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Efeitos do extrato da folha de Punica granatum, L. sobre o
crescimento de células planctônicas, na formação de biofilme e
sobre biofilmes pré-formados em isolados orais de Candida albicans
de pacientes com AIDS.
Priscilla Maria Fernandes Abdala de Alencar
2016
Priscilla Maria Fernandes Abdala de Alencar
Efeitos do extrato da folha de Punica granatum, L. sobre o
crescimento de células planctônicas, na formação de biofilme e
sobre biofilmes pré-formados em isolados orais de Candida albicans
de pacientes com AIDS.
São Luis
2016
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária da
Universidade CEUMA, para obtenção do título
de Mestre em Biologia Parasitária.
Área de Concentração: Microbiologia.
Orientadora: Profa. Dra. Cristina de Andrade
Monteiro
Alencar, Priscilla Maria Fernandes Abdala de.
Efeitos do extrato da folha de Punica granatum, L. sobre o crescimento de
células planctônicas, na formação do biofilme e sobre biofilmes pré-formados
em isolados orais de Candida albicans de pacientes com AIDS. / Priscilla Maria
Fernandes Abdala de Alencar. - São Luís: UNICEUMA, 2016.
66p.:il.
Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) – Programa de Pós-
Graduação em Biologia Parasitária. Universidade CEUMA, 2016.
1. P. granatum. 2.C. albicans. 3. Biofilme. I. Monteiro, Cristina de Andrade
(Orientadora). II. Monteiro, Andrea de Souza. (Cordenadora). III. Título.
CDU: 578.876:616.98
A368e
Nome: Priscilla Maria Fernandes Abdala de Alencar
Título: Efeitos do extrato da folha de Punica granatum, L. sobre o
crescimento de células planctônicas, na formação de biofilme e
sobre biofilmes pré-formados em isolados orais de Candida albicans
de pacientes com AIDS.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Biologia Parasitária da Universidade CEUMA para obtenção do título
de Mestre.
Aprovado em: _____∕_____∕_____
Banca Examinadora
Prof. Dr. _________________________________
Instituição: _______________________________
Assinatura: _______________________________
Prof. Dr. _________________________________
Instituição: _______________________________
Assinatura: _______________________________
Prof. Dr. _________________________________
Instituição: _______________________________
Assinatura: _______________________________
DEDICATÓRIA
A Deus que está sempre comigo, me dando forças e me mostrando
sempre as melhores escolhas, o melhor caminho.
Aos meus pais, marido, filho e irmãs, os meus alicerces, pelo amor e
apoio incondicional.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a minha orientadora, Profa. Dra. Cristina de Andrade
Monteiro pelos ensinamentos, pelo auxílio e disponibilidade durante
o desenvolvimento deste trabalho.
Aos alunos do laboratório de Micologia da Universidade Ceuma que,
ao longo desses anos construímos, além da amizade, um dia-a-dia
saudável e de respeito mútuo.
Alencar PMFA. Efeitos do extrato da folha de Punica granatum, L.
sobre o crescimento de células planctônicas, na formação de
biofilme e sobre biofilmes pré-formados em isolados orais de
Candida albicans de pacientes com AIDS.
[dissertação]. São Luís. Universidade CEUMA; 2016.
RESUMO
Introdução: Nas últimas décadas, o número acentuado de
infecções fúngicas tem sido associado ao aumento da população
imunocomprometida. O tratamento da candidíase é um desafio
clínico, principalmente para os pacientes imunossuprimidos devido
às condições da doença, número limitado de agentes antifúngicos
disponíveis, e os efeitos colaterais indesejáveis e toxicidade de
alguns, surgimento de isolados resistentes e recorrência das
manifestações. Consequentemente, as moléculas que podem ser
derivadas a partir de fontes naturais e que possuem propriedades
antifúngicas são de interesse uma vez que podem representar uma
alternativa adequada para limitar este processo. Objetivo: o
presente estudo teve como objetivo avaliar as atividades
antifúngicas e antibiofilme do extrato de folhas de P. granatum
contra isolados de C. albicans de mucosa bucal de pacientes com
AIDS. Material e Métodos: Extrato hidro alcoólico foi obtido à partir
de folhas da P. granatum no qual foi submetido a análise fitoquímica,
avaliação de atividade antifúngica por método ágar difusão,
determinação do CIM e análise do efeito do extrato hidroalcóolico
sobre o biofilme em formação e pré-formado em isolados clínicos de
Candida albicans e ATCC. Resultados: A análise fitoquímica
revelou a presença de vários compostos secundários com potencial
efeito antimicrobiano. O ensaio antifúngico pelo método de
microdiluição demonstrou atividade contra todos os isolados de C.
albicans testados, incluindo a amostra padrão de referência ATCC
18804, com CIM de 8,0mg\ml (amostra 35), 4,0 mg\ml (amostra 46),
8,0mg\ml (amostra 48) e 4,0mg/ml (ATCC 18804). O efeito do
extrato sobre o biofilme em formação e o biofilme pré-formado foi
dependente da amostra. Conclusão: Os resultados sugerem que o
extrato hidroalcoólico obtido a partir de folhas de P. granatum possui
compostos bioativos com potenciais efeitos anti-Candida e
antibiofilme, inibindo o crescimento de células planctônicas,
interferindo na formação de biofilmes por Candida albicans e
interrompendo biofilmes pré-formados.
Palavras-chave: P. granatum. C. albicans. Biofilme.
Alencar PMFA. Effects of Punica granatum, L leaves extract on
planktonic cells growth, biofilm formation and on pre-formed biofilms
of Candida albicans oral isolates from AIDS patients.
[dissertation]. São Luis. Universidade CEUMA; 2016
ABSTRACT
Introduction:In last few decades, the sharp increase of fungal
infections observed has been linked to the immunocompromised
population growth. Treatment of candidiasis is a clinical challenge
mainly for immunosuppressed patients due the conditions of illness,
limited number of available antifungal agents, and undesirable side
effects and toxicity of some, emergence of resistant strains and
recurrence. Therefore, molecules that derives from natural sources
and that possess antifungal properties are of interest as they may
represent a suitable alternative to limit this process. Objective: the
present study aimed to evaluate the antifungal and antibiofilm
activities of hydroalcoholic extract of leaves of P. granatum against
C. albicans isolates from oral mucosa of patients with AIDS. Material
and Methods: It was obtained alcoholic hydro extract from the
leaves of P. granatum in which it was subjected to phytochemical
analysis, evaluation of antifungal activity by agar diffusion method,
determination of MIC and analysis of the effect of hydroalcoholic
extract on the biofilm formation and preformed in clinical isolates of
Candida albicans and ATCC. Results: Phytochemical analysis
revealed the presence of several secondary metabolites with
potential antimicrobial effect. The antifungal assay by microdilution
method demonstrated activity against all isolates of C. albicans
tested, including laboratorial strain ATCC 18804 with MIC of 8.0 mg \
ml (sample 35), 4.0 mg \ ml (sample 46 ), 8.0 mg \ ml (clinical strain
48) and 4.0mg / ml (ATCC 18804). The effect of extracts on biofilm
formation and pre-formed biofilm was dependent on the sample.
Conclusion: the results suggest that hydroalcoholic extract obtained
from P. granatum leaves has bioactivity compounds with potential
anti-Candida and antibiofilm effects, inhibiting planktonic cells
growth, interfering the formation of biofilms by Candida albicans and
disrupting pre-formed biofilms.
Key-words: P. granatum. C.albicans. Biofilm.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Tabela 1: Composição Fitoquímica do Extrato hidroalcóolico da folha de Punica
granatum L.
SUMÁRIO
1. Capítulo 1 12
2. Introdução 13
3. Material e Métodos 15
4. Resultados 20
5. Discussão 22
6. Conclusão 28
7. Referencias 28
8. Ilustrações 36
9. Comitê de Ética 41
10. Introduction 42
11. Material and Methods 44
12. Results 49
13. Discussion 51
14. Conclusion 57
15. Ilustrations 58
16. Normas da Revista 63
CAPÍTULO 1
EFEITOS DO EXTRATO DA FOLHA DE Punica granatum, L.
SOBRE O CRESCIMENTO DE CÉLULAS PLANCTÔNICAS, NA
FORMAÇÃO DE BIOFILME E SOBRE BIOFILMES PRÉ-
FORMADOS EM ISOLADOS ORAIS DE Candida albicans DE
PACIENTES COM AIDS.
INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, o aumento acentuado de infecções fúngicas,
tem sido associado ao crescimento da população
imunocomprometida [1]. Candida albicans é a espécie mais
freqüentemente isolada em humanos [2,3,4,5] e a candidíase
orofaríngea (OPC) continua a ser a infecção oportunista mais
prevalente entre os pacientes portadores da AIDS, em muitos países
em desenvolvimento, como os da América latina e África [6,7].
Estima-se que 91% dos pacientes que convivem com a AIDS por um
longo período, apresentam vários episódios por ano de OPC [8,9].
Destes, 10% a 49% morrem de infecção fúngica [8,10].
O tratamento da candidíase representa um desafio médico significativo,
principalmente para os pacientes imunossuprimidos, devido às condições
da doença, número limitado de agentes antifúngicos disponíveis, os
efeitos colaterais indesejáveis além da toxicidade de alguns, surgimento
de cepas resistentes e recorrência [11]. Além disso, há a resistência
antifúngica mediada pela formação de biofilmes, um fenômeno bem
relatado na literatura e conferido às espécies de Candida, e que,
provavelmente, contribui para o aumento de sua patogenicidade [12,13].
Consequentemente, os produtos derivados a partir de fontes naturais e
que possuem propriedades antifúngicas passam a ser de grande
interesse, uma vez que podem representar uma alternativa adequada
para limitar este processo [12].
A Punica granatum (romã) é uma pequena árvore nativa da Ásia e
cultivada na região do Mediterrâneo, China, Índia, África do Sul e
Américas e tem sido amplamente utilizada na medicina popular para o
tratamento e prevenção de muitas doenças como a inflamação e cancro,
ulceração gástrica, diarréia, febre, infecções microbianas, entre outras
[14].
A atividade antimicrobiana da romã tem sido investigada e vários
estudos sugerem que os seus compostos bioativos pode ser uma opção
viável no controle do crescimento de diferentes espécies microbianas,
principalmente bactérias [15,16,17,18,19,20,21,22]. No entanto, a maioria
das pesquisas tem se concentrado em suas propriedades antioxidantes,
anticancerígenas e anti-inflamatórios [23].
Existem poucos estudos com fungos [16,21,24,25] e, a maioria destes,
estão relacionados com extratos preparados a partir de sementes,
pericarpo, cascas e a partir do fruto inteiro, sendo raros aqueles
relacionados à atividade antifúngica de folhas de extratos hidroalcoólicos.
A romã é uma rica fonte de compostos bioativos, especificamente
compostos polifenólicos e taninos [26]. A punicalagina, isolada a partir da
casca do fruto da romã, foi relatada por apresentar atividade
antimicrobiana contra isolados de Candida albicans [22]. Dependendo da
metodologia utilizada nestes estudos e até mesmo o tempo da colheita,
diferentes constituintes metabólitos podem ser encontrados, incluindo:
ácido ascórbico, ácido gálico, ácido cafeico, punicalagina, esteróides,
taninos, alcalóides, flavonóides, entre outros [23].
Portanto, tendo em vista a riqueza de fontes naturais e as várias
observações sobre o uso popular e científico desta espécie de planta,
bem como, a busca por novos antifúngicos e/ou substâncias que possam
interagir com os tratamentos já conhecidos a fins de inibir ou desagregar
a formação do biofilme (considerado importante fator de virulência de
algumas espécies do gênero Candida); o presente estudo teve como
objetivo avaliar as atividades antifúngicas e antibiofilme do extrato de
folhas de P. granatum contra isolados de C. albicans de mucosa bucal de
pacientes com AIDS.
MATERIAL E MÉTODOS
Obtenção e preparo das folhas de Punica granatum L.
As folhas de Punica granatum L. foram coletadas no Herbário Ático
Seabra da Universidade Federal do Maranhão – UFMA às 06:00 após
estiagem de 24 horas. As folhas foram limpas com papel toalha e
selecionadas. Descartaram-se as folhas já secas ou com fungos para
posterior processo de secagem in natura das mesmas. Após 72 horas, as
folhas foram trituradas em moinho elétrico e o pó obtido foi medido em
proveta graduada para posterior extração dos metabólitos presentes.
Preparação do extracto hidroalcoólico de folhas de P. granatum
O processo de extração de metabólitos das folhas foi realizado por
maceração, utilizando-se uma mistura de álcool etílico e água destilada
(solução hidro alcoólica 70%) como solvente. O volume do solvente
utilizado foi três vezes superior ao volume do soluto (pó das folhas). A
mistura foi feita em frasco âmbar fechado e mantido em constante
agitação. Após 72 horas foi realizada a primeira filtragem do extrato, com
auxílio de um funil e papel filtro. O volume filtrado foi medido em proveta
graduada e o obtido foi então reposto com mais solvente para a mistura
inicial. O mesmo processo foi repetido mais duas vezes sempre a cada
três dias, sendo que na terceira vez foi obtido o filtrado final da maceração
e a solução obtida das três filtragens foi misturada e medida. Após esse
processo de extração, o volume obtido foi submetido à rota evaporação
para a eliminação da fração alcoólica do extrato. O resultado final foi
então liofilizado e estocado à -20º C.
Análise Fitoquímica do Extrato.
Parte do extrato hidro alcoólico foi submetido à análise fitoquímica à
partir de testes colorimétricos semi-qualitativos como já descrito
anteriormente [27], para determinação dos compostos secundários
presentes no extrato hidro alcoólico.
Populacão, amostra e condições de cultura
Amostras clínicas de Candida foram coletadas da mucosa oral de 52
pacientes com AIDS, recrutados em um hospital público de referência na
cidade de São Luís, Maranhão, Brasil (Comitê de Ética da Universidade
Federal do Maranhão processo nº 23115006540/2009-40). Os pacientes
portadores da AIDS tinham contagens de células CD4 + variando de 10 a
552 células/mm³ e carga viral 2567-256860 cópias/ml. Todos os pacientes
tinham candidíase orofaríngea, 52,2% já haviam utilizado antifúngico e,
destes, 75% estavam usando tanto fluconazol quanto nistatina e 8,3%
fluconazol, nistatina e anfotericina B. Os isolados de Candida albicans
foram previamente identificados por CHROMagar Candida® (BioMerieux,
França) e mais tarde pelo sistema automatizado VITEK YBC (BioMerieux,
França). Os isolados foram mantidas em BHI (Brain Heart Infusion) mais
15% de glicerol a -20 ° C [28]. No momento da utilização, os isolados
foram crescidos a 37 ° C em caldo de dextrose de Sabouraud (DIFICO®,
Detroit, Michigan, EUA) mais cloranfenicol, lavadas em solução salina
tamponada com fosfato (PBS) (Sigma-Aldrich, Poole, Reino Unido) por
centrifugação e, em seguida, ressuspendidas em PBS padronizado para
cerca de 10 UFC/mL de acordo com a gama de turbidez McFarland 0.5
com o mesmo volume inicial. Três isolados clínicos de Candida albicans
(C. albicans 35, C. albicans 46, C. albicans 48) e uma amostra de
referência: C. albicans ATCC 18804 foram utilizadas nos testes.
Análise da atividade antifúngica pelo método Ágar difusão
O teste utilizado para verificar a atividade antimicrobiana de extracto de
folha de romã, foi realizado pelo método Ágar Difusão, de acordo com a
CLSI M44-A padrão [29], com adaptações. Placas de Petri contendo SDA
foram utilizadas e inoculadas com inóculo padrão. Em seguida, pequenas
perfurações na superfície do ágar, foram realizadas em que 50 μl de
extrato bruto (90 mg/mL) foram pipetadas e as placas foram incubadas a
37ºC durante 48 hours. As zonas de inibição foram medidas como
indicadores de atividades. Todos os testes foram realizados em triplicata
e repetidos duas vezes. O Fluconazol (128 ug/ml) foi usado como droga
padrão. O diâmetro da zona de inibição em torno de cada pequena
cavidade foi medida e registrada no final do período de incubação. Foi
realizada uma média dos testes em triplicata.
Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM)
Concentrações de estoque do extrato bruto foram preparadas em água
bidestilada (90 mg/mL). Duas diluições em série (32 a 64 mg/ml) do
extrato foram feitas em uma placa de fundo plano estéril de microdiluição
(96 poços) contendo 100 µl de meio de cultura (YNB). A atividade
antifúngica do extrato sobre os isolados de C. albicans, foi avaliada nos
termos da concentração inibitória mínima (MIC), pelo teste antifúngico de
microdiluição proposto pelo Clinical and Laboratory Standards Institute
(CLSI) [29], método M27-A3.
Os inóculos (100 µl) foram adicionados a cada poço das
microplacas, contendo extrato em várias concentrações e foram
incubados a 37 ° C durante 48 h. As concentrações inibitórias mínimas
(CIM) foram determinadas após a leitura, em um leitor de microplacas
(leitor de bioMérieux 250 Versão 2.0.5) a 450 nm. As densidades ópticas
(DO) foram determinadas como a média de três experimentos. A DO da
amostra de controle (sem extrato) foi comparada ao ODS de diferentes
concentrações do extrato e os MICs foram definidos como a concentração
mais baixa do extrato, que causou noventa porcento de redução na
absorbância, em comparação com a do controle.
Efeito do Extrato hidroalcoólico da Romã sobre a formação de
biofilme e biofilmes pré-formados de C. albicans.
Os biofilmes foram preparados como descrito anteriormente [30],
em placas de 96 poços de microtitulação de poliestireno de fundo plano
pré-esterilizados (TPP). Suspensões celulares padronizadas de C.
albicans em PBS (100 ul) foram transferidas para os poços das
microplacas e incubadas a 37 ° C durante 1,5 h para permitir a adesão
das células na superfície. Após a fase de adesão, os poços foram lavados
duas vezes com PBS para remover as células não aderidas. Meio de YNB
fresco (200µl) contendo diferentes concentrações (64mg\ml; 32mg\ml) de
extrato de Romã foram adicionados em cada poço e incubados por
24horas a 37ºC. Para verificar o efeito do extrato sobre o biofilme pré-
formado, foi preparado biofilme de C. albicans durante 24 h a 37 ° C tal
como descrito acima. Posteriormente, as células foram lavadas com PBS
e 200 µl de meio fresco de YNB foi adicionado com diferentes
concentrações do extrato. Após isto, a Placa foi incubada durante 24 h a
37ºC. Meio de YNB com inóculo e meio YNB com o fluconazol (4 µg/ml)
foram incluídos nos poços como controle. Após o período de incubação,
os poços foram lavados para remover as células planctônicas, o biofilme
foi fixado com 99% de metanol (300 µl) durante 15 minutos e depois
lavado por três vezes com água destilada e deixado secar à temperatura
ambiente.
As placas foram incubadas por 20 minutos a 37ºC com 200µl de
Cristal Violeta 1%, lavados em água corrente e secos. O corante
remanescente dos poços foi adicionado com 150 µl de etanol 95% e, na
sequencia, 100µl de cada mistura foi transferida a uma nova placa de 96
poços [31]. A análise quantitativa da adesão das leveduras foi realizada
através da leitura de absorbância dos poços em um leitor de microplacas
(bioMérieux Reader 250 Version 2.0.5) a 570nm. Todos os experimentos
foram realizados em duas ocasiões diferentes e com seis repetições.
Análise Estatística
Para verificar a interação das variáveis amostras clínicas, formação
de biofilme e concentrações do extrato, foi feito um teste de Análise de
Variância com estes três fatores, com interação entre eles (ANOVA).
Havendo efeito significativo, avaliou-se as variáveis separadamente pelo
teste pos hoc de Tukey.
RESULTADOS
Análise Fitoquímica
A análise fitoquímica do extrato revelou a presença de fenóis,
taninos hidrossolúveis, flavonóides, flavonas, flavonóis, xantonas;
esteróides; saponinas, chauconas e auronas, cujos valores detectados
foram classificados como fracamente positivo (+), moderadamente
positivo (++) e fortemente positivo (+++) (Tabela 1).
Atividade antifúngica através do método Ágar difusão
Os resultados do teste de difusão em ágar mostraram que os
diâmetros de zona de inibição variaram entre 11 e 27 mm e os maiores
diâmetros médios foram observados contra o isolado 46 (23,83mm) e
estirpe de referência Candida albicans ATCC 18804 (23,16mm). Os
diâmetros médios da zona de inibição de HepG de todas as amostras
testadas foi significativamente mais elevada do que a de fluconazol.
(Figura 1).
Determinação da concentração inibitória Mínima (CIM)
Como mostrado na Figura 2, o ensaio antifúngico pelo método de
microdiluição demonstrou atividade contra todos os isolados de C.
albicans testados, incluindo a amostra padrão de referência ATCC 18804,
com CIMs de 8,0mg\ml (amostra 35), 4,0 mg\ml (amostra 46), 8,0mg\ml
(amostra 48) e 4,0mg/ml (ATCC 18804).
Efeito do extrato hidroalcóolico da folha de Romã sobre a formação
do biofilme.
A interferência do extrato bruto das folhas de Punica granatum
sobre o início de formação do biofilme dos isolados de C. albicans foi
avaliada pela análise com cristal violeta. O efeito do extrato foi
dependente da amostra. As amostras 35 e 48 tiveram o progresso de
formação de biofilme reduzido em mais de 50% na concentração de 32
µg/mL. As amostras ATCC e 46 não apresentaram redução sob à ação do
extrato em ambas as concentrações utilizadas. Não houve diferença na
formação de biofilme com relação às concentrações diferentes do extrato
utilizadas (Figura 3). O teste ANOVA confirma estes resultados mostrando
uma interação significativa entre as variáveis “amostras”, “formação de
biofilme” e “concentração do extrato” analisadas (tabela 2).
Efeito do extrato hidroalcóolico da folha de Romã sobre o biofilme
pré-formado.
Neste estudo, analisou-se a densidade ótica após 24h de biofilmes
de C. albicans tratados com HepG em duas concentrações diferentes
para verificar a inibição do biofilmes pré-formados. O biofilme pré-formado
de isolados de C. albicans apresentou resistencia ao extrato, exceto à
amostra 48, em que houve uma redução de aproximadamente 50% do
crescimento do biofilme em ambas as concentrações testadas (Figura 4).
Quando comparada a densidade de biofilmes em formação com os pré-
formados, houve uma diferença significativa (Tabela 4). Não houve
diferença significativa entre os meios de formação de biofilmes em
diferentes concentrações de 32 e 64 mg/ml (tabela 5).
DISCUSSÃO
Devido ao crescente desenvolvimento de resistência a fármacos e os
efeitos adversos causados por agentes antifúngicos existentes, a procura
de novos compostos antimicrobianos tem sido o foco da maior parte dos
estudos com agentes patogênicos e produtos naturais [25]. Embora
existam muitos estudos sobre as propriedades terapêuticas da Punica
granatum, poucos foram realizados com o objetivo de verificar as suas
atividades antifúngicas ou de antivirulência. Neste estudo, relatamos pela
primeira vez o potencial uso de extrato de folhas de romã contra isolados
clinicamente importantes de Candida. P.granatum L. (romã), bem como
muitas outras plantas usadas para fins medicinais, podem ser uma
alternativa terapêutica porque apresentam metabólitos secundários em
suas diversas partes anatômicas como folhas, frutos, sementes, flores e
cascas, que são ativos contra uma ampla gama de microrganismos [30].
Este estudo mostrou uma grande quantidade de fenóis, flavonóides e
taninos hidrossolúveis na sua composição química. Estes compostos são
pequenas moléculas produzidas por plantas que são capazes de inibir a
diversas espécies de microrganismos. Estes achados corroboram com os
de Wang [32], que mostrou que as folhas de P. granatum contêm,
principalmente, esteróides, saponinas, flavonóides, taninos e alcalóides
de piperidina. A maior investigação fitoquímica da romã tem sido feito com
as três principais partes do corpo: Arilos, sementes e pericarpo. Embora
se tivesse demonstrado que o pericarpo da romã tenha níveis
significativamente mais elevados de polifenóis do que outras partes da
planta [33], este estudo mostrou que nas folhas são encontrados alguns
dos mesmos componentes com potencial antimicrobiano. Isto é
interessante, porque as folhas são uma parte anatômica mais fácil de
obter e para ser usado na extração de metabolitos com diversas
propriedades.
A maioria dos estudos sobre as propriedades terapêuticas e uso
medicinal de P. granatum é feita com pericarpo (26,30%) ou epicarpo e
mesocarpo do fruto (20, 10%) [34]. Apenas 4% deles, incluem folhas. Há
estudos feitos sobre a atividade antifúngica de arilos e sementes,
pericarpo, extrato da casca da fruta contra Candida [25], mas não há
nenhum com extratos de folhas.
Phatthalung et. al [35], estudaram os efeitos de vários extratos contra
Acinetobacter baummannii e sua análise fitoquímica do extrato do
pericarpo de Punica granatum L., mostrou a presença de taninos
hidrolisáveis e flavonóides que eles julgaram ser responsáveis por tal
ação. Estes dados corroboram com os resultados da nossa análise
fitoquímica, que diz respeito ao flavonóide encontrado. Tanto pelos
métodos de difusão quanto microdiluição em ágar, o extrato hidroalcoólico
de folhas de romã mostrou excelente atividade quando testado sobre os
isolados. Houve formação de zonas de inibição para todas as amostras
testadas, embora dois deles tenham demonstrado resistência ao
fluconazol e valores muito baixos de MICs, foram obtidos. Além disso, os
diâmetros médios das zonas de inibição do extrato de P. granatum,
apresentou melhores resultados (diâmetro da zona de inibição: 18,82 mm)
do que a de fluconazol (diâmetro da zona de inibição: 11,08 mm). Extratos
derivados de outras partes de P. granatum que têm sido estudadas por
outros autores também mostraram efeito antifúngico. Aníbal et al [25],
constataram atividade antifúngica do extrato da casca e do pericarpo de
romã contra cepas de referência de Candida albicans, C. dipliniensis, C.
tropicalis, C. krusei, C. guillermondii, obtendo resultados semelhantes
aos encontrados neste estudo.
Além disso, Qader, Khalid, Saadullah [36] fizeram uma triagem de
extratos etanólicos de plantas, entre elas Punica granatum (200 mg/mL),
para compostos biologicamente ativos contra Candida spp. pelo método
de difusão em disco. Eles verificaram uma atividade antimicrobiana
potencial contra Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida krusei e
Candida glabrata.
Foss et al. [37] trabalharam com extrato hidroalcoólico (90%) de casca
de romã e encontraram uma ação antifúngica contra amostras padrão de
dermatófitos Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum,
Microsporumcanis, M. gypseum, com valores de MIC variando desde 125
µg/ml a 250 µg/ml. Os autores isolaram o componente ativo, o
punicalagina cuja actividade antifúngica foi observada contra T. rubrum.
Bassiri-Jahromi et al [21], verificaram a atividade antifúngica de oito
cultivos de P.granatum L., extrato metanólico da casca e polpa sobre
cinco espécies de Candida pelo método de microdiluição. Eles
demonstraram que a casca de romã é um extrato rico em flavonóides e
inibiu o crescimento de todas as espécies de Candida testadas.
O efeito antifúngico demonstrado pelas folhas do extrato hidroalcoólico
de P. granatum pode ser devido à sua composição química: rica em
compostos fenólicos que possuem propriedades antifúngicas de
interesse. Tem sido demonstrado por estudos, que o efeito antimicrobiano
de P. granatum L. está relacionado com a presença de fenóis, tais como
taninos, que reagem com as proteínas do microrganismo e tornam estas
moléculas inativas na presença dos seus substratos [38]. O punicalagina
é outro composto oriundo da P. granatum L., que mostra boa atividade
sobre microrganismos [21,39]. Pinheiro [40] fracionou o extrato da folha
utilizada neste trabalho e verificou que a fração acetato de etila, que tem
todos os flavonóides do extrato bruto, teve efeito antimicrobiano contra
cinco patógenos respiratórios diferentes. A presença de flavonóides
(luteolina, kaempferol e quercetina) também foram relatados em cascas
de romã por van Elswijk et al[41].
Particularmente, tem sido conhecido que os ácidos fenólicos têm se
mostrado promissores in vitro e in vivo contra espécies de Cândida [11].
Os compostos fenólicos mais comuns são os ácidos fenólicos (ácidos
cinâmico e benzóico), flavonóides, proantocianidinas, cumarinas,
estilbenos, lignanas e lignina [42,43].
Além da resistência de células planctônicas, 65% das infecções
causadas por Candida estão relacionadas com a formação de biofilmes.
Os biofilmes são agregados de microrganismos, formados através da
adesão de células sobre uma superfície, em meio aquoso [44]. Os
biofilmes formados por Candida spp. são difíceis de diagnosticar e tratar
porque suas células possuem a característica de serem mais resistentes a
agentes antifúngicos, em comparação com as células planctônicas. Dessa
forma, faz-se necessária a pesquisa de novas estratégias antibiofilme
[45,46]. Embora existam alguns estudos que investiguem a atividade
antimicrobiana de P. granatum, pesquisas sobre a atividade antibiofilme
de substâncias derivadas de plantas da família Punicaceae são escassos
e aqueles relacionados à essa atividade do extrato de folhas dessa
espécie ainda não foram descritos. O extrato hidroalcoólico de folhas de
P. granatum, na concentração de 32 mg/ml, cerca de três vezes superior
à concentração inibitória sobre as células planctônicas, foi eficaz na
interferência do desenvolvimento do biofilme em dois isolados clínicos de
C. albicans (C. albicans 35 e 48) e na concentração de 64 mg/ml
interferiu, também, na formação de biofilme de C. albicans 48. O biofilme
da amostra de referência ATCC e C. albicans 46 demonstrou resistência à
ação do extrato em ambas as concentrações utilizadas. Estes resultados
demonstraram que o efeito do extrato foi dependente da amostra. Não
houve diferença no processo de formação de biofilmes na presença de
diferentes concentrações do extrato utilizado. No entanto, o extrato de P.
granatum não teve qualquer efeito contra biofilmes pré-formados de
amostras testadas em qualquer concentração; exceto para o isolado de C.
albicans 48 cujo biofilme pré-formado, tinha o seu crescimento reduzido
em cerca de 50% em ambas as concentrações testadas. Estes achados
foram esperados, pois verifica-se uma diferença significativa entre
biofilmes em início de formação e densidades celulares de biofilmes pré-
formados.
Os resultados deste trabalho são semelhantes aos obtidos por Oliveira
et al[47], que avaliou o potencial antifúngico de diversos extratos de
plantas, entre os quais, Punica granatum L. sobre a formação de biofilmes
de Candida albicans em resina acrílica. Depois de expor as amostras em
grupos tratados a uma concentração de 50 mg/ml do extrato durante 5
minutos, verificou-se os valores de CFU/ml e observou-se que o extrato
de P. granatum resultou numa redução significativa no biofilme de C.
albicans (p <0,01) em comparação com o grupo controle (NaCl a 0,9%).
Endo et al[14] avaliaram o efeito do extrato hidroalcoólico da casca de
romã em biofilme pré formado por 48 h de C. albicans pelo método de
cristal violeta. A MIC50 observada por eles era > 1000 ug/ml, 25% vezes
maior que os valores correspondentes para células planctônicas. Este
estudo indicou que os biofilmes são mais resistentes a extratos de
plantas. Outros estudos também indicam que biofilmes de C. albicans são
resistentes a agentes e extratos vegetais [48,49]. Bakkiyaraj et al[50]
verificaram uma atividade antibiofilme de um extrato metanólico de casca
da romã sobre Candida albicans. O extrato em concentração de 750
µg/ml inibiu a formação do biofilme, em biofilmes pré-formados por 24 h e
teve efeito na arquitetura do biofilme formado por este fungo.
Conclusão
Tomados em conjunto os resultados sugerem que o extrato
hidroalcoólico obtido a partir de folhas de P. granatum possui compostos
bioativos com potenciais efeitos anti-Candida e antibiofilme, inibindo o
crescimento de células planctônicas, interferindo na formação de biofilmes
por Candida albicans e interrompendo biofilmes pré-formados. O estudo
confirma o potencial do extrato de romã na busca de novos compostos
anti-fúngicos. São necessários mais estudos para ensaios biológicos de
frações do extrato, isolamento e caracterização dos compostos ativos
desta parte da planta.
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ILUSTRAÇÕES
Tabela 1: Composição Fitoquímica do Extrato hidroalcóolico da folha
de Punica granatum L.
Compostos Secundários
Fenóis Taninas
Flavonoide Flavonas,
Flavonóis e Xantonas
Esteróides Saponinas Chauconas Auronas
Extrato Hidroalcóolico
+++
+++
+++
++
++
++
Legenda: Critérios adotados: +++ fortemente positivo; ++
moderadamente positivo; + fracamente positivo.
Figura 1 - zona de inibição (mm) devido à ação de extratos
hidroalcoólicos das folhas em Punicagranatum 90mg\ml contra
Candida albicans/isolados clínicos (35, 46, 48) e C. albicans ATCC
18804. ND: zona de inibição não detectado. * P <0,05 foi
considerado significativo.
Agar diffusion test
0
5
10
15
20
25
30 P. granatum (90 mg/mL)
Fluconazole (128 µg/mL)
ATCC 18804 35 46 48 Mean
ND ND
*
Candida albicans strains
Zo
ne o
f In
hib
itio
n (
mm
)
Figura 2 - valores de concentração inibitória mínima (CIM) de extratos
hidroalcoólicos da folha de Punicagranatum sobre isolados clínicos de C.
albicans (35, 46, 48) e C. albicans ATCC 18804 pelo método de
microdiluição em caldo.
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
ATCC 18804 35 46 480
4
8
12
16
Candida albicans strains
MIC
of
P.
gra
natu
m(m
g/m
L)
Figura 3 - Interferência de diferentes concentrações do extrato da folha de
Punica granatum (32 e 64 mg/ml) nos estágios iniciais de formação do
biofilme de isolados clínicos e amostra padrão ATCC. Os resultados foram
obtidos por análise com violeta de cristal a OD492. Os dados
apresentados são uma média de seis réplicas.
Interference on C. albicans biofilm
0.0
0.5
1.0
1.5
ATCC 18804 35 46 48
P. granatum (0 mg/mL)
P. granatum (32mg/mL)
P. granatum (64 mg/mL)
Fluconazole (4 µg/mL)
Strains
O.D
. (4
92 n
m)
Tabela 2. Teste de ANOVA com 3 fatores e interação entre eles.
FV SQ GL QM F p
Amostra 1,15 3 0,38 59,17 0,000
Biofilme 3,53 1 3,53 547,34 0,000
Concentração 1,19 2 0,60 92,56 0,000
Amostra* biofilme 0,54 3 0,18 27,84 0,000
Amostra* concentração 1,76 6 0,29 45,39 0,000
Biofilme * concentração 0,20 2 0,10 15,55 0,000
Amostra*Biofilme*Concentração 0,74 6 0,12 19,15 0,000 Erro 0,77 120 0,01
Total 9,888 143
Tabela 3. Teste de Tukey com a média da capacidade de formação de
biofilme das amostras que mostram respostas diferentes em presença do
extrato
Samples N Mean SD
ATTC 18804 36 0,401 c 0,093
35 36 0,541 b 0,213
46 36 0,634 a 0,268
48 36 0,601 a 0,352
DP = desvio padrão das amostras que apresentam respostas diferentes
em presença do extrato
Figura 4 - Interferência de concentrações Diferentes fazer extrato
hidroalcoólico de Folhas de Punica granatum (32 e 64 mg / mL) em
biofilmes pré-formados dos Isolados Clínicos e da Amostra ATCC. Os
Resultados obtidos were Pela Análise com violeta cristal a OD492. Os
Dados Results Display Resultados São Média de SEIS repetições.
Interference on C. albicans pre-formed biofilms
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
ATCC 18804 35 46 48
P. granatum (0 mg/mL)
P. granatum (32mg/mL)
P. granatum (64 mg/mL)
Fluconazole (4 µg/mL)
Strains
O.D
. (4
92 n
m)
Tabela 4. Comparação das médias da formação do biofilme (há diferença em relação à quantidade de biofilme formado).
Biofilme N Média DP
Pré-formado 72 0,387 b 0,092
Início 72 0,701 a 0,285
Tabela 5. Teste de Tukey das médias das concentrações( há diferença em relação às concentrações de 0 para 32)
Concentração N Média DP
0 48 0,673 a 0,327
32 48 0,486 b 0,216
64 48 0,474 b 0,177
CEP
EFFECTS OF PUNICA GRANATUM, L LEAVES EXTRACT ON
PLANKTONIC CELLS GROWTH, BIOFILM FORMATION AND ON
PRE-FORMED BIOFILMS OF CANDIDA ALBICANS ORAL
ISOLATES FROM AIDS PATIENTS
INTRODUCTION
In last few decades, the sharp increase of fungal infections observed
has been linked to the growing of immunocompromised
population[1]. C. albicans is the most frequently isolated species in
humans [2,3,4,5] and oropharyngeal candidiasis (OPC) continues to
be the most prevalent opportunistic infection among patients living
with AIDS in many development countries as those from Latin
America and Africa [6,7]. It is estimated that 91% of these patients,
due to the long course of AIDS, present several episodes per year of
OPC [8,9]. Of these, 10% to 49% die of fungal infection [8,10].
Treatment of candidiasis is a clinical challenge mainly for
immunosuppressed patients due the conditions of illness, limited
number of available antifungal agents, and undesirable side effects
and toxicity of some, emergence of resistant strains and recurrence
[11]. Also, there is the biofilms-mediated antifungal resistance, a well-
documented phenomenon for Candida species and that, probably,
contributes to Candida pathogenicity [12,13].
Therefore, molecules that derives from natural sources and that
possess antifungal properties are of interest as they may represent a
suitable alternative to limit this process.
Punica granatum (pomegranate) is a small tree native from Asia and
cultivated in the Mediterranean region, China, India, South Africa and
Americas. Pomegranate has been widely used in folk medicine for
prevention and treatment of many illnesses as inflammation and
cancer, gastric ulceration, diarrhea, fever, microbial infections,
among others [14].
The antimicrobial activity of pomegranate has been investigated and
several studies suggest that its bioactive compounds can be a viable
option in controlling growth of different microbial species, mainly
bacteria [15,16,17,18,19,20,21,22]. However,most research has
focused on its antioxidant, anticarcinogenic and anti-inflammatory
properties [23]. There are few studies with fungi [16,21,24,25], and
most of these are related to crude extracts activities prepared from
seeds, pericarp, peels and from the whole fruit being rare those
related to antifungal activity of leaves hydroalcoholic extracts.
Pomegranate is a rich source of bioactive compounds, specifically
polyphenolic compounds and tannin [26]. Punicalagin isolated from
the fruit peel of pomegranate was reported to have antimicrobial
activity against Candida albicans [22].
Depending on the methodology used in these studies and even the
time of harvest, different constituents can be found, including:
ascorbic acid, gallic acid, caffeic acid, punicalagins, steroids, tannins,
alkaloids, flavonoids, among others [23].
Thus, given the wealth of natural substances and the various
comments on the folk and scientific use of this plant species, the lack
of studies related to its antifungal properties, the search for new
antifungals and/or substances that can interact with known
treatments to inhibit or disaggregate the formation of Candida
biofilms; the present study aimed to evaluate the antifungal and
antibiofilm activities of hydroalcoholic extract of leaves of P.
granatum against C. albicans isolates from oral mucosa of patients
with AIDS.
MATERIAL AND METHODS
Collection of the plant materials
The leaves of Punica granatum L. were collected at Herbário Ático
Seabra da Universidade Federal do Maranhão – UFMA às 06:00
após estiagem de 24 horas in month of. The leaves were dried at
room temperature for 72 hours, followed by trituration in slicer. Then,
the powdered leaves were measured in a graduated cylinder for
subsequent extraction of metabolites present. .
Preparation of the hydroalcoholicextract of leaves of P. granatum
(HEPg)
Fresh leaves of P. granatum were carefully cleaned, dried, powdered
and stored in airtight containers until it was used. Plant material was
macered using a hydroalcoholic solution of 70% (v/v) as a liquid
extractor at a __:__ ratio (m/v), under constant shaker during 72
hours at room temperature. O volume do solvente utilizado foi três
vezes superior ao volume do soluto (pó das folhas). The solution was
filtered three times and total volume obtained was lyophilized.The
stock extract was preserved in airtight ambar glass container and
stored at 4°C.When using the lyophilized extract was diluted in PBS
(phosphate-buffered saline, pH 7.4)(Sigma–Aldrich, Poole, UK).
Phytochemical analysis of extract:
Phytochemical analysis was performed as previously described by
Matos [27] in order to screen the presence of secondary metabolites
in the crude extracts.
Population, strains and culture conditions
Candida samples were from oral mucosa of 52 AIDS patients
recruited at a Public Reference Hospital in São Luís city, Maranhão,
Brasil(Ethics Committee of Federal University of Maranhão process
No. 23115006540/2009-40). AIDS patients had CD4 + cell counts
ranging from 10 to 552 cells/mm 3 and viral load 2567-256860
copies/mL. All patients had oropharyngeal candidiasis, 52.2% had
used antifungal and of these 75% were using both fluconazole and
nystatin and 8.3% fluconazole, nystatin and amphotericin B.
Candida albicans isolates were previously identified by CHROMagar
Candida® (BioMerieux, França) medium and later by the automated
system VITEK YBC (BioMerieux, França).
Samples were kept in BHI (Brain Heart Infusion), plus 15% glycerol
at -20 ° C [28]. At the time of use samples were grown at 37ºC in
Sabouraud Dextrose Broth(DIFICO®, Detroit, Michigan, EUA) plus
chloramphenicol, washed in phosphate-buffered saline(PBS)
(Sigma–Aldrich, Poole, UK) by centrifugation and then re-suspended
in PBS and standardized to approximately 107 UFC/ml according to
the 0.5 McFarland turbidity range with the same initial volume.
Three clinical isolates of Candida albicans (C. albicans 35, C.
albicans 46, C. albicans 48) and one reference strain: C. albicans
ATCC 18804 were used in tests.
Antifungal activity by agar diffusion method
The test to verify the antimicrobial activity of pomegranate leaf
extract was carried out by the agar diffusion method according to the
CLSI M44-A standard [29] with adaptations. SDA Petri dishes was
used and inoculated with standard inoculum. Then small perforations
on agar surface were done in which 50 µl of crude extract (90mg/mL)
were pipetted and plates were incubated at 37ºC for 48 hours.The
zones of inhibition were measured as indicators of activities. All the
tests were done in triplicate and repeated twice. Fluconazole (128
μg/mL) were used as standard drug. The diameter of inhibition zone
around each small well was measured and recorded at the end of
incubation period. The average of the triplicate tests was taken.
Determination of minimun inhibitory concentration (MIC)
Stock concentrations of crude extract were prepared in double-
distilled water (90 mg/mL). Serial two-fold dilutions (2 to 64 mg/mL)
of the extract were made in a sterile flat-bottom microdilution plate
(96 wells) containing 100 μl of culture medium. The antifungal activity
of extract against C. albicans isolates was evaluated in terms of their
minimum inhibitory concentration (MIC) by the antifungal broth
microdilution test proposed by the Clinical and Laboratory
StandardsInstitute (CLSI) guidelines M27-A3 method.
Yeast inoculum (100 µL) was added to each well of the microplates
containing extract dilutions and incubated at 37 °C during 48 h.
The minimum inhibitory concentrations (MICs) were determined after
reading of microtiters in a microplate reader (bioMérieux Reader 250
Version 2.0.5) at 450nm. The optical densities (ODs) were given as
mean of three experiments. The OD of the control sample (without
extract) was compared to the ODs of different concentrations of the
extract and the MICs were defined as the lowest concentration of
extract which caused ninety percentage reduction in the absorbance
compared to that of control.
Effect of pomenegrate leaves hydroalcoholic extract on C. albicans
biofilm formation and pre-formed biofilms
Biofilms were prepared as described previously [30] on pre-
sterilized, flat-bottomed 96-well polystyrene microtiter plates (TPP).
C. albicans standard cell suspension in PBS (100 μL) was
transferred to microplates wells and incubated at 37°C for 1,5 h to
allow attachment of cells on the surface. After the adhesion phase,
wells were washed twice with PBS to remove loosely attached cells.
Then fresh YNB medium (200 µL) supplemented with different
concentrations of extract (64mgml; 32mg/ml) was added to each
well and plates were incubated at 37°C for 24 h. To verify the effect
of extract against mature biofilms, C. albicans biofilms were
prepared for 24 h at 37ºC as described above, cells were washed
with PBS and 200 μl of fresh YNB medium plus different
concentrations of extract were added. Plate was incubated for 24 h
at 37ºC. YNB medium plus inoculum and YNB medium with
fluconazole (4 µg/ml) were included as control wells. After
incubation, wells were washed to remove any planktonic cells,
biofilms were fixed with 99% methanol (300µL) for 15 min and then
washed 3x with distilled water and left to dry at room temperature.
Biofilms were stained for 20 min at 37 ◦C with 200µl of 1% crystal
violet (CV) washed with running tap water, and dried. The bound
dye was released with 150µL of 95% ethanol and 100µL of each
mixture were transferred to a new 96-well microplate[31]. Biofilm
growth was analyzed spectrophotometrically with a microtiter plate
reader (bioMérieux Reader 250 Version 2.0.5) at 570nm. All
experiments were performed in two different occasions and with six
repetitions.
Statistical Analysis
Para verificar a interação das variáveis amostras clínicas, formação
de biofilme e concentrações do extrato foi feito um teste de Análise
de Variância com estes três fatores, com interação entre eles
(ANOVA). Havendo efeito significativo, avaliou-se as variáveis
separadamente pelo teste pos hoc de Tukey.
RESULTS
Phytochemical analysis
Phytochemical analysis revealed the presence of phenols,
hydrosoluble tannins, flavonoids, flavones, flavonols, xanthones;
steroids; saponins, chauconas and auronas, in HEPg, whose
amounts detected were classified as weakly positive (+),
moderately positive (++) and strongly positive (+++) (Table 1).
Antifungal activity by agar diffusion method
Results from agar diffusion test showed diameters of inhibition zone
ranged from 11 to 27 mm and the medium largest diameters were
observed against isolate 46 (23.83mm) and reference strain ATCC
18804 (23.16mm). The average diameters of inhibition zone of
HEPg of all tested isolates was significantly higher than that of
fluconazole. (Figure 1).
Microdilution MIC determination
As shown in Figure 2, the antifungal assay by microdilution method
has shown activity against all C. albicans isolates tested, including
the reference strain ATCC 18804 with MICs of 8.0mg\ml (isolate
35), 4.0mg\ml(isolate 46), 8.0mg\ml (isolate 48) and 4.0mg/ml
(ATCC 18804).
Effect of pomenegrate leaves hydroalcoholic extract on C. albicans
biofilm formation
The interference of the crude extract of Punica granatum leaves on
the early formation biofilms of C. albicans isolates was assessed by
analysis with crystal violet. As it can be seen in table 5 the effect of
the extract was dependent on sample. Samples 35 and 48 had
reduced biofilm formation progress by more than 50% at a
concentration of 32 µg/mL as compared to control. Biofilm formation
of reference strain ATCC and of 46 isolate was not reduced when
treated with the extract in both concentration tested. There was no
difference in biofilm formation interference with regard to different
concentrations of the extract used (Figure 3). ANOVA test
confirmed these results showing a significant interaction between
the variables "samples", "biofilm formation" and "concentration of
the extract" analyzed (Table 2).
The process of formation of biofilms of the samples in the presence
of extract was statistically different (Table 3).
Effect of pomenegrate leaves hydroalcoholic extract on C. albicans
pre-formed biofilm
In this study, we analyzed the optical density of 24 hour C. albicans
biofilms treated with HEPg in two different concentrations to verify
inhibiting of formed biofilms.
The pre-formed biofilms of C. albicans isolates were quite resistant
to the extract except the isolated 48, in which there was a reduction
of approximately 50% of the biofilm growth at both concentrations
tested (Figure 4).
When we compared the density of biofilms in early formation with
that of the preformed ones there was a significant difference (Table
4). There was no significant difference among the means of biofilm
formation in different concentrations of 32 and 64 mg/ml (Table5).
DISCUSSION
Due to the increasing development of resistance to drugs and the
side effects caused by existing antifungal agents, the search for
new antimicrobial compounds has been the focus of most studies
involving pathogens and natural products [25]. Although many
studies about therapeutic properties of Punica granatum exist, few
or none have been performed with the aim of verifying its antifungal
or antivirulence activities. Here we report for the first time the
potential use of leaves extract of pomegranate against clinically
important isolates of Candida.
P.granatum L. (pomegranate), as well as many other plants used
for medicinal purposes, can be an alternative as therapy because
they present secondary metabolites in its various anatomical parts,
as leaf, fruit, seed, flowers and peel, that are active against a wide
range of microorganisms [30].
This study showed a great quantity of phenols, flavonoids and
hydrosoluble tannins in its chemical composition. These are small
molecules produced by plants that are able to inhibit many
microorganisms‟ species. These findings corroborate those of
Wang et al., [32] that showed that P. granatum leaves contain
mainly steroids, saponins, flavonoids, tannins and piperidine
alkaloids. Most phytochemical investigation of pomegranate fruit
has been done with the three main body parts: arils, seeds and
pericarp. Although it was found that the pomegranate pericarp has
significantly higher levels of polyphenols than other parts of the
plant [33], this research showed that in leaves some of the same
constituents with potential antimicrobial were also found. This is
interesting because leaves are an anatomical part easier to obtain
to be used in the extraction of metabolites with diverse properties.
Most studies on therapeutic properties and medicinal use of P.
granatum is made with pericarp (26.30%) or epicarp and mesocarp
of the fruit (20, 10%) [34]. Only 4% of those include leaves. There
are studies done regarding antifungal activity of arils and seeds,
pericarp, peeland fruit extracts against Candida [25], but there is
none with leaves extracts.
Phatthalung et al.[35] studied the effects of various extracts against
Acinetobacter baummannii and their phytochemical analysis of the
pericarp extract of Punica granatum L., showed presence of
hydrolysable tannins and flavonoids that they judged to be
responsible for such action. These data corroborate the results of
phytochemical analysis with respect to flavonoid found by us.
Both by agar diffusion and microdilution methods the hydroalcoholic
extract of pomegranate leaves showed excellent activity against
tested isolates. There was formation of inhibition zones for all
samples tested, although two of them had shown resistance to
fluconazole, and very low MICs values were obtained. Also, the
average diameters of inhibition zones of P. granatum extract
showed better results (inhibition zone diameter: 18.82 mm) than
that of fluconazole (inhibition zone diameter: 11.08 mm) in well
method. Extracts derived from other parts of P. granatum that have
been studied elsewhere also showed antifungal effect. For instance
Anibal et al. [25] found antifungal activity of hydroalcoholic extract
from peel and pericarp of pomegranate against reference strains of
Candida albicans, C. dipliniensis, C. tropicalis, C. krusei, C.
guillermondii, results similar to that found in this study.
Also, Qader, Khalid, Saadullah [36] have done a screening of
ethanolic extracts of plants, among them Punica granatum
(200mg/mL), for biologically active compounds against Candida
spp. by disc diffusion method. They verified a potential antimicrobial
activity against Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida
krusei and Candida glabrata.
Foss et al [37] worked with hydroalcoholic extract (90%)of
pomegranate peel and found an antifungal action against standard
samples of dermatophytes Trichophyton mentagrophytes,
Trichophyton rubrum, Microsporumcanis, M. gypseum, with MIC
values ranging from 125 µg/mL to 250 µg/mL.The authors isolated
the active component, the punicalagin whose antifungal activity was
observed against T. rubrum.
Bassiri-Jahromi et al [21] verified the antifungal activity of eight
Persian cultivars of P.granatum L. peel and pulp methanol extracts
against five Candida species by microdilution method. They
demonstrated that flavonoid-rich pomegranate peel extract could
inhibit growth of all Candida species tested.
The antifungal effect shown by the hydroalcoholic extract leaves of
P. granatum may be due to the chemical composition of the extract
rich in phenolic compounds which possess antifungal properties of
interest. It has been demonstrated by studies that the antimicrobial
effect of P. granatum L. is related to the presence of phenols, such
as tannins, which react with the proteins of the microorganism and
make these molecules become inactivated in the presence of their
substrates [38.]. The punicalagin is another P. granatum L.
compound, which shows activity on microorganisms [39]. Pinheiro
[40] has fractioned the leaf extract used in this work and verified
that the ethyl acetate fraction, which has all flavonoids of crude
extract,had antimicrobial effect against five different respiratory
pathogens. Presence of phytoestrogenic flavonoids (luteolin,
kaempferol and quercetin) have also been reported in pomegranate
peels by van Elswijk et al [41].
Particularly,it has been known that phenolic acids have shown
promising in vitro and in vivo activity against Candida species
[11].The most common phenolic compounds are phenolic acids
(cinnamic and benzoic acids), flavonoids, proanthocyanidins,
coumarins, stilbenes, lignans, and lignins [42,43].
Besides the problem of planktonic cells resistance, 65% of
infections caused by Candida are related to the formation of
biofilms. Biofilms are aggregates of microorganisms, which are
formed due to the attachment of cells to host surface in aqueous
environment [44]. Biofilms formed by Candida spp. are very difficult
to diagnose and treat because their cells have a characteristic of
being more resistant to antifungal agents compared to planktonic
cells, so a search for new anti-biofilm strategies is necessary
[45,46].
Although there are some studies investigating the antimicrobial
activity of P. granatum, researches about antibiofilm activity of
substances derived from plants of the Punicaceae family are scarce
and those related to that activity of leaves extract of the species
there is none.
Hydroalcoholic extract of P. granatum leaves, at concentration of 32
mg/mL,approximately three times above the inhibitory concentration
on planktonic cells,was effective in interferingwith the biofilm
developmentof two clinical isolates (C. albicans 35 e C. albicans 48)
and in concentration of 64 mg/ml also interferedin biofilm formation
of C. albicans 48. The reference strain ATCC and C. albicans 46
biofilms showed resistance to the action of the extract in both
concentrations used.These results have shown that the effect of
extract was dependent on sample. There was no difference in
biofilm formation process in the presence of different concentrations
of the extract used.
However, P. granatum extract had no effect against pre-formed
biofilms of tested samples at any concentration; except for isolate
C. albicans 48 whose pre-formed biofilm had its growth reduced by
approximately 50% in both tested concentrations. These were
expected because it was verified a significant difference between
biofilms in beginning of formation and pre-formed biofilm cellular
densities.
Results from this work are similar to those obtained by Oliveira et al
[47] that evaluated the antifungal potential of many plant extracts,
among them, Punica granatum L. after Candida albicans biofilm
formation on acrylic resin. After exposing treated groups samples to
a concentration of 50 mg/ml of the extract for 5 minutes,values of
CFU/mL was verified and it was found that P. granatum extract
resulted in significant reduction of C. albicans biofilm (p < 0.01)
compared to the control group (0.9% NaCl).
Endo et al [14] assessed the effect of pomegranate peel
hydroalcoholic extract on 48 h pre-formed biofilm of C. albicans by
crystal violet method. The MIC50 observed by them was >
1000µg/mL, 25% times higherthan corresponding values for
planktonic cells. This study indicated that biofilms are more
resistant to plant extracts. Other studies also indicate that C.
albicans biofilms are resistant to antifungal agents and plants
extracts [48,49,].
Bakkiyaraj et al [50] verified an antibiofilm activity of a methanolic
extract of pomegranate peelagainst Candida albicans. The extract
at 750 μg/mL inhibited the formation of biofilms, disrupted 24 h pre-
formed biofilms and had effect on the architecture of the biofilm of
this fungus.
CONCLUSION
Taken together the results suggest that hydroalcoholic extract
obtained from P. granatum leaves has bioactivity compounds with
potential anti-Candida and antibiofilm effects, inhibiting planktonic
cells growth, interfering the formation of biofilms by Candida
albicans and disrupting pre-formed biofilms.The results of this study
confirm the potential of the pomegranate extract studied in the
search of new antifungal compounds. Further studies are necessary
for biological assays of extracts fractions, isolation and
characterization of the active compounds of this part of plant.
ILUSTRATIONS
Table 1: Phytochemical composition of hydroalcoholic leaves
extracts from Punicagranatum L.
Compostos Secundários
Fenóis Taninas
Flavonoide Flavonas,
Flavonóis e Xantonas
Esteróides Saponinas Chauconas Auronas
Extrato Hidroalcóolico
+++
+++
+++
++
++
++
Legend: Critérios adotados: +++ fortemente positivo; ++ moderadamente positivo; + fracamente positivo.
Figure 1 – Zone of Inhibition (mm) due action of hydroalcoholic
extracts of Punicagranatum leaves at 90mm/mL against Candida
albicans clinical isolates (35, 46, 48) and C. albicans ATCC 18804.
ND: non-detected zone of inhibition. *P < 0.05 was considered to be
significant.
Agar diffusion test
0
5
10
15
20
25
30 P. granatum (90 mg/mL)
Fluconazole (128 µg/mL)
ATCC 18804 35 46 48 Mean
ND ND
*
Candida albicans strains
Zo
ne o
f In
hib
itio
n (
mm
)
Figure 2 - Minimum inhibitory concentration (MIC) values of
hydroalcoholic extracts of Punicagranatum leaves againstCandida
albicans clinical isolates (35, 46, 48) and C. albicans ATCC 18804
by the broth microdilution method.
Minimum Inhibitory Concentration (MIC)
ATCC 18804 35 46 480
4
8
12
16
Candida albicans strains
MIC
of
P.
gra
natu
m(m
g/m
L)
Figure 3 – Interference of different concentrations of Punica granatum leaves
extract (32 and 64 mg / mL) in the early stages of biofilm formation
of clinical isolates and reference strain ATCC. The results were
obtained by analysis with crystal violet at OD492. The data shown
are an average of six replicates.
Interference on C. albicans biofilm
0.0
0.5
1.0
1.5
ATCC 18804 35 46 48
P. granatum (0 mg/mL)
P. granatum (32mg/mL)
P. granatum (64 mg/mL)
Fluconazole (4 µg/mL)
Strains
O.D
. (4
92 n
m)
Table 2. ANOVA test with 3 factors and interaction among them
FV SQ GL QM F p
Sample 1,15 3 0,38 59,17 0,000
Biofilm 3,53 1 3,53 547,34 0,000
Concentration 1,19 2 0,60 92,56 0,000
Sample * biofilm 0,54 3 0,18 27,84 0,000
Sample * concentration 1,76 6 0,29 45,39 0,000
Biofilm * concentration 0,20 2 0,10 15,55 0,000
Sample * biofilm * concentration 0,74 6 0,12 19,15 0,000
Erro 0,77 120 0,01
Total 9,888 143
Table 3.Tukey test with the meanof biofilm formation capacity of the samples
showing different responses in the presence of the extract
Samples N
Mea
n SD
ATTC 18804
3
6
0,40
1 c
0,09
3
35
3
6
0,54
1 b
0,21
3
46
3
6
0,63
4 a
0,26
8
48
3
6
0,60
1 a
0,35
2
SD = standard deviation
Figure 4 – Interference between different concentrations of the
hydroalcoholic extract of Punica granatum sheets (32 and 64 mg /
ml) pre-formed biofilms of clinical isolates and the ATCC sample.
The results were obtained by analysis with crystal violet OD492.
The data shown are average of six repetitions.
Interference on C. albicans pre-formed biofilms
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
ATCC 18804 35 46 48
P. granatum (0 mg/mL)
P. granatum (32mg/mL)
P. granatum (64 mg/mL)
Fluconazole (4 µg/mL)
Strains
O.D
. (4
92 n
m)
Table 4. Comparison of average of biofilm formation (no difference
regarding the amount of biofilm formed).
Biofilm N
Medi
a DP
Pré-formed
7
2
0,38
7 b
0,09
2
Begining
7
2
0,70
1 a
0,28
5
Table 5. Tukey test of mean concentrations (no difference in
relation to concentrations of 0 to 32)
Concentration N Medi
a DP
0 4
8
0,67
3 a
0,32
7
32 4
8
0,48
6 b
0,21
6
64 4
8
0,47
4 b
0,17
7
NORMAS DA REVISTA
![Top [Unidade II] Ceuma Ren (1)](https://img.pdfslide.net/doc/110x75/55cf9200550346f57b929202/top-unidade-ii-ceuma-ren-1.jpg)
