PS 8 Electroforeza proteinelor

SC SANYS MEDICAL SRLBUCURESTI

Str. Intrarea Binelui nr.1A. S 4

Procedura specificaELECTROFOREZA

PROTEINELOR SERICEPS-SMC-08

Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 1 /11

Procedura specifica

ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICEPS-SMC-08

Intocmit Verificat AprobatNume Bchim. Paveliuc Carmen Dr. Andronescu C-tin Dr. Manoliu SilviuFunctie RMC Sef laborator DirectorSemnatura/Data 15.10.2009 15.10. 2009 15.10.2009

i.Această copie este difuzată controlat DA X NU

Notă: Procedurile SMC sunt proprietatea SC SANYS MEDICAL SRL şi sunt protejate prin drepturile de copyright. Orice copiere a acestei proceduri sau reproducere parţială este permisă numai cu acordul scris al Directorului.





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 2 /11

FG-01.02

INDICATORUL APROBARILOR SI AL REVIZIILOR

Editie/Reviziadata aplicarii

Numarul capitolului si al paginilor revizuite

Nume, prenume si semnaturaElaborat Verificat Aprobat

Rev.:1/015.10. 2009 Elaborare si aprobare editia 1

R M C Sef lab. Sef lab

FG-01.03

DIFUZARE /RETRAGERE

Destinat : Nr. Ex. Ed./Rev :

Data difuzare/semnatura

Data retragere/semnatura

Sef laborator. 1 1/0 15.10.2009

RMC 2 1/0 15.10.2009

RENAR 3 1/0





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 3 /11

FG-01.04

01.SCOP

Documentul are ca scop descrierea procedurii aplicata in SC SANYS MEDICAL pentru efectuarea electroforezei proteinelor serice, utilizind poba de ser analizata in vitro printr-un sistem semiautomat.

02. DOMENIU

Procedura se aplică in departamentul „Biochimie” in analizele: Determinari ale proteinelor serice.

03. DOCUMENTE DE REFERINŢĂ

Manual operare « PHORESIS CORMAY »Instructiuni de lucru pentru electroforeza proteinelor serice pe suport de gel de agaroza puse la dispozitie de firma producatoare ;Investigatia electroforetica in diagnosticul de laborator – ghid de interpretare – Andreea Chiva, Editura Universitara Carol Davila, Bucuresti 2008 ;A manual of Laboratory Diagnostic Tests, edition 7, by Frances Fischbach, ed. Lippincott Williams & Wilkins, 2004;Biochimie medicala, V.Dinu, E.Trutia, E.P.Cristea, A.Popescu, Editura Medicala, 2006.

04. DEFINITII, TERMINOLOGIE SI PRESCURTARI

Electroforeza proteinelor serice este o metoda de separare a proteinelor plasmatice bazata pe proprietatea proteinelor de a migra intr-un camp electric si de a precipita la punctul izoelectric. Incarcarea electrica a proteinelor este determinata de numarul de aminoacizi cu catene laterale acide sau cu catene laterale bazice. La un anumit pH numit punct izoelectric (pI), numarul gruparilor incarcate pozitiv este egal cu numarul gruparilor incarcate negativ, astfel ca, la un pH mai mare decit pI, proteinele vor fi incarcate negativ, iar la un pH mai mic decit pI, proteinele vor fi incarcate pozitiv.La pH-ul utilizat in electroforeze de 8.6, proteinele plasmatice sunt incarcate negativ si vor migra spre anod cu viteze depinzind de marimea sarcinii.Pe electroforegrama, dupa colorare, proteinele apar ca benzi colorate. Prin masurarea densitatii optice fiecare banda da un maxim de absorbtie.PI – punct izoelectricά1 – alfa 1 globulineά2 – alfa 2 globuline





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 4 /11

ß 1 - beta 1 globulineß 2 - beta 2 globulineγ - gama globuline

05. CONSIDERATIILE DE SECURITATE SI PROTECTIE

05.01. Masuri de protectie a personalului: 1. nu se vor consuma alimente sau bauturi, nu se fumeaza si nu se aplica cosmetice ;

2. alimentele si bauturile vor fi depozitate in locurile amenajate pentru luarea mesei si pentru odihna ; 3. spalarea regulata pe maini la sfarsitul fiecarei etape de lucru sau imediat dupa contaminarea cu materiale chimice, biologice ;

4. bandajarea taieturilor sau a zonelor afectate ale pielii cu materiale rezistente la apa ;5. imbracarea hainelor de protectie de laborator, a manusilor latex, ochelarilor de protectie ;

6. separarea hainelor de strada de echipamentul de protectie, in vestiar, in compartimente separate; 7. majoritatea reactivilor au azida de sodiu cu rol de conservant. Se va evita contactul reactivilor cu pielea si mucoasele ; 8. dotarea trusie de prim ajutor cu materialele necesare.

05.02. Masuri de protectie a pacientului si probei: 1. asigurarea confortului pacientului in timpul recoltei;

2. purtarea echipamentului adecvat de protectie pentru o recoltare care sa fereasca de risc pacientul;3. folosirea sistemelor de recoltare de unica folosinta, in termen de valabilitate;4. folosirea de solutii dezinfectante pentru suprafete si decontaminarea lor in caz de accidente ;

5. pentru transportul probelor biologice va fi respectata Procedura de evitare a incrucisarii circuitelor de lucru.

6. monitorizarea temperaturii in incaperi, termostate, frigidere, a parametrilor sterilizarii uscate si umede; 7. utilizarea de materiale de unica folosinta in contact cu proba.

05.03 . Masuri de protectie a mediului :1. folosirea recipientelor adecvate pentru stocarea temporara a deseurilor infecte si menajere ;2. utilizarea solutiilor dezinfectante pentru instrumente si suprafete ;3. predarea de catre fiecare compartiment a deseurilor infecte rezultate in urma analizelor ;

4. aplicarea masurilor adecvate in caz de contaminare a suprafetelor cu reactivi sau produse biologice ;

5. decontaminarea tuturor suprafetelor de lucru la sfarsitul zilei de lucru ; 6. verificarea parametrilor de temperatura si presiune pentru sterilizarea la autoclav si etuva folosind controalele (consemnarea procedurilor in registrele respective).





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 5 /11

06. ECHIPAMENT SI MATERIALE

1. Echipament, materiale: Sistemul PHORESIS

Sistemul permite efectuarea electroforetica de: PROTEINE, - Sistemul realizeaza operatiile de migrare si interpretare a migrarilor electroforetice de proteine serica - In analiza sunt utilizate geluri de agaroza, sistemul fiind deschis, adica citeste toate formatele de geluri agaroza;

- Aparatul confera precizie si siguranta prin calibrarea proprie a metodei si prin softul performant din dotare ( comunicare usoara cu utilizatorul).

- Pornirea aparatului se face in urmatoarea ordine: interconectarea corecta a componentelor, pornirea propriu zisa, care se face in urmatoarea ordine: cititor, imprimanta, unitate centrala.

- Selectarea tipului de anliza: proteine, - Operatii executate pentru obtinera analizelor: developare gel de analiza, pornirea

procesului de migrare, citirea gelului de analiza, trasare histograma, pozitionare fractii, completare date pacient, salvare analiza, operatii cu baza de date.

- Gestionarea pacientilor si rezultatelor se face in baza soft- ului, care permite : evidenta pacientilor dupa varsta si sex, evidenta rezultatelor analizelor in functie de pacient si data efectuarii acestora ;

- Imprimanata compatibila Reactivi de lucru :

- Tampon veronal concentrat - Colorant concentrat (amido black)- Solutie concentrata de decolorare- Benzi de plastic cu fante pentru aplicarea serului- Benzi de hartie de filtru

Pipete semiautomate de 5 -100ml

Materiale: vacuete de biochimie, varfuri de unica folosinta, tuburi Eppendorf, recipiente pentru reactivi.

2. Softul utilizat 3. Resurse : vata, spirt, conuri de unica folosinta, vacutainer biochimie, ac dublu de recoltare, hirtie de filtru, 4 recipiente pentru a le umple cu reactivi.

07. REGULI DE PROCEDURA

Fluxul activitatilor incepand cu preluarea informatiilor de la client si terminand cu inactivarea deseurilor, este urmatorul :





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 6 /11

preluarea cerintelor clientului ; analiza capabilitatii laboratorului de a efectua analizele solicitate in baza ‘Registru de analiza capabilitate ‘ FG-07-02 si clarificare asupra cerintelor si asteptarilor referitoare la serviciu ce urmeaza a fi prestat ; inregistrarea comenzii ; recoltarea / receptia probei efectuata conform procedurii PGS-SMC-17; predarea / primirea probelor; punerea probei in lucru - prelucrarea probei; elaborarea fisei de determinare a analizei; validarea rezultatelor; introducerea datelor in calculator; predarea catre client a Buletinului de analiza; predarea la sfarsitul perioadei de lucru a deseurilor infecte in vederea inactivarii.

08. METODA DE LUCRU

8.1. Testare ; PregatireElectroforeza pe gel de agaroza (Cormay –Gel Protein 100) permite separarea fractiunilor

albumine, alfa1, alfa 2 globine, beta1, beta 2 globine si gamma globuline din serul sanguin.Proteinele serice intr-un mediu bazic cu pH-8.6 sunt incarcate negativ, migrand intr-un camp electric spre anod. Pe electroforegrama, dupa colorare, proteinele apar ca benzi colorate. Prin masurarea densitatii optice a electroforegramei fiecare banda da un maxim de absorbtie.

- activarea echipamentului Se urmareste procedura de mentenata a sistemului pentru :

a. Bransarea la prizele de curent (100-220V si 50-60Hz)b. Pornirea baii de migrarec. Verificarea indicatorilor de status initial

- intretinere curenta- Sursa de alimentare cu energie este conforma cu reglementarile nationale - Schimbarea solutiilor de lucru regulat, conform instructiunilor de operare pentru

electroforeza- Spalarea bai de migrare cu apa distilata dupa ce s-a inlaturat tamponul din cuva ;- Spalarea suportului cu apa de la robinet si apoi cu solutie de dezinfectare dupa

efectuarea fiecarei utilizari

- calibrareAparatul este calibrat de catre producator. Reprezentantul firmei realizeaza calibararea aparatului atunci cand se doreste modificarea factorului de calibrare.Controlul de calitate:

Se foloseste ser de control cu nivel normal si patologic al valorilor, iar rezultatele obtinute trebuie sa se incadreze intre limitele din prospectul lotului folosit.

Serul de control se prepara conform instructiunilor:





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 7 /11

- se aduce mai intai la temperatura camerei - se dizolva cu apa demineralizata - dupa dizolvare se lasa aproximativ 30 de minute la temperatura camerei si se agita din cand in cand. - dupa dizolvarea completa se portioneaza in criotuburi si se introduce in congelator fiind valabil 30 de zile.

Serul de control se migreaza odata cu probele care trebuie testate si se scaneaza ca si o proba de pacient. La fiecare 12 probe lucrate se recomanada includerea unui ser de control pentru fiecare nivel, normal si patologic; Dupa efectuarea mai multor seruri de control (minim 6) vom obtine curbelele Levey- Jennings pentru fiecare fractiune proteica, plus deviatie standard si coeficient de variabilitate. Calitatea rezultatelor determinate se asigura conform PGS-SMC-11 Asigurarea calitatii rezultatelor.

- atentionari (precautii)

Unii reactivi pot conţine azidă de sodiu. Azidele de sodiu pot reacţiona cu tubulatura din plumb sau cupru a instalaţiilor sanitare, formând azidele metalice care sunt foarte explozive. Pentru evitarea formării acestor amestecuri explozive, reactivi trebuie diluaţi cu foarte multă apă după efectuarea testărilor.

Se vor citi cu atenţie informaţiile referitoare la reactivii toxici sau cu risc biologic specificate în prospectul de lucru al reactivului

In contact cu proba se utilizeaza materiale de unica folosinta. Nu se folosesc reactivii dupa expirarea termenului indicat pe eticheta. Probele pot fi pastrate la 2-8 0C pana la 7 zile si la –200C pentru mai mult timp. Nu se vor inghe-

ta de 2 ori.

Pregatirea reactivilor -

a) Gelul de agaroza este gata de utilizare; b) Tamponul– fiecare flacon de tampon concentrat se va dilua pana la un litru cu apa demineralizata; c) Colorantul - flaconul de solutie concentrata se dilueaza la 300 ml cu apa demineralizata; d) Decolorantul – flaconul cu decolorant se va dilua 1/1000 cu apa demineralizata; e) Solutia de fixare-se amesteca 135 ml de etanol,30 ml acid acetic glacial si 135 ml dee apa distilata.Solutia de fixare trebuie preparata cu cel putin 15 minute inainte de folosire.Are o stabilitate de 3 luni la temperatura camerei in recipient bine inchis.

Pregatirea baii de migrare:





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 8 /11

-se pun 300 ml solutie tampon de migrare in cele 2 compartimente ale cuvei, cate 150 ml in fiecare compartiment. Probele de analizat:

- probele se lasa pe masa la temperatura camerei;- verificarea identificarii corecte;

-se resping probele neconforme;-analiza se efectueaza cu ser proaspat,diluat cu tampon diluat(1+6),diluat chiar inainte de

folosire -serul poate fi pastrat in frigider (2-8 grade) timp de o saptamana;-nu se folosesc serurile hemolizate sau plasma;

Migrarea-se scoate gelul din ambalaj si se aseaza pe o foaie de hartie sau o hartie de filtru;-se elimina rapid excesul de lichid de pe suprafata gelului cu hartie de filtru.Indepartati hartia

de filtru imediat ce s-a umezit-plasati sablonul pentru probe pe gel(astfel incat cele doua puncte de pe gel sa corespunda fantelor);

-presati usor cu degetul in lungul sablonului pentru a adera la gel ,fara a face bule de aer intre gel di sablon.

-aplicati 5 uL de ser diluat pe fiecare fanta si lasati serul sa difuzeze complet(cam 5 minute dupa pipetarea ultimei probe)

-indepartati excesul de ser cu hartie de filtru.-scoateti sablonul pentru-curbati placuta de agaroza si plasati-o in cuva de migrare,cu fata in jos,cu probele la capatul

catodic(-)- inchideti cutia de migrare cu capacul.se-porniti electroforeza la 100V timp de 20 minute(Cormay S-20)-dupa migrare se deconecteaza baia si se scoate gelul.

FixareaFixarea se face imediat dupa migrare prin cufundareabplacutelor in solutia de fixare timp de 15 minute,in pozitie verticala.Apoi se usuca gelul cu jet de aer cald la 80 de grade sau la etuva pana la uscarea completa.

ColorareaSe introduce gelul perfect uscat si adus la temperatura camerei in solutia de colorare timp de 10 minute.

DecolorareaSe decoloreaza in 3 bai succesive pana se obtine fondul gelului perfect clar.Se usuca gelul la jet de aer cald timp de 10 minute. Se lasa apoi gelul sa se raceasca la temperatura camerei 10-15 minute.





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 9 /11

CitireaCitirea se efectueaza cu ajutorul unui densitometru/scanner cu filtru galben la 570nm;Se vizualizeaza curbele pentru fiecare proba;Se printeaza si se arhiveaza rezultatele partiale tiparite de imprimanta analizorului.

8.2. Neutralizare / inactivareDeoarece deseurile infectioase sunt un potential pericol pentru sanatatea personalului de

laborator, acestea parasesc incinta laboratorului la sfarsitul programului de lucru in saci de plastic de culoare galbena si sunt depozitate temporar in incinta speciala, de unde urmeaza a fi ridicate spre inactivare si incinerarare de catre firma cu care laboratorul are contract.

09. NOTE SI CODURI EROARE

Codurile de eroare se gasesc la capitolul « Erori » din manualul de utilizare al aparatului. 10. NOTE DEFECTIUNI

Defectiunile sistemului se noteaza in registru ( fisa echipamentului nr. 2).Se folosesc sisteme de siguranta (stabilizator de tensiune).

11. CALCULAREA REZULTATELOR

Rezultatele sunt efectuate automat de catre densitomertu . Rezultatele sunt exprimate sub forma de concentraţii procentuale, considerând că suma tuturor concentraţiilor fracţiilor proteice depistate trebuie să fie egală cu 100% si sub forma de valori absolute. 12. RAPORTAREA SI SEMNIFICATIE CLINICA

Valorile de referinţă sunt valorile normale corespunzătoare pacienţilor sănătoşi. Sunt luate în considerare următoarele valori de referinţă

Fractii Valori procentuale de referinta ( % )

Valori absolute de referinta ( g/l )

ALBUMINA 53 - 66 3.9 – 6ALFA 1 2 – 5,5 0.1 – 0.23ALFA 2 6 - 12 0.45 – 0.85BETA globuline 8 - 15 0.4 – 0.8GAMMA 11-21 0.55 – 1.4

Variatiile concentratiilor fractiunilor majore au corespondenta in diferite stari patologice:a) Albumina :





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 10 /11

Creşterea fracţiei albuminei se constată în:- alimentaţie excesivă;- mielom multiplu, boala Waldenström, colagenoze, sarcoidoză;;- stări de hemoconcentraţiei şi deshidratare (vărsături, diaree, transpiraţii abundente) – creştere relativă;- după administrarea unor medicamente (corticosteroizi, insulină, steroizi anabolici, mialgin, morfină, tiroidă);

Scăderea fractiei albuminei se întâlneşte în:- deficit de aport proteic (inaniţie, subnutriţie);- tulburări de digestie şi de absorbţie proteică (vărsături, diaree cronică, boli de pancreas, operaţii pe stomac sau duoden);- stări de hipercatabolism proteic (boli febrile, hiperfuncţia glandei tiroide, efort fizic intens, sarcină);- deficit de sinteză a albuminelor în suferinţe hepatice;- pierderi de proteine: nefrite, sindrom nefrotic, hemoragii, arsuri, necroze, după operaţii chirurgicale;- după intoxicaţii cu benzen, tetraclorură de carbon;- după administrarea unor medicamente: anticoncepţionale, salicilaţi;- stări de hiperhidratare şi stări edematoase – scăderi relative;

b) Alfa -1-globulina :

Creşterea fracţiei ά1-globulinei apare în infecţii acute şi cronice, glomerulonefrită acută şi cronică, poliartrită, lupus eritematos;

Scăderea fracţiei ά1-globulinei apare în insuficienţă hepatică acută şi în sindrom nefrotic;

c) Alfa-2- globulina : Creşterea fracţiei ά2-globulinei apare în glomerulonefrită acută şi cronică, sindrom nefrotic,

tumori maligne, reumatism articular acut, poliartrită reumatoidă, hepatită acută, infarct miocardic, lupus eritematos;

d) β-globulinele :

Creşterea fracţiei β-globulinelor apare în hepatite virale, ciroze hepatice, glomerulonefrită acută, anemii de diverse etiologii, preinfarct şi infarct miocardic, sindrom nefrotic, neoplasme

Scăderea fracţiei β-globulinelor apare în boli inflamatorii acute şi mai ales cornice;Fractiunea beta 1 corespunde transferinei si beta lipoproteinelor, fractiunea beta 2 corespunde complementului C3.

e) Gamma-globulina:





Ed./Rev.: 1/0

Pagina nr. 11 /11

Creşterea fracţiei γ-globulinei apare în procese inflamatorii cronice (infecţioase şi imune), hepatită acută şi cronică, ciroză, glomerulonefrită, poliartrită reumatoidă, boli cronice (TBC, SIDA), parazitoze, tumori maligne, colagenoze, sarcoidoză.

13. ATRIBUŢII ŞI RESPONSABILITĂŢI

Operator receptie - inregistreaza probele in Sistemul Informatizat al Laboratorului ;Asistent medical - recolteaza proba, o inscriptioneaza, o pregateste pentru lucru ; - asigura eliminarea deseurilor Biochimist - efectueaza calibrarile şi controalele pe care le interpretează si arhiveaza; - efectuează determinările parametrilor solicitaţi pentru fiecare pacient, conform listei de lucru; - verifică calitatea probelor şi face specificaţii în legătură cu acestea (probe hemolizate, lipemice, icterice sau incorect recoltate); - determina incertitudinea de masurare; - inregistreaza rezultatele in softul de laborator; - efectuează operaţiunile de întreţinere pentru analizoare conform fisei de mentenanta; - anunţă eventualele defecţiuni ce necesită intervenţia service-ului specializat; - arhiveaza rezultatele partiale tiparite de imprimanta analizorului; - valideaza tehnic rezultatele; - tine evidenta materialelor ;Sef laborator - verifică prin sondaj corectitudinea executării analizei, controalelor şi calibrărilor; - verifică incertitudinea de măsurare; - verifică prin sondaj monitorizarea condiţiilor de lucru; - supravegheaza si controleaza intretinerea analizorului si anunta firma de service in caz de nevoie; - valideaza rezultatele din punct de vedere biologic.

14. ÎNREGISTRĂRILE calităţii sunt mentinute conform Procedurii Generale “Controlul inregistrarilor“cod PGS-SMC-02.

formular Cod ArhivareRegistru rezultate biochimie FS-07-01 3 aniCererea de analiza FG-11-01 3 aniRaport de analiza FG-11-02 3 ani

Documents

PS 8 Electroforeza proteinelor