt sich um eine Kombination aus verschiedenen in der Literatur bekannten

Algorithmen, wobei teilweise Anpassungen der Methoden an diese Aufgaben-

stellung notwendig waren, beschrieben in Kap. 6.4.1. Der Vorteil dieses Verfah-

rens liegt darin, dass es auf alle Zelltypen anwendbar ist, die Verengungen an

den Zellkontaktstellen aufweisen. Die Methode ist in der Lage, trotz teilweise


nicht vorhandener Verengungen an den Zellkontaktstellen eine Separation mit

Hilfe bestimmter Konturpunkte durchzuführen. Jedoch sollte der Anteil an Eng-

stellen an den Zellkontaktstellen für ein genaues Separationsergebnis überwie-

gen.

Der Algorithmus benötigt trotz vorgeschalteter CBS (Kap. 6.1) im Vergleich zu

den Separationsverfahren, beschrieben in den Kapiteln 6.5 und 6.6, ca. die

dreifache Rechenzeit (Tabelle 34). Für ein Bild werden, abhängig von der An-

zahl und Größe vorhandener Agglomerate, ca. 1s Rechenzeit in Anspruch ge-

nommen. Das Verfahren setzt die Detektion der Kernbereiche innerhalb der

Agglomerate voraus. Im Rahmen des Projektes geschieht dies durch die in

Kap. 6.3.2 beschriebene Methode auf Basis des Histogram-Backprojection-

Algorithmus.

Tabelle 34 bietet einen Überblick der Rechenzeiten der drei vorgestellten Sepa-

rationsverfahren.

Tabelle 34: Vergleich der Rechenzeiten zwischen den drei Separationsverfahren für einen Pro-

benausschnitt der Linie L929 auf einer Intel Core i7 3,2GHz CPU

Separationsverfahren Durchschnittliche Rechenzeit des

Separationsvorgangs für einen Probenausschnitt der Linie L929

Separationsverfahren (Kap. 6.4) 1,03s

Separationsverfahren (Kap. 6.5) 0,27s

Separationsverfahren auf Basis von (38) (Kap. 6.6)

0,31s

Das Trennverfahren (Kap. 6.4) ist mit einer Rechenzeit von ca. 1s im Vergleich

zu den anderen beiden Verfahren am langsamsten. Die Methoden (Kap. 6.5

und Kap. 6.6) benötigen jeweils Rechenzeiten von ca. 300ms.

Das Separationsverfahren (Kap. 6.5) führt eine Zellflächenrekonstruktion mit

Hilfe einer Wachstumssimulation auf Basis der im Vorfeld detektierten Kernbe-

reiche (Kap. 6.3.2) durch. Der Vorteil dieser Methode ist die Anwendbarkeit auf

alle Zelllinien, bei denen eine Kerndetektion möglich ist. Die Segmentierung der

Kerne ist z.B. mit Hilfe einer zytochemischen Färbung der Zellen durchführbar.

Somit kann der Algorithmus, im Gegensatz zu den Verfahren, beschrieben in

Kap. 6.1 und 6.4, völlig unabhängig von der Zellgeometrie die Separation von

Agglomeraten durchführen. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist die ver-

gleichsweise schnelle Verarbeitungszeit. Für ein Bild werden im Durchschnitt

ca. 0,3s benötigt. Die Qualität dieses Verfahrens hängt stark von der Detektier-

barkeit der Kernbereiche ab. So führt eine ungenaue Segmentierung der Kerne

mit hoher Wahrscheinlichkeit auch zu einer nicht zufriedenstellenden Separati-


on in den Zellclustern. Mit dem Verfahren zur Detektion der Kernbereiche, be-

schrieben in Kap. 6.3.2, ist jedoch eine hinreichende Segmentierungsgenauig-

keit für Zellen vom Typ MC3T3 und L929 gegeben. Da auf einfache Weise mit

Hilfe eines im Rahmen dieses Projektes entwickelten Softwaretools neue Farb-

templates erstellt werden können, stellt eine Anpassung der Kerndetektion an

andere Zelllinien kein Problem dar.

Kap. 6.6. beschreibt ein weiteres Separationsverfahren, dass im Vergleich zu

den zwei zuvor genannten Trennmethoden (Kap. 6.4 und Kap. 6.5) ohne vorhe-

rige Detektion der Kernbereiche arbeitet. Der Separationsvorgang dieser Me-

thode ist in (38) beschrieben. Der Vorteil liegt darin, dass in diesem Fall keine

Anfärbung und Segmentierung der Zellkerne vorgenommen werden müssen.

Zudem benötigt diese Methode mit ca. 0,3s pro Bild eine geringe Rechenzeit.

Ein Nachteil dieser Methode ist, dass aus biologischer Sicht teilweise unsinnige

Trennvorgänge durchgeführt werden, z.B. durch einen Zellkernbereich. Dies

liegt an der variablen Morphologie der verwendeten Zelltypen. So sind auch an

engen Zellbereichen teilweise Kernflächen vorzufinden, die bei einer iterativen

Erosion fälschlicherweise aufgetrennt werden. Darüber hinaus ist diese Metho-

de nicht für die Separation kompakt gewachsener Cluster, z.B. vom Typ

MC3T3, geeignet, da diese Zelllinie kaum Verengungen an den Zellkontaktstel-

len ausbildet. Tabelle 35 zeigt die durchschnittlichen Jaccard-Koeffizienten für

die in Kap. 6.4 bis 6.6 beschriebenen Separationsverfahren, um die Qualität der

Zellflächenrekonstruktion vergleichen zu können. Die Jaccard-Koeffizienten al-

ler untersuchten Zellen sind in Kap. 13.12 hinterlegt.

Tabelle 35: Vergleich des Jaccard-Koeffizienten für 3 verschiedene Separationsverfahren auf

Basis von 200 Zellen (100 L929- und 100 MC3T3 Zellen)

Separation von L929 Cluster

Wachstumssimulation (Kap. 6.5)

Separationsverfahren auf Basis von (38) (Kap. 6.6)

Separationsverfahren (Kap. 6.4)

Jaccard-Koeffizienten Jaccard-Koeffizienten Jaccard-Koeffizienten

0,79 0,77 0,80

Separation von MC3T3 Cluster

Wachstumssimulation (Kap. 6.5)



Jaccard-Koeffizienten Jaccard-Koeffizienten Jaccard-Koeffizienten

0,79 0,38 0,42

Das Separationsverfahren auf Basis von (38) liefert für 100 segmentierte L929

Referenzzellen einen durchschnittlichen Jaccard-Koeffizient von 0,77. Mit die-

sem Ergebnis schneidet das Verfahren auf Basis von (38) etwas schlechter ab

als der Algorithmus aus Kap. 6.4. Der Grund liegt darin, dass die Methode im


Gegensatz zu dem Verfahren aus Kap. 6.4 nicht in der Lage ist zu erkennen, ob

Zellkernbereiche durch den Separationsprozess aufgetrennt werden. Der Algo-

rithmus, beschrieben in Kap. 6.5, liefert ebenfalls etwas schlechtere Ergebnisse

als das Verfahren aus Kap. 6.4, da es die Separation nicht anhand der für die

Linie L929 charakteristischen Verengungen vornimmt, sondern die Zellflächen-

approximation, ausgehend von den detektierten Zellkernbereichen, durchführt.

Mit der Trennmethode aus Kap. 6.4 ist die, im Vergleich zu den Verfahren aus

Kap. 6.5 und Kap. 6.6, präziseste Zellflächenrekonstruktion von L929 Zellen

möglich (Jaccard-Koeffizient: 0,80). Allerdings ist diese Methode sehr rechenin-

tensiv (Tabelle 34) und analog zum Trennverfahren auf Basis von (38) (Kap.

6.6) nur für Zelltypen geeignet, die Verengungen an den Kontaktstellen der Zel-

len aufweisen. Zur Trennung von kompakten Zell-Agglomeraten, z.B. der Linie

MC3T3, ist von den vorgestellten Verfahren ausschließlich die Wachstumssimu-

lation, beschrieben in Kap. 6.5, geeignet. Für eine Separation werden keine

Engstellen der Zellkontur benötigt.

Andere Separationsverfahren basieren oft auf der Auswertung geometrischer

Merkmale (46; 47).

In (46) wird von einem zuvor segmentierten Zellcluster dessen Skelett berech-

net. Die Positionen der Konturverengungen des Clusters werden mit Hilfe eines

Abstandshistogramms ermittelt, in dem für jeden Konturpunkt der kürzeste Ab-

stand zum Skelett enthalten ist. Ein definiertes Regelwerk steuert die Auswahl

der Konturpunkte, die zur Trennung des Clusters verbunden werden.

Vorteil dieses Verfahrens ist die gute Anwendbarkeit auf elliptisch geformte Zel-

len, die bei Agglomeratbildung Verengungen an den Zellkontaktstellen aufwei-

sen. Ein Nachteil liegt darin, dass die Methode nicht auf Zellen mit variabler

Morphologie anwendbar ist. Es wird keine Methode vorgestellt, mit der die Se-

paration von Clustern mit teilweise fehlenden Verengungen vorgenommen wird.

In (46) wird darüber hinaus keine Beurteilung der Separationsleistung geliefert,

z.B. durch Vergleich der automatischen Zellzählung nach der Zellseparation mit

einer Referenzzählung. Ein Bild aus (46) zeigt Zellen, die trotz vorhandener

Verengungen der Zellclusterkonturen nicht getrennt wurden, so dass eine gute

Separationsleistung angezweifelt werden muss. Aufgrund der genannten Nach-

teile wird dieses Verfahren nicht für die Auftrennung von L929 und MC3T3 Ag-

glomeraten eingesetzt.

Eine weitere aus der Literatur bekannte Separationsmethode wird in (47) vor-

gestellt. Die mit Hilfe einer Kantenerkennung segmentierten Zellkonturen wer-

den jeweils in Abschnitte mit einer spezifizierten Länge unterteilt und für jeden

Abschnitt die Normale berechnet. Durch bestimmte Winkelbeziehungen der


Normalen zu der x-Achse wird auf eine Verengung der Kontur geschlossen.

Punkte, die jeweils eine Engstelle in der Kontur repräsentieren, werden unter

Verwendung spezieller Regeln verbunden und so die Cluster aufgetrennt. Es

folgt eine Ellipsenapproximation der separierten Bereiche zur Rekonstruktion

der individuellen Zellflächen.

Diese Methode ist durch die elliptische Approximation der separierten Zellberei-

che ausschließlich auf ellipsenförmige Zellen begrenzt. Für Zellen mit variieren-

der Morphologie, z.B. vom Typ L929, ist trotz häufiger Verengungen an den

Zellkontaktstellen keine ausreichende Zellflächenrekonstruktion dieser Art nach

der Separation gewährleistet, da die Zellgeometrie stark von der Form einer

Ellipse abweichen kann. Darüber hinaus zeigen die Ergebnisse in (47), dass für

lediglich vier Bilder mit jeweils ca. 300 – 400 Zellen ein Vergleich der automati-

schen Zellzählung mit einer Referenzzählung vorgenommen wurde. Die Abwei-

chung der automatischen Zellzählung zur Referenzzählung variiert von Bild zu

Bild zwischen -7,09% und 8,59%. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die

vorgestellte Methode keine reproduzierbaren Ergebnisse, selbst bei Verwen-

dung derselben Zelllinie, liefert. Aus diesen Gründen wird das Verfahren aus

(47) für die Separation der in diesem Projekt vorliegenden Zelltypen nicht ein-

gesetzt.

Ein weiteres Verfahren stützt sich auf die farbliche Unterscheidung von zusam-

mengewachsenen Zellen (45). Hier wird eine zweifache Fluoreszenzfärbung

einer Probe zur farblichen Darstellung des Zytoplasmas und der Zellkerne vor-

genommen. Die Segmentierung der Zellplasmen wird mit einem histogrammba-

sierten Schwellwertverfahren im PAP-gefärbten Durchlichtbild und die Detektion

der Kerne ebenfalls mit einem histogrammbasierten Schwellwertverfahren im

DAPI-gefärbten Fluoreszenzbild ausgeführt. Die Trennung von Zellclustern er-

folgt mit Hilfe der Segmentierung von dunkler erscheinenden Überlappungsbe-

reichen zusammenhängender Zellen durch das Otsu Schwellwertverfahren. Zur

Bewertung der Separationsleistung wurden als Referenzwert 1665 Zellen ma-

nuell gezählt und der automatischen Zellzählung gegenübergestellt. Daraus

resultiert für die automatische Zellzählung eine Abweichung von 24% zum Re-

ferenzwert. Diese Abweichung ist im Vergleich zu den anderen Separationsver-

fahren sehr hoch (Tabelle 35).

Vorteil dieses Verfahrens ist eine geringe Rechenzeit. Es liegen zwar keine An-

gaben über die Ausführungsgeschwindigkeit vor, aber die vorgestellten Bildver-

arbeitungsfunktionen besitzen erfahrungsgemäß Rechenzeiten jeweils im hun-

dertstel bis zehntel Sekundenbereich. Nachteil dieser Methode ist, dass die Se-

paration eine farbliche Unterscheidung des Überlappungsbereiches zusam-


mengewachsener Zellen voraussetzt. Diese Eigenschaft ist im Rahmen dieses

Projektes nicht gegeben, so dass auch dieses Verfahren hier keine Verwen-

dung findet.

Das in (43) beschriebene Verfahren segmentiert fluoreszenzgefärbte Zellen mit

Hilfe des Gradientenverfahrens und trennt zusammenhängende Zellbereiche

auf Basis einer Wasserscheidentransformation mit anschließender Distanz-

transformation. Dieser Algorithmus beschränkt sich jedoch ausschließlich auf

die Segmentierung und Separation von fluoreszenzgefärbten HEp-2 Zellen,

wobei die Zellmorphologie dieses Typs aufgrund fehlender Zellausläufer und

der relativ runden Geometrie einfacher automatisch zu analysieren ist im Ver-

gleich zum Typ L929 und MC3T3. Im Ergebnisteil des papers ist für 20 Testbil-

der mit insgesamt 1242 Zellen eine Abweichung von 5% zur Referenzzählung

angegeben. Es ist davon auszugehen dass sich bei der hier vorliegenden kom-

plexeren Zellmorphologie sowie der kontrastärmeren May-Grünwaldfärbung

schlechtere Ergebnisse einstellen die zu einer ungenauen automatische Be-

stimmung des Zytotoxizitätsgrades eines vorliegenden Materials führen.

In (38) werden Zellagglomerate vom Typ L929 einer Separation, basierend auf

morphologischen Operationen, unterzogen. Die automatische Zellzählung mit

Hilfe dieses Verfahrens liefert im Vergleich zu den Ergebnissen der in Kap. 6.4

und 6.5 vorgestellten Trennverfahren größere Abweichungen zum Referenzwert

(Tabelle 36).

Tabelle 36: Vergleich der durchschnittlichen Abweichungen der automatischen Zellzählung zur

Referenzzählung für die Separationsverfahren aus Kap. 6.4 – 6.6 für die Linien L929 und

MC3T3 unter Berücksichtigung eines Konfidenzintervalls von 99%. Untersucht wurden pro Zell-

linie 100 Probenausschnitte mit insgesamt ca. 20.000 L929 Zellen und ca. 10.000 MC3T3 Zel-

len

Separationsverfahren MC3T3 L929

Verfahren A (Kap. 6.4) --- 1,27% +/- 0,22%

Verfahren B (Kap. 6.5) 3,5% +/- 0,61% 1,31% +/- 0,25%

Verfahren aus (38) (Kap. 6.6) --- 3,13% +/- 0,35%

Tabelle 36 zeigt, dass das Separationsverfahren aus (38) im Durchschnitt eine

1,86% höhere Abweichung der automatischen L929-Zellzählung zur Referenz-

zählung aufweist als das in Kap. 6.4 beschriebene Trennverfahren. Im Ver-

gleich zum Separationsverfahren (Kap. 6.5) liegt ebenfalls eine höhere Abwei-

chung (1,82%) vor. Für die Vereinzelung von Zellclustern der Linie MC3T3 sind

die Verfahren aus (38) und Kap. 6.4 im Gegensatz zu dem Trennverfahren aus


Kap. 6.5, das hier eine Abweichung von 3.5% zum Referenzwert aufweist, nicht

geeignet.

Auf Basis der diskutierten Methoden lässt sich schlussfolgern, dass für die

Trennung von Zellagglomeraten des Typs L929 sowie ähnlich gearteter Zellen

das Separationsverfahren, beschrieben in Kap. 6.4, mit vorgeschalteter CBS

(Kap. 6.1) die zu bevorzugende Methode ist. Alternativ kann mit ähnlichen Er-

gebnissen der Wachstumsalgorithmus aus Kap. 6.5 zur Separation und Rekon-

struktion der Zellflächen herangezogen werden, insbesondere wenn eine ver-

gleichsweise kurze Prüfzeit erforderlich ist. Bei der Analyse von MC3T3 Zellen

oder morphologisch ähnlichen Typen eignet sich das Wachstumsverfahren

(Kap. 6.5). Für den Fall, dass Zellen ohne Färbung der Kernbereiche analysiert

werden sollen, lassen sich Agglomerate mit dem Verfahren auf Basis von (38)

auftrennen.

7. Automatisierung der Algorithmenauswahl 112

7. Automatisierung der Algorithmenauswahl

In den Kapiteln 5 und 6 wurden die Zellsegmentierungs- und separationsverfah-

ren vorgestellt. Das vorliegende Kapitel geht nun auf das Konzept der automati-

schen Zellanalyse ein. Es wird ein Verfahren vorgestellt, dass das geladene

Bildmaterial hinsichtlich der Zellmorphologie und des Mikroskopkontrastes ana-

lysiert und die für die Analyse am besten geeignete Kombination an Algorith-

men ausgewählt. Abbildung 65 gibt einen Überblick des allgemeinen Analyse-

konzeptes.

Abbildung 65: Allgemeine Vorgehensweise bei der Bildanalyse


Aus Abb. 65 geht hervor, dass zunächst die Auswahl des geeigneten Zelldetek-

tionsverfahrens automatisiert werden muss und im weiteren Verlauf die Aus-

wahl des geeigneten Zellseparationsverfahrens. Im Folgenden werden geeigne-

te Methoden dafür vorgestellt.

7.1 Automatische Auswahl der geeigneten

Zellsegmentierungsmethode

Nach dem Laden des Bildmaterials in das Programm steht zunächst die Detek-

tion der Zellbereiche an. Dazu kommen, abhängig davon ob die Bilder im Auf-

licht- oder Durchlichtkontrast aufgenommen sind, die Schwellwertsegmentie-

rung oder die histogrammbasierte Methode zum Einsatz. Untersuchungen zei-

gen, dass die Standardabweichung der Grauwerte im Bild Aufschluss darüber

gibt, ob es im Auflicht- oder Durchlichtkontrast aufgenommen wurde (Abb. 66).

Abbildung 66: Punktdiagramm zur Standardabweichung der Grauwerte für 100 Bilder, aufge-

nommen am Auflichtmikroskop (blau) und 100 Bilder, aufgenommen am Durchlichtmikroskop(

rot)

Abb. 66 zeigt die Verteilung der Merkmalswerte xA,i für 100 Probenausschnitte,

aufgenommen am Auflichtmikroskop (blau) sowie die Verteilung der Merkmals-

werte xB,i für 100 Probenausschnitte aufgenommen am Durchlichtmikroskop

(rot) mit i = 1, 2, …, 100. Zur Einordnung eines neuen Merkmalswertes in die

Klassen Auflicht oder Durchlicht können die Dichtefunktionen der beiden Klas-

sen herangezogen werden. Dafür werden zum einen der Mittelwert µA der

Merkmalswerte der Auflichtbilder und zum anderen der Mittelwert µB der Merk-

0,00

10,00

20,00

30,00

40,00

50,00

60,00

70,00

80,00

0 20 40 60 80 100 120

Stan

dar

dab

we

ich

un

g [G

rau

stu

fen

]

Probennummer

Standardabweichung der Grauwerte

Std.-Abw. Auflicht Std.-Abw. Durchlicht


malswerte für die Durchlichtbilder benötigt. Des Weiteren sind die Standardab-

weichungen σA ebenfalls für die Merkmalswerte der Auflichtbilder und σB für die

Merkmalswerte der Durchlichtbilder zu ermitteln. Mit dem Mittelwert und der

Standardabweichung kann die Dichtefunktion der Normalverteilung (79) be-

stimmt werden (Gl. 23).

21

22 1, ,

2

x

x e

(Gl. 23)

Die Dichtefunktionen φA der Auflichtverteilung und φB der Durchlichtverteilung

sind in Abb. 67 dargestellt.

Abbildung 67: Dichtefunktionen der Standardabweichungen von Graustufen in 100 Auflichtbil-

dern (blau) und 100 Durchlichtbildern (rot)

Für die Klassifikation eines Bildes in die Klasse Auflicht oder Durchlicht wird

nun der Merkmalswert x für das Bild bestimmt und in die beiden Dichtefunktio-

nen φA und φB eingesetzt und der jeweilige Funktionswert bestimmt. Wenn der

Funktionswert φA(x, µA, σA) ≥ φB(x, µB, σB) resultiert, erfolgt die Einordnung des

Eingabebildes in die Klasse Auflicht, andernfalls in die Klasse Durchlicht. Liegt

eine Klassifizierung als Auflichtbild vor, kommt das Segmentierungsverfahren,

beschrieben in Kap. 5.2.1, zum Einsatz, ansonsten die Methode, beschrieben in

Kap. 5.2.2. Aus Abb. 67 geht hervor, dass sich die beiden Verteilungen nur ge-

0,00000

0,02000

0,04000

0,06000

0,08000

0,10000

0,12000

0,14000

0,16000

1 5 9

13

17

21

25

29

33

37

41

45

49

53

57

61

65

69

73

77

81

85

89

93

97

φ(x

,µ,σ

)

Standardabweichung x

Dichtefunktionen der Standardabweichungen von Graustufen in Auflicht- und Durchlichtbildern

Dichtefkt. Auflicht Dichtefkt. Durchlicht


ringfügig überschneiden, so dass von einer weitestgehend sicheren Klassifizie-

rung in Auflicht- oder Durchlichtbilder auszugehen ist.

7.2 Automatische Auswahl der geeigneten Zellseparationsmethode

Für die Auswahl eines geeigneten Zellseparationsverfahrens liegen durch die

im Vorfeld ausgeführten Algorithmen verschiedene Informationen vor. Es sind

die Anzahl segmentierter Zellbereiche (Kap. 5.2), als Cluster und Einzelzelle

klassifizierte Zellbereiche (Kap. 6.2) und die detektierten Kerne pro Zellbereich

(Kap. 6.3) bekannt. Untersuchungen zeigen, dass sich die durchschnittliche

Anzahl der Zellkerne pro Agglomerat (KA) für Proben vom Typ L929 und

MC3T3 deutlich unterscheiden (Abb. 68).

Abbildung 68: Anzahl der Zellkerne pro Cluster im Vergleich für die Zelltypen L929 und MC3T3

Abb. 68 zeigt die Verteilung der Merkmalswerte für 100 Probenausschnitte mit

dem Zelltyp L929 (blau) sowie für 100 Probenausschnitte mit dem Typ MC3T3

(rot). Zur Einordnung eines neuen Merkmalswertes in die Klassen L929 oder

MC3T3 können wie bereits in Kap. 7.1 beschrieben die Dichtefunktionen heran-

gezogen werden.

Die Dichtefunktionen φL929 für den Typ L929 und φMC3T3 für den Typ MC3T3

sind in den Abbildungen 69 und 70 dargestellt.

1,00

2,00

4,00

8,00

16,00

32,00

64,00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100Ve

rhäl

tnis

Ke

rne

zu

Clu

ste

r

Probe

Merkmal KA - Anzahl der Kerne pro Cluster

Merkmal KA für L929 Merkmal KA für MC3T3


Abbildung 69: Dichtefunktion des Merkmals KA für den Zelltyp L929

Abbildung 70: Dichtefunktion des Merkmals KA für den Zelltyp MC3T3

Für die Klassifikation eines Bildes in die Klasse L929 oder MC3T3 wird nun der

Merkmalswert x für das Bild bestimmt, dieser in die beiden Dichtefunktionen

φL929 und φMC3T3 eingesetzt und der jeweilige Funktionswert bestimmt. Wenn der

Funktionswert φA(x, µL929, σL929) ≥ φB(x, µMC3T3, σMC3T3) resultiert, erfolgt die Ein-

ordnung des Eingabebildes in die Klasse L929, andernfalls in die Klasse

MC3T3. Liegt eine Klassifizierung als L929 Zellbild vor, kommt das Separati-

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

0,8

0

0,9

2

1,0

4

1,1

6

1,2

8

1,4

0

1,5

2

1,6

4

1,7

6

1,8

8

2,0

0

2,1

2

2,2

4

2,3

6

2,4

8

2,6

0

2,7

2

φ(x

,µ,σ

)

Anz.Kerne/Cluster x

Dichtefunktionen des Merkmals KA für den Zelltyp L929

Dichtefkt. Merkmal KA L929

0,00

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

0,0

0

2,0

0

4,0

0

6,0

0

8,0

0

10

,00

12

,00

14

,00

16

,00

18

,00

20

,00

22

,00

24

,00

26

,00

28

,00

30

,00

32

,00

34

,00

36

,00

38

,00

φ(x

,µ,σ

)

Anz.Kerne/Cluster x

Dichtefunktion des Merkmals KA für den Zelltyp MC3T3

Dichtefkt. Merkmal KA MC3T3


onsverfahren, beschrieben in Kap. 6.4, zum Einsatz, ansonsten die Methode,

beschrieben in Kap. 6.5.

Zur Bewertung der Qualität des Entscheidungsmerkmals KA wurde für 100

Proben durch die Software automatisch das Separationsverfahren ausgewählt

und geprüft ob die resultierenden Ergebnisse im Vergleich zu den Ergebnissen

mit dem nicht ausgewählten Separationsverfahren besser oder gleich gut sind.

Die Untersuchung zeigt, dass die Software zu 99% das am besten geeignete

Separationsverfahren für die Zelltrennung in Clustern auswählt.

Die Separationsverfahren, beschrieben in den Kapiteln 6.4 und 6.5, setzen die

Detektion der Kernbereiche voraus. Sollte der Fall eintreten, dass keine Zell-

kerne detektiert wurden kommt das Separationsverfahren, beschrieben in Kap.

6.6 zum Einsatz das unter Verwendung morphologischer Operationen die Tren-

nung zusammengewachsener Zellbereiche ohne Berücksichtigung der Kernbe-

reiche vornimmt.

8. Automatische Parametereinstellung 118

8. Automatische Parametereinstellung

Die Parametereinstellungen der für die Zellanalyse benötigten Algorithmen

werden durch die Fachkraft an die zu untersuchende Zelllinie und das Material

angepasst. Die Einstellungen sind in einer Datei speicherbar. Auf diese Weise

ist nur ein einmaliges Einstellen aller Parameter für eine bestimmte Zelllinie und

Material notwendig.

Ist für alle zu untersuchenden Zelltypen und Materialien eine Parameterdatei

generiert worden, ist zu Beginn der Analyse die passende Parameterdatei vom

Anwender auszuwählen.

Zur Einstellung der Algorithmenparameter ist ein bestimmtes Maß an Fachwis-

sen im Bereich Computer Vision notwendig, die Anwender der Software müs-

sen entsprechend geschult werden. Aus diesem Grund ist eine automatische

Lösung zur Bestimmung der Algorithmenparameter für eine Applikation hilf-

reich.

8.1 Automatische Parametereinstellung für die Zellsegmentierung

Das Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap. 5.2.1 kommt z.B. zum Ein-

satz, wenn Proben am Auflichtmikroskop aufgenommen und die darauf befindli-

chen Zellen zuvor angefärbt wurden. Der Algorithmus benötigt 6 Parameter

(S1O,R, S1U,R, S1O,G, S1U,G, S1O,B, S1U,B) zur Einstellung pro Zelltyp und ver-

wendetem Material (Tabelle 37).


schiedlichen Materialien; S1O,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals; S1U,R: Unterer Schwellwert

des Rotkanals; S1O,G: Oberer Schwellwert des Grünkanals; S1U,G: Unterer Schwellwert des

Grünkanals; S1O,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; S1U,B: Unterer Schwellwert des Blauka-

nals

Proben- material

S1O,R S1U,R S1O,G S1U,G S1O,B S1U,B

L929 Stahl* 210 0 210 0 215 0

Titan* 190 0 190 0 190 0

Polystyrol 175 0 175 0 180 0

MC3T3

Stahl* 210 0 210 0 215 0

Titan* 185 0 185 0 190 0

Polystyrol 170 0 170 0 180 0

Die drei Parameter SU,R, SU,G und SU,B werden auf den Wert 0 gesetzt, da die

Zellbereiche stets dunkler erscheinen als das umgebene Material. Die automa-


tische Einstellung der Parameter SO,R, SO,G und SO,B erfolgt nach folgender Vor-

gehensweise.

Zunächst wird das Farbbild in den Rot- Grün- und Blaukanal aufgetrennt. Im

Histogramm des Rotkanals (Abb. 71) folgt die Bestimmung des globalen Maxi-

mums.

Abbildung 71: Histogramm des Rotkanals eines Zellbildes. Die Zellen sind vom Typ L929, May-

Grünwald gefärbt und auf dem Material Stahl aufgebracht. Das globale Maximum liegt auf dem

Index 229 mit 161.299 Pixeln

Der Index des globalen Maximums entspricht dem häufigsten im Bild vorkom-

menden Grauwert. Dieser kann dem verwendeten Material zugeordnet werden,

da es die meiste Fläche im Bild belegt. Ausgehend vom Index des globalen

Maximums wird schrittweise der Index um eins verkleinert bis die Anzahl der

Pixel an der aktuell betrachteten Histogrammposition weniger als p = 3% der

Anzahl an Pixeln am absoluten Maximum entspricht. Der aktuelle Histogram-

mindex wird dem Parameter S1O,R zugewiesen. Aufgrund der Farbvielfalt der

Zellen ist die Wahrscheinlichkeit hoch dass Grauwerte bis zum aktuellen Histo-

grammindex den Zellbereichen zugeordnet werden können. Für die anderen

beiden Kanäle wird analog verfahren und die jeweiligen resultierenden Indizes

den Parametern SO,G und SO,B zugewiesen. Zur Bestimmung des optimalen

Prozentwertes p wurden von 100 zufällig ausgewählten Zellen die Referenzkon-

turen ermittelt und mit den automatisch generierten Zellkonturen verglichen. Als

Vergleichsmaß kam der Jaccard-Koeffizient zum Einsatz. Unter der Verwen-

dung verschiedener Prozentsätze hat sich p = 3% als optimal herausgestellt, da

für 100 untersuchte Zellen hierfür der größte Jaccard-Koeffizient resultierte.

Für die Detektion der Hintergrundbereiche innerhalb der Zellen (Abb. 17) sind

ebenfalls 3 der 6 Parameter automatisch einzustellen (Tabelle 38).


Tabelle 38: Schwellwerte zur Segmentierung der Materialbereiche innerhalb der bereits erfass-

ten Zellbereiche; S2O,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals; S2U,R: Unterer Schwellwert des

Rotkanals; S2O,G: Oberer Schwellwert des Grünkanals; S2U,G: Unterer Schwellwert des Grünka-

nals; S2O,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; S2U,B: Unterer Schwellwert des Blaukanals

Proben- material


Stahl* 255 215 255 215 255 220

Titan* 255 195 255 195 255 195

Polystyrol 255 180 255 180 255 185

Da der Hintergrundbereich heller als die Zellen erscheint und die oberen

Schwellwerte für die Detektion der Zellbereiche bereits ermittelt sind, werden

die unteren Segmentierungsschwellen S2U,R, S2U,G und S2U,B auf folgende Wer-

te gesetzt:

S2U,R = S1O,R + 1

S2U,G = S1O,G + 1

S2U,B = S1O,B + 1

Der Algorithmenablauf ist in Form eines Flussdiagramms in Abb. 72 dargestellt.


Abbildung 72: Flussdiagramm zum Ablauf der automatischen Parametereinstellung

Nach Ausführung der automatischen Parameterfestlegung ergeben sich für die

verschiedenen Materialen und Zelltypen die in Tabelle 39 enthaltenen Schwell-

werte.


schiedlichen Materialien; S1O,R: Oberer Schwellwert des Rotkanals; S1U,R: Unterer Schwellwert


des Rotkanals; S1O,G: Oberer Schwellwert des Grünkanals; S1U,G: Unterer Schwellwert des

Grünkanals; S1O,B: Oberer Schwellwert des Blaukanals; S1U,B: Unterer Schwellwert des Blauka-

nals

Proben- material


L929 Stahl* 195-220 0 195-220 0 200-230 0

Titan* 180-200 0 180-200 0 190-210 0

Polystyrol 175-180 0 175-180 0 175-180 0

MC3T3 Stahl* 195-220 0 195-220 0 200-230 0

Titan* 180-200 0 180-200 0 190-210 0

Polystyrol 175-180 0 175-180 0 175-180 0

Tabelle 39 zeigt, dass die Parameter für ein bestimmtes Material innerhalb des

angegebenen Grauwertintervalls schwanken. Der Grund ist auf geringe Hellig-

keitssschwankungen innerhalb einer Bilderserie zurückzuführen (Abb. 73).

Abbildung 73: Zwei Histogramme von Bildern mit Zellen jeweils vom Typ L929, May-Grünwald

gefärbt, aufgenommen am Auflichtmikroskop. Das zweite Bild ist etwas heller, es besitzt ein

leicht nach rechts verschobenes Histogramm (unten)

Abb. 73 zeigt zwei Histogramme von Probenausschnitten die an unterschiedli-

chen Stellen auf derselben Probe aufgenommen wurden. Es handelt sich hier-

bei um Aufnahmen von May-Grünwald gefärbten Zellen des Typs L929. Anhand

der leichten Rechtsverschiebung des unteren Histogramms im Vergleich zum

oberen Histogramm wird deutlich, dass leichte Helligkeitsschwankungen in ei-

ner Probenserie vorliegen können.


8.2 Automatische Parametereinstellung für die CBS Methode

Die kontextbasierte Separationsmethode (CBS), beschrieben in Kap. 6.1, wird

nach der Zellbereichsegementierung zur ersten Stufe der Zellseparation einge-

setzt. Die Einstellung des Algorithmus erfolgt über die folgenden vier Parame-

ter:

r: Radius der Kreismaske C1

a: Festlegung des Radius der Kreismaske C2 mit r2 = a · r

x, y: Parameter der Entscheidungsfunktion f2(x,y) für eine Engstelle in der Zelle

Zur automatischen Einstellung der Parameter ist der Einsatz von genetischen

Algorithmen möglich. Mit ihrer Hilfe können komplexe Optimierungsaufgaben in

vertretbarer Zeit gelöst werden. Die Funktionsweise lehnt sich, jedoch verein-

facht, an die natürliche Evolution von Lebewesen an und läuft prinzipiell nach

folgendem Schema ab (80):

1. An die Problemstellung angepasste genetische Codierung der Lösungskan-

didaten vornehmen

2. Initialisierung: Anfangspopulation erzeugen mit meist zufälliger Zuordnung

von Fitnesswerten.

3. Durchlaufe die folgenden Schritte, bis ein Abbruchkriterium erfüllt ist:

- Güte der Lösungskandidaten mit Hilfe der Fitnessfunktion berechnen

- Selektion der Eltern für die nachfolgende Rekombination

- Rekombination der ausgewählten Lösungskandidaten

- Zufällige Veränderung der Nachfahren (Mutation)

- Reproduktion der neuen Generation und Prüfen der Abbruchbedingung

Für die vorliegende Anwendung wird zunächst der Wertebereich der o.g. vier

Parameter wie folgt festgelegt.

r: 1, 2, 3, …, 50

a: 1.5, 2.0, 2.5, …, 6.0

x: 1.00, 1.05, 1.10, …, 3.00

y: 1.2, 1.4, 1.6, …, 10.0

Der Wertebereich und die Quantisierung der Parameter sind für die vorliegende

Anwendung angepasst. Mit den vorliegenden 4 Wertebereichen ergeben sich

50x10x41x45 = 922.500 Parameterkonfigurationen, aus denen eine für den


Zelltyp L929 geeignete Parametereinstellung gefunden werden soll. Der Typ

L929 wird hier vorrangig untersucht, da dieser typischerweise für Biokompatibili-

tätstests herangezogen wird.

Als Codierungsvariante kommt in diesem Fall die Realzahlcodierung zum Ein-

satz, da die Parameterwerte nicht nur ganzzahlige Werte annehmen können.

Ein Individuum I bzw. ein Lösungskandidat besitzt die folgende Form:

I = {r, a, x, y}

Zur Bestimmung der Güte eines Individuums wird eine Fitnessfunktion benötigt.

Diese Funktion vergleicht die automatisch ermittelte Zellanzahl mit der Refe-

renzzählung unter Verwendung einer bestimmten Parameterkonfiguration. Für

die automatische Bestimmung der Zellanzahl kommt nach der Zellbereichseg-

mentierung die CBS Methode zur Separation zusammenhängender Zellen zum

Einsatz, wobei die verwendete Parameterkonfiguration von dem aktuell zu be-

wertendem Individuum repräsentiert wird. Das setzt eine vorherige manuelle

Zellzählung eines Referenzbildes mit Zellclustern voraus.

Im nächsten Schritt erfolgt die Selektion der Elternpaare für die anschließende

Rekombination. Dazu kommt das „Roulette-Wheel-Selection“ Verfahren zum

Einsatz, bei dem zunächst die Anteile der normierten Fitnesswerte

,

1

ii prop n

i

i

FF

F

(Gl. 24)

auf eine Drehscheibe aufgetragen werden. Abb. 74 verdeutlicht beispielhaft das

Vorgehen anhand von 10 Individuen.

Abbildung 74: Beispielhafte fitnessproportionale Aufteilung von 10 Individuen auf einer Scheibe.

Ein Zufallswert im Bereich 1 bis 360 (schwarzer Pfeil) wählt ein Individuum für die Reproduktion

aus.

Die Selektion erfolgt durch n-maliges Drehen der Scheibe, wobei nach jedem

Drehvorgang ein Elternteil ausgewählt wird. Dabei kann der Fall eintreten, dass

ein Individuum mehrmals ausgewählt wird. Der Drehvorgang wird hier durch die

Fitnessverteilung der Individuen Auswahl


Bestimmung einer Zufallszahl zwischen 1 bis 360 simuliert. Ausgewählt ist da-

raufhin das Individuum, dessen Winkelbereich auf der Drehscheibe von der Zu-

fallszahl getroffen wurde.

Daraufhin steht die Rekombination der selektierten Elternpaare an. Dies ge-

schieht mit Hilfe der ganzarithmetischen Rekombination. Bei dieser Methode

werden für alle Gene neue Werte bestimmt. Die Werte ergeben sich aus der

gewichteten Summe der Elterngene, wobei die Gewichtung über den Parameter

α festgelegt ist:

1 1 1 11 , , ,I r x y

2 2 2 22 , , ,I r x y

1 2 1 2 1 2 1 21 1 , 1 , 1 , 1K r r a a x x y y (Gl. 25)

2 1 2 1, 2 1 2 12 1 , 1 1 , 1K r r a a x x y y (Gl. 26)

Zum Beispiel ergeben sich unter Verwendung des Parameters α = 0,7 für die

folgenden zwei Elternteile I1 und I2 die zwei Nachkommen K1 und K2:

I1 = {r1=8, a1=2.0, x1=1.1, y1=3.0} K1 = {8.9, 2.15, 1.19, 3.3}

I2 = {r2=11, a2=2.5, x2=1.40, y2=4.0} K2 = {10.1, 2.35, 1.31, 3.7}

Im letzten Schritt der Rekombination müssen die berechneten Genwerte auf

den nächstgelegenen gültigen Wert des Wertebereiches gerundet werden:

K1 = {9, 2.0, 1.20, 3.4}

K2 = {10, 2.5, 1.30, 3.8}

Nach der Rekombination erfolgt eine Mutation der Gene, die mit einer Wahr-

scheinlichkeit von p = 1% pro Gen auftritt. Mit Hilfe der Mutationsoperation ist

es möglich eine gewisse Inhomogenität in der Population aufrecht zu erhalten.

Erfolgt eine Mutation, so wird der Wert des betrachteten Gens zufällig auf einen

gültigen Wert innerhalb des Wertebereiches gesetzt.

8.2.1 Ergebnisse zur automatischen Parametereinstellung für die CBS Methode

Für die Durchführung der Parameterfestlegung mit dem genetischen Algorith-

mus wird eine Anfangspopulation von 20 Individuen gewählt und im Rahmen

von 50 Generationen nach dem besten Parametersatz gesucht. Dabei beträgt

die Rechenzeit auf einem intel Core i7 mit 3,2Ghz ca. 60s. Wird der genetische

α = 0,7


Algorithmus 10-mal hintereinander ausgeführt so erhält man die folgenden Pa-

rameterkonfigurationen:

Tabelle 40: Automatische Parameterfestlegung des genetischen Algorithmus 10-mal

hintereinander ausgeführt

Nr Parameter

(50 Generationen) Auto. Zellzahl

(50 Generationen) REF

1 {14, 2.0, 1.65, 3.4} 49 50

2 {11, 3.5, 1.95, 2.6} 49 50

3 {13, 2.0, 1.70, 3.0} 49 50

4 {13, 2.5, 1.80, 3.2} 49 50

5 {10, 4.0, 1.85, 2.8} 49 50

6 {11, 3.0, 2.05, 4.2} 49 50

7 {15, 3.5, 1.55, 2.2} 49 50

8 {15, 2.0, 2.20, 3.4} 49 50

9 {14, 3.0, 1.65, 2.0} 49 50

10 {10, 3.5, 1.85, 3.2} 49 50

Aus Tabelle 40 geht hervor, dass der genetische Algorithmus innerhalb von 50

Generationen reproduzierbar Parameterkonfigurationen für die CBS ermittelt,

mit denen die Zellseparation durchgeführt werden kann. Das Ergebnis der Zell-

separation liegt für alle Parametersätze nahe am Referenzwert. Das Referenz-

bild enthält 50 Zellen, wobei nach der Zellbereichsegmentierung mit dem Ver-

fahren, beschrieben in Kap. 8.1, 24 Zellbereiche vorliegen. In diesen 24 Zellbe-

reichen liegen vor Anwendung der CBS die restlichen 26 Zellen zusammen-

hängend in verschiedenen Clustern vor.

8.3 Diskussion der Ergebnisse zu den automatischen

Parametereinstellungen

Zur Beurteilung der Qualität der in Kap. 8.1 vorgestellten Methode zur automa-

tischen Parameterbestimmung ist eine Referenzsegmentierung notwendig. Da-

zu sind durch einen Experten pro Zelllinie und Mikroskopkontrastart jeweils 50

Zellen manuell segmentiert worden. Mit Hilfe des Jaccard-Koeffizienten kann

nun eine Aussage über die durchschnittliche Abweichung der automatisch ge-

nerierten Zellkonturen zu den Referenzkonturen erfolgen. Die vollständigen Da-

ten sind in Kap. 13.13 aufgelistet, Tabelle 41 beinhaltet den Durchschnittswert

des Jaccard-Koeffizienten auf Basis von 50 Zellen jeweils für einen Mikroskop-

kontrast. Zum Vergleich sind die Jaccard-Koeffizienten sowohl von der manuel-

len als auch automatischen Parameterauswahl in Tabelle 41 enthalten.

Tabelle 41: Bewertung der Qualität des Schwellwertverfahrens mit manueller und automatischer

Parameterfestlegung für unterschiedliche Zelllinien, Materialien und Mikroskopkontraste mit


Hilfe des Jaccard-Koeffizienten; A-HF: Auflicht-Hellfeld; A-DF: Auflicht-Dunkelfeld; D-HF: Durch-

licht-Hellfeld; D-PK: Durchlicht-Phasenkontrast

Material L929 MC3T3


Manuelle Parameterfestlegung

Stahl*/Titan* 0,89 0,85 --- --- 0,87 0,90 --- ---

Polystyrol --- --- 0,87 0,60 --- --- 0,76 0,53

Automatische Parameterfestlegung

Stahl* /Titan* 0,92 0,87 --- --- 0,90 0,92 --- ---

Polystyrol --- --- 0,90 0,65 --- --- 0,78 0,55

Aus Tabelle 41 geht hervor, dass bei der automatischen Parameterauswahl

geringfügig bessere Jaccard-Koeffizienten im Vergleich zur manuellen Parame-

terfestlegung resultieren. Der Grund liegt darin, dass bei der automatischen Pa-

rameterfestlegung die leichten Helligkeitsschwankungen zwischen einzelnen

Bildaufnahmen ausgeglichen werden.

Bei Verwendung des Durchlicht-Phasenkontrastes resultieren für beide Varian-

ten der Parameterauswahl mit Jaccard-Koeffizienten von 0,60 und 0,65 keine

verwertbaren Ergebnisse, da sowohl Zellen als auch das Substrat teilweise die

gleiche Farbgebung aufweisen und durch global einstellbare Schwellwerte nicht

mehr hinreichend genau zwischen Vorder- und Hintergrund unterschieden wer-

den kann.

Bei der Parameterauswahl für die CBS Methode mit Hilfe eines genetischen

Algorithmus resultieren bei mehrmaliger Ausführung nicht die gleichen Parame-

tersätze (Tabelle 40). Der Grund liegt in der zufälligen Festlegung der Startpa-

rameter sowie der zufälligen Mutation von Individuen, die schließlich zu unter-

schiedlichen Parameterwerten führen können. Allerdings weichen die Parame-

terkonfigurationen nicht deutlich voneinander ab und die CBS Methode liefert

für die in Tabelle 40 aufgeführten Parametersätze die gleiche Qualität. Diese

Eigenschaft der CBS Methode, für unterschiedliche Parameterkonfigurationen

gleiche Ergebnisse zu erzielen, befürwortet den Einsatz eines genetischen Al-

gorithmus zur automatischen Parameterfestlegung da die Wahrscheinlichkeit

hoch ist mit einer mäßigen Anzahl an Generationen eine gute Lösung zu erzie-

len. Die Verwendung der unterschiedlichen Parameterkonfigurationen aus Ta-

belle 40 führen bei der automatischen Zellzählung lediglich zu geringen Abwei-

128

chungen. Setzt man die folgenden drei Parametersätze für die CBS-Methode

ein

I1 = {14, 2.0, 1.65, 3.4}

I2 = {11, 3.0, 2.05, 4.2}

I3 = {10, 3.5, 1.85, 3.2}

und führt eine Zellzählung in Kombination mit dem Zellbereichsegmentierungs-

verfahren, beschrieben in Kap. 8.1, und dem Zellseparationsverfahren, be-

schrieben in Kap. 6.5 durch, so ergeben sich für jeweils 20 Probenausschnitte

durchschnittliche Abweichungen von 1,38%, 1,47% und 1,44% zur Referenz-

zählung. Eine Stichprobe von 20 Probenausschnitten reicht hier aus um zu zei-

gen, dass die Abweichungen der automatischen Zellzählungen bei Verwendung

unterschiedlicher Parametersätze, die alle als die beste Lösung vom geneti-

schen Algorithmus vorgeschlagen wurden, mit 0,09% und 0,06% sehr gering

sind.

9. Bewertung des Biokompatibilitätsgrades 129

9. Bewertung des Biokompatibilitätsgrades

Die in Kap. 5 und 6 vorgestellten Algorithmen ermöglichen die Segmentierung

und Separation von L929-, MC3T3- oder ähnlichen Zelltypen in mikroskopi-

schen Bildern, so dass nachfolgende Zellanalysen mittels der Software möglich

sind. Die Bewertung des Biokompatibilitätsgrades erfolgt laut DIN ISO Norm

10993-5 (5) entweder durch quantitative oder qualitative in-vitro-Zellversuche,

wobei das Prüfmaterial einer der in Tabelle 42 aufgeführten Zytotoxizitätsstu-

fen14 zugeordnet wird.

Tabelle 42: Zytotoxische Einteilung der Prüfmaterialien laut DIN ISO Norm 10993-5 (5)

Zytotoxizitäts-skala

Interpretation

0 Nicht zytotoxisch

1 Schwach zytotoxisch

2 Mäßig zytotoxisch

3 Stark zytotoxisch

9.1 Quantitative Bewertung der Biokompatibilität

Die quantitative Bewertung der Biokompatibilität eines Substrates (Probenwerk-

stoff) erfolgt mit Hilfe der Zellproliferation, d.h. es wird das Wachstums- und

Vermehrungsverhalten der Zellen nach einem festgelegten Testzeitraum in

Kontakt mit dem Probenwerkstoff untersucht. In Standardlaboren wird zur Be-

stimmung der Zellproliferation (nach Ablauf der Versuchsdauer) die Anzahl vita-

ler Zellen, die in Gegenwart des Probenwerkstoffes überlebt haben, mit speziel-

len Zählkammern ermittelt. Mit Hilfe der entwickelten Software ist hingegen eine

automatische Zellzählung und Morphologieanalyse für mikroskopische Aufnah-

men möglich. Die Arbeitsschritte im Rahmen der Zellzahlbestimmung mit Hilfe

der Zählkammern (Verfahren A) und unter Verwendung einer computergestütz-

ten Analyse (Verfahren B) sind in Abb. 75 dargestellt.

14

Zytotoxizität: Unter Zytotoxizität versteht man die schädigende Wirkung chemischer Substan-

zen (hier der Probenwerkstoff) auf damit in Verbindung stehende Zellen.


Abbildung 75: Vergleich der Arbeitsschritte der herkömmlichen Zellzahlbestimmung mit Hilfe

von Zählkammern (Verfahren A) mit der computergestützten Auswertung der Zellbilder (Verfah-

ren B). Erklärung siehe Text.

Zu Beginn müssen für beide Verfahren A und B die vorbereitenden Maßnah-

men für die zu testenden Probenwerkstoffe getroffen werden (Schritt 1). Dieser

Arbeitsschritt zur Probenaufbereitung ist bereits in Kap. 3 beschrieben. Es folgt,

ebenfalls für beide Verfahren analog, das Aufbringen der Zellen auf die Pro-

benoberfläche (Schritt 2). Dies geschieht mit Hilfe der Suspensionsmethode,

Abb. 76.


Abbildung 76: Suspensionsmethode zum Aufbringen der Zellen auf die Probenoberfläche

Das zu prüfende Material wird in ein Well (gefäßartige Struktur) gegeben und

vollständig mit der Zellsuspension übergossen. Aufgrund der im Vergleich zur

umgebenden Flüssigkeit höheren Dichte der Zellen, sinken diese mit fortschrei-

tender Zeit auf die Probenoberfläche.

Metallische Materialien neigen in wässriger Umgebung (z.B. Nährmedium oder

Blut) zur Korrosion, wobei Ionen in das Medium abgegeben werden (81; 82).

Diese Ionen können das Wachstum und die Morphologie der Zellen beeinflus-

sen. Aufgrund dieser Tatsache ist ein separater Ansatz der nichttoxischen Refe-

renzproben in einem eigenen Well erforderlich, da sonst der Referenzwert

durch die herausgelösten Metallionen verfälscht werden könnte.

Die mit Zellen behafteten Proben werden anschließend für 72 Stunden im Brut-

schrank inkubiert15 (Schritt 3). Während dieser Zeit durchlaufen die Zellen einen

Wachstums- und Teilungsprozess, der, abhängig von der Toxizität des zugrun-

deliegenden Materials, zu unterschiedlichen Populationen führt.

Die Vorgehensweise zur Bestimmung der Zellanzahl auf den Proben unter-

scheidet sich in den nachfolgenden Arbeitsschritten zwischen den beiden Me-

thoden.

Nach Verfahren A steht nun die Überführung der Metallproben in ein neues

Well an. Dadurch ist sichergestellt, dass nur die Zellen auf der Probenoberflä-

che abgelöst werden und nicht diejenigen, welche sich neben der Probe auf

dem Kulturgefäß angeheftet haben (Schritt 4.1A).

Beim Ablösen der Zellen von der Probenoberfläche entstehen 1000µl Zellsus-

pension (Schritt 4.2A). Von dieser Lösung werden 20µl in eine Fuchs-

Rosenthal-Zählkammer pipettiert. Es folgt die Zählung aller Zellen, die sich in

einem definierten Raster der Zählkammer mit einem Volumen von 3,2µl befin-

den. Die resultierende Zellanzahl wird auf das Volumen von 1000µl hochge-

rechnet. Methode A sieht eine 10-malige Wiederholung des Pipettier- und Zähl-

15

Inkubieren: Unter inkubieren ist das heranzüchten der Zellen unter bestimmten Aussenbedin-

gungen (5% CO2-Begasung, 37°C) im Inkubator (Brutschrank) zu verstehen.


vorgangs vor. Anschließend erfolgt die Mittelwertbildung der 10 resultierenden

Zellzahlen xi mit i = 1, 2, …, 10 gemäß Gl. 27 (Schritt 4.3.A).

10

1

11000

10 3,2

i

i

xx

(Gl. 27)

Verfahren B sieht nach dem Zellwachstum im Brutschrank im Gegensatz zu

Verfahren A eine Färbung der Zellen auf der Probenoberfläche vor (Schritt

4.1B). Zum Einsatz kommt hier die May-Grünwald-Färbung, aus den in Kap.

3.2.1 genannten Gründen. Damit ist die Voraussetzung für eine automatische

optische Detektion der Zellen und Kernbereiche auf der Probe gegeben. Nach

der Färbung folgt die Aufnahme der Probenoberfläche unter dem Mikroskop

(Schritt 4.2B). Untersuchungen zur Eignung einer Stichprobe bei der Aufnahme

der Materialoberfläche sind in Kap. 9.2 erläutert. Eine Analysesoftware ermittelt

daraufhin die Zellanzahl auf der Probenoberfläche (Schritt 4.3B).

Mit beiden Verfahren ist sowohl die Zellanzahl PR der Referenzprobe als auch

die Zellanzahl PM des zu testenden Materials zu bestimmen. Mit 100M

R

PP

P

wird die Proliferationsrate der Testprobe berechnet. Abhängig von der Prolifera-

tionsrate erfolgt, analog zu (82), die Einstufung des Testmaterials in eine Zyto-

toxizitätsstufe, gemäß Tabelle 43.

Tabelle 43: Zuordnung der Zellproliferation zu den vier Stufen der Zytotoxizität

Zytotoxizitäts-skala

Proliferationrate P [%]

Interpretation

0 100 – 81 Nicht zytotoxisch

1 80 – 71 Schwach zytotoxisch

2 70 – 61 Mäßig zytotoxisch

3 60 - 0 Stark zytotoxisch

9.2 Untersuchung verschiedener Stichprobenumfänge zur

Berechnung der durchschnittlichen Zellanzahl einer Probe

Zur Bestimmung der Proliferationsrate mit Hilfe der Software ist, wie bereits in

Kap. 9.1 beschrieben, die Ermittlung der durchschnittlichen Zellanzahl auf einer

Probe Voraussetzung. Die Probenoberfläche weist eine Fläche von 3,14cm2

auf. Für eine optimale automatische Zellanalyse werden die Bilder, abhängig

vom Zelltyp, mit einer Vergrößerung von Faktor 50 oder 100 aufgenommen.

Erfolgt die Aufnahme mit einer Vergrößerung von Faktor 50, sind bereits 128

Bildaufnahmen zur Abbildung der gesamten Probe notwendig. Zur Reduzierung


des damit verbundenen Arbeitsaufwandes ist die Verwendung einer Stichprobe

denkbar, die die durchschnittliche Zellanzahl der Probe repräsentieren soll.

Es werden verschiedene Stichprobenumfänge festgelegt und jeweils die Abwei-

chung vom Referenzwert bestimmt. Unter dem Referenzwert ist hier die durch-

schnittliche Zellanzahl aller Probenausschnitte zu verstehen, die keine Proben-

randbereiche aufweisen. Nach Abzug der Bilder, auf denen der Probenrand

sichtbar ist, verbleiben von den 128 noch 96 Probenausschnitte.

Problematisch bei der Auswahl der Ausschnitte ist jedoch, dass die Zelldichte

auf der Probenoberfläche variiert (Abb. 77).

Abbildung 77: Links: L929-Zellen auf dem Material Stahl mit vergleichsweise schwacher Zell-

dichte. Rechts: Deutlich höhere Zelldichte auf derselben Probe an einer anderen Position

Daher ist es sinnvoll, die Selektion der Ausschnitte nicht zufällig, sondern mit

Hilfe eines Experten durchzuführen, wobei Probenbereiche mit einer mittleren

Zelldichte ausgewählt werden. Die vollständigen Daten zur Untersuchung der

Eignung verschiedener Stichprobenumfänge sind in Kap. 13.14 aufgeführt. Ta-

belle 44 zeigt die aus der Untersuchung resultierende maximale positive und

negative Abweichung der durchschnittlichen Zellanzahl vom Referenzwert für

unterschiedliche Stichprobenumfänge.

Tabelle 44: Verschiedene Stichprobenumfänge mit der jeweiligen Abweichung zum Referenz-

wert. Für jeden Stichprobenumfang wurden 10 Versuche durchgeführt. Zeichenerklärung: Abw.:

Die maximale positive und negative Abweichung der durchschnittlichen Zellanzahl vom Refe-

renzwert [%]

Stichprobenumfänge

zufällige Auswahl der Stichprobe

Nr. 80 Bilder 50 Bilder 30 Bilder 15 Bilder

Abw. -4,2% bis 6,0% -7,5% bis +13,5% -17,4% bis +36,4% -20,6% bis +23,5%

gezielte Auswahl der Stichprobe


Abw. -4,8% bis +4,6% -4,7% bis +2,2% -12,6% bis +6,4% -20,0% bis 9,6%


Tabelle 44 zeigt zunächst die Abweichungen der ermittelten durchschnittlichen

Zellanzahl zum Referenzwert bei zufälliger Auswahl des Bildmaterials. Für ei-

nen Stichprobenumfang von 50, der ca. die Hälfte der Gesamtmenge ohne

Probenrand entspricht, streut für 10 Versuche die Abweichung der durchschnitt-

lichen Zellanzahl der Stichprobe im Vergleich zum Referenzwert von -7,5% bis

+13,5%.

In Tabelle 43 ist für die Einstufung der Toxizität eines Materials in den Grad

„nicht zytotoxisch“ ein Intervall von 20% der Proliferationsratenänderung ange-

geben und für die Einstufung in die Klassen „schwach zytotoxisch“ sowie „mä-

ßig zytotoxisch“ noch 10%. Mit der genannten Streuung von -7,5% bis 13,5%

um den Referenzwert ist jedoch eine sichere Zuordnung in eine bestimmte Zy-

totoxizitätsstufe nicht gewährleistet. Daher ist der Einsatz einer zufälligen Stich-

probe hier ungeeignet. Der Grund liegt in der ungleichmäßigen Verteilung der

Zellen auf der Probenoberfläche (Abb. 78).

Abbildung 78: Zellanzahl für 96 verschiedene Ausschnitte einer Probe (blaue Raute). Die

durchschnittliche Zellanzahl aller Probenausschnitte beträgt 477,23 Zellen (rotes Quadrat)

Abb. 78 zeigt, dass die Zelldichte auf der Probenoberfläche variiert. Die meisten

Probenausschnitte liefern eine Population zwischen 300 – 500 Zellen. Einige

Bereiche weisen jedoch deutlich höhere (> 1000 Zellen) Populationen auf. Dies

führt zu einer hohen Standardabweichung von 352,65 Zellen. Die vergleichs-

weise hohe Zellanzahl von Probenausschnitten mit höherem Index ist darauf

zurückzuführen, dass die Zelldichte im oberen Probenbereich zunimmt (Abb.

78). Die unterschiedliche Zelldichteverteilung ist wahrscheinlich auf die Präpa-

rationstechnik zurückzuführen und nicht reproduzierbar.

0

500

1000

1500

2000

2500

0 20 40 60 80 100 120

Zella

nza

hl p

ro P

rob

en

auss

chn

itt

Bildnummer (Index) des Probenausschnittes

Zellanzahl proProbenausschnitt

Mittelwert


Abbildung 79: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei den Bildaufnahmen der voll-

ständigen Probe. Die Aufnahmen beginnen am rechten unteren und enden am linken oberen

Probenbereich

Die Aufnahmen der Probenausschnitte erfolgen mäanderförmig, beginnend am

unteren rechten Probenbereich. Die Bilder werden nummeriert, der Index läuft

von 1 bis 128.

Tabelle 44 zeigt weiterhin die Streuung der Abweichung der durchschnittlichen

Zellanzahl zum Referenzwert für verschiedene, gezielt ausgewählte Stichpro-

benumfänge. Die geringste Abweichung resultiert unter Verwendung einer

Stichprobe mit 15 Bildern. Für 10 Durchläufe ergibt sich eine Abweichung von

-4,7% bis +2,2% vom Referenzwert. Für einen Stichprobenumfang von 20 Bil-

dern findet keine Reduzierung der Abweichung mehr statt. Im Gegenteil, die

Abweichung zum Referenzwert erhöht sich mit -4,8% bis +4,6% leicht. Dies

lässt darauf schließen, dass sich die Abweichung zum Referenzwert bei geziel-

ter Auswahl der Bildausschnitte, trotz Einsatz eines größeren Stichprobenum-

fanges, im Durchschnitt nicht weiter verringern lässt.

Für die Biokompatibilitätsanalyse von Implantatmaterialien ist es notwendig, ein

zu prüfendes Material nicht bioverträglicher einzustufen als es tatsächlich der

Fall ist. Tritt dieser Fehler dennoch auf, könnte im schlimmsten Fall die Absto-

ßung des Implantates vom umliegenden Körpergewebe die Folge sein. Daher

ist es empfehlenswert, die, abhängig von der Vorgehensweise bei der Prüfung,

ermittelten Abweichungen zum Referenzwert bei der Einordnung in die Zytoto-

xizitätsstufen zu berücksichtigen. Tabelle 45 zeigt die Anpassung der unteren

Zellproliferationsgrenze für die Zytotoxizitätsstufe „nicht zytotoxisch“ unter Be-

rücksichtigung des Gesamtfehlers bei Verwendung eines Stichprobenumfanges

mit 15 Bildern sowie der Zellzählung der vollständigen Probe.

Start (Index:1)

Ende (Index: 128)


Tabelle 45: Anpassung der Zellproliferationsgrenzen für die Einordnung in die Zytotoxizitätsstu-

fe „nicht zytotoxisch“ unter Berücksichtigung der Gesamtabweichung bei Verwendung einer

Stichprobe mit 15 Bildern und bei Verwendung der vollständigen Probe für die Zellzählung

Zytotoxizitätsprüfung mit einer Stichprobe

von 15 Bildern

(99% Konfidenzintervall)

Zytotoxizitätsprüfung unter Berücksichtigung der voll-

ständigen Probe

(99% Konfidenzintervall)

Fehler bei Verwendung einer Stichprobe (Tabelle 43)

+/- 5% 0%

Fehler der computergestützten Zellzählung von L929-Zellen

1,43% +/- 0,69% 1,27% +/- 0,22%

Max. Gesamtfehler 7,12% ≈ 1,49% Erlaubte Proliferationsrate für die

Einstufung des untersuchten Materials in die Toxizitätsstufe

„nicht zytotoxisch“ gemäß Tabelle 43 unter Berücksichtigung des hier ermittelten Gesamtfehlers

100 – 88,12% 100 – 82,51%

Tabelle 45 (links) zeigt, dass unter Berücksichtigung des maximalen Gesamt-

fehlers von 7,12% für den Einsatz einer Stichprobe mit 15 Bildern bis zu einer

Proliferationsrate von 88,12% im Vergleich zur Referenzprobe eine zu 99% si-

chere Zuordnung in die Zytotoxizitätsstufe „nicht zytotoxisch“ gewährleistet ist.

Unter Verwendung der vollständigen Probe für die Zellzählung ist hingegen eine

zu 99% sichere Zuordnung in die Zytotoxizitätsstufe „nicht zytotoxisch“ mit einer

Proliferationsrate von bereits 82,51% zum Referenzwert möglich, da der max.

Gesamtfehler mit 1,49% erheblich kleiner ist als beim Einsatz der Stichprobe.

Die Bestimmung der Zellanzahl der vollständigen Probe erfordert jedoch 128

Probenausschnitte im Vergleich zu den 15 Ausschnitten der Stichprobe. Daraus

resultiert ein ca. 8,5-facher Arbeitsaufwand für die Bereitstellung des Bildmate-

rials.

9.3 Simulation unterschiedlich bioverträglicher Materialien

Die Vorgehensweise bei der Zuordnung der Zytotoxizitätsstufen mit Hilfe der

Zellanalysesoftware soll anhand der folgenden Untersuchung exemplarisch ge-

zeigt werden. Um eine kontinuierliche Abnahme der Zytotoxizität und somit un-

terschiedliche Vitalitätsstufen der L929- und MC3T3- Zellen hervorzurufen, setzt

man die Zellen einer zuvor hergestellten Verdünnungsreihe einer toxischen

Substanz (hier Formaldehyd) aus. Das Konzentrationsintervall wird für Zellen

vom Typ L929 auf 0,0 bis 0,5 µg/ml und für Zellen des Typs MC3T3 auf 0,0 bis

1,0 µg/ml in 0,1 µg/ml Schritten festgelegt. Nach 72 Stunden Versuchsdauer

färbt eine May-Grünwald-Lösung die Zellen an. Von jeder Konzentration werden


3 Ansätze hergestellt. Die Software wertet pro Formaldehyd-Konzentration 15

mit dem Mikroskop erstellte Bilder aus und ermittelt automatisch die durch-

schnittliche Anzahl der vitalen Zellen aus der Stichprobe. Als Referenz dient die

durchschnittliche Anzahl vitaler Zellen ohne zytotoxischen Einfluss. Das Ver-

hältnis der durchschnittlichen vitalen Zellen der Stichprobe im Vergleich zu den

durchschnittlichen vitalen Zellen der Referenzprobe wird in Form der Proliferati-

onsrate in Tabelle 36 dargestellt. Da hier lediglich die Tendenz der Proliferati-

onsratenänderung bei zunehmender Toxizität überprüft wird, ist eine exakte

Bestimmung der Proliferationsrate nicht entscheidend. Eine Abweichung von -

4,7% bis 2,2% (Tabelle 44) von der realen durchschnittlichen Zellanzahl einer

Probe ist hier vertretbar, da sich dadurch die Entwicklung der Proliferationsrate

bei steigender Toxizität nicht ändert.

Tabelle 46: Formaldehyd-Verdünnungsreihe mit einer Konzentration von 0,0 µg/ml bis 0,5 µg/ml

in 0,1 µg/ml Schritten für die Linie L929 und bis 1,0 µg/ml für MC3T3 Zellen auf dem Material

Polystyrol. Abhängig von der Proliferationsrate erfolgt eine Interpretation des zytotoxischen

Zustandes der Zellen

Zelllinie Formaldehyd-konzentration

[µg/ml]

Proliferation [%]

Interpretation

L929 0,0 100 Nicht zytotoxisch

L929 0,1 87,2 Nicht zytotoxisch

L929 0,2 73,9 Schwach zytotoxisch

L929 0,3 63,8 Mäßig zytotoxisch

L929 0,4 54,5 Stark zytotoxisch

L929 0,5 41,7 Stark zytotoxisch

MC3T3 0,0 100 Nicht zytotoxisch

MC3T3 0,1 84,2 Nicht zytotoxisch

MC3T3 0,2 71,8 Schwach zytotoxisch

MC3T3 0,3 68,1 Mäßig zytotoxisch



MC3T3 0,6 56,5 Stark zytotoxisch





Tabelle 46 zeigt, dass mit zunehmender Formaldehyd-Konzentration die Prolife-

rationsrate für beide Zelltypen (L929 und MC3T3) sinkt, da sich die toxische

Wirkung negativ auf das Wachstumsverhalten auswirkt. Die Proliferationsrate

sinkt bis zur Formaldehyd-Konzentration von 0,2 µg/ml für beide Zelllinien ähn-

lich stark. Bei höheren Konzentrationen verringert sich die Proliferationsrate für


den Typ L929 stärker im Vergleich zur Linie MC3T3. Während bei der Linie

L929 bereits bei einer Formaldehyd-Konzentration von 0,4 µg/ml eine starke

Zytotoxizität vorliegt, ist dies für den Typ MC3T3 erst bei einer Konzentration

von 0,6 µg/ml der Fall.

Für dieses Verhalten können verschiedene Zusammenhänge verantwortlich

sein. Eine mögliche Ursache kann ein im Vergleich zum Typ L929 weiter fortge-

schrittener Adhäsionsprozess der MC3T3-Zellen sein. Des Weiteren bilden Zel-

len der Linie MC3T3 im Gegensatz zu L929-Zellen im Durchschnitt größere und

kompaktere Agglomerate aus, die mit ihrer geflechtartigen komplexen Struktur

eventuell eine höhere Resistenz gegenüber toxischen Einflüssen besitzen. Ab-

hängig von der Stoffwechselaktivität einer Zelllinie ist es ebenso möglich, dass

der Typ L929 schneller Reaktionen auf einen toxischen Einfluss zeigt als Zellen

vom Typ MC3T3.

Im nächsten Schritt wird nun geprüft, ob neben der Proliferationsrate auch die

morphologischen Zellmerkmale der vorliegenden Zelllinien eine Aussage über

den Biokompatibilitätsgrad zulassen. Tritt der Fall ein, dass sich die Morpholo-

gie der Zellen für die o.g. Konzentrationen sicher messbar unterscheiden lässt,

so ist eine Berücksichtigung der Zellmorphologie als Ergänzung zur Proliferati-

onsrate als Bewertungskriterium für die Biokompatibilität sinnvoll.

9.4 Qualitative Bewertung der Biokompatibilität

Eine Methode zur qualitativen Bewertung der Biokompatibilität ist die Morpholo-

gieanalyse der Zellen mit Hilfe eines Mikroskopes. Die Schwierigkeit bei dieser

Untersuchungsmethode liegt im Gegensatz zur quantitativen Betrachtung darin,

dass morphologische Merkmale, z.B. die Kompaktheit oder die mittlere Zellflä-

che, nicht ohne Hilfsmittel durch eine Laborfachkraft exakt bestimmt werden

können. Die qualitative Analyse der Zellmorphologie entspricht daher einer sub-

jektiven Einschätzung auf Basis von Erfahrungswerten der jeweiligen Labor-

fachkraft. Mit Hilfe der entwickelten Analysesoftware lassen sich verschiedene

morphologische Zelleigenschaften, z.B. die Fläche und Kompaktheit, bestim-

men und daraus eine genauere qualitative Bewertung der Biokompatibilität ab-

leiten.

Zunächst werden die morphologischen Zellmerkmale „Kompaktheit“ und

„durchschnittliche Einzelzellfläche“ auf ihre Eignung zur Bestimmung der Bio-

kompatibilität untersucht, da sich die Zellmorphologie mit abnehmender Biover-

träglichkeit nach (3) von flächigen über spindelförmigen bis hin zu kleinen ku-


gelförmigen Zellbereichen verändert. Hierfür finden die bereits in Kap. 9.3 auf-

geführten Zellaufnahmen der Formaldehyd-Verdünnungsreihe Verwendung.

Die Ergebnisse der morphologischen Zellanalyse für unterschiedliche Formal-

dehyd-Konzentrationen sind in Tabelle 47 aufgeführt.

Tabelle 47: Auswertung der morphologischen Merkmale für eine Formaldehyd-

Verdünnungsreihe mit einer Konzentration von 0,0 µg/ml bis 0,5 µg/ml in 0,1 µg/ml Schritten für

die Linie L929 und bis 1,0 µg/ml für MC3T3 Zellen auf dem Material Polystyrol. Bei den in der

Tabelle angegebenen Daten handelt sich jeweils um Durchschnittswerte aus 15 verschiedenen

Probenausschnitten; ∆K: Relative Abweichung zur Kompaktheit bei einer Formaldehydkonzent-

ration von 0,0 µg/ml

Zell-linie

Formaldehyd-konzentration

[µg/ml]

Mittlere Kompakt-

heit K

∆K [%]

Standard-abweichung

für K

Durch-schnittliche

Einzelzellfläche [µm

2]

L929 0,0 1,75 0,0 0,11 480

L929 0,1 1,72 -1,7 0,13 440

L929 0,2 1,78 1,7 0,14 470

L929 0,3 2,01 14,9 0,20 549

L929 0,4 1,72 -1,7 0,19 478

L929 0,5 1,83 4,6 0,32 561

MC3T3 0,0 2,71 0,0 0,17 713

MC3T3 0,1 2,81 3,7 0,23 736

MC3T3 0,2 2,94 8,5 0,22 699

MC3T3 0,3 2,98 10,0 0,21 683

MC3T3 0,4 3,01 11,1 0,25 667

MC3T3 0,5 3,01 11,1 0,26 681

MC3T3 0,6 2,98 10,0 0,27 695

MC3T3 0,7 3,09 14,0 0,26 696

MC3T3 0,8 3,19 17,7 0,28 698

MC3T3 0,9 3,26 20,3 0,26 689

MC3T3 1,0 3,33 22,9 0,25 681

Die in Tabelle 47 enthaltenen Daten für die Linie L929 weisen einen Korrelati-

onskoeffizient KC1 = 0,31 zwischen der Formaldehyd-Konzentration und der

durchschnittlichen Kompaktheit auf. Des Weiteren resultiert ein Korrelationsko-

effizient KA1 = 0,67 mit der durchschnittlichen Einzelzellfläche. Für den Zelltyp

MC3T3 hingegen resultiert ein Korrelationskoeffizient KC2 = 0,96 zwischen der

Formaldehyd-Konzentration und der durchschnittlichen Kompaktheit. Für die

durchschnittliche Einzelzellfläche und der Konzentration ergibt sich ein Korrela-

tionskoeffizient KA2 = -0,49.


9.5 Diskussion der Ergebnisse zur Bewertung des

Biokompatibilitätsgrades

Im Gegensatz zur personellen Bewertung der Zellmorphologie ist es mit Hilfe

eines computergestützten Systems möglich, qualitative Merkmale quantitativ

auszuwerten. Die Daten in Tabelle 47 zeigen, dass mit den Merkmalen „durch-

schnittliche Einzelzellfläche“ und „Kompaktheit“ für die Linie L929 keine sichere

Bewertung der Biokompatibilität durchführbar ist. Es besteht keine ausreichen-

de Korrelation zw. der Formaldehyd-Konzentration und den Merkmalswerten im

Rahmen des vorgegebenen Konzentrationsintervalls (0 bis 0,5µg/ml). Die

durchschnittliche Einzelzellfläche des Zelltyps MC3T3 ist, analog zur Linie

L929, aufgrund einer unzureichenden Korrelation zur Formaldehyd-

Konzentration nicht als morphologisches Merkmal zur Bewertung der Biokom-

patibilität geeignet. Im Gegensatz dazu liegt mit KC2 = 0,96 eine gute Korrelation

zwischen der Konzentration und der durchschnittlichen Kompaktheit der MC3T3

Zellen vor. Jedoch ist die Änderung der durchschnittlichen Kompaktheit von

einer Konzentrationsstufe zur nächsten Stufe gering und im Vergleich dazu die

vorliegende Standardabweichung der durchschnittlichen Merkmalswerte für ei-

ne bestimmte Konzentrationsstufe hoch (Tabelle 47). So ist eine sichere Be-

stimmung der Zytotoxizitätsstufe auf Basis des Merkmals „Kompaktheit“ für die

Linie MC3T3 nicht gewährleistet.

Aus Tabelle 47 geht weiterhin hervor, dass für die Zelltypen L929 und MC3T3

keine wesentliche Änderung der Zellfläche bei der vorliegenden Formaldehyd-

Konzentrationsreihe vorliegt. Diese Beobachtung entspricht nicht den in (3) be-

schriebenen morphologischen Änderungen der Zellen von flächig über spindel-

förmig bis hin zu kugelig bei Zunahme der Biounverträglichkeit. Der Grund liegt

darin, dass keine Korrelation zwischen der in der Literatur angegebenen Mor-

phologieänderung bei toxischem Einfluss und der in der Norm hinterlegten Ein-

stufung der Proliferationsrate in die verschiedenen Zytotoxizitätsstufen gegeben

ist. Abb. 80 stellt den Zusammenhang zwischen der Morphologieänderung und

der Änderung der Proliferationsrate bei verschiedenen Formaldehyd-

Konzentrationsstufen dar.


Abbildung 80: Morphologieänderung von L929-Zellen bei unterschiedlichen Formaldehyd-

Konzentrationen. Die unteren Strahlen besitzen einen farblichen Verlauf von grün (bioverträg-

lich) nach rot (biounverträglich). Der obere Strahl zeigt die Bioverträglichkeit für den Zelltyp

MC3T3 und der untere Strahl für den Typ L929. Die gestrichelte Linie zeigt ab welcher Formal-

dehydkonzentration eine stark zytotoxische Wirkung auf die Zellen vorliegt

Abb. 80 verdeutlicht, dass bei Verwendung von L929-Zellen eine Beurteilung

der Biokompatibilität auf Basis morphologischer Merkmale nicht sinnvoll er-

scheint, denn das für die Einstufung in verschiedene Zytotoxizitätsstufen benö-

tigte Konzentrationsintervall liegt entsprechend Tabelle 46 zwischen 0 µg/ml bis

0,4 µg/ml. Morphologische Änderungen der L929-Zellen treten hingegen erst

bei höheren Konzentrationen auf, wobei unter Berücksichtigung der dann vor-

liegenden Proliferationsrate bereits eine Einstufung in den stark zytotoxischen

Bereich vorliegt. Für MC3T3 Zellen liegt eine ähnliche Situation vor. Das benö-

tigte Formaldehyd-Konzentrationsintervall zur Einstufung der Zytotoxizität in alle

gemäß Tabelle 43 aufgeführten 4 Stufen liegt zwischen 0 µg/ml bis 0,6 µg/ml

(Tabelle 46). Analog zur Linie L929 liegen auch beim Typ MC3T3 für das ange-

gebene Konzentrationsintervall keine mit dieser computergestützten Methode

sicher messbaren Unterschiede der morphologischen Merkmale vor.

Dennoch wird die computergestützte Auswertung der morphologischen Zell-

merkmale nicht verworfen. Denkbar ist zum einen, dass andere Zelltypen we-

sentlich resistenter gegenüber toxischen Einflüssen sind und somit die Ände-

rung der Zellmorphologie ähnlich zur Änderung der Proliferationsrate erfolgt.

Zum anderen kann eine computergestützte morphologische Auswertung der

Zellen als Schnelltest eingesetzt werden. Damit lassen sich Materialien, die

sehr stark zytotoxisch auf eine bestimmte Zelllinie wirken, mit deutlich geringe-

rem Rechenaufwand bereits ausschließen.

10. Ergebnisse und Diskussion 142

10. Ergebnisse und Diskussion

Es wurde eine Analysesoftware zur Unterstützung des Experten bei der Be-

stimmung der Biokompatibilität von Medizinprodukten entwickelt. Unter dem

Einsatz dieser Software ist, abhängig davon ob eine Stichprobe oder die voll-

ständige Probe für die Zellzählung verwendet wird, mit den in Abb. 81 gezeigten

Prüfzeiten zu rechnen. Ergänzende Informationen zu den Prüfzeiten der ver-

schiedenen Vorgehensweisen zur Zellzählung sind in Kap. 13.16 aufgeführt.

Abbildung 81: Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate. Es werden 4 verschiedene

Methoden der Prüfung vorgestellt. Methode A: Manuelle Zellzählung mit Hilfe einer Fuchs-

Rosenthal-Zählkammer; Methode B: Computergestützte Zellzählung anhand einer Stichprobe

mit einem Umfang von 15 Probenausschnitten; Methode C: Computergestützte Zellzählung der

vollständigen Probe; Methode D: Computergestützte Zellzählung ebenfalls von der vollständi-

gen Probe, wobei hier die Probe im Gegensatz zu den Methoden B und C automatisch durch

ein an das Mikroskop installiertes Achssystem abgerastert wird.

Unter Zuhilfenahme der computergestützten Zellanalyse wird zunächst die Ge-

samtprüfzeit im Vergleich zur manuellen Zellzählung verlängert (Abb. 81, Ver-

fahren B und C). Der Grund liegt in dem zusätzlich benötigten Arbeitsschritt der

Zellfärbung und insbesondere der zahlreichen mikroskopischen Bildaufnahmen

als Input für die automatische Bestimmung der Proliferationsrate. Bei Verwen-

1

2

4

8

16

32

64

128

256

512

1024

2048

4096

1 5 10 25 50

Zeit

[M

inu

ten

]

Anzahl Proben

Manuelle Zellzählung(Methode A)

Automatische Zellzählung(Stichprobe mit 15 Bildern,Methode B)

Automatische Zellzählung(vollst.Zellzählung, Methode C)

Autom.Probenscan +computergestützte Zellzählung(Methode D)


dung einer Stichprobe von 15 Probenausschnitten (Abb. 81, Verfahren B) ist mit

einer Gesamtprüfzeit von 1,4h für 5 Proben zu rechnen, für die vollständige

Zellzählung von 5 Proben sogar mit 4,1h. Im Gegensatz dazu erfolgt die manu-

elle Zellzählung mittels Zählkammer (Abb. 81, Verfahren A) in 1,2h. Dabei wird

je Probe 10-mal manuell ausgezählt und schließlich der Mittelwert gebildet.

Im Rahmen dieser Arbeit stand kein ansteuerbares Achssystem für das Mikro-

skop zur Verfügung. Jedoch könnte mit Einsatz eines Achssystems zur automa-

tischen Aufnahme der Probenoberfläche die Prüfzeit deutlich reduziert werden

(Abb. 81, Verfahren D). Lässt man die für die Zellanalyse benötigte Rechenzeit

des Computers unberücksichtigt, so verringert sich die Arbeitszeit für z.B. 5

Proben von 4,1h auf ca. 1,1h und liegt damit im Bereich der benötigten Zeit im

Rahmen der manuellen Zellzählung. Bei steigender Anzahl der zu analysieren-

den Proben erhöht sich die Zeitersparnis unter Verwendung der automatischen

Zellzählung, vorausgesetzt die mikroskopischen Bildaufnahmen werden auto-

matisch aufgenommen. Für die Analyse von z.B. 50 Proben würde demnach die

benötigte Arbeitszeit von 10h bei manueller Zellzählung auf 7,4h für die compu-

tergestützte Zählung sinken.

Die Zeit zur Bestimmung der Proliferationsrate hängt stark von der Erfahrung

der Laborfachkraft ab und kann daher um mehrere Minuten variieren. Hingegen

erfolgt die computergestützte Analyse bei jedem Auswertevorgang in nahezu

gleicher Zeit. Rechenzeitunterschiede im Sekundenbereich ergeben sich ledig-

lich durch die sich ändernden Laufzeiten der Separationsalgorithmen aufgrund

der variablen Zellmorphologie.

Unabhängig davon, ob eine manuelle Zählung von Zellen in Suspension oder

auf der Probenoberfläche vorgenommen wird, muss zu Beginn der Biokompati-

bilitätsprüfung eine bestimmte Ausgangspopulation auf das zu untersuchende

Material gebracht werden. Ideal wäre, wenn für verschiedene Proben tatsäch-

lich die gleiche Ausgangspopulation bereitgestellt werden kann. Untersuchun-

gen zeigen jedoch (Kap 13.15), dass die gleiche Ausgangspopulation für ver-

schiedene Proben nicht gewährleistet werden kann. Abbildungen 82 und 83

stellen die ermittelten Daten grafisch dar.


Abbildung 82: Versuchsreihe A: Durch einen Experten ermittelte durchschnittliche Zellanzahl

von jeweils 6 Proben (A1 bis A6) des gleichen Materials mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-

Zählkammer.

Abbildung 83: Vergleich der computergestützten vollständigen Zellzählung von 3 Proben (C1

bis C3) mit einer durch einen Experten durchgeführten Referenzzählung (B1 bis B3).

Abb. 82 zeigt, dass sich die Zellanzahl der verschiedenen Proben unterschei-

det, obwohl die gleichen Arbeitsschritte und Randbedingungen gewählt wurden.

Es ist daher auszuschließen, dass der Arbeitsschritt zur Aufbringung einer be-

stimmten Zellanzahl auf die Probenoberflächen reproduzierbar genau ist. Diese

Aussage wird dadurch untermauert, dass sowohl bei der Zellzählung mittels

Zählkammer als auch bei der Zellerfassung auf mikroskopischen Bildern teil-

weise deutlich vom Mittelwert abweichende Zahlen resultieren. Die Probe A2

weist 17,4% mehr Zellen als der Mittelwert der Versuchsreihe A und die Probe

48281

60563

48938 49625 54219

47928 51592

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Zella

nza

hl

Proben-Nr.

Gesamtzellzahlen Versuchsreihe A Mittelwert aller Proben der Versuchsreihe A

83117

47504 53271

61297

81380

46702 52279

60120

0

20000

40000

60000

80000

100000

Zella

nza

hl

Proben-Nr.

Gesamtzellzahlen der Versuchsreihe B Mittelwert aller Proben der Versuchsreihe B

Gesamtzellzahlen der Versuchsreihe C Mittelwert aller Proben der Versuchsreihe C

A1 A2 A5 A4 A3 Ø A6

B1 B3 B2 C1 C2 C3 Ø Ø

A2


B1 35,6% mehr Zellen als der Mittelwert der Versuchsreihe B auf. Des Weiteren

liegen die Standardabweichungen zu den Zellzahlen der Proben A1 bis A6 in

der gleichen Größenordnung (Kap. 13.15, Tabelle 79), so dass man hier auf

einen reproduzierbaren Arbeitsablauf bei der Bestimmung der Zellanzahl

schließen kann.

Aufgrund der variierenden Zellanzahl ist die Untersuchung von nur einer Probe

zur Bestimmung des Biokompatibilitätsgrades nicht empfehlenswert. Sinnvoll ist

hingegen die Untersuchung von mehreren Proben des gleichen Materials, um

die resultierenden Ergebnisse einer statistischen Auswertung zu unterziehen

und ein sicheres Gesamtergebnis zu gewährleisten. Denkbar ist hier der Aus-

schluss von Ausreißern, z.B. mit Hilfe des Grubbs-Tests (84), und die nachfol-

gende Neuberechnung des Mittelwertes der Zellanzahl. Führt man den Grubbs-

Test für die Probenserien A, B und C durch, so stellen sich die Proben A2, B1

und C1 als Ausreißer heraus (Kap. 13.17).

Abbildung 84: Links: Durchschnittliche Zellanzahl der Versuchsreihen A-C vor Ausschluß der

Ausreißer; Rechts: Durchschnittliche Zellanzahl der Versuchsreihen A-C nach Ausschluss der

mit Hilfe des Grubbs-Tests ermittelten Ausreißer

Ohne Berücksichtigung der ermittelten Ausreißer resultiert ein neuer Mittelwert

für die Versuchsreihe A von 49798, für die Versuchsreihe B von 50388 und für

die Versuchsreihe C von 49491. Nach dem Ausschluss der Ausreißer liegen

nun für die unterschiedlichen Methoden zur Gewinnung der Zellanzahl ähnliche

Werte vor (Abb. 84).

51592

61297 60120

49798 50388 49491

0

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

Zella

nza

hl

Durchschnittliche Zellanzahl der Versuchsreihen A B C vor Ausschluss der Ausreißer

Durchschnittliche Zellanzahl der Versuchsreihen A B C nach Ausschluss der Ausreißer


Abb. 83 zeigt weiterhin die Ergebnisse der automatischen Zellzahlbestimmung

(Versuchsreihe C) für dieselben Proben, die bereits in der Versuchsreihe B oh-

ne computergestütztes System gezählt wurden. Für die Probe C1 resultiert eine

Abweichung von 2,1% zur Probe B1, für C2 eine Abweichung von 1,7% zu B2

und für C3 eine Abweichung von 1,9% zu B3. Es fällt auf, dass mit steigender

Zellanzahl auf der Probenoberfläche die Abweichung zu den jeweiligen Mess-

werten aus Versuchsreihe B zunimmt. Der Grund liegt darin, dass bei zuneh-

mender Zelldichte im Bild die Separation der zusammenhängenden Zellen er-

schwert wird und folglich nicht alle Zellen erfasst werden.

Die hier genannten Abweichungen von 1,7% bis 2,1% sind leicht höher als die

in Kap. 6.5.2 genannten 1,31% für die Linie L929. Der Grund liegt darin, dass,

im Gegensatz zu den untersuchten Bildaufnahmen mit 100-facher Vergröße-

rung in Kap. 6.5.2, hier mit einer Vergrößerung von Faktor 50 das Bildmaterial

aufgenommen wurde. Bei einer Vergrößerung von Faktor 50 sind bereits 128

Aufnahmen für die vollständige Erfassung der Probenoberfläche notwendig,

deshalb wurde hier die Vergrößerung reduziert. Eine kleinere Vergrößerung der

Zellen stellt für die automatische Zellanalyse jedoch eine größere Herausforde-

rung dar, da pro Zelle weniger Bildpixel zur Verfügung stehen. Tauscht man die

bestehende Kamera durch eine entsprechend höher auflösende Kamera aus,

würden sich auch bei einer Vergrößerung von Faktor 50 ähnliche Abweichun-

gen wie in Kap. 6.5.2 einstellen.

Für die Bestimmung der Genauigkeit der in Kap. 6 vorgestellten Separations-

verfahren sind zunächst jeweils für 100 Probenausschnitte die mittlere Abwei-

chung zur Referenz ermittelt worden. Um eine Aussage über die statistische

Sicherheit der angegebenen Abweichung zu erhalten, sind für vier verschiede-

ne Konfidenzintervalle die Toleranzen um die mittlere Abweichung berechnet

worden. Es ist zu erwarten, dass mit der jeweils angenommenen Wahrschein-

lichkeit die mittlere Abweichung für 100 Probenausschnitte im jeweils angege-

benen Toleranzbereich liegt (Tabelle 48).

Tabelle 48: Übersicht der statistischen Daten zur Genauigkeit der Zellzählung der verschiede-

nen Separationsverfahren

Ver-fahren

Zell-typ

Mittlere Abweichung

zur Referenz

[%]


[%]

Standard- fehler

[%]


Toleranz um

Abweichung [%]

Methode aus Kap 6.4 mit CBS

L929 1,27 0,87 0,09

95% 1,27 +/- 0,17

99% 1,27 +/- 0,22

99,9% 1,27 +/- 0,29

99,99% 1,27+/- 0,34


Methode aus Kap.

6.5 L929 1,31 0,96 0,10

95% 1,31 +/- 0,19

99% 1,31 +/- 0,25

99,9% 1,31 +/- 0,31

99,99% 1,31 +/- 0,37

Methode aus Kap.

6.6 L929 3,13 1,37 0,14

95% 3,13 +/- 0,27

99% 3,13 +/- 0,35

99,9% 3,13 +/- 0,45

99,99% 3,13 +/- 0,53

Methode aus Kap.

6.5 MC3T3 3,50 2,36 0,24

95% 3,50 +/- 0,46

99% 3,50 +/- 0,61

99,9% 3,50 +/- 0,78

99,99% 3,50 +/- 0,92

Für einen schnellen visuellen Vergleich der in Tabelle 47 hinterlegten Daten

dient die folgende Abb. 85.

Abbildung 85: Visualisierung der in Tabelle 48 hinterlegten statistischen Daten zur Zellzählung

der verschiedenen Separationsverfahren. Auf der x-Achse sind jeweils für die 4 im Vergleich

stehenden Verfahren die Konfidenzintervalle 95%, 99%, 99,9% und 99,99% aufgetragen. Der y-

Wert repräsentiert die Abweichung zur Referenzzählung. Die farbige Markierung innerhalb der

jeweiligen Toleranzbereiche repräsentiert den Mittelwert.

Abb. 85 visualisiert die in Tabelle 48 hinterlegten Daten. Das Bild ist in 4 Ab-

schnitte unterteilt wobei jeder Abschnitt für ein zu vergleichendes Separations-

verfahren steht (Spalte 1 in Tabelle 48). Jeder Abschnitt enthält die Intervall-

grenzen, jeweils für das 95%-, 99%-, 99,9%- und 99,99%-Konfidenzniveau. Die

graue Markierung innerhalb der Intervalle repräsentiert den Mittelwert der Ab-

weichung zur Referenz. Anhand der Grafik wird deutlich, dass die Abweichun-

gen für die Verfahren, beschrieben in Kap. 6.4 mit vorgeschalteter CBS und

Kap. 6.5 für den Zelltyp L929 die geringsten Abweichungen zur Referenz sowie

die kleinsten Konfidenzintervalle aufweisen. Die Auswahl des passenden Kon-

fidenzintervalls hängt von der Problemstellung ab und muss im Einzelfall festge-

legt werden.


Welches Konfidenzintervall ist für die vorliegende Aufgabenstellung geeignet?

Bei der vorliegenden Anwendung ist es wichtig, dass ein Implantatmaterial nicht

besser biokompatibel eingestuft wird als es tatsächlich der Fall ist. Im schlimms-

ten Fall können Abstoßungsreaktionen des Körpers die Folge sein.

Aufgrund der variierenden Startpopulation der Zellen auf dem Proben- sowie

Referenzmaterial (Abbildung 82) wird ohnehin eine Mittelwertbildung der Refe-

renz-Zellzählung und Test-Zellzählung für 10 Proben durchgeführt so dass

durch diese Vorgehensweise die Verwendung des 99%-Konfidenzintervalls für

jede Probe ausreichend erscheint.

Es ist zu erwarten, dass sich mit fortschreitender Arbeitszeit die Fehlerwahr-

scheinlichkeit einer Laborfachkraft, hervorgerufen durch Konzentrationsverlust,

erhöht. Dies führt zu Fehlern bei der Bestimmung der Zellanzahl und Proliferati-

onsrate. Darüber hinaus kann nicht garantiert werden, dass mehrere La-

borfachkräfte für denselben Probenausschnitt die gleiche morphologische Be-

wertung vornehmen. Aus diesen Fehlerquellen können unterschiedliche Bewer-

tungsergebnisse für die Biokompatibilität eines Materials resultieren. Auch mit

den vorliegenden computergestützten Verfahren ist aufgrund der Komplexität

der Zellmorphologie keine fehlerfreie automatische Zellanalyse möglich. Durch

die automatisierte und damit reproduzierbare Anwendung der Algorithmen ist

jedoch im Gegensatz zur personellen Analyse ein objektives Ergebnis gewähr-

leistet.

Ist die Laborfachkraft mit dem automatisch generierten Segmentierungs- oder

Separationsergebnis der Zellen unzufrieden, kann sie bei Bedarf interaktiv das

Ergebnis modifizieren und die Berechnung des Biokompatibilitätsgrades erneut

durchführen lassen.

Aufgrund der Ergebnisse der Untersuchungen zu quantitativen und qualitativen

Zellmerkmalen (Kap. 9) wird für die Bewertung der Biokompatibilität mit Hilfe

der Zelllinien L929 und MC3T3 ausschließlich die Änderung der Proliferations-

rate im Vergleich zu einer Referenzprobe herangezogen und auf eine automati-

sche Beurteilung der morphologischen Zellmerkmale aus den in Kap. 9.5 ge-

nannten Gründen verzichtet. Mit Hilfe der Software ist jedoch eine automatische

Morphologieanalyse von Zellen möglich. Diese Funktion steht daher z.B. für

andere Zelllinien zur Verfügung und beansprucht nur unwesentlich mehr Re-

chenzeit.


10.1 Generalisierungsleistung der Software

Generalisierungsleistung der vorgestellten Segmentierungsmethoden

Die Form, Größe und Art der Objekte ist für die Detektion mit Hilfe des in Kap.

5.2.1 vorgestellten Segmentierungsverfahrens unerheblich, lediglich der Intensi-

tätswert der Pixel ist für die Erfassung von Bedeutung. Daher handelt es sich

hier um ein Segmentierungsverfahren dass für alle Objekte einsetzbar ist, die

einen Kontrastunterschied zum Hintergrund aufweisen. Voraussetzung für eine

ordentliche Segmentierung ist eine reproduzierbare Helligkeit von Bild zu Bild,

andernfalls ist eine Anpassung der Segmentierungsschwellen erforderlich.

Die histogrammbasierte Segmentierungsmethode, beschrieben in Kap. 5.2.2,

kann zur Detektion beliebiger Objekte im Bild angewandt werden. Auf Basis des

Bildhistogramms erfolgt die Bestimmung der Schwellwerte automatisch, so

dass eine manuelle Parametereingabe entfällt. Voraussetzung für eine erfolg-

reiche Segmentierung ist ein ausreichender Kontrastunterschied zwischen Vor-

der- und Hintergrund des Bildes. Vorranging findet dieses Verfahren dann An-

wendung wenn der Hintergrundbereich eines Bildes relativ homogen erscheint.

Dies ist z.B. meist bei Durchlichtaufnahmen der Fall.

Der Histogram Backprojection Algorithmus kann ebenfalls für die Detektion be-

liebiger Objekte im Bild angewendet werden sofern sie sich farblich von dem

Hintergrund unterscheiden. Treten Objekte mit unterschiedlicher Farbgebung

auf so können mit Hilfe mehrerer Farbtemplates alle Objekte in einem Bild

segmentiert werden. Das Verfahren kommt an seine Grenzen wenn eine deutli-

che Farbvariation eines Objektes von Bild zu Bild auftritt so dass Objektfarben

teilweise nicht im Template abgebildet sind. In diesem Fall ist eine Segmentie-

rung der entsprechenden Objektbereiche nicht möglich und das Farbtemplate

muss angepasst werden.

Generalisierungsleistung der vorgestellten Separationsmethoden:

Die CBS-Methode, beschrieben in Kap. 6.1, ist anwendbar auf alle Objekte die

sich zu Objektclustern zusammengeschlossen haben bzw. optisch der Erschei-

nung eines zusammengewachsenen Bereiches entsprechen und daher mit Hilfe

von Segmentierungsverfahren als ein Objektbereich detektiert werden. Diese

Methode benötigt für die Separation der Objekte Einschnürungen in der Kontur

des Objektclusters. Dies ist bei vielen Objekttypen der Fall, z.B. Partikel oder

verschiedene Zelllinien.

Mit Hilfe der einstellbaren Kreismaskendurchmesser C1 und C2 ist der Algorith-


mus in der Lage unterschiedlich große Objektcluster zu trennen. Eine iterative

Ausführung der CBS-Methode mit variierenden Kreismaskendurchmessern er-

möglicht die Trennung von unterschiedlich großen Objekten innerhalb eines

Bildes. Die CBS-Methode findet keine Anwendung für Objekttypen, dessen

Cluster keine Einschnürungen an den Objektkontaktstellen aufweisen, z.B. für

den Fall des Zelltyps MC3T3.

Das Separationsverfahren, beschrieben in Kap. 6.4, ist für alle Zelltypen an-

wendbar, die Einschnürungen an den Zellkontaktstellen aufweisen und deren

Kernbereiche so angefärbt sind, dass sie einen Kontrastunterschied zur Umge-

bung aufweisen. Dies ist z.B. für Zellen der Typen L929, L132 und HEp-2 der

Fall. Der Algorithmus ist hingegen nicht anwendbar auf Zellen die meistens

kompakte Cluster ohne Einschnürungen an den Zellkontaktstellen aufweisen,

z.B. beim Typ MC3T3.

Die Wachstumssimulation, beschrieben in Kap. 6.5, ist für die Separation aller

Objekte geeignet, die ein Objektmerkmal aufweisen das mit der Fläche des ge-

samten Objektes korreliert. Für diese Methode ist es, im Gegensatz zum CBS-

Verfahren oder dem Algorithmus aus Kap. 6.4, unerheblich ob die Objektcluster

Einschnürungen an den Kontaktstellen aufweisen oder nicht. Ein geeignetes

Objektmerkmal im Bereich der Zellanalyse ist die Kernfläche. Eine Korrelation

der Kernflächen zur gesamten Zellfläche wurde für die Zelltypen L929, MC3T3,

L132 und BHK-21 nachgewiesen. Es ist davon auszugehen, dass weitere Zell-

typen eine Korrelation zwischen Kern- und Zellfläche aufweisen, so dass das

Verfahren für viele weitere Zelltypen einsetzbar ist. Voraussetzung für eine er-

folgreiche Separation von zusammenhängenden Zellen ist die Detektion der

Kernbereiche, auf deren Basis die Konturen der Zellen innerhalb eines Clusters

berechnet werden. Dieses Verfahren ist ungeeignet für Objekte deren Objekt-

merkmal in keinem Zusammenhang mit der Objektgröße steht.

Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelte Software lässt sich auch für andere

Färbemethoden und Anwendungen einsetzen. So kann neben der histologi-

schen May-Grünwald- oder der kristallviolett- ebenso eine Fluoreszenzfärbung

zur nachfolgenden Zellanalyse zum Einsatz kommen (Abb. 87 und Abb. 88).


Abbildung 86: Links: Segmentierungsergebnis von kristallviolett gefärbten MC3T3-Zellen;

Rechts: Segmentierungsergebnis von May-Grünwald gefärbten MC3T3-Zellen

Abbildung 87: Links: Segmentierungsergebnis von zweifach fluoreszenzgefärbten MC3T3 Zel-

len. Die Zellkerne sind mit dem Fluoreszenzfarbstoff DAPI und der restliche Zellbereich mit dem

Fluoreszenzfarbstoff Phalloidin angefärbt. Rechts: Segmentierungsergebnis von DAPI-

fluoreszenzgefärbten Kernbereichen humaner Hautzellen

Abb. 88 (Rechts) zeigt, dass aneinandergrenzende Kernbereiche korrekt ge-

trennt werden. So ist eine Analyse der Kernfläche sowie die Bestimmung der

Zellanzahl auf Basis der ermittelten Kernbereiche möglich.

Bei Verwendung der Analysesoftware gibt es keine Restriktionen bezüglich der

verwendeten Färbung, da das Segmentierungsverfahren, beschrieben in Kap.

5.2.3, mit Hilfe passender Farbtemplates auf verschieden gefärbte Zellbereiche

eingestellt werden kann. Bei der Färbemethode sollte für eine optimale Separa-

tion zusammengewachsener Zellen jedoch berücksichtigt werden, dass der

Zellkernbereich zum Rest der Zelle einen ausreichenden Kontrast aufweist. Ist

dies nicht der Fall, kann auch mit Hilfe des in Kap. 6.6 beschriebenen Trennver-

fahrens eine Zellseparation erfolgen. Dieses liefert jedoch ungenauere Ergeb-

nisse im Vergleich zu den anderen Separationsverfahren (Kap. 6.4 – Kap. 6.5).

Neben anderen Färbeverfahren ist die Software auch auf andere Zelllinien an-

wendbar. Mit den Separationsverfahren (Kap. 6.4 bis 6.6) ist eine Flächenre-

konstruktion zusammengewachsener Zellen sowohl bei Zelltypen mit Einschnü-


rungen an den Zellkontaktstellen als auch bei Typen mit kompakten Clustern

möglich.

Abbildung 88: Links: Segmentierung von BHK-21 Zellen; Rechts: Segmentierung von L132

Zellen. Zellflächen weisen eine blaue und Kernbereiche eine grüne Kontur auf

Abb. 89 zeigt das Segmentierungsergebnis mit anschließender Separation zu-

sammengewachsener Zellen für die Typen BHK-21 und L132. Auf der linken

Bildhälfte sind Zellen vom Typ BHK-21 abgebildet. Die morphologische Form

weist Ähnlichkeiten zum Typ MC3T3 auf, wobei die BHK-21 Zellen vergleichs-

weise weniger kompakte Agglomerate bilden. Im Gegensatz dazu neigen Zellen

des Typs L132 (Abb. 89 Rechts) zur Bildung kleiner kompakter Cluster. In bei-

den Fällen ist trotz unterschiedlicher Morphologie und Clusterbildung eine au-

tomatische Detektion mit dem in Kap. 5.2.1 vorgestellten Segmentierungsver-

fahren und dem Separationsverfahren (Kap. 6.5) möglich.

Des Weiteren können mit Hilfe dieser Software Zellen in Suspension analysiert

werden. Im Unterschied zu den hier untersuchten L929 und MC3T3 Zellen, die

auf einem Substrat aufgebracht wurden und eine große morphologische Varia-

tion aufzeigen, weisen Zellen in Suspension eine meist elliptische Form auf, die

die Segmentierung und Vereinzelung zusammengewachsener Zellen ver-

gleichsweise vereinfacht (Abb. 90).


Abbildung 89: Segmentierung von in Suspension befindlichen L929 Zellen. Die Suspension

befindet sich in einer Zählkammer, daher ist das Raster im Bild sichtbar.

Abb. 90 zeigt die Segmentierung von in Suspension befindlichen Zellen. Zu-

sammenhängende Zellen werden mit Hilfe des in Kap. 6.5 beschriebenen Se-

parationsverfahrens erfolgreich getrennt, so dass eine korrekte Zellzahlbestim-

mung auch in Suspension möglich ist.

Die Software lässt sich neben der Analyse von Zellen auch auf völlig andere

Aufgabenstellungen anwenden, z.B. zur Vermessung verschiedener Objekte.

Dies ist möglich, da die verwendeten Segmentierungsverfahren (Kap. 5.2) un-

abhängig von der Morphologie auf verschiedene Objekte angewendet und mit

Hilfe einer Kalibrierfunktion Pixel in das Längenmaß Meter umgerechnet wer-

den können. Für eine Kalibrierung wird ein Objekt benötigt, von dem das Maß in

der Basiseinheit Meter bekannt ist, z.B. ein Endmaß oder eine Schieblehre

(Abb. 91). Ist das System kalibriert, kann der Abstand zwischen zwei Punkten

durch interaktives Einzeichnen einer Geraden in das Bildfenster bestimmt wer-

den, unabhängig von der Art der vorliegenden Objekte.


Abbildung 90: Links: Kalibrierung der Software mit Hilfe eines Referenzobjektes, hier der bei

10mm eingestellte Messschieber. Rechts: Vermessung eines 30mm Endmaßes

Abb. 91 (Links) zeigt die Kalibrierung der Software mit Hilfe einer auf 10mm

eingestellten Schieblehre. Dazu wird interaktiv eine Gerade in das Bildfenster

gezeichnet, wobei der Startpunkt z.B. an der linken vorderen Kante des Mess-

schnabels gewählt und der Endpunkt an der rechten vorderen Kante des Mess-

schnabels gesetzt wird. Nach Eingabe des Abstandes in der Basiseinheit Meter

(hier 0,01m) ist das System nun in der Lage den Umrechnungsfaktor von Pixel

nach Meter zu bestimmen. Abb. 91 (Rechts) zeigt die interaktive Vermessung

eines 30mm Endmaßes nach erfolgter Kalibrierung.

Ein weiteres Anwendungsgebiet für den Einsatz dieser Software ist die optische

Qualitätskontrolle von Bauteilen auf Defekte wie z.B. Kratzer oder Luftein-

schlüsse bei lackierten Oberflächen. Da viele Oberflächen von beispielsweise

lackierten Kunststoffteilen eine relativ homogene Färbung aufweisen, fallen De-

fekte meist durch einen farblichen Unterschied zur lokalen Umgebung auf. Mit

Hilfe eines Templates, das die Farben der zu suchenden Defekte enthält, kön-

nen mit dem Segmentierungsverfahren (Kap. 5.2.3) gezielt Fehlstellen auf der

Materialoberfläche detektiert und ausgewertet werden (Fläche, Form, …).

11. Zusammenfassung und Ausblick 155

11. Zusammenfassung und Ausblick

Gegenstand der vorliegenden Arbeit ist die Entwicklung einer vielseitig einsetz-

baren Zellanalysesoftware für die Biokompatibilitätsprüfung von Medizinproduk-

ten. Zurzeit besteht großer Bedarf an automatisierten Zellanalysesystemen für

die Biokompatibilitätsprüfung, da die Prüfungen manuell und somit sehr kosten-

intensiv und fehleranfällig durchgeführt werden. Zwar lässt sich das Experten-

wissen einer erfahrenen Fachkraft nicht durch ein computergestütztes Verfah-

ren ersetzen, jedoch verringert der Einsatz einer Analysesoftware die Prüfzei-

ten, spart Kosten ein und führt zu einer reproduzierbaren, objektiven Bewertung

des Bildmaterials. Um das Expertenwissen einer erfahrenen Fachkraft einflie-

ßen zu lassen, ist die Software so konzipiert, dass bei Bedarf Änderungen an

der Analyse vorgenommen werden können. Derzeit existieren bereits verschie-

dene Zellanalyseverfahren, jedoch sind sie meistens für spezielle Anwendungs-

fälle konzipiert und somit nicht flexibel einsetzbar. Die in dieser Arbeit entwickel-

te Software verfügt über eine hohe Generalisierungsleistung. Sie kann für die

Analyse unterschiedlicher Zelllinien Verwendung finden und lässt sich neben

der Zellanalyse auch auf andere Problemstellungen erweitern, bei denen eine

Teilchenanalyse im Vordergrund steht. Eine besondere Herausforderung stellt

die starke morphologische Variation der untersuchten Zellen dar. Aus diesem

Grund wird die Separation agglomerierter Zellen erschwert. Eine weitere Prob-

lematik stellt die verwendete Färbemethode dar. Diese Anwendung wählt eine

zytochemische Färbung, da sich so mit nur einem Färbeprozess im Gegensatz

zu einer Fluoreszenzfärbung mehrere Zellmerkmale visualisieren lassen. Zu-

dem ist eine zytochemische Färbung kostengünstiger und einfacher umsetzbar.

Diesen Vorteilen stehen die Nachteile gegenüber, dass der Bildkontrast deutlich

geringer ausfällt und Farbvariationen der Zellbereiche auftreten.

Zu Beginn der Biokompatibilitätsprüfung muss das Probenmaterial für das an-

schließende Aufbringen der Zellen durch mehrere Prozessschritte vorbereitet

werden. Nachdem die Zellen einen festgelegten Zeitraum in Kontakt mit dem

Material verbracht haben, folgt die zytochemische Anfärbung und anschließend

die Analyse unter dem Mikroskop. Das vorgestellte computergestützte Verfah-

ren unterstützt diese Analyse. Die Software eliminiert zuerst Bildartefakte wie

z.B. Korrosionserscheinungen des Materials. Je nach verwendeter Zelllinie

kommen unterschiedliche Mikroskopkontraste zum Einsatz, für die jeweils taug-

liche Zellsegmentierungsverfahren ausgewählt werden. Unter den entstehen-

den getrennten Zellbereichen befinden sich oft auch agglomerierte Zellen, die

eine Separation erforderlich machen. Sind die Kerne der Zellen sichtbar, wird


ihre Detektion mit dem Histogram-Backprojection-Algorithmus durchgeführt. Die

darauf folgende Separation der agglomerierten Zellen findet mit Hilfe von zwei

verschiedenen Verfahren statt. Das erste, im Rahmen dieser Arbeit entwickelte

Verfahren, eignet sich bei Zelllinien mit kompakten zusammenhängen Zellclus-

tern (z.B. MC3T3) und separiert die Zellen durch eine Wachstumssimulation,

ausgehend von den detektierten Kernbereichen. Das zweite Verfahren, dass

verschiedene aus der Literatur bekannte Verfahren kombiniert, nutzt die Tatsa-

che, dass manche Zelllinien (z.B. L929) bei agglomerierten Zellen Verengungen

an den Zellkontaktstellen bilden, die über die Berechnung der dominanten Kon-

turpunkte ermittelt werden. Der A*-Algorithmus berechnet anschließend die kür-

zesten Pfade zwischen den Schwerpunkten der Zellkerne. Unter Berücksichti-

gung verschiedener Regeln, die eine aus biologischer Sicht korrekte Trennung

gewährleisten, werden aus den Pfadpunkten außerhalb der Kernbereiche und

den dominanten Konturpunkten die Trennlinien der Zellen generiert. Eine Vor-

schaltung der, ebenfalls im Rahmen dieser Arbeit entwickelten, kontextbasier-

ten Trennfunktion (CBS) vor das zuletzt genannte Separationsverfahren führt zu

einer Verbesserung der Analysegenauigkeit und zur Reduktion der Rechenzeit.

Die Einstellung der CBS-Parameter kann mit Hilfe eines genetischen Algorith-

mus automatisch vorgenommen werden. Für die anderen beiden Separations-

verfahren ist jeweils nur ein Parameter einzustellen, daher wurde auf eine au-

tomatische Parameterfestlegung verzichtet.

Sind keine Zellkerne im Bild sichtbar, so steht für die Zellseparation in Clustern

ein weiteres aus der Literatur bekanntes Verfahren zur Verfügung. Es eignet

sich ausschließlich für Zelllinien mit Verengungen an den Zellkontaktstellen.

Nach der Zellseparation folgt die Prüfung der durch den Rand teilweise abge-

schnittenen Zellen dahingehend, ob sie für die Auswertung übernommen oder

verworfen werden. Zur Bewertung des Biokompatibilitätsgrades wurden ver-

schiedene Zellmerkmale auf ihre Tauglichkeit hin untersucht. Mit Hilfe der Soft-

ware lassen sich die durchschnittliche Kompaktheit, Zelldichte, Proliferationsra-

te sowie die durchschnittliche Einzelzellfläche berechnen.

Die Software erstellt zu Beginn von einem als 100% biokompatibel angenom-

menen Material Referenzdaten. Diese umfassen die Werte zu den bereits ge-

nannten Zellmerkmalen. Die Daten aus den Biokompatibilitätsprüfungen der zu

untersuchenden Materialien werden anschließend mit den zuvor erstellten Re-

ferenzdaten verglichen und daraus Kennzahlen für den Grad der Biokompatibili-

tät abgeleitet.

Für die Bestimmung der Analysegenauigkeit des computergestützten Verfah-

rens wurden die vorliegenden Zellzahlen von Experten ermittelt und mit den


Ergebnissen aus der automatischen Zellzählung verglichen. Es stellte sich her-

aus, dass die automatische Zellzählung der Linie L929 bei Verwendung eines

Stichprobenumfanges von 100 Probenausschnitten zu 1,27% +/- 0,22% unter

Verwendung eines Konfidenzintervalls von 99% von der Referenzzählung ab-

weicht. Die automatische Zählung von MC3T3 Zellen weicht bei einem Umfang

von 100 Probenausschnitten zu 3,5% +/- 0,61% unter Verwendung eines Kon-

fidenzintervalls von 99% von der Referenzzählung ab. Die Zellmorphologie be-

treffenden Merkmale lassen sich auf diese Weise nicht verifizieren, da eine

Quantifizierung durch einen Experten ohne zusätzliche Hilfsmittel nicht möglich

ist. Die Untersuchungen verschiedener Zellmerkmale für die Bestimmung der

Biokompatibilität zeigen zwar, dass mit zunehmenden Toxizitätsgrad des Mate-

rials eine morphologische Änderung der Zellen eintritt, jedoch erst ab einem

stark zytotoxischen Zustand. Die Eignung der genannten Merkmale zur Beurtei-

lung der Biokompatibilität ist bei den Zelllinien L929 und MC3T3 somit nur be-

dingt gegeben, da sie ausschließlich zur Bestätigung eines stark zytotoxischen

Zustandes herangezogen werden können. Es ist jedoch nicht auszuschließen

dass andere Zelllinien stärkere morphologische Veränderungen unter toxi-

schem Einfluss zeigen und diese analysiert werden sollen. In dem Fall stellt die

Software ein geeignetes Hilfsmittel dar.

Die Arbeit ist im Rahmen des BMBF geförderten interdisziplinären Forschungs-

projektes „Computer Vision zur Biokompatibilitätsprüfung von Implantatwerk-

stoffen“ entstanden. Durch die Zusammenarbeit von Biotechnologen und Soft-

wareentwicklern konnte ein Zellanalysesystem entwickelt werden, das gezielt

auf die Bedürfnisse der Anwender bei der Arbeit mit einem Zellanalysepro-

gramm zugeschnitten ist.

Im weiteren Verlauf ist eine Auslagerung geeigneter Verfahren auf die Grafik-

karte zur Geschwindigkeitsoptimierung geplant, so dass sich ein weiterer Zeit-

gewinn für die automatische Zellzählung einstellt.

Eine Möglichkeit zur weiteren Automatisierung des Prüfverfahrens besteht da-

rin, die bisher durch einen Experten aufgenommenen Probenausschnitte auto-

matisch mit Hilfe einer Achssteuerung für das Mikroskop aufnehmen zu lassen.

Dadurch entfällt der hohe Zeitaufwand für die derzeit personengebundene Auf-

nahme der Probenausschnitte.

12. Literaturverzeichnis 158

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13. Anhang 165

13. Anhang

13.1 Untersuchung zur Farbverteilung von Korrosionserscheinungen

auf dem Material Titan*

In Abb. 92 sind 10 verschiedene Bildartefakte (rot markiert) sowie 10 unter-

schiedliche Hintergrundbereiche ohne Bildartefakte (weiß markiert) dargestellt.

Die Artefakte scheinen eine leichte Grünfärbung aufzuweisen. Das Untersu-

chungsergebnis der Farbzusammensetzung aller markierten Artefakte bestätigt

die Annahme, aufgeführt in Tabelle 49.

Abbildung 91: Zellen vom Typ L929 auf dem Substrat Titan*. Bildartefakte, hervorgerufen durch

Korrosionsprozesse, sind rot und Hintergrundbereiche ohne Artefakte weiß markiert.

13. Anhang 166

Tabelle 49: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für korrodierte Artefakte

Proben-bereich

Mittlerer Farbwert Relative Abweichung in %

Rotkanal Grünkanal Blaukanal Rot- zum Grünkanal

Blau- zum Grünkanal

1 149,8 153,5 146,1 -2,4 -4,8

2 142,3 148,4 134,2 -4,1 -9,6

3 167,3 169,2 164,1 -1,1 -3,0

4 168,4 176,2 154,5 -4,4 -12,3

5 166,1 173,1 155,5 -4,0 -10,2

6 171,7 179,1 158,9 -4,1 -11,3

7 176,2 181,9 166,5 -3,1 -8,5

8 167,4 170,8 159,6 -2,0 -6,6

9 172,3 177,9 160 -3,1 -10,1

10 176,6 182,4 169,1 -3,2 -7,3

Durchschnitt -3,2 -8,4

Abbildung 92: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für 10 verschiedene Bildar-

tefakte, hervorgerufen durch Materialkorrosion

-15,0

-10,0

-5,0

0,0

5,0

Re

lati

ve A

bw

eic

hu

ng

(%)

Relative Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für Bildartefakte hervorgerufen durch Materialkorrosion

Rotkanal zum Grünkanal Blaukanal zum Grünkanal

13. Anhang 167

Tabelle 50: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für den Hintergrundbereich

ohne korrodierte Artefakte

Proben-bereich

Mittlerer Farbwert Relative Abweichung in %

Rotkanal Grünkanal Blaukanal Rot- zum Grünkanal

Blau- zum Grünkanal

1 218,2 214,9 215,1 1,5 0,1

2 217,6 215,3 214,5 1,1 -0,4

3 215,8 212,8 212,9 1,4 0,0

4 216,3 213,5 213,2 1,3 -0,1

5 219,3 216,7 215,7 1,2 -0,5

6 214,9 211,8 211,5 1,5 -0,1

7 217,4 214,5 213,7 1,4 -0,4

8 212,1 208,7 208,2 1,6 -0,2

9 213,3 210,5 210,2 1,3 -0,1

10 210,8 207,3 207,6 1,7 0,1

Durchschnitt 1,4 -0,2

Abbildung 93: Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für 10 verschiedene Hin-

tergrundbereiche ohne Artefakte, hervorgerufen durch Materialkorrosion

-5,0

-3,0

-1,0

1,0

3,0

5,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Re

lati

ve A

bw

eic

hu

ng

(%)

Relative Abweichung des Rot- und Blaukanals zum Grünkanal für den Hintergrundbereich ohne Korrosionsartefakte

Rel. Abw. Rotkanal zum Grünkanal Rel. Abw. Blaukanal zum Grünkanal

13. Anhang 168

Abbildung 94: Summe der relativen Abweichungen des Rot- und Blaukanals vom Grünkanal für

10 verschiedene Artefakt- sowie Hintergrundbereiche

13.2 Untersuchung zur Farbzusammensetzung der verwendeten

Materialien

In diesem Kapitel werden die Untersuchungsergebnisse der Farbzusammen-

setzung des Materials Stahl*, Titan* und Polystyrol vorgestellt und auf Basis der

gewonnen Informationen Schwellwerte für die Detektion von Materialerschei-

nungen innerhalb der Zellen generiert. Dazu wurde von jedem Material eine

Aufnahme im Hellfeld-Kontrast erzeugt und der durchschnittliche Farbwert so-

wie die Standardabweichung in 5 unterschiedlichen Bildbereichen berechnet.

Tabelle 51: Farbzusammensetzung des Materials Titan* bei May-Grünwald-Färbung unter Verwendung

eines Auflichtmikroskopes im Hellfeldkontrast

ROI-Nr.

Mittelwert Rot-

Kanal

Mittelwert Grün- Kanal

Mittelwert Blau- Kanal

Standard- Abweichung Rot- Kanal

Standard- Abweichung Grün- Kanal

Standard- Abweichung Blau- Kanal

1 207,9 205,3 196,4 5,29 6,03 6,21

2 212,5 212,4 199,7 6,9 7,47 8,22

3 211,7 208,9 195,8 4,47 5,91 4,73

4 207,4 206,0 196,6 7,94 8,7 9,78

5 210,4 207,9 194,1 3,93 6,04 4,4

Durch-schnitt

210,0 208,1 196,5 5,71 6,83 6,67

-20,0

-15,0

-10,0

-5,0

0,0

5,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Re

lati

ve A

bw

eic

hu

ng

(%)

Summe der relativen Abweichungen des Rot- und Blaukanals vom Grünkanal

Summe der Abweichungen des Rot- und Blaukanals vom Grünkanal fürArtefakteSumme der Abweichungen des Rot- und Blaukanals vom Grünkanal für denBildhintergrund

13. Anhang 169

Abbildung 95: Berechnung der Farbzusammensetzung des Materials Titan* auf Basis der 5 in grün mar-

kierten Bildbereiche

Da das Material Titan* im Gegensatz zu den gefärbten Zellen deutlich heller erscheint,

werden die oberen Schwellwertgrenzen für den Rot- Grün- und Blaukanal auf SO,R =

SO,G = SO,B = 255 gesetzt. Der untere Schwellwert für den Rotkanal ergibt sich aus Ta-

belle 51, gerundet zu SU,R = , , 207,44 7,94 200.R i R iMIN MAX

x Die Schwell-

werte SU,G sowie SU,B werden analog berechnet, man erhält SU,G = 197 und SU,B = 184.

Tabelle 52: Farbzusammensetzung des Materials Stahl* bei May-Grünwald-Färbung unter Verwendung

eines Auflichtmikroskopes im Hellfeldkontrast

ROI-Nr.

Mittelwert Rot-

Kanal






1 207,2 209,3 209,6 2,52 2,94 1,84

2 209,5 213,5 212,9 2,66 3,89 2,01

3 208,3 211,6 211,8 2,25 2,56 1,73

4 205,1 207,7 208,2 2,98 4,06 2,35

5 205,3 207,7 208,5 2,83 3,82 2,25

Durch-schnitt

207,1 210,0 210,2 2,65 3,45 2,04

13. Anhang 170

Abbildung 96: Berechnung der Farbzusammensetzung des Materials Stahl* auf Basis der 5 in grün mar-

kierten Bildbereiche

Auch das Material Stahl* erscheint im Gegensatz zu den gefärbten Zellen deutlich hel-

ler, so dass die oberen Schwellwertgrenzen für den Rot- Grün- und Blaukanal auf SO,R

= SO,G = SO,B = 255 gesetzt werden. Eine analoge Berechnung zu den Schwellwerten

für das Material Stahl* findet für die Schwellwerte SU,R, SU,G sowie SU,B statt, man er-

hält SU,R = 202, SU,G = 204 und SU,B = 206.

Tabelle 53: Farbzusammensetzung des Materials Polystyrol bei May-Grünwald-Färbung unter Verwen-

dung eines Durchlichtmikroskopes im Hellfeldkontrast

ROI-Nr.

Mittelwert Rot-

Kanal






1 191,0 188,8 191,0 1,04 0,9 1,21

2 189,2 186,7 189,4 1,13 0,97 1,17

3 191,3 189,0 191,5 1,07 0,88 1,17

4 189,4 187,2 189,7 1,05 0,91 1,23

5 187,7 184,5 187,5 1,45 1,25 1,27

Durch-schnitt

189,7 187,2 189,8 1,15 0,98 1,21

13. Anhang 171

Abbildung 97: Berechnung der Farbzusammensetzung des Materials Polystyrol auf Basis der 5

in grün markierten Bildbereiche

Das Material Polystyrol erscheint ebenso wie Stahl* und Titan* im Gegensatz

zu den gefärbten Zellen heller, so dass die oberen Schwellwertgrenzen für den

Rot- Grün- und Blaukanal auf SO,R = SO,G = SO,B = 255 gesetzt werden. Im Ver-

gleich zu Stahl* und Titan* wirkt die Farbgebung des Polystyrols homogener

und es treten keine Bildartefakte wie Korrosionserscheinungen auf. Dies spie-

gelt sich in einer im Vergleich zu den anderen Substraten kleineren Stan-

dardabweichung wider. Die Schwellwerte SU,R, SU,G sowie SU,B werden analog

zu den Schwellwerten für die anderen Werkstoffe berechnet, man erhält SU,R =

186, SU,G = 183 und SU,B = 186.

13.3 Bewertung der in Kap. 5.2 vorgestellten Verfahren zur

Segmentierung von Zellen

Zur Bewertung der Segmentierungsleistung der in Kap. 5.2. vorgestellten Ver-

fahren wurden in den Mikroskopkontrasten Auflicht-Hellfeld, Auflicht-Dunkelfeld,

Durchlicht-Hellfeld und Durchlicht-Phasenkontrast von jeweils 50 Zellen des

Typs MC3T3 und L929 der Jaccard-Koeffizient berechnet. Als Referenzkontur

kommt die manuelle Segmentierung derselben 50 Zellen eines Experten zum

Einsatz. Tabelle 54 zeigt die ermittelten Daten der Linie L929 für das Material

Stahl*/Titan*, Tabelle 55 für Polystyrol. Tabelle 56 zeigt die Daten der Linie

MC3T3 ebenfalls für die Materialien Stahl*/Titan*, Tabelle 57 für Polystyrol.

13. Anhang 172

Tabelle 54: Bewertung der Segmentierungsleistung der Verfahren TF: Schwellwertverfahren,

Kap. 5.2.2; TB: Histogrammbasierte Methode, Kap. 5.2.3; HB: Histogram-Backprojection-

Algorithmus Kap. 5.2.4 für die verschiedenen Mikroskopkontraste A-HF: Auflicht-Hellfeld und A-

DF: Auflicht-Dunkelfeld. Die L929-Zellen befinden sich auf dem Substrat Stahl* und Titan*, da-

her kommt das Durchlichtmikroskop nicht zum Einsatz

Zell-Nummer

Segmentierungsverfahren (Zelllinie L929, Material Stahl*/Titan*)

TF TB HB

Mikroskopkontrast

A-HF A-DF D-HF D-PK A-HF A-DF D-HF D-PK A-HF A-DF D-HF D-PK

1 0,90 0,79 --- --- 0,92 0,78 --- --- 0,78 0,60 --- ---

2 0,89 0,78 --- --- 0,87 0,74 --- --- 0,81 0,64 --- ---

3 0.86 0,73 --- --- 0,85 0,89 --- --- 0,77 0,67 --- ---

4 0,92 0,78 --- --- 0,85 0,88 --- --- 0,83 0,72 --- ---

5 0,93 0,90 --- --- 0,90 0,52 --- --- 0,86 0,82 --- ---

6 0,89 0,89 --- --- 0,91 0,62 --- --- 0,77 0,67 --- ---

7 0,89 0,90 --- --- 0,93 0,81 --- --- 0,76 0,84 --- ---

8 0,88 0,91 --- --- 0,85 0,89 --- --- 0,66 0,80 --- ---

9 0,89 0,86 --- --- 0,75 0,85 --- --- 0,71 0,81 --- ---

10 0,88 0,92 --- --- 0,86 0,86 --- --- 0,77 0,82 --- ---

11 0,89 0,86 --- --- 0,85 0,81 --- --- 0,75 0,75 --- ---

12 0,88 0,77 --- --- 0,87 0,88 --- --- 0,84 0,60 --- ---

13 0,90 0,83 --- --- 0,86 0,77 --- --- 0,81 0,67 --- ---

14 0,89 0,76 --- --- 0,92 0,81 --- --- 0,75 0,81 --- ---

15 0,90 0,68 --- --- 0,87 0,78 --- --- 0,73 0,83 --- ---

16 0,90 0,88 --- --- 0,85 0,58 --- --- 0,78 0,76 --- ---

17 0,89 0,84 --- --- 0,86 0,70 --- --- 0,74 0,79 --- ---

18 0,85 0,84 --- --- 0,82 0,69 --- --- 0,79 0,81 --- ---

19 0,91 0,93 --- --- 0,89 0,77 --- --- 0,81 0,87 --- ---

20 0,91 0,90 --- --- 0,88 0,82 --- --- 0,71 0,87 --- ---

21 0,88 0,88 --- --- 0,89 0,80 --- --- 0,77 0,80 --- ---

22 0,90 0,90 --- --- 0.89 0,78 --- --- 0,82 0,84 --- ---

23 0,85 0,89 --- --- 0,93 0,84 --- --- 0,76 0,83 --- ---

24 0,90 0,83 --- --- 0,85 0,86 --- --- 0,86 0,89 --- ---

25 0,92 0,77 --- --- 0,89 0,82 --- --- 0,83 0,77 --- ---

26 0,90 0,84 --- --- 0,91 0,84 --- --- 0,74 0,88 --- ---

27 0,91 0,86 --- --- 0,90 0,91 --- --- 0,78 0,91 --- ---

28 0,90 0,79 --- --- 0,86 0,78 --- --- 0,74 0,80 --- ---

29 0,88 0,83 --- --- 0,86 0,78 --- --- 0,81 0,87 --- ---

30 0,86 0,86 --- --- 0,91 0,83 --- --- 0,74 0,83 --- ---

31 0,92 0,88 --- --- 0,65 0,89 --- --- 0,85 0,80 --- ---

32 0,92 0,83 --- --- 0,90 0,84 --- --- 0,80 0,71 --- ---

33 0,93 0,85 --- --- 0,88 0,81 --- --- 0,80 0,78 --- ---

34 0,90 0,87 --- --- 0,90 0,80 --- --- 0,75 0,78 --- ---

35 0,89 0,88 --- --- 0,81 0,79 --- --- 0,75 0,76 --- ---

36 0,82 0,86 --- --- 0,88 0,80 --- --- 0,84 0,73 --- ---

37 0,89 0,89 --- --- 0,81 0,79 --- --- 0,79 0,78 --- ---

38 0,92 0,86 --- --- 0,88 0,85 --- --- 0,78 0,85 --- ---

39 0,84 0,87 --- --- 0,86 0,79 --- --- 0,73 0,83 --- ---

40 0,83 0,86 --- --- 0,91 0,79 --- --- 0,72 0,77 --- ---

41 0,87 0,90 --- --- 0,87 0,83 --- --- 0,79 0,87 --- ---

42 0,86 0,87 --- --- 0,89 0,82 --- --- 0,74 0,87 --- ---

43 0,88 0,92 --- --- 0,81 0,88 --- --- 0,73 0,89 --- ---

44 0,88 0,94 --- --- 0,83 0,92 --- --- 0,79 0,81 --- ---

45 0,88 0,89 --- --- 0,87 0,84 --- --- 0,79 0,83 --- ---

46 0,88 0,87 --- --- 0,82 0,69 --- --- 0,79 0,84 --- ---

47 0,90 0,86 --- --- 0,88 0,80 --- --- 0,87 0,89 --- ---

48 0,92 0,88 --- --- 0,87 0,67 --- --- 0,82 0,82 --- ---

49 0,93 0,90 --- --- 0,84 0,77 --- --- 0,83 0,92 --- ---

50 0,92 0,85 --- --- 0,84 0,72 --- --- 0,83 0,82 --- ---

Durch-schnitt

0,89 0,85 0,86 0,80 0,78 0,80

13. Anhang 173

Tabelle 55: Zeichenerklärung siehe Tabelle 46. Die L929-Zellen befinden sich auf dem transpa-

renten Substrat Polystyrol, daher kommt das Auflichtmikroskop nicht zum Einsatz

Zell-Nummer

Segmentierungsverfahren (Zelllinie L929, Material Polystyrol)

TF TB HB

Mikroskopkontrast


1 --- --- 0,88 0,64 --- --- 0,81 0,88 --- --- 0,77 0,71

2 --- --- 0,94 0,81 --- --- 0,91 0,71 --- --- 0,89 0,66

3 --- --- 0,86 0,13 --- --- 0,87 0,91 --- --- 0,82 0,19

4 --- --- 0,83 0,63 --- --- 0,82 0,70 --- --- 0,74 0,57

5 --- --- 0,89 0,40 --- --- 0,85 0,76 --- --- 0,85 0,70

6 --- --- 0,88 0,63 --- --- 0,94 0,71 --- --- 0,92 0,51

7 --- --- 0,87 0,56 --- --- 0,87 0,68 --- --- 0,86 0,54

8 --- --- 0,92 0,58 --- --- 0,87 0,77 --- --- 0,85 0,58

9 --- --- 0,85 0,45 --- --- 0,88 0,77 --- --- 0,75 0,57

10 --- --- 0,85 0,64 --- --- 0,87 0,82 --- --- 0,80 0,48

11 --- --- 0,86 0,55 --- --- 0,87 0,78 --- --- 0,83 0,59

12 --- --- 0,84 0,68 --- --- 0,86 0,83 --- --- 0,81 0,61

13 --- --- 0,88 0,65 --- --- 0,90 0,83 --- --- 0,87 0,69

14 --- --- 0,84 0,61 --- --- 0,86 0,72 --- --- 0,86 0,53

15 --- --- 0,84 0,67 --- --- 0,86 0,76 --- --- 0,83 0,62

16 --- --- 0,88 0,68 --- --- 0,89 0,65 --- --- 0,81 0,59

17 --- --- 0,88 0,66 --- --- 0,89 0,60 --- --- 0,84 0,67

18 --- --- 0,87 0,72 --- --- 0,88 0,66 --- --- 0,78 0,61

19 --- --- 0,84 0,62 --- --- 0,85 0,81 --- --- 0,73 0,65

20 --- --- 0,86 0,68 --- --- 0,86 0,74 --- --- 0,91 0,72

21 --- --- 0,93 0,45 --- --- 0,93 0,80 --- --- 0,88 0,66

22 --- --- 0,86 0,43 --- --- 0,89 0,72 --- --- 0,78 0,66

23 --- --- 0,89 0,42 --- --- 0,89 0,73 --- --- 0,84 0,72

24 --- --- 0,88 0,59 --- --- 0,88 0,77 --- --- 0,84 0,63

25 --- --- 0,85 0,59 --- --- 0,87 0,83 --- --- 0,76 0,70

26 --- --- 0,91 0,58 --- --- 0,90 0,79 --- --- 0,84 0,58

27 --- --- 0,89 0,61 --- --- 0,87 0,68 --- --- 0,82 0,62

28 --- --- 0,89 0,65 --- --- 0,87 0,69 --- --- 0,84 0,62

29 --- --- 0,90 0,63 --- --- 0,91 0,78 --- --- 0,84 0,70

30 --- --- 0,90 0,70 --- --- 0,88 0,79 --- --- 0,85 0,78

31 --- --- 0,87 0,57 --- --- 0,88 0,74 --- --- 0,82 0,52

32 --- --- 0,86 0,60 --- --- 0,88 0,77 --- --- 0,78 0,59

33 --- --- 0,80 0,72 --- --- 0,80 0,84 --- --- 0,66 0,73

34 --- --- 0,90 0,65 --- --- 0,91 0,81 --- --- 0,83 0,68

35 --- --- 0,89 0,70 --- --- 0,89 0,80 --- --- 0,85 0,61

36 --- --- 0,86 0,71 --- --- 0,88 0,76 --- --- 0,65 0,61

37 --- --- 0,81 0,63 --- --- 0,81 0,80 --- --- 0,73 0,64

38 --- --- 0,86 0,54 --- --- 0,86 0,86 --- --- 0,73 0,55

39 --- --- 0,86 0,66 --- --- 0,87 0,72 --- --- 0,73 0,63

40 --- --- 0,83 0,51 --- --- 0,85 0,86 --- --- 0,64 0,59

41 --- --- 0,93 0,65 --- --- 0,90 0,72 --- --- 0,80 0,68

42 --- --- 0,84 0,44 --- --- 0,84 0,75 --- --- 0,76 0,72

43 --- --- 0,95 0,76 --- --- 0,93 0,71 --- --- 0,89 0,72

44 --- --- 0,75 0,52 --- --- 0,78 0,78 --- --- 0,74 0,51

45 --- --- 0,89 0,67 --- --- 0,86 0,83 --- --- 0,81 0,74

46 --- --- 0,89 0,52 --- --- 0,86 0,81 --- --- 0,69 0,66

47 --- --- 0,86 0,59 --- --- 0,89 0,87 --- --- 0,88 0,73

48 --- --- 0,83 0,57 --- --- 0,84 0,76 --- --- 0,84 0,69

49 --- --- 0,88 0,73 --- --- 0,90 0,80 --- --- 0,87 0,79

50 --- --- 0,90 0,71 --- --- 0,90 0,86 --- --- 0,78 0,79

Durch-schnitt

0,87 0,60 0,87 0,77 0,81 0,63

13. Anhang 174

Tabelle 56: Zeichenerklärung siehe Tabelle 46. Die MC3T3-Zellen befinden sich auf dem Sub-

strat Stahl* und Titan*, daher kommt das Durchlichtmikroskop nicht zum Einsatz

Zell-Nummer

Segmentierungsverfahren (Zelllinie MC3T3, Material Stahl*/Titan*)

TF TB HB

Mikroskopkontrast


1 0,75 0,95 --- --- 0,81 0,94 --- --- 0,75 0,94 --- ---

2 0,85 0,95 --- --- 0,90 0,92 --- --- 0,87 0,90 --- ---

3 0,85 0,94 --- --- 0,85 0,93 --- --- 0,84 0,94 --- ---

4 0,87 0,94 --- --- 0,94 0,94 --- --- 0,94 0,93 --- ---

5 0,91 0,88 --- --- 0,91 0,78 --- --- 0,92 0,88 --- ---

6 0,85 0,86 --- --- 0,89 0,81 --- --- 0,92 0,91 --- ---

7 0,89 0,91 --- --- 0,92 0,93 --- --- 0,92 0,94 --- ---

8 0,91 0,91 --- --- 0,91 0,92 --- --- 0,87 0,93 --- ---

9 0,82 0,92 --- --- 0,91 0,93 --- --- 0,89 0,91 --- ---

10 0,87 0,90 --- --- 0,92 0,88 --- --- 0,90 0,90 --- ---

11 0,86 0,73 --- --- 0,87 0,73 --- --- 0,86 0,71 --- ---

12 0,92 0,90 --- --- 0,92 0,87 --- --- 0,79 0,91 --- ---

13 0,86 0,92 --- --- 0,88 0,90 --- --- 0,76 0,93 --- ---

14 0,87 0,93 --- --- 0,72 0,93 --- --- 0,83 0,91 --- ---

15 0,93 0,93 --- --- 0.94 0,93 --- --- 0,91 0,94 --- ---

16 0,92 0,93 --- --- 0,92 0,90 --- --- 0,89 0,86 --- ---

17 0,85 0,93 --- --- 0,85 0,90 --- --- 0,78 0,89 --- ---

18 0,80 0,90 --- --- 0,83 0,90 --- --- 0,79 0,84 --- ---

19 0,89 0,95 --- --- 0,85 0,94 --- --- 0,75 0,89 --- ---

20 0,92 0,90 --- --- 0,91 0,86 --- --- 0,89 0,86 --- ---

21 0,84 0,87 --- --- 0,84 0,86 --- --- 0,86 0,71 --- ---

22 0,91 0,87 --- --- 0,82 0,87 --- --- 0,91 0,78 --- ---

23 0,87 0,92 --- --- 0,85 0,84 --- --- 0,85 0,83 --- ---

24 0,86 0,93 --- --- 0,88 0,91 --- --- 0,81 0,87 --- ---

25 0,95 0,93 --- --- 0,94 0,94 --- --- 0,93 0,91 --- ---

26 0,88 0,87 --- --- 0,89 0,82 --- --- 0,81 0,83 --- ---

27 0,87 0,85 --- --- 0,69 0,82 --- --- 0,85 0,82 --- ---

28 0,84 0,88 --- --- 0,81 0,81 --- --- 0,85 0,88 --- ---

29 0,75 0,89 --- --- 0,81 0,80 --- --- 0,84 0,85 --- ---

30 0,86 0,84 --- --- 0,69 0,74 --- --- 0,50 0,81 --- ---

31 0,93 0,90 --- --- 0,92 0,87 --- --- 0,91 0,87 --- ---

32 0,93 0,86 --- --- 0,93 0,80 --- --- 0,93 0,82 --- ---

33 0,92 0,88 --- --- 0,93 0,73 --- --- 0,80 0,86 --- ---

34 0,90 0,83 --- --- 0,84 0,83 --- --- 0,88 0,83 --- ---

35 0,89 0,88 --- --- 0,86 0,78 --- --- 0,86 0,52 --- ---

36 0,91 0,86 --- --- 0,91 0,76 --- --- 0,91 0,84 --- ---

37 0,94 0,88 --- --- 0,92 0,74 --- --- 0,91 0,87 --- ---

38 0,89 0,91 --- --- 0,89 0,89 --- --- 0,86 0,91 --- ---

39 0,93 0,92 --- --- 0,86 0,91 --- --- 0,89 0,88 --- ---

40 0,91 0,90 --- --- 0,85 0,85 --- --- 0,85 0,89 --- ---

41 0,86 0,92 --- --- 0,88 0,83 --- --- 0,84 0,86 --- ---

42 0,92 0,89 --- --- 0,86 0,76 --- --- 0,90 0,80 --- ---

43 0,91 0,91 --- --- 0,91 0,79 --- --- 0,91 0,86 --- ---

44 0,90 0,88 --- --- 0,91 0,79 --- --- 0,89 0,85 --- ---

45 0,89 0,86 --- --- 0,83 0,57 --- --- 0,82 0,73 --- ---

46 0,75 0,92 --- --- 0,76 0,91 --- --- 0,80 0,90 --- ---

47 0,85 0,91 --- --- 0,89 0,86 --- --- 0,83 0,92 --- ---

48 0,88 0,92 --- --- 0,77 0,92 --- --- 0,74 0,93 --- ---

49 0,76 0,90 --- --- 0,83 0,89 --- --- 0,71 0,91 --- ---

50 0,77 0,82 --- --- 0,86 0,85 --- --- 0,80 0,79 --- ---

Durch-schnitt

0,87 0,90 0,86 0,85 0,85 0,86

13. Anhang 175

Tabelle 57: Zeichenerklärung siehe Tabelle 46. Die MC3T3-Zellen befinden sich auf dem trans-

parenten Substrat Polystyrol, daher kommt das Auflichtmikroskop nicht zum Einsatz

Zell-Nummer

Segmentierungsverfahren (Zelllinie MC3T3, Material Polystyrol)

TF TB HB

Mikroskopkontrast


1 --- --- 0,82 0,59 --- --- 0,86 0,85 --- --- 0,79 0,49

2 --- --- 0,74 0,45 --- --- 0,77 0,76 --- --- 0,76 0,57

3 --- --- 0,84 0,40 --- --- 0,77 0,83 --- --- 0,81 0,67

4 --- --- 0,78 0,71 --- --- 0,70 0,74 --- --- 0,83 0,56

5 --- --- 0,81 0,31 --- --- 0,86 0,77 --- --- 0,87 0,65

6 --- --- 0,80 0,82 --- --- 0,83 0,78 --- --- 0,75 0,68

7 --- --- 0,80 0,83 --- --- 0,84 0,83 --- --- 0,82 0,60

8 --- --- 0,72 0,46 --- --- 0,66 0,79 --- --- 0,71 0,44

9 --- --- 0,80 0,29 --- --- 0,68 0,92 --- --- 0,70 0,73

10 --- --- 0,70 0,41 --- --- 0,85 0,88 --- --- 0,86 0,79

11 --- --- 0,74 0,48 --- --- 0,69 0,85 --- --- 0,72 0,63

12 --- --- 0,73 0,28 --- --- 0,83 0,9 --- --- 0,77 0,78

13 --- --- 0,79 0,70 --- --- 0,86 0,85 --- --- 0,80 0,55

14 --- --- 0,73 0,23 --- --- 0,88 0,82 --- --- 0,87 0,48

15 --- --- 0,69 0,12 --- --- 0,80 0,70 --- --- 0,89 0,38

16 --- --- 0,83 0,58 --- --- 0,89 0,79 --- --- 0,92 0,40

17 --- --- 0,81 0,67 --- --- 0,88 0,81 --- --- 0,74 0,50

18 --- --- 0,69 0,73 --- --- 0,77 0,83 --- --- 0,75 0,64

19 --- --- 0,79 0,65 --- --- 0,80 0,81 --- --- 0,76 0,54

20 --- --- 0,75 0,61 --- --- 0,86 0,85 --- --- 0,85 0,58

21 --- --- 0,78 0,47 --- --- 0,71 0,88 --- --- 0,61 0,72

22 --- --- 0,67 0,65 --- --- 0,83 0,82 --- --- 0,80 0,59

23 --- --- 0,75 0,75 --- --- 0,85 0,82 --- --- 0,79 0,62

24 --- --- 0,72 0,69 --- --- 0,84 0,80 --- --- 0,83 0,61

25 --- --- 0,85 0,24 --- --- 0,86 0,80 --- --- 0,73 0,33

26 --- --- 0,84 0;65 --- --- 0,88 0,88 --- --- 0,88 0,55

27 --- --- 0,74 0,54 --- --- 0,87 0,85 --- --- 0,85 0,67

28 --- --- 0,77 0,66 --- --- 0,93 0,86 --- --- 0,84 0,42

29 --- --- 0,79 0,71 --- --- 0,87 0,85 --- --- 0,81 0,49

30 --- --- 0,69 0,64 --- --- 0,77 0,84 --- --- 0,87 0,58

31 --- --- 0,77 0,09 --- --- 0,86 0,90 --- --- 0,84 0,64

32 --- --- 0,77 0,57 --- --- 0,79 0,84 --- --- 0,85 0,69

33 --- --- 0,80 0,77 --- --- 0,81 0,89 --- --- 0,78 0,57

34 --- --- 0,78 0,64 --- --- 0,81 0,77 --- --- 0,73 0,5

35 --- --- 0,77 0,56 --- --- 0,84 0,86 --- --- 0,79 0,7

36 --- --- 0,77 0,77 --- --- 0,86 0,85 --- --- 0,81 0,6

37 --- --- 0,64 0,56 --- --- 0,79 0,83 --- --- 0,75 0,71

38 --- --- 0,81 0,66 --- --- 0,87 0,87 --- --- 0,82 0,56

39 --- --- 0,74 0,60 --- --- 0,84 0,79 --- --- 0,82 0,47

40 --- --- 0,78 0,76 --- --- 0,85 0.91 --- --- 0,80 0,56

41 --- --- 0,76 0,52 --- --- 0,83 0,80 --- --- 0,78 0,57

42 --- --- 0,61 0,48 --- --- 0,66 0,82 --- --- 0,64 0,58

43 --- --- 0,69 0,70 --- --- 0,84 0,76 --- --- 0,73 0,47

44 --- --- 0,81 0,60 --- --- 0,86 0,71 --- --- 0,81 0,47

45 --- --- 0,66 0,17 --- --- 0,73 0,67 --- --- 0,71 0,47

46 --- --- 0,70 0,28 --- --- 0,81 0,79 --- --- 0,77 0,68

47 --- --- 0,80 0,65 --- --- 0,8 0,86 --- --- 0,64 0,61

48 --- --- 0,81 0,50 --- --- 0,82 0,84 --- --- 0,66 0,59

49 --- --- 0,85 0,24 --- --- 0,86 0,88 --- --- 0,67 0,57

50 --- --- 0,79 0,15 --- --- 0,87 0,85 --- --- 0,82 0,50

Durch-schnitt

0,76 0,53 0,82 0,82 0,78 0,58

13. Anhang 176

13.4 Untersuchung zur Klassifizierung der Zellbereiche mit Hilfe

geometrischer Merkmale

Zur Überprüfung der Eignung geometrischer Merkmale zur Klassifizierung der

segmentierten Zellbereiche in Einzelzelle oder Zellcluster wurden aus fünf un-

terschiedlichen Probenbereichen von 100 als Cluster und 100 als Einzelzelle

eingeordneten Zellbereichen die Fläche und Kompaktheit ermittelt.

Abbildung 98: Vergleich der Fläche von 100 Einzelzellen und 100 Zellcluster aus fünf unter-

schiedlichen Proben der Linie L929

Abbildung 99: Vergleich der Kompaktheit von 100 Einzelzellen und 100 Zellcluster aus fünf

unterschiedlichen Proben der Linie L929

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

20000

0 20 40 60 80 100 120

Fläc

he

(P

ixe

l)

Nummer der Einzelzelle bzw. des Clusters

Fläche von Einzelzellen im Vergleich zur Fläche der Zellcluster

Einzelzellen Cluster

0

2

4

6

8

10

12

0 20 40 60 80 100 120

Ko

mp

akth

eit

Nummer der Einzelzelle bzw. des Clusters

Kompaktheit von Einzelzellen im Vergleich zur Kompaktheit der Zellcluster


13. Anhang 177

Abbildung 100: Die Kompaktheit aufgetragen über die Zellfläche für 100 Einzelzellen (blau) und

100 Zellcluster (rot)

Abb. 99 zeigt, dass mit Hilfe des Merkmals Fläche die Einzelzellen und Cluster

nicht eindeutig voneinander trennbar sind. Die 100 untersuchten Einzelzellen

besitzen eine durchschnittliche Fläche von AE = 1954 Pixel mit einer Stan-

dardabweichung von ϭAE = 1415 Pixel. Die durchschnittliche Fläche der 100

untersuchten Cluster ist mit AC = 5226 Pixel zwar signifikant größer im Ver-

gleich zu AE, jedoch besitzen sie eine relativ große Standardabweichung mit

ϭAC = 3267.

Auch die Kompaktheit, Abb. 100, stellt sich nicht als sicheres Merkmal zur Un-

terscheidung von Einzelzellen und Cluster heraus. Die untersuchten Einzelzel-

len besitzen eine mittlere Kompaktheit von KE = 2,4 mit einer Standardabwei-

chung ϭKE =1,6. Für die Cluster resultiert ein mittlere Kompaktheit von KC = 4,3

mit einer Standardabweichung ϭKC = 2,1.

Abb. 101 zeigt, dass auch die Kombination der Merkmale Fläche sowie Kom-

paktheit keine sichere Klassifikation in Einzelzelle oder Cluster zulässt, zu viele

Zellbereiche würden falsch klassifiziert werden, da sich die blaue Punktewolke

(Merkmalstupel der Einzelzellen) und die rote Punktewolke (Merkmalstupel der

Cluster) zu stark überlappen.

13.5 Untersuchung zur Farbzusammensetzung der Kernbereiche

und der restlichen Zelle

Es wird geprüft ob sich die Farbzusammensetzung des Kernbereiches von der

Farbzusammensetzung des restlichen Zellbereiches unterscheidet. Untersucht

0

2

4

6

8

10

12

0 5000 10000 15000 20000

Ko

mp

akth

eit

Fläche

Kompaktheit und Fläche von Einzelzellen im Vergleich zur Kompaktheit und Fläche der Zellcluster


13. Anhang 178

werden jeweils 50 Zellen vom Typ L929 und MC3T3. Dabei wird jede Zellfläche

iZA und der darin enthaltene Kernbereich iKA segmentiert, mit i = 1, 2, …, 50.

Daraufhin werden die Histogrammschwerpunkte ,S RR , ,S RG und ,S RB der Histo-

gramme des Rot- Grün- und Blaukanals von den Zellflächen ohne Kernbereich

i i iR Z KA A A berechnet. Des Weiteren werden die Histogrammschwerpunkte

,S KR , ,S KG und ,S KB der Histogramme des Rot- Grün- und Blaukanals von den

Zellkernbereichen iKA berechnet.

13. Anhang 179

Tabelle 58: Histogrammschwerpunkte Rs, Gs und Bs des Rot- Grün- und Blaukanals für 50

verschiedene MC3T3 Zellen

Zellnr. Kernbereich Restlicher Zellbereich

RS,K GS,K BS,K Ø

Sättigung RS,R GS,R BS,R

Ø Sättigung

1 76 78 148 135 150 162 191 56

2 104 108 200 110 184 189 200 29

3 76 78 147 133 167 169 187 34

4 84 93 163 135 172 177 196 40

5 90 92 161 125 184 188 199 28

6 106 113 174 109 183 185 195 27

7 83 87 159 132 158 164 194 53

8 79 85 159 140 156 160 188 52

9 74 77 151 141 160 165 193 50

10 73 70 147 144 151 157 191 60

11 105 112 173 111 148 161 197 65

12 94 102 164 118 132 142 184 76

13 82 79 156 137 157 162 196 59

14 107 118 173 106 158 162 188 51

15 85 84 155 130 163 167 201 56

16 107 115 168 102 149 151 187 59

17 92 95 159 119 121 123 164 77

18 78 83 144 124 136 143 177 65

19 87 88 159 126 123 123 175 86

20 107 103 168 116 137 138 177 67

21 108 112 173 106 166 170 194 43

22 84 89 149 121 183 182 192 24

23 106 109 169 103 161 166 201 55

24 110 113 174 105 167 179 217 61

25 92 94 156 117 156 160 196 58

26 115 120 181 105 165 166 198 52

27 124 125 170 80 171 172 194 39

28 114 121 175 98 155 164 199 60

29 108 109 166 103 149 151 183 55

30 91 95 155 116 153 163 194 57

31 97 97 160 115 161 166 194 46

32 113 117 179 107 160 167 197 52

33 104 113 173 113 170 171 198 47

34 121 117 182 104 166 164 197 49

35 107 110 168 105 183 185 198 31

36 103 106 169 113 162 166 200 55

37 118 122 182 101 166 170 201 51

38 130 136 190 91 173 172 198 40

39 113 124 181 105 163 169 200 51

40 91 99 167 122 135 142 182 72

41 107 113 172 106 166 168 193 42

42 114 131 184 100 164 168 188 38

43 118 124 184 104 159 165 197 53

44 98 96 162 118 177 182 197 34

45 126 129 180 86 174 178 190 30

46 109 109 173 109 187 190 199 27

47 115 120 174 96 166 166 187 39

48 106 109 171 111 179 181 192 30

49 124 127 179 87 172 176 190 31

50 120 120 174 99 163 167 197 51

Ø 101,5 105,3 168 112,8 161,2 165,5 192,9 49,3

13. Anhang 180

Tabelle 59: Histogrammschwerpunkte Rs, Gs und Bs des Rot- Grün- und Blaukanals für 50

verschiedene L929 Zellen

Zellnr. Kernbereich Restlicher Zellbereich

RS,K GS,K BS,K Ø

Sättigung RS,R GS,R BS,R

Ø Sättigung

1 71 66 153 154 133 137 187 85

2 71 69 146 142 111 106 170 107

3 63 56 134 150 117 113 177 105

4 83 91 168 134 160 169 205 59

5 94 102 178 128 146 156 204 76

6 80 97 172 140 136 145 199 86

7 84 85 157 127 165 170 206 55

8 82 81 160 135 168 170 212 60

9 69 62 132 138 155 160 193 59

10 78 75 151 136 126 120 177 92

11 66 78 168 162 108 117 181 114

12 62 72 151 155 145 158 206 79

13 95 117 187 128 163 177 209 58

14 102 116 183 119 149 156 183 55

15 59 59 143 159 120 125 179 95

16 87 97 177 133 147 156 197 73

17 72 72 148 140 160 165 202 62

18 63 61 140 149 124 133 176 86

19 61 60 141 155 132 144 187 83

20 63 60 144 155 137 137 195 87

21 57 52 130 158 110 115 171 103

22 78 79 151 135 176 181 200 39

23 73 71 147 141 132 138 183 81

24 95 97 170 123 174 178 205 46

25 82 83 162 136 162 167 201 57

26 73 67 143 141 172 177 208 50

27 74 79 164 150 135 143 194 85

28 74 69 153 149 168 170 210 60

29 60 50 113 145 128 135 173 78

30 94 96 166 121 170 171 200 47

31 110 116 187 113 176 183 205 40

32 75 85 167 150 151 158 205 73

33 98 103 178 123 186 191 209 33

34 84 88 162 130 167 171 206 55

35 78 78 160 142 180 185 211 43

36 69 76 155 153 141 143 200 85

37 57 53 114 139 141 142 193 83

38 91 94 172 131 176 179 212 50

39 77 77 148 131 162 167 200 53

40 81 81 164 138 161 163 211 69

41 99 108 184 127 170 182 217 58

42 91 97 173 127 173 177 205 45

43 66 61 131 142 157 162 195 59

44 80 90 163 133 158 167 199 57

45 62 59 134 151 120 130 174 85

46 80 91 168 138 154 159 202 68

47 75 72 144 135 167 171 199 47

48 73 65 144 149 145 145 194 77

49 70 74 148 141 150 151 187 59

50 64 68 139 140 154 157 191 56

Ø 76,9 79,1 155,3 139,4 150,4 155,4 196,1 68,3

Die Tabellen 58 und 59 zeigen, dass sich die Histogrammschwerpunkte für die

Kernbereiche von den Histogrammschwerpunkten der restlichen Zellbereiche

13. Anhang 181

für die Linien MC3T3 und L929 signifikant unterscheiden. Die Sättigung weißt

ebenso für den Kernbereich sowie für die übrige Zellfläche unterschiedliche

Werte auf. Somit sind die untersuchten Merkmale als Inputdaten für ein KNN

zur Klassifizierung des Zellkernbereiches sowie der übrigen Zellfläche geeignet.

13.6 Untersuchung zur Zellzählung vor Anwendung der

Separationsverfahren

Tabelle 60: Vergleich der automatischen L929-Zellzählung mit dem Segmentierungsverfahren

aus Kap. 5.2.1 vor Anwendung der Separationsmethoden im Vergleich zur Referenzzählung;

AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung;

AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer Fehler (((REF Norm – AZ Norm)

/ REF Norm) * 100)

Nr AZ REF REF Norm AZ Norm ERR (%)


1 172 232 273 202,4 25,9 51 304 342 273 242,7 11,1

2 163 369 273 120,6 55,8 52 191 217 273 240,3 12,0

3 175 250 273 191,1 30,0 53 250 284 273 240,3 12,0

4 156 199 273 214,0 21,6 54 209 223 273 255,9 6,3

5 184 240 273 209,3 23,3 55 268 283 273 258,5 5,3

6 143 199 273 196,2 28,1 56 295 324 273 248,6 9,0

7 160 215 273 203,2 25,6 57 328 363 273 246,7 9,6

8 165 210 273 214,5 21,4 58 401 436 273 251,1 8,0

9 144 215 273 182,8 33,0 59 377 413 273 249,2 8,7

10 219 280 273 213,5 21,8 60 270 277 273 266,1 2,5

11 132 252 273 143,0 47,6 61 308 347 273 242,3 11,2

12 173 229 273 206,2 24,5 62 363 399 273 248,4 9,0

13 176 248 273 193,7 29,0 63 338 350 273 263,6 3,4

14 72 79 273 248,8 8,9 64 328 387 273 231,4 15,2

15 94 109 273 235,4 13,8 65 291 337 273 235,7 13,6

16 91 98 273 253,5 7,1 66 364 343 273 289,7 6,1

17 78 89 273 239,3 12,4 67 321 352 273 249,0 8,8

18 88 114 273 210,7 22,8 68 322 341 273 257,8 5,6

19 93 121 273 209,8 23,1 69 260 272 273 261,0 4,4

20 94 113 273 227,1 16,8 70 455 496 273 250,4 8,3

21 69 80 273 235,5 13,8 71 275 327 273 229,6 15,9

22 122 162 273 205,6 24,7 72 439 489 273 245,1 10,2

23 122 153 273 217,7 20,3 73 233 251 273 253,4 7,2

24 111 121 273 250,4 8,3 74 342 359 273 260,1 4,7

25 73 87 273 229,1 16,1 75 338 355 273 259,9 4,8

26 91 104 273 238,9 12,5 76 319 341 273 255,4 6,5

27 105 124 273 231,2 15,3 77 385 419 273 250,8 8,1

28 66 81 273 222,4 18,5 78 351 382 273 250,8 8,1

29 61 67 273 248,6 9,0 79 378 432 273 238,9 12,5

30 57 62 273 251,0 8,1 80 309 352 273 239,7 12,2

31 62 77 273 219,8 19,5 81 300 484 273 169,2 38,0

32 71 81 273 239,3 12,3 82 472 573 273 224,9 17,6

33 63 73 273 235,6 13,7 83 487 573 273 232,0 15,0

34 78 96 273 221,8 18,8 84 380 394 273 263,3 3,6

35 76 96 273 216,1 20,8 85 485 512 273 258,6 5,3

36 85 105 273 221,0 19,0 86 466 492 273 258,6 5,3

37 75 83 273 246,7 9,6 87 512 535 273 261,3 4,3

38 83 93 273 243,6 10,8 88 319 340 273 256,1 6,2

39 69 91 273 207,0 24,2 89 331 342 273 264,2 3,2

40 88 99 273 242,7 11,1 90 302 322 273 256,0 6,2

41 82 90 273 248,7 8,9 91 283 318 273 243,0 11,0

42 65 75 273 236,6 13,3 92 292 308 273 258,8 5,2

43 279 298 273 255,6 6,4 93 335 368 273 248,5 9,0

44 349 360 273 264,7 3,1 94 281 292 273 262,7 3,8

45 323 352 273 250,5 8,2 95 268 313 273 233,8 14,4

13. Anhang 182

46 385 417 273 252,1 7,7 96 354 411 273 235,1 13,9

47 353 378 273 254,9 6,6 97 288 350 273 224,6 17,7

48 384 420 273 249,6 8,6 98 370 419 273 241,1 11,7

49 305 337 273 247,1 9,5 99 192 238 273 220,2 19,3

50 327 396 273 225,4 17,4 100 263 284 273 252,8 7,4

Ø Fehler 13,7

Tabelle 61: Vergleich der automatischen MC3T3-Zellzählung mit dem Segmentierungsverfah-

ren aus Kap. 5.2.1 vor Anwendung der Separationsmethoden im Vergleich zur Referenzzäh-

lung; AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenz-

zählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer Fehler (((REF Norm –

AZ Norm) / REF Norm) * 100)



1 4 85 73 3,4 95,3 51 42 66 73 46,5 36,4

2 14 107 73 9,6 86,9 52 34 96 73 25,9 64,6

3 11 82 73 9,8 86,6 53 30 75 73 29,2 60,0

4 10 90 73 8,1 88,9 54 7 140 73 3,7 95,0

5 15 65 73 16,8 76,9 55 45 63 73 52,1 28,6

6 28 90 73 22,7 68,9 56 47 139 73 24,7 66,2

7 5 95 73 3,8 94,7 57 23 69 73 24,3 66,7

8 14 104 73 9,8 86,5 58 31 171 73 13,2 81,9

9 11 99 73 8,1 88,9 59 43 56 73 56,1 23,2

10 16 67 73 17,4 76,1 60 11 51 73 15,7 78,4

11 9 96 73 6,8 90,6 61 10 32 73 22,8 68,8

12 9 82 73 8,0 89,0 62 21 22 73 69,7 4,5

13 7 86 73 5,9 91,9 63 15 59 73 18,6 74,6

14 9 84 73 7,8 89,3 64 18 39 73 33,7 53,8

15 17 82 73 15,1 79,3 65 19 50 73 27,7 62,0

16 10 63 73 11,6 84,1 66 19 24 73 57,8 20,8

17 20 78 73 18,7 74,4 67 15 21 73 52,1 28,6

18 6 92 73 4,8 93,5 68 16 32 73 36,5 50,0

19 9 70 73 9,4 87,1 69 16 32 73 36,5 50,0

20 19 82 73 16,9 76,8 70 15 35 73 31,3 57,1

21 18 48 73 27,4 62,5 71 11 36 73 22,3 69,4

22 21 42 73 36,5 50,0 72 17 33 73 37,6 48,5

23 26 48 73 39,5 45,8 73 16 28 73 41,7 42,9

24 18 45 73 29,2 60,0 74 24 31 73 56,5 22,6

25 19 50 73 27,7 62,0 75 21 42 73 36,5 50,0

26 25 55 73 33,2 54,5 76 17 56 73 22,2 69,6

27 20 41 73 35,6 51,2 77 17 31 73 40,0 45,2

28 12 84 73 10,4 85,7 78 13 67 73 14,2 80,6

29 11 41 73 19,6 73,2 79 14 68 73 15,0 79,4

30 15 63 73 17,4 76,2 80 15 72 73 15,2 79,2

31 12 96 73 9,1 87,5 81 24 69 73 25,4 65,2

32 15 73 73 15,0 79,5 82 24 69 73 25,4 65,2

33 30 58 73 37,8 48,3 83 42 69 73 44,4 39,1

34 32 71 73 32,9 54,9 84 49 69 73 51,8 29,0

35 26 62 73 30,6 58,1 85 15 126 73 8,7 88,1

36 43 84 73 37,4 48,8 86 40 126 73 23,2 68,3

37 29 62 73 34,1 53,2 87 77 126 73 44,6 38,9

38 24 65 73 27,0 63,1 88 77 196 73 28,7 60,7

39 11 129 73 6,2 91,5 89 32 52 73 44,9 38,5

40 11 129 73 6,2 91,5 90 33 40 73 60,2 17,5

41 11 129 73 6,2 91,5 91 26 41 73 46,3 36,6

42 49 38 73 94,1 28,9 92 26 51 73 37,2 49,0

43 6 95 73 4,6 93,7 93 29 41 73 51,6 29,3

44 58 114 73 37,1 49,1 94 31 43 73 52,6 27,9

45 41 65 73 46,0 36,9 95 28 44 73 46,5 36,4

46 29 179 73 11,8 83,8 96 19 32 73 43,3 40,6

47 39 256 73 11,1 84,8 97 12 29 73 30,2 58,6

48 34 53 73 46,8 35,8 98 28 55 73 37,2 49,1

49 21 52 73 29,5 59,6 99 56 84 73 48,7 33,3

50 46 60 73 56,0 23,3 100 69 106 73 47,5 34,9

Ø Fehler 61,55

13. Anhang 183

13.7. Zellzählung mit dem Algorithmus aus Kap. 6.4 bei

vorgeschalteter CBS und ohne CBS

Tabelle 62: Vergleich der automatischen L929-Zellzählung mit dem Algorithmus aus Kap. 6.4

bei vorgeschalter CBS (1) und ohne CBS (2); AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenz-

zählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzäh-

lung; ERR: Relativer Fehler (((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100)

Nr AZ 1 AZ 2 REF REF Norm

AZ 1 Norm

AZ 2 Norm

ERR 1 [%]

ERR 2 [%]

1 231 229 232 273 271,8 269,5 0,4 1,3

2 364 360 369 273 269,3 266,3 1,4 2,4

3 246 243 250 273 268,6 265,4 1,6 2,8

4 199 194 199 273 273,0 266,1 0,0 2,5

5 239 237 240 273 271,9 269,6 0,4 1,3

6 197 194 199 273 270,3 266,1 1,0 2,5

7 215 212 215 273 273,0 269,2 0,0 1,4

8 205 199 210 273 266,5 258,7 2,4 5,2

9 215 211 215 273 273,0 267,9 0,0 1,9

10 275 274 280 273 268,1 267,2 1,8 2,1

11 256 249 252 273 277,3 269,8 1,6 1,2

12 228 222 229 273 271,8 264,7 0,4 3,1

13 245 245 248 273 269,7 269,7 1,2 1,2

14 79 77 79 273 273,0 266,1 0,0 2,5

15 111 107 109 273 278,0 268,0 1,8 1,8

16 100 95 98 273 278,6 264,6 2,0 3,1

17 90 88 89 273 276,1 269,9 1,1 1,1

18 116 111 114 273 277,8 265,8 1,8 2,6

19 118 115 121 273 266,2 259,5 2,5 5,0

20 114 110 113 273 275,4 265,8 0,9 2,7

21 81 79 80 273 276,4 269,6 1,3 1,2

22 160 158 162 273 269,6 266,3 1,2 2,5

23 155 153 153 273 276,6 273,0 1,3 0,0

24 121 119 121 273 273,0 268,5 0,0 1,7

25 86 84 87 273 269,9 263,6 1,1 3,4

26 103 98 104 273 270,4 257,3 1,0 5,8

27 121 116 124 273 266,4 255,4 2,4 6,5

28 79 74 81 273 266,3 249,4 2,5 8,6

29 67 66 67 273 273,0 268,9 0,0 1,5

30 61 60 62 273 268,6 264,2 1,6 3,2

31 77 72 77 273 273,0 255,3 0,0 6,5

32 81 80 81 273 273,0 269,6 0,0 1,2

33 72 72 73 273 269,3 269,3 1,4 1,4

34 94 93 96 273 267,3 264,5 2,1 3,1

35 94 93 96 273 267,3 264,5 2,1 3,1

36 104 101 105 273 270,4 262,6 1,0 3,8

37 82 80 83 273 269,7 263,1 1,2 3,6

38 93 86 93 273 273,0 252,5 0,0 7,5

39 91 88 91 273 273,0 264,0 0,0 3,3

40 99 94 99 273 273,0 259,2 0,0 5,1

41 91 86 90 273 276,0 260,9 1,1 4,4

42 75 71 75 273 273,0 258,4 0,0 5,3

43 297 292 298 273 272,1 267,5 0,3 2,0

44 366 364 360 273 277,6 276,0 1,7 1,1

45 348 348 352 273 269,9 269,9 1,1 1,1

46 405 401 417 273 265,1 262,5 2,9 3,8

47 375 370 378 273 270,8 267,2 0,8 2,1

48 416 409 420 273 270,4 265,9 1,0 2,6

49 330 328 337 273 267,3 265,7 2,1 2,7

50 385 377 396 273 265,4 259,9 2,8 4,8

51 352 344 342 273 281,0 274,6 2,9 0,6

52 213 212 217 273 268,0 266,7 1,8 2,3

53 286 285 284 273 274,9 274,0 0,7 0,4

54 221 221 223 273 270,6 270,6 0,9 0,9

55 290 290 283 273 279,8 279,8 2,5 2,5

56 324 323 324 273 273,0 272,2 0,0 0,3

13. Anhang 184

57 367 366 363 273 276,0 275,3 1,1 0,8

58 435 432 436 273 272,4 270,5 0,2 0,9

59 414 409 413 273 273,7 270,4 0,2 1,0

60 275 279 277 273 271,0 275,0 0,7 0,7

61 350 345 347 273 275,4 271,4 0,9 0,6

62 405 400 399 273 277,1 273,7 1,5 0,3

63 359 362 350 273 280,0 282,4 2,6 3,4

64 390 388 387 273 275,1 273,7 0,8 0,3

65 341 339 337 273 276,2 274,6 1,2 0,6

66 353 349 343 273 281,0 277,8 2,9 1,7

67 359 350 352 273 278,4 271,4 2,0 0,6

68 351 343 341 273 281,0 274,6 2,9 0,6

69 277 280 272 273 278,0 281,0 1,8 2,9

70 506 505 496 273 278,5 278,0 2,0 1,8

71 323 317 327 273 269,7 264,7 1,2 3,1

72 493 492 489 273 275,2 274,7 0,8 0,6

73 258 253 251 273 280,6 275,2 2,8 0,8

74 362 362 359 273 275,3 275,3 0,8 0,8

75 357 353 355 273 274,5 271,5 0,6 0,6

76 349 342 341 273 279,4 273,8 2,3 0,3

77 425 411 419 273 276,9 267,8 1,4 1,9

78 391 381 382 273 279,4 272,3 2,4 0,3

79 436 421 432 273 275,5 266,0 0,9 2,5

80 360 357 352 273 279,2 276,9 2,3 1,4

81 481 446 484 273 271,3 251,6 0,6 7,9

82 581 561 573 273 276,8 267,3 1,4 2,1

83 577 565 573 273 274,9 269,2 0,7 1,4

84 397 392 394 273 275,1 271,6 0,8 0,5

85 507 503 512 273 270,3 268,2 1,0 1,8

86 490 490 492 273 271,9 271,9 0,4 0,4

87 543 540 535 273 277,1 275,6 1,5 0,9

88 339 332 340 273 272,2 266,6 0,3 2,4

89 340 342 342 273 271,4 273,0 0,6 0,0

90 322 321 322 273 273,0 272,2 0,0 0,3

91 317 313 318 273 272,1 268,7 0,3 1,6

92 302 300 308 273 267,7 265,9 1,9 2,6

93 361 348 368 273 267,8 258,2 1,9 5,4

94 295 288 292 273 275,8 269,3 1,0 1,4

95 307 302 313 273 267,8 263,4 1,9 3,5

96 401 391 411 273 266,4 259,7 2,4 4,9

97 343 339 350 273 267,5 264,4 2,0 3,1

98 407 402 419 273 265,2 261,9 2,9 4,1

99 233 219 238 273 267,3 251,2 2,1 8,0

100 279 277 284 273 268,2 266,3 1,8 2,5

Ø Fehler 1,27 2,41

13.8. Vergleich der automatischen Kernzählung auf Basis eines

KNN zur Referenz

Tabelle 63: Vergleich der automatischen Kernzählung auf Basis eines KNN mit der Referenz-

zählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Refe-

renzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer Fehler (((REF

Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100)

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm

ERR (%)

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm

ERR (%)

1 198 232 273 233,0 14,7 51 287 342 273 229,1 16,1

2 330 369 273 244,1 10,6 52 178 217 273 223,9 18,0

3 211 250 273 230,4 15,6 53 256 284 273 246,1 9,9

4 176 199 273 241,4 11,6 54 193 223 273 236,3 13,5

5 214 240 273 243,4 10,8 55 251 283 273 242,1 11,3

6 179 199 273 245,6 10,1 56 293 324 273 246,9 9,6

7 198 215 273 251,4 7,9 57 310 363 273 233,1 14,6

13. Anhang 185

8 186 210 273 241,8 11,4 58 382 436 273 239,2 12,4

9 189 215 273 240,0 12,1 59 366 413 273 241,9 11,4

10 256 280 273 249,6 8,6 60 241 277 273 237,5 13,0

11 222 252 273 240,5 11,9 61 307 347 273 241,5 11,5

12 185 229 273 220,5 19,2 62 343 399 273 234,7 14,0

13 198 248 273 218,0 20,2 63 318 350 273 248,0 9,1

14 66 79 273 228,1 16,5 64 353 387 273 249,0 8,8

15 83 109 273 207,9 23,9 65 299 337 273 242,2 11,3

16 75 98 273 208,9 23,5 66 287 343 273 228,4 16,3

17 74 89 273 227,0 16,9 67 305 352 273 236,5 13,4

18 101 114 273 241,9 11,4 68 302 341 273 241,8 11,4

19 108 121 273 243,7 10,7 69 219 272 273 219,8 19,5

20 104 113 273 251,3 8,0 70 454 496 273 249,9 8,5

21 67 80 273 228,6 16,3 71 292 327 273 243,8 10,7

22 134 162 273 225,8 17,3 72 449 489 273 250,7 8,2

23 121 153 273 215,9 20,9 73 203 251 273 220,8 19,1

24 104 121 273 234,6 14,0 74 308 359 273 234,2 14,2

25 67 87 273 210,2 23,0 75 310 355 273 238,4 12,7

26 85 104 273 223,1 18,3 76 293 341 273 234,6 14,1

27 98 124 273 215,8 21,0 77 376 419 273 245,0 10,3

28 59 81 273 198,9 27,2 78 344 382 273 245,8 9,9

29 50 67 273 203,7 25,4 79 392 432 273 247,7 9,3

30 48 62 273 211,4 22,6 80 307 352 273 238,1 12,8

31 64 77 273 226,9 16,9 81 411 484 273 231,8 15,1

32 63 81 273 212,3 22,2 82 506 573 273 241,1 11,7

33 56 73 273 209,4 23,3 83 495 573 273 235,8 13,6

34 88 96 273 250,3 8,3 84 331 394 273 229,3 16,0

35 85 96 273 241,7 11,5 85 449 512 273 239,4 12,3

36 93 105 273 241,8 11,4 86 450 492 273 249,7 8,5

37 70 83 273 230,2 15,7 87 462 535 273 235,7 13,6

38 81 93 273 237,8 12,9 88 302 340 273 242,5 11,2

39 77 91 273 231,0 15,4 89 297 342 273 237,1 13,2

40 82 99 273 226,1 17,2 90 268 322 273 227,2 16,8

41 76 90 273 230,5 15,6 91 254 318 273 218,1 20,1

42 61 75 273 222,0 18,7 92 282 308 273 250,0 8,4

43 266 298 273 243,7 10,7 93 308 368 273 228,5 16,3

44 313 360 273 237,4 13,1 94 251 292 273 234,7 14,0

45 323 352 273 250,5 8,2 95 270 313 273 235,5 13,7

46 380 417 273 248,8 8,9 96 344 411 273 228,5 16,3

47 337 378 273 243,4 10,8 97 302 350 273 235,6 13,7

48 369 420 273 239,9 12,1 98 375 419 273 244,3 10,5

49 300 337 273 243,0 11,0 99 200 238 273 229,4 16,0

50 356 396 273 245,4 10,1 100 229 284 273 220,1 19,4

Ø Fehler 14,1

13.9 Vergleich der automatischen Kernzählung auf Basis des HB-

Algorithmus mit der Referenzzählung

Tabelle 64: Vergleich der automatischen L929-Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus mit

der Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Nor-

mierte Referenzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer Fehler

(((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100)

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm

ERR Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm

ERR

1 227 232 273 267,1 2,2 51 340 342 273 271,4 0,6

2 366 369 273 270,8 0,8 52 209 217 273 262,9 3,7

3 241 250 273 263,2 3,6 53 281 284 273 270,1 1,1

4 194 199 273 266,1 2,5 54 218 223 273 266,9 2,2

5 234 240 273 266,2 2,5 55 285 283 273 274,9 0,7

6 197 199 273 270,3 1,0 56 319 324 273 268,8 1,5

7 212 215 273 269,2 1,4 57 365 363 273 274,5 0,6

8 198 210 273 257,4 5,7 58 417 436 273 261,1 4,4

13. Anhang 186

9 209 215 273 265,4 2,8 59 404 413 273 267,1 2,2

10 270 280 273 263,3 3,6 60 270 277 273 266,1 2,5

11 255 252 273 276,3 1,2 61 341 347 273 268,3 1,7

12 221 229 273 263,5 3,5 62 393 399 273 268,9 1,5

13 246 248 273 270,8 0,8 63 356 350 273 277,7 1,7

14 75 79 273 259,2 5,1 64 385 387 273 271,6 0,5

15 104 109 273 260,5 4,6 65 336 337 273 272,2 0,3

16 93 98 273 259,1 5,1 66 345 343 273 274,6 0,6

17 86 89 273 263,8 3,4 67 345 352 273 267,6 2,0

18 114 114 273 273,0 0,0 68 336 341 273 269,0 1,5

19 115 121 273 259,5 5,0 69 268 272 273 269,0 1,5

20 108 113 273 260,9 4,4 70 500 496 273 275,2 0,8

21 78 80 273 266,2 2,5 71 309 327 273 258,0 5,5

22 159 162 273 267,9 1,9 72 484 489 273 270,2 1,0

23 153 153 273 273,0 0,0 73 250 251 273 271,9 0,4

24 118 121 273 266,2 2,5 74 355 359 273 270,0 1,1

25 85 87 273 266,7 2,3 75 350 355 273 269,2 1,4

26 97 104 273 254,6 6,7 76 337 341 273 269,8 1,2

27 119 124 273 262,0 4,0 77 410 419 273 267,1 2,1

28 74 81 273 249,4 8,6 78 375 382 273 268,0 1,8

29 63 67 273 256,7 6,0 79 418 432 273 264,2 3,2

30 60 62 273 264,2 3,2 80 353 352 273 273,8 0,3

31 70 77 273 248,2 9,1 81 445 484 273 251,0 8,1

32 79 81 273 266,3 2,5 82 562 573 273 267,8 1,9

33 71 73 273 265,5 2,7 83 562 573 273 267,8 1,9

34 92 96 273 261,6 4,2 84 386 394 273 267,5 2,0

35 91 96 273 258,8 5,2 85 500 512 273 266,6 2,3

36 100 105 273 260,0 4,8 86 483 492 273 268,0 1,8

37 78 83 273 256,6 6,0 87 536 535 273 273,5 0,2

38 84 93 273 246,6 9,7 88 330 340 273 265,0 2,9

39 87 91 273 261,0 4,4 89 338 342 273 269,8 1,2

40 92 99 273 253,7 7,1 90 317 322 273 268,8 1,6

41 85 90 273 257,8 5,6 91 305 318 273 261,8 4,1

42 70 75 273 254,8 6,7 92 295 308 273 261,5 4,2

43 291 298 273 266,6 2,3 93 346 368 273 256,7 6,0

44 360 360 273 273,0 0,0 94 284 292 273 265,5 2,7

45 345 352 273 267,6 2,0 95 301 313 273 262,5 3,8

46 396 417 273 259,3 5,0 96 393 411 273 261,0 4,4

47 367 378 273 265,1 2,9 97 337 350 273 262,9 3,7

48 405 420 273 263,3 3,6 98 396 419 273 258,0 5,5

49 327 337 273 264,9 3,0 99 218 238 273 250,1 8,4

50 375 396 273 258,5 5,3 100 272 284 273 261,5 4,2

Ø Fehler 3,09

Tabelle 65: Vergleich der automatischen MC3T3-Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus

mit der Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm:

Normierte Referenzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer

Fehler (((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100).

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm


AZ Norm

ERR

1 73 85 73 62,7 14,1 51 66 66 73 73,0 0,0

2 94 107 73 64,1 12,1 52 92 96 73 70,0 4,2

3 77 82 73 68,5 6,1 53 74 75 73 72,0 1,3

4 88 90 73 71,4 2,2 54 128 140 73 66,7 8,6

5 63 65 73 70,8 3,1 55 58 63 73 67,2 7,9

6 87 90 73 70,6 3,3 56 135 139 73 70,9 2,9

7 86 95 73 66,1 9,5 57 66 69 73 69,8 4,3

8 99 104 73 69,5 4,8 58 159 171 73 67,9 7,0

9 94 99 73 69,3 5,1 59 52 56 73 67,8 7,1

10 62 67 73 67,6 7,5 60 48 51 73 68,7 5,9

11 87 96 73 66,2 9,4 61 26 32 73 59,3 18,8

12 77 82 73 68,5 6,1 62 20 22 73 66,4 9,1

13 76 86 73 64,5 11,6 63 57 59 73 70,5 3,4

14 72 84 73 62,6 14,3 64 37 39 73 69,3 5,1

15 71 82 73 63,2 13,4 65 47 50 73 68,6 6,0

13. Anhang 187

16 52 63 73 60,3 17,5 66 21 24 73 63,9 12,5

17 69 78 73 64,6 11,5 67 20 21 73 69,5 4,8

18 90 92 73 71,4 2,2 68 27 32 73 61,6 15,6

19 56 70 73 58,4 20,0 69 29 32 73 66,2 9,4

20 72 82 73 64,1 12,2 70 30 35 73 62,6 14,3

21 47 48 73 71,5 2,1 71 34 36 73 68,9 5,6

22 41 42 73 71,3 2,4 72 31 33 73 68,6 6,1

23 43 48 73 65,4 10,4 73 26 28 73 67,8 7,1

24 43 45 73 69,8 4,4 74 31 31 73 73,0 0,0

25 47 50 73 68,6 6,0 75 37 42 73 64,3 11,9

26 51 55 73 67,7 7,3 76 54 56 73 70,4 3,6

27 38 41 73 67,7 7,3 77 28 31 73 65,9 9,7

28 79 84 73 68,7 6,0 78 60 67 73 65,4 10,4

29 35 41 73 62,3 14,6 79 65 68 73 69,8 4,4

30 58 63 73 67,2 7,9 80 66 72 73 66,9 8,3

31 90 96 73 68,4 6,3 81 60 69 73 63,5 13,0

32 71 73 73 71,0 2,7 82 62 69 73 65,6 10,1

33 56 58 73 70,5 3,4 83 65 69 73 68,8 5,8

34 65 71 73 66,8 8,5 84 65 69 73 68,8 5,8

35 60 62 73 70,6 3,2 85 115 126 73 66,6 8,7

36 80 84 73 69,5 4,8 86 117 126 73 67,8 7,1

37 56 62 73 65,9 9,7 87 121 126 73 70,1 4,0

38 64 65 73 71,9 1,5 88 180 196 73 67,0 8,2

39 122 129 73 69,0 5,4 89 50 52 73 70,2 3,8

40 122 129 73 69,0 5,4 90 34 40 73 62,1 15,0

41 122 129 73 69,0 5,4 91 39 41 73 69,4 4,9

42 35 38 73 67,2 7,9 92 45 51 73 64,4 11,8

43 90 95 73 69,2 5,3 93 36 41 73 64,1 12,2

44 103 114 73 66,0 9,6 94 39 43 73 66,2 9,3

45 60 65 73 67,4 7,7 95 41 44 73 68,0 6,8

46 160 179 73 65,3 10,6 96 31 32 73 70,7 3,1

47 236 256 73 67,3 7,8 97 29 29 73 73,0 0,0

48 48 53 73 66,1 9,4 98 50 55 73 66,4 9,1

49 47 52 73 66,0 9,6 99 78 84 73 67,8 7,1

50 55 60 73 66,9 8,3 100 96 106 73 66,1 9,4

Ø Fehler 7,58

Tabelle 66: Automatische L929-Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus mit anschließender

Kernseparation im Vergleich zur Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF: Refe-

renzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zell-

zählung; ERR: Relativer Fehler (((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100)

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm


AZ Norm

ERR

1 231 232 273 271,8 0,4 51 353 342 273 281,8 3,2

2 366 369 273 270,8 0,8 52 212 217 273 266,7 2,3

3 245 250 273 267,5 2,0 53 285 284 273 274,0 0,4

4 200 199 273 274,4 0,5 54 221 223 273 270,6 0,9

5 239 240 273 271,9 0,4 55 289 283 273 278,8 2,1

6 201 199 273 275,7 1,0 56 325 324 273 273,8 0,3

7 217 215 273 275,5 0,9 57 367 363 273 276,0 1,1

8 205 210 273 266,5 2,4 58 435 436 273 272,4 0,2

9 215 215 273 273,0 0,0 59 415 413 273 274,3 0,5

10 274 280 273 267,2 2,1 60 277 277 273 273,0 0,0

11 261 252 273 282,8 3,6 61 350 347 273 275,4 0,9

12 228 229 273 271,8 0,4 62 405 399 273 277,1 1,5

13 247 248 273 271,9 0,4 63 358 350 273 279,2 2,3

14 79 79 273 273,0 0,0 64 391 387 273 275,8 1,0

15 111 109 273 278,0 1,8 65 341 337 273 276,2 1,2

16 100 98 273 278,6 2,0 66 354 343 273 281,8 3,2

17 90 89 273 276,1 1,1 67 359 352 273 278,4 2,0

18 119 114 273 285,0 4,4 68 350 341 273 280,2 2,6

19 120 121 273 270,7 0,8 69 274 272 273 275,0 0,7

20 114 113 273 275,4 0,9 70 507 496 273 279,1 2,2

21 83 80 273 283,2 3,8 71 323 327 273 269,7 1,2

22 161 162 273 271,3 0,6 72 492 489 273 274,7 0,6

13. Anhang 188

23 154 153 273 274,8 0,7 73 258 251 273 280,6 2,8

24 122 121 273 275,3 0,8 74 364 359 273 276,8 1,4

25 88 87 273 276,1 1,1 75 357 355 273 274,5 0,6

26 103 104 273 270,4 1,0 76 348 341 273 278,6 2,1

27 122 124 273 268,6 1,6 77 427 419 273 278,2 1,9

28 79 81 273 266,3 2,5 78 391 382 273 279,4 2,4

29 67 67 273 273,0 0,0 79 438 432 273 276,8 1,4

30 63 62 273 277,4 1,6 80 361 352 273 280,0 2,6

31 77 77 273 273,0 0,0 81 482 484 273 271,9 0,4

32 81 81 273 273,0 0,0 82 580 573 273 276,3 1,2

33 72 73 273 269,3 1,4 83 577 573 273 274,9 0,7

34 95 96 273 270,2 1,0 84 397 394 273 275,1 0,8

35 95 96 273 270,2 1,0 85 506 512 273 269,8 1,2

36 107 105 273 278,2 1,9 86 490 492 273 271,9 0,4

37 83 83 273 273,0 0,0 87 544 535 273 277,6 1,7

38 92 93 273 270,1 1,1 88 338 340 273 271,4 0,6

39 91 91 273 273,0 0,0 89 340 342 273 271,4 0,6

40 98 99 273 270,2 1,0 90 322 322 273 273,0 0,0

41 89 90 273 270,0 1,1 91 314 318 273 269,6 1,3

42 75 75 273 273,0 0,0 92 300 308 273 265,9 2,6

43 297 298 273 272,1 0,3 93 361 368 273 267,8 1,9

44 366 360 273 277,6 1,7 94 295 292 273 275,8 1,0

45 350 352 273 271,4 0,6 95 310 313 273 270,4 1,0

46 404 417 273 264,5 3,1 96 403 411 273 267,7 1,9

47 376 378 273 271,6 0,5 97 345 350 273 269,1 1,4

48 416 420 273 270,4 1,0 98 407 419 273 265,2 2,9

49 331 337 273 268,1 1,8 99 234 238 273 268,4 1,7

50 385 396 273 265,4 2,8 100 278 284 273 267,2 2,1

Ø Fehler 1,31

Tabelle 67: Automatische MC3T3-Kernzählung auf Basis des HB-Algorithmus mit anschließen-

der Kernseparation im Vergleich zur Referenzzählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF:

Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzählung; AZ Norm: Normierte automatische

Zellzählung; ERR: Relativer Fehler (((REF Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100)

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm


AZ Norm

ERR

1 82 85 73 70,4 3,5 51 68 66 73 75,2 3,0

2 102 107 73 69,6 4,7 52 94 96 73 71,5 2,1

3 79 82 73 70,3 3,7 53 74 75 73 72,0 1,3

4 96 90 73 77,9 6,7 54 135 140 73 70,4 3,6

5 65 65 73 73,0 0,0 55 59 63 73 68,4 6,3

6 92 90 73 74,6 2,2 56 141 139 73 74,1 1,4

7 91 95 73 69,9 4,2 57 69 69 73 73,0 0,0

8 101 104 73 70,9 2,9 58 165 171 73 70,4 3,5

9 97 99 73 71,5 2,0 59 55 56 73 71,7 1,8

10 69 67 73 75,2 3,0 60 50 51 73 71,6 2,0

11 92 96 73 70,0 4,2 61 29 32 73 66,2 9,4

12 82 82 73 73,0 0,0 62 21 22 73 69,7 4,5

13 85 86 73 72,2 1,2 63 60 59 73 74,2 1,7

14 75 84 73 65,2 10,7 64 39 39 73 73,0 0,0

15 80 82 73 71,2 2,4 65 47 50 73 68,6 6,0

16 58 63 73 67,2 7,9 66 22 24 73 66,9 8,3

17 74 78 73 69,3 5,1 67 22 21 73 76,5 4,8

18 96 92 73 76,2 4,3 68 30 32 73 68,4 6,3

19 61 70 73 63,6 12,9 69 30 32 73 68,4 6,3

20 79 82 73 70,3 3,7 70 33 35 73 68,8 5,7

21 50 48 73 76,0 4,2 71 35 36 73 71,0 2,8

22 42 42 73 73,0 0,0 72 34 33 73 75,2 3,0

23 46 48 73 70,0 4,2 73 28 28 73 73,0 0,0

24 46 45 73 74,6 2,2 74 32 31 73 75,4 3,2

25 52 50 73 75,9 4,0 75 40 42 73 69,5 4,8

26 54 55 73 71,7 1,8 76 55 56 73 71,7 1,8

27 39 41 73 69,4 4,9 77 31 31 73 73,0 0,0

28 80 84 73 69,5 4,8 78 64 67 73 69,7 4,5

29 40 41 73 71,2 2,4 79 67 68 73 71,9 1,5

13. Anhang 189

30 61 63 73 70,7 3,2 80 69 72 73 70,0 4,2

31 92 96 73 70,0 4,2 81 67 69 73 70,9 2,9

32 73 73 73 73,0 0,0 82 70 69 73 74,1 1,4

33 59 58 73 74,3 1,7 83 73 69 73 77,2 5,8

34 67 71 73 68,9 5,6 84 73 69 73 77,2 5,8

35 60 62 73 70,6 3,2 85 124 126 73 71,8 1,6

36 81 84 73 70,4 3,6 86 126 126 73 73,0 0,0

37 58 62 73 68,3 6,5 87 129 126 73 74,7 2,4

38 67 65 73 75,2 3,1 88 196 196 73 73,0 0,0

39 125 129 73 70,7 3,1 89 50 52 73 70,2 3,8

40 125 129 73 70,7 3,1 90 39 40 73 71,2 2,5

41 125 129 73 70,7 3,1 91 42 41 73 74,8 2,4

42 36 38 73 69,2 5,3 92 51 51 73 73,0 0,0

43 94 95 73 72,2 1,1 93 39 41 73 69,4 4,9

44 110 114 73 70,4 3,5 94 42 43 73 71,3 2,3

45 65 65 73 73,0 0,0 95 42 44 73 69,7 4,5

46 170 179 73 69,3 5,0 96 33 32 73 75,3 3,1

47 247 256 73 70,4 3,5 97 30 29 73 75,5 3,4

48 50 53 73 68,9 5,7 98 54 55 73 71,7 1,8

49 48 52 73 67,4 7,7 99 81 84 73 70,4 3,6

50 57 60 73 69,4 5,0 100 101 106 73 69,6 4,7

Ø Fehler 3,52

13.10 Zellzählung mit der Wachstumssimulation im Vergleich zur

Referenzzählung

Tabelle 68: Vergleich der L929-Zellzählung (1) sowie der MC3T3-Zellzählung (2) mit der

Wachstumssimulation zur Referenzzählung; AZ 1: Automatische L929-Zellzählung; AZ 2: Au-

tomatische MC3T3-Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Referenzzäh-

lung; AZ 1 Norm: Normierte automatische L929-Zellzählung; AZ 2 Norm: Normierte automati-

sche MC3T3-Zellzählung; ERR 1: Relativer Fehler für den Typ L929 (((REF Norm – AZ Norm) /

REF Norm) * 100); ERR 2: Relativer Fehler für den Typ MC3T3

Nr AZ 1 REF 1 AZ 2 REF 2 REF 1 Norm

REF 2 Norm

AZ 1 Norm

AZ 2 Norm

ERR 1 [%]

ERR 2 [%]

1 231 232 82 85 273 73 271,8 70,4 0,4 3,5

2 366 369 102 107 273 73 270,8 69,6 0,8 4,7

3 245 250 79 82 273 73 267,5 70,3 2,0 3,7

4 200 199 96 90 273 73 274,4 77,9 0,5 6,7

5 239 240 65 65 273 73 271,9 73,0 0,4 0,0

6 201 199 92 90 273 73 275,7 74,6 1,0 2,2

7 217 215 91 95 273 73 275,5 69,9 0,9 4,2

8 205 210 101 104 273 73 266,5 70,9 2,4 2,9

9 215 215 97 99 273 73 273,0 71,5 0,0 2,0

10 274 280 69 67 273 73 267,2 75,2 2,1 3,0

11 261 252 92 96 273 73 282,8 70,0 3,6 4,2

12 228 229 82 82 273 73 271,8 73,0 0,4 0,0

13 247 248 85 86 273 73 271,9 72,2 0,4 1,2

14 79 79 75 84 273 73 273,0 65,2 0,0 10,7

15 111 109 80 82 273 73 278,0 71,2 1,8 2,4

16 100 98 58 63 273 73 278,6 67,2 2,0 7,9

17 90 89 74 78 273 73 276,1 69,3 1,1 5,1

18 119 114 96 92 273 73 285,0 76,2 4,4 4,3

19 120 121 61 70 273 73 270,7 63,6 0,8 12,9

20 114 113 79 82 273 73 275,4 70,3 0,9 3,7

21 83 80 50 48 273 73 283,2 76,0 3,8 4,2

22 161 162 42 42 273 73 271,3 73,0 0,6 0,0

23 154 153 46 48 273 73 274,8 70,0 0,7 4,2

24 122 121 46 45 273 73 275,3 74,6 0,8 2,2

25 88 87 52 50 273 73 276,1 75,9 1,1 4,0

26 103 104 54 55 273 73 270,4 71,7 1,0 1,8

27 122 124 39 41 273 73 268,6 69,4 1,6 4,9

13. Anhang 190

28 79 81 80 84 273 73 266,3 69,5 2,5 4,8

29 67 67 40 41 273 73 273,0 71,2 0,0 2,4

30 63 62 61 63 273 73 277,4 70,7 1,6 3,2

31 77 77 92 96 273 73 273,0 70,0 0,0 4,2

32 81 81 73 73 273 73 273,0 73,0 0,0 0,0

33 72 73 59 58 273 73 269,3 74,3 1,4 1,7

34 95 96 67 71 273 73 270,2 68,9 1,0 5,6

35 95 96 60 62 273 73 270,2 70,6 1,0 3,2

36 107 105 81 84 273 73 278,2 70,4 1,9 3,6

37 83 83 58 62 273 73 273,0 68,3 0,0 6,5

38 92 93 67 65 273 73 270,1 75,2 1,1 3,1

39 91 91 125 129 273 73 273,0 70,7 0,0 3,1

40 98 99 125 129 273 73 270,2 70,7 1,0 3,1

41 89 90 125 129 273 73 270,0 70,7 1,1 3,1

42 75 75 36 38 273 73 273,0 69,2 0,0 5,3

43 297 298 94 95 273 73 272,1 72,2 0,3 1,1

44 366 360 110 114 273 73 277,6 70,4 1,7 3,5

45 350 352 65 65 273 73 271,4 73,0 0,6 0,0

46 404 417 170 179 273 73 264,5 69,3 3,1 5,0

47 376 378 247 256 273 73 271,6 70,4 0,5 3,5

48 416 420 50 53 273 73 270,4 68,9 1,0 5,7

49 331 337 48 52 273 73 268,1 67,4 1,8 7,7

50 385 396 57 60 273 73 265,4 69,4 2,8 5,0

51 353 342 68 66 273 73 281,8 75,2 3,2 3,0

52 212 217 94 96 273 73 266,7 71,5 2,3 2,1

53 285 284 74 75 273 73 274,0 72,0 0,4 1,3

54 221 223 135 140 273 73 270,6 70,4 0,9 3,6

55 289 283 59 63 273 73 278,8 68,4 2,1 6,3

56 325 324 141 139 273 73 273,8 74,1 0,3 1,4

57 367 363 69 69 273 73 276,0 73,0 1,1 0,0

58 435 436 165 171 273 73 272,4 70,4 0,2 3,5

59 415 413 55 56 273 73 274,3 71,7 0,5 1,8

60 277 277 50 51 273 73 273,0 71,6 0,0 2,0

61 350 347 29 32 273 73 275,4 66,2 0,9 9,4

62 405 399 21 22 273 73 277,1 69,7 1,5 4,5

63 358 350 60 59 273 73 279,2 74,2 2,3 1,7

64 391 387 39 39 273 73 275,8 73,0 1,0 0,0

65 341 337 47 50 273 73 276,2 68,6 1,2 6,0

66 354 343 22 24 273 73 281,8 66,9 3,2 8,3

67 359 352 22 21 273 73 278,4 76,5 2,0 4,8

68 350 341 30 32 273 73 280,2 68,4 2,6 6,3

69 274 272 30 32 273 73 275,0 68,4 0,7 6,3

70 507 496 33 35 273 73 279,1 68,8 2,2 5,7

71 323 327 35 36 273 73 269,7 71,0 1,2 2,8

72 492 489 34 33 273 73 274,7 75,2 0,6 3,0

73 258 251 28 28 273 73 280,6 73,0 2,8 0,0

74 364 359 32 31 273 73 276,8 75,4 1,4 3,2

75 357 355 40 42 273 73 274,5 69,5 0,6 4,8

76 348 341 55 56 273 73 278,6 71,7 2,1 1,8

77 427 419 31 31 273 73 278,2 73,0 1,9 0,0

78 391 382 64 67 273 73 279,4 69,7 2,4 4,5

79 438 432 67 68 273 73 276,8 71,9 1,4 1,5

80 361 352 69 72 273 73 280,0 70,0 2,6 4,2

81 482 484 67 69 273 73 271,9 70,9 0,4 2,9

82 580 573 70 69 273 73 276,3 74,1 1,2 1,4

83 577 573 73 69 273 73 274,9 77,2 0,7 5,8

84 397 394 73 69 273 73 275,1 77,2 0,8 5,8

85 506 512 124 126 273 73 269,8 71,8 1,2 1,6

86 490 492 126 126 273 73 271,9 73,0 0,4 0,0

87 544 535 129 126 273 73 277,6 74,7 1,7 2,4

88 338 340 196 196 273 73 271,4 73,0 0,6 0,0

89 340 342 50 52 273 73 271,4 70,2 0,6 3,8

90 322 322 39 40 273 73 273,0 71,2 0,0 2,5

91 314 318 42 41 273 73 269,6 74,8 1,3 2,4

92 300 308 51 51 273 73 265,9 73,0 2,6 0,0

93 361 368 39 41 273 73 267,8 69,4 1,9 4,9

94 295 292 42 43 273 73 275,8 71,3 1,0 2,3

95 310 313 42 44 273 73 270,4 69,7 1,0 4,5

96 403 411 33 32 273 73 267,7 75,3 1,9 3,1

13. Anhang 191

97 345 350 30 29 273 73 269,1 75,5 1,4 3,4

98 407 419 54 55 273 73 265,2 71,7 2,9 1,8

99 234 238 81 84 273 73 268,4 70,4 1,7 3,6

100 278 284 101 106 273 73 267,2 69,6 2,1 4,7

Ø Fehler 1,31 3,50

13.11 Zellzählung mit dem Algorithmus aus Kap. 6.6 und Vergleich

mit der Referenzzählung

Tabelle 69: L929-Zellzählung auf Basis des Algorithmus in Kap. 6.6 im Vergleich zur Referenz-

zählung; AZ: Automatische Zellzählung; REF: Referenzzählung; REF Norm: Normierte Refe-

renzzählung; AZ Norm: Normierte automatische Zellzählung; ERR: Relativer Fehler (((REF

Norm – AZ Norm) / REF Norm) * 100)

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm

ERR [%]

Nr AZ REF REF Norm

AZ Norm

ERR [%]

1 229 232 273 269,5 1,3 51 327 342 273 261,0 4,4

2 347 369 273 256,7 6,0 52 209 217 273 262,9 3,7

3 241 250 273 263,2 3,6 53 280 284 273 269,2 1,4

4 195 199 273 267,5 2,0 54 212 223 273 259,5 4,9

5 236 240 273 268,5 1,7 55 276 283 273 266,2 2,5

6 194 199 273 266,1 2,5 56 313 324 273 263,7 3,4

7 218 215 273 276,8 1,4 57 355 363 273 267,0 2,2

8 205 210 273 266,5 2,4 58 421 436 273 263,6 3,4

9 209 215 273 265,4 2,8 59 400 413 273 264,4 3,1

10 271 280 273 264,2 3,2 60 268 277 273 264,1 3,2

11 245 252 273 265,4 2,8 61 335 347 273 263,6 3,5

12 221 229 273 263,5 3,5 62 392 399 273 268,2 1,8

13 244 248 273 268,6 1,6 63 341 350 273 266,0 2,6

14 72 79 273 248,8 8,9 64 377 387 273 265,9 2,6

15 104 109 273 260,5 4,6 65 324 337 273 262,5 3,9

16 96 98 273 267,4 2,0 66 329 343 273 261,9 4,1

17 88 89 273 269,9 1,1 67 338 352 273 262,1 4,0

18 110 114 273 263,4 3,5 68 333 341 273 266,6 2,3

19 117 121 273 264,0 3,3 69 264 272 273 265,0 2,9

20 111 113 273 268,2 1,8 70 474 496 273 260,9 4,4

21 78 80 273 266,2 2,5 71 316 327 273 263,8 3,4

22 157 162 273 264,6 3,1 72 470 489 273 262,4 3,9

23 151 153 273 269,4 1,3 73 245 251 273 266,5 2,4

24 116 121 273 261,7 4,1 74 348 359 273 264,6 3,1

25 86 87 273 269,9 1,1 75 346 355 273 266,1 2,5

26 101 104 273 265,1 2,9 76 328 341 273 262,6 3,8

27 122 124 273 268,6 1,6 77 403 419 273 262,6 3,8

28 79 81 273 266,3 2,5 78 376 382 273 268,7 1,6

29 64 67 273 260,8 4,5 79 420 432 273 265,4 2,8

30 58 62 273 255,4 6,5 80 337 352 273 261,4 4,3

31 76 77 273 269,5 1,3 81 470 484 273 265,1 2,9

32 77 81 273 259,5 4,9 82 542 573 273 258,2 5,4

33 69 73 273 258,0 5,5 83 542 573 273 258,2 5,4

34 94 96 273 267,3 2,1 84 379 394 273 262,6 3,8

35 93 96 273 264,5 3,1 85 487 512 273 259,7 4,9

36 99 105 273 257,4 5,7 86 471 492 273 261,3 4,3

37 80 83 273 263,1 3,6 87 504 535 273 257,2 5,8

38 89 93 273 261,3 4,3 88 327 340 273 262,6 3,8

39 90 91 273 270,0 1,1 89 330 342 273 263,4 3,5

40 94 99 273 259,2 5,1 90 314 322 273 266,2 2,5

41 88 90 273 266,9 2,2 91 312 318 273 267,8 1,9

42 73 75 273 265,7 2,7 92 299 308 273 265,0 2,9

43 289 298 273 264,8 3,0 93 354 368 273 262,6 3,8

44 354 360 273 268,5 1,7 94 288 292 273 269,3 1,4

45 345 352 273 267,6 2,0 95 306 313 273 266,9 2,2

46 411 417 273 269,1 1,4 96 398 411 273 264,4 3,2

47 370 378 273 267,2 2,1 97 340 350 273 265,2 2,9

13. Anhang 192

48 408 420 273 265,2 2,9 98 402 419 273 261,9 4,1

49 331 337 273 268,1 1,8 99 234 238 273 268,4 1,7

50 388 396 273 267,5 2,0 100 278 284 273 267,2 2,1

Ø Fehler 3,13

13.12 Bewertung der in Kap. 6 vorgestellten Verfahren zur

Separation zusammengewachsener Zellen

Um die Genauigkeit der Separation von zu Clustern verbundenen Zellen zu be-

werten, wurden 100 automatisch segmentierte Zellbereiche mit den von einem

Experten manuell festgelegten Zellbereichen verglichen. Mit Hilfe des Jaccard-

Koeffizienten kann eine Aussage über die durchschnittliche Abweichung der

automatisch generierten Zellkonturen zu den Referenzkonturen erfolgen. Tabel-

le 70 zeigt die Jaccard-Koeffizienten für 100 verschiedene L929 Zellen. Zum

Einsatz kamen die Separationsverfahren beschrieben in Kap. 6.4, Kap. 6.5 und

Kap. 6.6.

Tabelle 70: Berechnung des Jaccard-Koeffizienten für 100 separierte L929-Zellen aus 10 ver-

schiedenen Probenausschnitten. Verfahren A: Kap. 6.4; Verfahren B: Kap. 6.5; Verfahren C:

Kap. 6.6

Verfahren A Verfahren B Verfahren C

Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard

1 0,74 51 0,79 1 0,73 51 0,78 1 0,77 51 0,82

2 0,77 52 0,77 2 0,8 52 0,78 2 0,74 52 0,81

3 0,75 53 0,85 3 0,76 53 0,8 3 0,86 53 0,79

4 0,85 54 0,8 4 0,81 54 0,85 4 0,81 54 0,8

5 0,79 55 0,73 5 0,82 55 0,8 5 0,75 55 0,78

6 0,78 56 0,83 6 0,8 56 0,79 6 0,77 56 0,82

7 0,8 57 0,88 7 0,73 57 0,74 7 0,76 57 0,77

8 0,87 58 0,82 8 0,76 58 0,86 8 0,79 58 0,78

9 0,83 59 0,79 9 0,77 59 0,81 9 0,8 59 0,81

10 0,76 60 0,81 10 0,75 60 0,78 10 0,73 60 0,76

11 0,84 61 0,78 11 0,84 61 0,82 11 0,73 61 0,78

12 0,73 62 0,88 12 0,75 62 0,76 12 0,56 62 0,77

13 0,73 63 0,86 13 0,78 63 0,8 13 0,61 63 0,8

14 0,77 64 0,79 14 0,74 64 0,78 14 0,73 64 0,82

15 0,83 65 0,79 15 0,77 65 0,82 15 0,83 65 0,78

16 0,83 66 0,83 16 0,76 66 0,73 16 0,81 66 0,75

17 0,69 67 0,8 17 0,78 67 0,77 17 0,78 67 0,72

18 0,86 68 0,76 18 0,85 68 0,75 18 0,83 68 0,74

19 0,82 69 0,78 19 0,81 69 0,73 19 0,75 69 0,76

20 0,77 70 0,8 20 0,76 70 0,76 20 0,79 70 0,78

21 0,79 71 0,76 21 0,78 71 0,8 21 0,8 71 0,75

22 0,75 72 0,85 22 0,73 72 0,77 22 0,85 72 0,77

23 0,84 73 0,82 23 0,84 73 0,75 23 0,8 73 0,77

24 0,8 74 0,85 24 0,76 74 0,75 24 0,77 74 0,84

25 0,77 75 0,77 25 0,77 75 0,77 25 0,75 75 0,81

26 0,85 76 0,75 26 0,8 76 0,79 26 0,74 76 0,79

27 0,82 77 0,79 27 0,83 77 0,8 27 0,79 77 0,76

28 0,84 78 0,8 28 0,85 78 0,78 28 0,79 78 0,76

29 0,79 79 0,81 29 0,77 79 0,79 29 0,8 79 0,8

30 0,8 80 0,77 30 0,75 80 0,8 30 0,78 80 0,78

31 0,77 81 0,86 31 0,78 81 0,76 31 0,74 81 0,73

32 0,83 82 0,83 32 0,79 82 0,76 32 0,75 82 0,75

13. Anhang 193

33 0,88 83 0,76 33 0,76 83 0,81 33 0,72 83 0,8

34 0,79 84 0,78 34 0,75 84 0,78 34 0,7 84 0,74

35 0,82 85 0,8 35 0,83 85 0,84 35 0,81 85 0,73

36 0,76 86 0,8 36 0,76 86 0,74 36 0,77 86 0,74

37 0,78 87 0,83 37 0,77 87 0,79 37 0,84 87 0,81

38 0,8 88 0,76 38 0,79 88 0,77 38 0,78 88 0,77

39 0,83 89 0,75 39 0,78 89 0,85 39 0,74 89 0,78

40 0,78 90 0,83 40 0,79 90 0,76 40 0,76 90 0,76

41 0,8 91 0,74 41 0,83 91 0,83 41 0,82 91 0,72

42 0,74 92 0,77 42 0,78 92 0,8 42 0,8 92 0,69

43 0,77 93 0,79 43 0,76 93 0,77 43 0,8 93 0,77

44 0,72 94 0,76 44 0,73 94 0,78 44 0,64 94 0,86

45 0,82 95 0,83 45 0,82 95 0,78 45 0,75 95 0,83

46 0,85 96 0,82 46 0,79 96 0,79 46 0,79 96 0,73

47 0,83 97 0,85 47 0,8 97 0,79 47 0,79 97 0,79

48 0,78 98 0,88 48 0,79 98 0,82 48 0,81 98 0,79

49 0,77 99 0,78 49 0,77 99 0,78 49 0,78 99 0,8

50 0,84 100 0,79 50 0,83 100 0,84 50 0,77 100 0,82

Ø 0,80 0,79 0,77

Das Verfahren, beschrieben in Kap. 6.5, ist neben der Separation von L929-

Zellen auch für die Separation von zusammengewachsenen MC3T3-Zellen ge-

eignet. Die anderen Verfahren, beschrieben in Kap. 6.4 und Kap. 6.6 können

hingegen nicht für die Separation von MC3T3-Agglomeraten eingesetzt werden.

Zur Bewertung der Qualität der Zellflächenrekonstruktion wird auch hier der

Jaccard-Koeffizient von 100 getrennten Zellen herangezogen (Tabelle 71).

Tabelle 71: Berechnung des Jaccard-Koeffizienten für 100 separierte MC3T3-Zellen aus 10

verschiedenen Probenausschnitten. Verfahren A: Kap. 6.4; Verfahren B: Kap. 6.5; Verfahren C:

Kap. 6.6

Verfahren A Verfahren B Verfahren C

Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard Nr. Jaccard

1 0,5 51 0,47 1 0,83 51 0,71 1 0,46 51 0,42

2 0,45 52 0,48 2 0,81 52 0,77 2 0,39 52 0,43

3 0,62 53 0,29 3 0,82 53 0,76 3 0,62 53 0,25

4 0,41 54 0,41 4 0,78 54 0,79 4 0,36 54 0,43

5 0,36 55 0,38 5 0,73 55 0,75 5 0,39 55 0,38

6 0,3 56 0,64 6 0,81 56 0,8 6 0,27 56 0,46

7 0,63 57 0,39 7 0,72 57 0,78 7 0,55 57 0,26

8 0,81 58 0,42 8 0,73 58 0,81 8 0,69 58 0,29

9 0,3 59 0,48 9 0,77 59 0,72 9 0,28 59 0,41

10 0,24 60 0,37 10 0,68 60 0,71 10 0,24 60 0,37

11 0,76 61 0,38 11 0,78 61 0,85 11 0,45 61 0,33

12 0,34 62 0,44 12 0,79 62 0,83 12 0,34 62 0,34

13 0,3 63 0,28 13 0,85 63 0,72 13 0,27 63 0,29

14 0,5 64 0,37 14 0,76 64 0,77 14 0,42 64 0,34

15 0,43 65 0,36 15 0,83 65 0,82 15 0,44 65 0,24

16 0,44 66 0,43 16 0,82 66 0,65 16 0,38 66 0,43

17 0,41 67 0,4 17 0,85 67 0,81 17 0,41 67 0,32

18 0,29 68 0,54 18 0,78 68 0,82 18 0,24 68 0,45

19 0,33 69 0,55 19 0,82 69 0,71 19 0,28 69 0,5

20 0,41 70 0,41 20 0,83 70 0,78 20 0,41 70 0,34

21 0,38 71 0,4 21 0,74 71 0,78 21 0,32 71 0,42

22 0,46 72 0,42 22 0,76 72 0,8 22 0,48 72 0,31

23 0,36 73 0,48 23 0,82 73 0,82 23 0,26 73 0,41

24 0,36 74 0,35 24 0,8 74 0,85 24 0,28 74 0,26

25 0,51 75 0,33 25 0,79 75 0,84 25 0,41 75 0,3

13. Anhang 194

26 0,46 76 0,42 26 0,75 76 0,72 26 0,35 76 0,38

27 0,27 77 0,34 27 0,79 77 0,85 27 0,27 77 0,31

28 0,32 78 0,38 28 0,8 78 0,77 28 0,29 78 0,38

29 0,35 79 0,46 29 0,84 79 0,79 29 0,37 79 0,37

30 0,39 80 0,43 30 0,77 80 0,75 30 0,29 80 0,43

31 0,4 81 0,42 31 0,84 81 0,78 31 0,41 81 0,38

32 0,4 82 0,5 32 0,78 82 0,86 32 0,36 82 0,48

33 0,42 83 0,47 33 0,77 83 0,73 33 0,4 83 0,5

34 0,48 84 0,44 34 0,85 84 0,82 34 0,44 84 0,42

35 0,43 85 0,29 35 0,74 85 0,8 35 0,44 85 0,3

36 0,45 86 0,38 36 0,83 86 0,84 36 0,35 86 0,35

37 0,34 87 0,38 37 0,78 87 0,75 37 0,27 87 0,36

38 0,39 88 0,46 38 0,77 88 0,86 38 0,39 88 0,43

39 0,44 89 0,42 39 0,88 89 0,79 39 0,38 89 0,44

40 0,52 90 0,49 40 0,75 90 0,79 40 0,4 90 0,5

41 0,3 91 0,46 41 0,83 91 0,8 41 0,32 91 0,43

42 0,38 92 0,62 42 0,78 92 0,77 42 0,33 92 0,57

43 0,43 93 0,39 43 0,77 93 0,75 43 0,28 93 0,34

44 0,37 94 0,42 44 0,74 94 0,79 44 0,26 94 0,38

45 0,55 95 0,36 45 0,87 95 0,79 45 0,43 95 0,29

46 0,46 96 0,39 46 0,8 96 0,8 46 0,37 96 0,4

47 0,42 97 0,47 47 0,78 97 0,83 47 0,34 97 0,45

48 0,41 98 0,53 48 0,71 98 0,8 48 0,45 98 0,5

49 0,33 99 0,45 49 0,66 99 0,84 49 0,3 99 0,42

50 0,39 100 0,42 50 0,73 100 0,81 50 0,35 100 0,43

Ø 0,42 0,79 0,38

13.13 Bewertung der in Kap. 8 vorgestellten Methoden zur

automatischen Parametereinstellung

Die folgenden Tabellen 72-75 zeigen die Jaccard-Koeffizienten für jeweils 50

L929- und MC3T3 Referenzzellen auf unterschiedlichen Materialien, die nach

der Schwellwertmethode mit automatischer Parameterfestlegung segmentiert

wurden (Kap. 8.1).

Tabelle 72: Bewertung der Segmentierungsleistung des in Kap. 8.1 beschriebenen Verfahrens

für die verschiedenen Mikroskopkontraste A-HF: Auflicht-Hellfeld und A-DF: Auflicht-Dunkelfeld.

Die L929-Zellen befinden sich auf dem Substrat Stahl* und Titan*, daher kommt das Durch-

lichtmikroskop nicht zum Einsatz

Segmentierungsverfahren (Zelllinie L929, Material Stahl*/Titan*)

Mikroskopkontrast

Nr. A-HF A-DF D-HF D-PK Nr. A-HF A-DF D-HF D-PK

1 0,9 0,82 --- --- 26 0,91 0,84 --- ---

2 0,91 0,82 --- --- 27 0,93 0,88 --- ---

3 0,92 0,75 --- --- 28 0,9 0,81 --- ---

4 0,95 0,81 --- --- 29 0,92 0,84 --- ---

5 0,94 0,9 --- --- 30 0,89 0,86 --- ---

6 0,91 0,91 --- --- 31 0,94 0,89 --- ---

7 0,9 0,92 --- --- 32 0,94 0,84 --- ---

8 0,92 0,92 --- --- 33 0,95 0,88 --- ---

9 0,92 0,88 --- --- 34 0,92 0,89 --- ---

10 0,9 0,93 --- --- 35 0,92 0,88 --- ---

11 0,93 0,86 --- --- 36 0,86 0,88 --- ---

12 0,91 0,79 --- --- 37 0,92 0,9 --- ---

13 0,93 0,85 --- --- 38 0,94 0,86 --- ---

14 0,9 0,77 --- --- 39 0,88 0,89 --- ---

13. Anhang 195

15 0,91 0,7 --- --- 40 0,9 0,87 --- ---

16 0,92 0,87 --- --- 41 0,9 0,91 --- ---

17 0,9 0,86 --- --- 42 0,89 0,87 --- ---

18 0,88 0,85 --- --- 43 0,9 0,93 --- ---

19 0,93 0,93 --- --- 44 0,92 0,94 --- ---

20 0,92 0,92 --- --- 45 0,91 0,9 --- ---

21 0,9 0,9 --- --- 46 0,93 0,88 --- ---

22 0,94 0,91 --- --- 47 0,92 0,89 --- ---

23 0,92 0,9 --- --- 48 0,94 0,88 --- ---

24 0,91 0,85 --- --- 49 0,95 0,9 --- ---

25 0,92 0,78 --- --- 50 0,94 0,86 --- ---

0,92 0,87



Die L929-Zellen befinden sich auf dem Substrat Polystyrol, daher kommt das Auflichtmikroskop

nicht zum Einsatz

Segmentierungsverfahren (Zelllinie L929, Material Polystyrol)

Mikroskopkontrast


1 0,91 0,66 --- --- 26 0,93 0,68 --- ---

2 0,95 0,83 --- --- 27 0,92 0,7 --- ---

3 0,88 0,14 --- --- 28 0,94 0,72 --- ---

4 0,87 0,66 --- --- 29 0,93 0,66 --- ---

5 0,92 0,38 --- --- 30 0,94 0,75 --- ---

6 0,91 0,66 --- --- 31 0,9 0,63 --- ---

7 0,9 0,6 --- --- 32 0,89 0,64 --- ---

8 0,93 0,62 --- --- 33 0,86 0,77 --- ---

9 0,88 0,58 --- --- 34 0,94 0,7 --- ---

10 0,89 0,69 --- --- 35 0,93 0,75 --- ---

11 0,89 0,58 --- --- 36 0,91 0,76 --- ---

12 0,86 0,72 --- --- 37 0,86 0,68 --- ---

13 0,9 0,7 --- --- 38 0,89 0,59 --- ---

14 0,87 0,65 --- --- 39 0,88 0,72 --- ---

15 0,85 0,67 --- --- 40 0,87 0,57 --- ---

16 0,88 0,7 --- --- 41 0,93 0,69 --- ---

17 0,9 0,71 --- --- 42 0,86 0,5 --- ---

18 0,92 0,73 --- --- 43 0,95 0,8 --- ---

19 0,9 0,65 --- --- 44 0,79 0,62 --- ---

20 0,91 0,67 --- --- 45 0,9 0,71 --- ---

21 0,93 0,5 --- --- 46 0,91 0,58 --- ---

22 0,89 0,47 --- --- 47 0,86 0,7 --- ---

23 0,92 0,42 --- --- 48 0,86 0,68 --- ---

24 0,93 0,64 --- --- 49 0,89 0,74 --- ---

25 0,9 0,66 --- --- 50 0,91 0,73 --- ---

0,90 0,65



Die MC3T3-Zellen befinden sich auf dem Substrat Stahl* und Titan*, daher kommt das Durch-

lichtmikroskop nicht zum Einsatz

Segmentierungsverfahren (Zelllinie MC3T3, Material Stahl*/Titan*)

Mikroskopkontrast


1 0,76 0,95 --- --- 26 0,91 0,9 --- ---

13. Anhang 196

2 0,89 0,94 --- --- 27 0,9 0,89 --- ---

3 0,88 0,95 --- --- 28 0,88 0,89 --- ---

4 0,9 0,96 --- --- 29 0,8 0,92 --- ---

5 0,91 0,92 --- --- 30 0,88 0,87 --- ---

6 0,87 0,89 --- --- 31 0,92 0,93 --- ---

7 0,9 0,92 --- --- 32 0,94 0,9 --- ---

8 0,9 0,93 --- --- 33 0,94 0,92 --- ---

9 0,85 0,92 --- --- 34 0,92 0,86 --- ---

10 0,9 0,93 --- --- 35 0,91 0,92 --- ---

11 0,89 0,77 --- --- 36 0,93 0,91 --- ---

12 0,93 0,91 --- --- 37 0,95 0,92 --- ---

13 0,88 0,92 --- --- 38 0,92 0,93 --- ---

14 0,87 0,93 --- --- 39 0,94 0,92 --- ---

15 0,93 0,94 --- --- 40 0,93 0,94 --- ---

16 0,93 0,93 --- --- 41 0,89 0,93 --- ---

17 0,86 0,95 --- --- 42 0,92 0,92 --- ---

18 0,84 0,92 --- --- 43 0,92 0,91 --- ---

19 0,91 0,95 --- --- 44 0,93 0,91 --- ---

20 0,94 0,93 --- --- 45 0,91 0,9 --- ---

21 0,88 0,9 --- --- 46 0,79 0,93 --- ---

22 0,92 0,91 --- --- 47 0,9 0,93 --- ---

23 0,9 0,93 --- --- 48 0,92 0,95 --- ---

24 0,9 0,93 --- --- 49 0,82 0,92 --- ---

25 0,95 0,94 --- --- 50 0,84 0,88 --- ---

0,90 0,92



Die MC3T3-Zellen befinden sich auf dem Substrat Polystyrol, daher kommt das Auflichtmikro-

skop nicht zum Einsatz

Segmentierungsverfahren (Zelllinie MC3T3, Material Polystyrol)

Mikroskopkontrast


1 0,83 0,62 --- --- 26 0,85 0,7 --- ---

2 0,77 0,47 --- --- 27 0,77 0,56 --- ---

3 0,86 0,42 --- --- 28 0,78 0,67 --- ---

4 0,8 0,75 --- --- 29 0,78 0,73 --- ---

5 0,82 0,3 --- --- 30 0,7 0,65 --- ---

6 0,8 0,85 --- --- 31 0,8 0,22 --- ---

7 0,82 0,86 --- --- 32 0,81 0,6 --- ---

8 0,74 0,48 --- --- 33 0,82 0,77 --- ---

9 0,83 0,27 --- --- 34 0,82 0,65 --- ---

10 0,74 0,42 --- --- 35 0,81 0,56 --- ---

11 0,75 0,54 --- --- 36 0,81 0,78 --- ---

12 0,73 0,3 --- --- 37 0,67 0,58 --- ---

13 0,82 0,75 --- --- 38 0,81 0,69 --- ---

14 0,75 0,23 --- --- 39 0,78 0,6 --- ---

15 0,72 0,15 --- --- 40 0,82 0,78 --- ---

16 0,85 0,62 --- --- 41 0,81 0,53 --- ---

17 0,84 0,68 --- --- 42 0,64 0,49 --- ---

18 0,72 0,73 --- --- 43 0,7 0,73 --- ---

19 0,79 0,67 --- --- 44 0,81 0,63 --- ---

20 0,77 0,64 --- --- 45 0,7 0,19 --- ---

21 0,8 0,5 --- --- 46 0,72 0,25 --- ---

22 0,7 0,71 --- --- 47 0,8 0,71 --- ---

23 0,76 0,75 --- --- 48 0,83 0,54 --- ---

24 0,74 0,7 --- --- 49 0,84 0,25 --- ---

25 0,84 0,22 --- --- 50 0,82 0,19 --- ---

0,78 0,55

13. Anhang 197

13.14 Untersuchung verschiedener Stichproben der

Probenoberfläche

Für eine computergestützte Analyse der Zellen auf der Probenoberfläche wird

die Vergrößerung am Mikroskop auf den Faktor 50 eingestellt. Mit diesem Pa-

rameter sind 128 Aufnahmen für die Abbildung der vollständigen Oberfläche

notwendig. Zur Reduzierung des damit verbundenen hohen Arbeitsaufwandes

ist die Verwendung einer Stichprobe der Zellaufnahmen denkbar. Tabelle 76

zeigt die Untersuchungsergebnisse der Abweichungen der durchschnittlichen

Zellanzahl verschiedener Stichprobenumfänge im Vergleich zum Referenzwert.

Unter dem Referenzwert ist hier die durchschnittliche Zellanzahl aller Proben-

ausschnitte zu verstehen, die keine Probenrandbereiche aufweisen.

Tabelle 76: Verschiedene Stichprobenumfänge mit der jeweiligen Abweichung zum Referenz-

wert. Für jeden Stichprobenumfang wurden 10 Versuche durchgeführt. Die zufälligen Stichpro-

ben umfassen 50, 30 und 10 Bilder, die gezielt ausgewählten Stichproben hingegen 15, 10 und

5 Bilder. Zeichenerklärung: Ø: Durchschnittliche Zellanzahl der Stichprobe; σ: Standardabwei-

chung der Stichprobe; ∆REF: relative Abweichung der durchschnittlichen Zellanzahl der Stichpro-

be zum Referenzwert; Abw.: Die maximale positive und negative Abweichung der durchschnitt-

lichen Zellzahl vom Referenzwert [%]

Stichprobenumfänge

zufällige Auswahl der Stichprobe


Ø σ ∆REF Ø σ ∆REF Ø σ ∆REF Ø σ ∆REF

1 506,1 379,6 6,0 441,3 331,5 -7,5 439,1 257,0 -8,0 477,5 302,2 0,1

2 494,6 384,9 3,6 482,3 364,0 1,1 510,3 408,6 6,9 589,4 555,5 23,5

3 473,6 374,7 -0,8 496,6 412,1 4,1 394,1 217,1 -17,4 398,4 156,7 -16,5

4 491,6 380,2 3,0 471,4 328,0 -1,2 529,7 386,6 11,0 423,1 195,6 -11,3

5 472,0 356,5 -1,1 489,2 349,4 2,5 613,9 497,6 28,6 485,1 302,8 1,6

6 491,3 383,1 2,9 475,4 321,2 -0,4 487,7 412,9 2,2 384,1 73,1 -19,5

7 493,0 382,1 3,3 477,0 396,7 0,0 507,2 393,3 6,3 379,1 143,9 -20,6

8 457,3 319,9 -4,2 541,5 419,2 13,5 499,4 415,2 4,6 587,6 438,2 23,1

9 480,0 373,3 0,6 519,4 433,4 8,8 651,0 532,6 36,4 439,0 282,2 -8,0

10 474,6 373,3 -0,6 462,0 369,4 -3,2 497,2 359,2 4,2 478,1 316,4 0,2

Abw. -4,2% bis 6,0% -7,5% bis +13,5% -17,4% bis +36,4% -20,6% bis +23,5%

gezielte Auswahl der Stichprobe


Ø σ ∆REF Ø σ ∆REF Ø σ ∆REF Ø σ ∆REF

1 463,2 66,7 -2,9 483,3 60,1 1,3 469,9 86,9 -1,5 429,0 51,6 -10,1

2 454,2 69,6 -4,8 475,9 77,1 -0,3 483,2 44,2 1,3 528,2 45,7 9,6

3 491,6 62,8 3,0 484,7 75,9 1,6 465,1 70,6 -2,5 487,6 47,3 2,2

4 499,2 45,1 4,6 476,2 65,7 -0,2 470,4 59,3 -1,5 426,2 70,1 -10,7

5 475,2 65,1 -0,4 481,5 70,5 0,9 507,9 104,1 6,4 415,8 38,1 -12,9

6 460,2 73,7 -3,6 461,3 65,7 -3,3 473,7 78,9 -0,7 444,0 44,4 -7,0

13. Anhang 198

7 477,9 59,8 0,1 487,9 62,4 2,2 459,6 69,6 -3,7 381,6 35,5 -20,0

8 477,4 60,2 0,0 487,4 89,2 2,0 417,3 41,7 -12,6 400,4 42,8 -16,1

9 484,9 61,6 1,6 475,6 61,5 -0,3 442,1 57 -7,3 498,8 71,9 4,5

10 464,6 47,3 -2,6 454,7 52,0 -4,7 420,2 84,6 -12,0 495,6 75,6 3,8

Abw. -4,8% bis +4,6% -4,7% bis +2,2% -12,6% bis +6,4% -20,0% bis 9,6%

13.15 Untersuchung zur manuellen Zellzählung in Suspension und

auf der Probenoberfläche

In der nachfolgenden Tabelle sind die Ergebnisse der manuellen Zellzählung in

Suspension mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-Kammer für 6 Proben aufgeführt.

Auf diese 6 Proben wurden im Vorfeld jeweils 10.000 L929-Zellen aufgebracht,

72 Stunden im Brutschrank inkubiert und danach für die Zählung in Suspension

abgelöst.

Tabelle 77: Manuell ermittelte Zellanzahl für 6 Proben in Suspension. Pro Probe wurden 10

Zählungen durchgeführt und der Mittelwert gebildet

Versuch-Nr. Ermittelte Zellanzahl Probe 1

1 47.813

2 52.813

3 44.375

4 51.250

5 50.625

6 51.250

7 44.063

8 45.625

9 47.188

10 47.813

Mittelwert 48.281

Standardabweichung 2.922

Probe 2

1 55.000

2 64.063

3 57.813

4 62.813

5 58.438

6 59.063

7 60.000

8 65.313

9 60.625

10 62.500

Mittelwert 60.563


Probe 3

1 49.063

2 50.625

3 53.438

13. Anhang 199

4 52.813

5 50.313

6 49.063

7 45.313

8 45.000

9 46.250

10 47.500

Mittelwert 48.938


Probe 4

1 47.500

2 51.250

3 54.375

4 49.375

5 48.125

6 49.375

7 47.500

8 44.063

9 48.750

10 55.938

Mittelwert 49.625


Probe 5

1 58.125

2 54.375

3 50.000

4 54.688

5 58.750

6 51.875

7 55.625

8 52.500

9 50.625

10 55.625

Mittelwert 54.219


Probe 6

1 47.500

2 46.875

3 48.125

4 46.250

5 45.625

6 53.125

7 44.375

8 53.750

9 46.563

10 47.188

Mittelwert 47.938


Tabelle 78: Manuell ermittelte Zellanzahl auf der Oberfläche von 3 Proben

Proben-Nr. Ermittelte Zellanzahl Probe 1 83117

Probe 2 47504

Probe 3 53271

13. Anhang 200

Tabelle 79: Manuell ermittelte Zellanzahlen für 6 Proben in Suspension (Versuchsreihe A) und 3

Proben unter dem Mikroskop, zunächst manuell (Versuchsreihe B) und dann computergestützt

gezählt (Versuchsreihe C). Für jede Probe in Suspension wurden 10 Zählungen eines bestimm-

ten Volumens durchgeführt und auf das Gesamtvolumen hochgerechnet. Aus den 10 Messun-

gen wird schließlich der Mittelwert gebildet.

Manuelle Zellzählung mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer

Versuchsreihe A Mittelwert Zellanzahl

Standard-abweichung

Probe A1 48281 2922

Probe A2 60563 2987

Probe A3 48938 2792

Probe A4 49625 3385

Probe A5 54219 2682

Probe A6 47938 2786

Mittelwert 51592

Manuelle Zählung gefärbter Zellen mit Hilfe mikroskopischer Bilder

Versuchsreihe B

Zellanzahl

Probe B1 83117

Probe B2 47504

Probe B3 53271

Mittelwert 61297

Automatische Zählung gefärbter Zellen mit Hilfe mikroskopischer Bilder

Versuchsreihe C

Zellanzahl Abweichung zu

Versuchsreihe B

Probe C1 81380 2,1%

Probe C2 46702 1,7%

Probe C3 52279 1,9%

Mittelwert 60120

13.16 Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate

Tabelle 80 stellt die Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate für 4 ver-

schiedene Methoden vor.

Tabelle 80: Prüfzeiten zur Bestimmung der Proliferationsrate. Es werden 4 verschiedene Me-

thoden der Prüfung vorgestellt. A: Manuelle Zellzählung mit Hilfe einer Fuchs-Rosenthal-

Zählkammer; B: Computergestützte Zellzählung anhand einer Stichprobe mit einem Umfang

von 15 Probenausschnitten; C: Computergestützte Zellzählung der vollständigen Probe; D:

Computergestützte Zellzählung ebenfalls von der vollständigen Probe, wobei hier die Probe im

Gegensatz zur Methode C automatisch durch ein an das Mikroskop installiertes Achssystem

abgescannt wird. Die Rechenzeiten in der Spalte „Automatische Zellzählung“ sind in Klammern

gesetzt, da es sich hier ausschließlich um automatisierte Arbeitsschritte handelt

Methode Anzahl Proben

Proben-erstellung

[Min]

Manuelle Zellzählung mittels Zähl-

kammer [Min]

Zell-färbung

[Min]

Mikroskopische Bildaufnahmen erzeugen [min]

Automatische Zellzählung

[Min]

Prüfzeit (personen-bezogene

Arbeitszeit) [h]

Manuelle 1 17-20 8-9 --- --- --- 0,4-0,5

13. Anhang 201

Zellzählung [A]

5 37-52 17-19 --- --- --- 0,9-1,2

10 62-92 33-38 --- --- --- 1,6-2,2

25 137-212 81-94 --- --- --- 3,6-5,1

50 262-412 163-188 --- --- --- 7,1-10,0

Automatische Zellzählung (Stichprobe

mit 15 Bildern)

[B]

1 17-20 --- 11 4 (1) 0,5-0,6

5 37-52 --- 13 20 (5) 1,2-1,4

10 62-92 --- 15 40 (10) 2,0-2,5

25 137-212 --- 20 100 (25) 4,3-5,5

50 262-412 --- 29 200 (50) 8,2-10,7

Automatische Zellzählung (vollständige Zellzählung)

[C]

1 17-20 --- 11 36 (8,5) 1,1

5 37-52 --- 13 180 (3h) (42,5) 3,8-4,1

10 62-92 --- 15 360 (6h) (85) 7,3-7,8

25 137-212 --- 20 900 (15h) (212,5) 17,6-18,9

50 262-412 --- 29 1800 (30h) (425) 34,9-37,4

Automatischer Probenscan

und computer-gestützte

Zellzählung [D]

1 17-20 --- 11 (8,5) 0,5

5 37-52 --- 13 (42,5) 0,8-1,1

10 62-92 --- 15 (85) 1,3-1,8

25 137-212 --- 20 (212,5) 2,6-3,9

50 262-412 --- 29 (425) 4,9-7,4

13.17. Elimination von Ausreißern mit Hilfe des Grubbs-Tests

Die Ergebnisse der Zellzählung der Versuchsreihen A, B und C sind in Kap.

13.15, Tabelle 79 gezeigt. Dabei weichen teilweise Werte deutlich vom Mittel-

wert ab. Der Grund liegt darin, dass mit der Methode zum Aufbringen der Zellen

auf die Probenoberfläche (Suspensionsmethode) nicht reproduzierbar die glei-

che Anzahl Zellen auf unterschiedliche Oberflächen aufgebracht werden kön-

nen. Um eine zuverlässigere Aussage über die Biokompatibilität des zugrunde

liegenden Materials zu gewährleisten, ist die Bestimmung der Ausreißer der

Versuchsreihen sinnvoll. Anschließend wird der Mittelwert der Zellanzahl für die

Versuchsreihen neu bestimmt. Auf diese Weise ist eine genauere Bestimmung

der Proliferationsrate gewährleistet. Eine Methode zur Bestimmung der Ausrei-

ßer für die Versuchsreihen A, B und C ist der Grubbs-Test (84) nach folgender

Vorschrift:

max( )in

x xT

s

mit (Gl. 28)

xi: Zellanzahl auf der i-ten Probe

x : Mittelwert der Zellzahlen aller Proben

13. Anhang 202

s: Standardabweichung aller Zellzahlen

Für die Versuchsreihe A ergibt sich nach Gl. 28 der Testwert TA = 1,984, für die

Versuchsreihe B TB = 1,398 und für die Versuchsreihe C TC = 1,398 (Tabelle

81).

Aus der Grubbs-Tabelle (84) entnimmt man unter Beachtung eines geeigneten

Signifikanzniveaus, hier z.B. α = 5% den festgelegten Schwellwert, der ebenso

von der Anzahl der aufgenommenen Messwerte abhängt. Für Versuchsreihe A

erhält man den Schwellwert SA = 1,82 und für die Versuchsreihen B und C je-

weils den Schwellwert SB = SC = 1,15. Ist der Testwert TA > SA so handelt es

sich bei dem entsprechenden Messwert um einen Ausreißer. Der Vorgang wird

anschließend für die verbleibenden Messwerte wiederholt bis kein weiterer Aus-

reißer ermittelt wurde. Für die Versuchsreihen A, B und C ergeben sich in die

Tabelle 81 aufgeführten Ausreißer.

Tabelle 81: Testwerte des Grubbs-Tests für die Versuchsreihen A, B und C zur Identifikation

von Ausreißern. Als Signifikanzniveau wurde α = 5% gewählt. Aus der Grubbs-Tabelle (84)

erhält man für n = 6 Messwerte und α=5% einen Schwellwert SA = 1,82. Für n = 3 Messwerte

und ebenfalls α=5% resultiert ein Schwellwert SB = SC = 1,15.

Manuelle Zellzählung mit Hilfe der Fuchs-Rosenthal-Zählkammer

Versuchsreihe A Zellanzahl Grubbs-

Testwert VA Ausreißer

Probe A1 48281 0,732 Nein

Probe A2 60563 1,984 Ja





Mittelwert mit Ausreißer 51592

Standardabweichung 4953,4

Mittelwert ohne Ausreißer 49798

Manuelle Zählung gefärbter Zellen mit Hilfe mikroskopischer Bilder

Versuchsreihe B

Zellanzahl Grubbs-

Testwert VB Ausreißer

Probe B1 83117 1,398 Ja

Probe B2 47504 0,884 Nein

Probe B3 53271 0,514 Nein




Automatische Zählung gefärbter Zellen mit Hilfe mikroskopischer Bilder

Versuchsreihe C

Zellanzahl Grubbs-

Testwert VC Ausreißer

Probe C1 81380 1,398 Ja

Probe C2 46702 0,883 Nein

Probe C3 52279 0,516 Nein




203

Tabelle 81 zeigt, nachdem die Ausreißer ermittelt und die Mittelwerte ohne Aus-

reißer neu berechnet werden, resultieren mit 49798 Zellen für Versuchsreihe A,

50388 Zellen für Versuchsreihe B und 49491 Zellen für Versuchsreihe C ähnli-

che Werte.

Publikationsliste 204

Publikationsliste

S. Buhl, B. Neumann, S.C. Schäfer, “Context-Based Separation of Cell Clusters

for the Automatic Biocompatibility Testing of Implant Materials”, Journal of

Computational Medicine, 2014, Article ID 542521 doi:10.1155/2014/542521

S. Buhl, B. Neumann, S.C. Schäfer, A. Severing, “Automatic cell segmentation

in strongly agglomerated cell networks for different cell types”, International

Journal of Computational Biology and Drug Design, 2013, Bd. 6, 1, S. 200 - 220

S. Buhl, B. Neumann, M. Schneider, U. Lehmann, E. Eisenbarth, "Automatische

Segmentierung von Zellkernen und den dazugehörigen Zellen in Zellclustern für

die Biokompatibilitätsprüfung", 20. Workshop Computational Intelligence des

VDI/GMA-FA 5.14 "Computational Intelligence" und der GI-FG "Fuzzy-Systeme

und Soft-Computing" in Bommerholz bei Dortmund, 1.-3. Dez. 2010

S. Buhl, B. Neumann, E. Eisenbarth, "Segmentation Of Cytological Stained Cell

Areas And Generation Of Cell Boundaries In Complex Shaded Cell Clusters",

55.IWK - International Scientific Colloquium, Isle Publisher, Ilmenau, 2010, pp.

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S. Buhl, B. Neumann, A. Grothe, "Bestimmung der Kraftausübung einer opti-

schen Pinzette auf Partikel in flüssiger Umgebung mit Methoden der digitalen

Bildverarbeitung", DGaO-Proceedings 2010 - http://www.dgao-proceedings.de -

ISSN: 1614-8436

S. Buhl, B. Neumann, A. Grothe, "Bewertung verschiedener Methoden zur Un-

tersuchung mikroskopischer Zellbilder mit CV und CI für die Bioverträglichkeit

von Implantatwerkstoffen", DGaO-Proceedings 2010 - http://www.dgao procee-

dings.de - ISSN: 1614-8436

A. Grothe, B. Neumann, S. Buhl, "Smart Illumination für die Detektion von Arte-

fakten auf glänzenden gekrümmten Oberflächen mit digitaler Bildverarbeitung"

DGaO-Proceedings 2010 - http://www.dgao-proceedings.de - ISSN: 1614-8436

S. Buhl, B. Neumann, M. Schneider, U. Lehmann, E. Eisenbarth, T. Weißbach,

"Automatische Segmentierung von mikroskopischen Zellbildern für die Biokom-

patibilitätsprüfung mit Hilfe eines Künstlich Neuronalen Netzes", 19. Workshop

http://www.dgao/

205

Computational Intelligence des VDI/GMA-FA 5.14 "Computational Intelligence"

und der GI-FG "Fuzzy-Systeme und Soft-Computing" in Bommerholz bei Dort-

mund, 2.-4. Dez. 2009

V. Gottfried, U. Lehmann, U. Klug, B. Neumann, M. Schneider, J. Brenig, S.

Buhl, "Simulation von Neuronalen Netzen für E-Learning", 19. Workshop Com-

putational Intelligence des VDI/GMA-FA 5.14 "Computational Intelligence" und

der GI-FG "Fuzzy-Systeme und Soft-Computing" in Bommerholz bei Dortmund,

2.-4. Dez. 2009

Lebenslauf 206

Lebenslauf

Persönliche Daten

Sven Buhl

Alter Schloßweg 29

58119 Hagen

E-Mail: [email protected]

geboren am 11.09.1981 in Menden

Berufliche Erfahrungen

01.06.2012 – heute Infineon Technologies AG, Process Engineer

Projektmanagement von AOI- und AXI-Themen (Automatic Optical Inspection and Automatic Xray Inspection)

Entwicklung von Bildverarbeitungs-Softwaretools

01.2006 – 31.05.2012 Fachhochschule Südwestfalen, wissenschaftlicher

Mitarbeiter

95% Drittmittelprojekt: Koordination des Softwa-reteams, Softwareentwicklung, Algorithmenent-wicklung

5% Arbeit in der Lehre

2002 – 2004 studentische Aushilfskraft bei der LMB GmbH

Einrichten und Bedienen von Laseranlagen zum Schweißen, Schneiden und Beschriften verschiedener Objekte

Studium

2008 – 2015 Fernuniversität in Hagen

Promotion an der Fakultät für Mathematik und In-

formatik bei Prof. Dr. J. Jahns im Bereich Computer

Vision mit dem Thema: Prüfung der Biokompatibilität

von Implantatwerkstoffen mit Methoden der digitalen

Bildverarbeitung

2006 – 2008 Fachhochschule Südwestfalen

Master of Science im Studiengang Computer Vision

and Computational Intelligence (CV&CI)

Masterarbeit: Konzeption und Realisierung einer

modularen Software auf .NET-Basis für die Anwen-

dung im Robot-Vision Bereich

Lebenslauf 207

2002 – 2005 Fachhochschule Südwestfalen

Diplomstudiengang Physikalische Technik

Diplomarbeit: Stabilisierung der Prozesssicherheit

bei der Laserbeschriftung unter Verwendung indust-

rieller Bildverarbeitung

2002 6 Monate Grund- und Fachpraktikum für den Studi-

engang „Physikalische Technik“ an der Fachhoch-

schule Südwestfalen bei der LMB GmbH und dem

Ingenieurbüro Düputell in Iserlohn

Schulbildung

1988 Einschulung in die Grundschule Wesselbach in

Hagen

1992 – 2001 Abitur an dem städt. Gymnasium Hohenlimburg in

Hagen

Eidesstattliche Erklärung 208

Eidesstattliche Erklärung

Ich erkläre hiermit, dass ich diese Dissertation selbstständig ohne Hilfe Dritter

und ohne Benutzung anderer als der angegebenen Quellen und Hilfsmittel ver-

fasst habe. Alle den benutzten Quellen wörtlich oder sinngemäß entnommenen

Stellen sind als solche einzeln kenntlich gemacht.

Diese Arbeit ist bislang keiner anderen Prüfungsbehörde vorgelegt worden und

auch nicht veröffentlicht worden.

Ich bin mir bewusst, dass eine falsche Erklärung rechtliche Folgen haben wird.

_______________________________________________________________

Ort, Datum, Unterschrift

Documents

Prüfung der Biokompatibilität von Implantatwerkstoffen mit ... · Danksagung iv Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei Allen bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit in