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PURIFICACIÓNDE
PROTEÍNASSemestre 2011-I
16 Agosto 2010
La estructura y función de una proteína está dada por su composición de aminoácidos POR TANTO, por la secuencia de DNA del gen que la codifica.
Código genético
Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de
aminoácidos
¿Qué es un aminoácido?¿Cómo se llama el enlace que une dos aminoácidos?
LAS PROTEÍNAS SON VITALES PARA EL BUEN FUNCIONAMIENTO CELULAR
FUNCIÓN EJEMPLOS
Catálisis Enzimas : proteasas, polimerasas, cinasas
Defensa Inmunoglobulinas, anticuerpos, toxinas
Transporte Hemoglobina, mioglobina, canales membranales
Soporte Colágeno, queratina
Movimiento Actina, miosina
Regulación Factores de transcripción (proteínas de unión al DNA)
Señalización Hormonas (insulina)
¿ PARA QUÉ NECESITAMOS PURIFICAR PROTEÍNAS?
Para la producción de anticuerpos
ESTUDIAR SU FUNCIÓN y regulación enzimática
REALIZAR ANÁLISIS ESTRUCTURALES: cristalografía de rayos X,
espectroscopía NMR.Estudiar sus interacciones con otras proteínas o con
ácidos nucleícos
Si no se conoce el gen que codifica a la proteína aislada:
La proteína purificada se puede usar para determinar la secuencia de aminoácidos y por tanto la secuencia del gen que la codifica!!!!
ANTES DE EMPEZAR!!!!
1. Seleccionar la muestra biológica (fuente)2. Definir objetivos: PUREZA Y CANTIDAD REQUERIDA
Muy alta > 99% Usos terapeúticos , estudios in vivo
Alta 95-99% Cristalografía de rayos X, Caracterización fisicoquímica
Moderada <95% Obtención de antigeno(s) para la producción de anticuerpos
Secuenciación
ANTES DE EMPEZAR!!!!
3. Investigar las PROPIEDADES de la proteína que se desea purificar ¿?
1. Tamaño
2. Propiedades iónicas (punto isoeléctrico)
3. Hidrofobicidad (solubilidad)
4. Estabilidad (temperatura, pH, oxidación-reducción)
5. Afinidad por un ligando
ANTES DE EMPEZAR!!!!
4. Contar con un método adecuado para la detección de la proteína de interés.
Monitorear el progreso de la purificación y ESTAR SEGUROS QUE SE ESTÁ PURIFICANDO LA
PROTEÍNA DE INTERÉS
a.Cuantificación de proteína total
a.Detectar específicamente la proteína de interés: por ejemplo ensayos de actividad, ensayos inmunológicos, SDS-PAGE
PARA PURIFICAR UNA PROTEÍNA ES NECESARIO REALIZAR VARIAS PASOS
Al final de la práctica aprenderemos a hacer e interpretar un
CUADRO DE PURIFICACIÓN
A PURIFICAR SE HA DICHO!!!!!1. Ya seleccionamos la muestra biológica (fuente)
El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular. El método seleccionado dependerá de la naturaleza del tejido y/o células
MÉTODOS PARA REALIZAR LA ROTURA CELULAR
1. Lisis celular válido para células sin pared celular como las células detejidos animales, pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.
2. Destrucción mecánica Congelación-descongelación, prensa de French, sonicación, macerado con N2 líquido
3. Lisis con detergentes
Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a
muchos agentes que pueden dañarla!!!!!!.
UTILIZAR:Soluciones amortiguadoras.
Inhibidores de proteasasBajas temperaturas (4°C)
EVITARAltas temperaturas
Manipular demasiado la muestra
PROCURARque el proceso sea lo más corto posible.
Dibujo de proteasas
El resultado de la lisis celular es un lisado u homogenado que contiene una mezcla de
proteínas, membranas y células rotas.
Esta preparación se somete a centrifugación
La fase soluble constituye el extracto crudo donde se encuentra la proteína de interés
OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO
Centrifugación
DEFINICION CENTRIFUGACION
CENTRIFUCACIÓN DIFERENCIAL
VARIOS PASOS SECUENCIALES DE CENTRIFUGACIÓN A DIFERENTES VELOCIDADES
La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad
de la del medio.
1.Volumen de solución a centrifugar para determinar el tipo de tubo y rotor a emplear.2.Naturaleza química de la solución para determinar la clase de tubo a emplear.3.La diferencia de densidad entre la partícula a sedimentar y la densidad del medio en el que se encuentra.
PARÁMETROS QUE SE DEBEN CONSIDERAR EN CUALQUIER CENTRIFUGACIÓN, SON:
En general cuanto mayor sea la diferencia de densidad se utilizará poco tiempo y poca fuerza de aceleración. Cuando el
diferencial es muy pequeño se pueden aplicar centrifugaciones de cientos de miles de g durante horas.
Métodos de purificación de proteínas
BAJA RESOLUCIÓN
Precipitación con sales, precipitación con temperatura
y pH
ALTA RESOLUCIÓN
Métodos cromatográficos: filtración en gel, intercambio
iónico, afinidad
Métodos electroforéticos: electroforesis no desnaturalizante,
desnaturalizante, isoelectroenfoque
Precipitación con sales
Sal más usada: Sulfato de Amonio
EXISTEN TABLAS QUE ESPECIFICAN LA CANTIDAD DE SULFATO DE AMONIO QUE SE DEBE AGREGAR PARA
LLEGAR A UN % DE SATURACIÓN ESPECÍFICO
