Upload
buianh
View
234
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT
SITARESMI YUNINGTYAS
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2011
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Purifikasi, Amobilisasi, dan
Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae dan Potensinya terhadap Susu UHT adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Bogor, April 2011 Sitaresmi Yuningtyas NIM G851090041
ABSTRACT SITARESMI YUNINGTYAS. Purification, Immobilization, and Characterization of β-Galactosidase from Enterobacter cloacae with Potentiality to UHT Milk. Under direction of MARIA BINTANG and TATIK KHUSNIATI.
Enzymatic hydrolysis of lactose is an important biotechnological process because the hydrolyzed products can be consumed by people with lactose intolerance. The aim of this study was purification, immobilization, and characterization of β-galactosidase from E. cloacae. This research also studied the hydrolysis of lactose in UHT milk. The stages of this research were production and purification β-galactosidase from E. cloacae; characterization of enzyme; optimization of immobilization formula; and hydrolisis of UHT milk. The β-galactosidase from E. cloacae was purified and showed a purification of 30.26-fold, a yield of about 6.18%, and a specific activity of 101.781 U/mg. Free and immobilized enzyme exhibited maximum activity at an optimal pH of 7.0 and an optimum temperature of 40°C. This enzyme was activated by Co2+, Mn2+, and Mg2+; however, was inhibited by Ca2+, Zn2+, Cu2+, and Hg2+. KM for free and immobilized β-galactosidase were 0.434 and 2.068 mM, respectively. Optimal formulation of cell and enzyme immobilization were consist of 10% (w/v) cell with 5% (w/v) sodium alginate and 10% (v/v) purified enzyme with 5% (w/v) sodium alginate, respectively. This researh found that entrapped β-galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (28.09%) after 6 hours in batch process as compared to entrapped E. cloacae (22.01%) after 18 hours. Free β-galactosidase was higher in the hydrolysis of lactose present in milk (78.20%) after 6 hours as compared to free E. cloacae (55.14%) after 18 hours.
Keyword: β-galactosidase, Enterobacter cloacae, purification, immobilization
RINGKASAN SITARESMI YUNINGTYAS. Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TATIK KHUSNIATI. Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-(1,4)-glikosidik dengan proporsi 4,7% dari total susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh. Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim β-galaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar. Orang-orang yang memiliki ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim β-galaktosidase yang rendah pada brush border pada usus halus disebut penderita laktosa intoleran. Salah satu solusi untuk penderita laktosa intoleran adalah memodifikasi susu dengan cara menghidrolisis laktosa secara enzimatik menggunakan β-galaktosidase. Penggunaan enzim dalam keadaan bebas yakni terlarut dalam air, kurang menguntungkan dalam skala industri karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan teknik amobilisasi. Sel atau enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi. Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan oleh Enterobacter colacae. Bertolak dari hal tersebut maka penelitian ini menggali potensi β-galaktosidase dari E. cloacae. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan karakterisasi β-galaktosidase dari E. cloacae. Selain itu, untuk mengetahui aktivitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase teramobil. Tahap awal dari penelitian ini adalah penentuan waktu produksi β-galaktosidase optimum dari E. cloacae. Selanjutnya dilakukan produksi β-galaktosidase. Setelah memperoleh enzim β-galaktosidase kasar maka dilanjutkan dengan tahap purifikasi enzim yang terdiri dari pengendapaan dengan amonium sulfat, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel. Tahap selanjutnya adalah enzim β-galaktosidase terpurifikasi dan sel E. cloacae diamobilisasi dengan teknik penjebakan dengan kalsium alginat. Optimasi variasi konsentrasi alginat dan bobot sel yang digunakan untuk amobilisasi sel dilakukan terlebih dahulu sebelum dilakukan amobilisasi sedangkan untuk amobilisasi enzim dilakukan optimasi konsentrasi alginat saja. Setelah diperoleh konsentrasi optimum alginat maka dilakukan amobilisasi sel E. cloacae dan amobilisasi β-galaktosidase. Penentuan karakterisasi β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil yang dilakukan meliputi suhu optimum, stabilitas suhu, pH optimum, stabilitas pH, aktivator dan inhibitor, serta parameter kinetik (KM dan Vmaks). Tahap terakhir adalah penentuan potensi β-galaktosidase terhadap susu UHT yang meliputi hidrolisis laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase
bebas, dan β-galaktosidase teramobil. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik GOD-POD (glukosa oksidase-peroksidase). Hasil penelitian ini menunjukan E. cloacae menghasilkan β-galaktosidase optimum pada waktu inkubasi jam ke-24 dengan suhu 37°C. Tahap purifikasi β-galaktosidase E. cloacae dengan menggunakan perlakuan pengendapan amonium sulfat 30-40%, dialisis, dan kromatografi filtrasi gel menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 101,781 U/mg dengan rendemen 6,18% dan tingkat kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali dari enzim kasar yang diperoleh. Suhu optimum bagi β-galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah 40°C. Stabilitas suhu pada β-galaktosidase bebas berkisar pada suhu 25-40°C sedangkan untuk enzim teramobil berkisar 25-45°C. pH optimum bagi β-galaktosidase E. cloacae bebas dan teramobil adalah pH 7. Stabilitas β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil pada kisaran pH 5,5-8,0. Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor β-galaktosidase dari E. cloacae sedangkan Ca2+ dan Zn2+ merupakan inhibitor parsial. Kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ merupakan aktivator bagi enzim tersebut. Enzim β-galaktosidase bebas dari E. cloacae mempunyai kecepatan maksimum sebesar 0,655 µmol/menit dan nilai KM sebesar 0,434 mM. Pada β-galaktosidase teramobil, kecepatan maksimumnya sebesar 0,012 µmol/menit dengan nilai KM sebesar 2,068 mM. Konsentrasi optimum untuk amobilisasi sel adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% sedangkan konsentrasi optimum untuk amobilisasi enzim adalah larutan enzim terpurifikasi 10% (v/v) dan alginat 5%. E. cloacae bebas dapat menghidrolisis laktosa pada susu UHT sebesar 55,14% sedangkan E. cloacae teramobil sebesar 22,01% setelah 18 jam. Aktivitas hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase bebas sebesar 77,99% sedangkan β-galaktosidase teramobil sebesar 28,09% setelah 6 jam. Pemakaian berulang enzim amobil dan sel amobil masih dapat dilakukan hingga 6 kali pengulangan. Kata kunci: β-galaktosidase, Enterobacter cloacae, purifikasi, amobilisasi
© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011 Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
PURIFIKASI, AMOBILISASI, DAN KARAKTERISASI β-GALAKTOSIDASE DARI Enterobacter cloacae SERTA POTENSINYA TERHADAP SUSU UHT
SITARESMI YUNINGTYAS
Tesis sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Magister Sains pada Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR 2011
Judul Tesis : Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT
Nama : Sitaresmi Yuningtyas NIM : G851090041
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S.
Dr. Ir. Tatik Khusniati, M. App. Sc. Ketua Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr
Tanggal Ujian: 7 April 2011 Tanggal Lulus:
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Karya ilmiah ini berjudul Purifikasi, Amobilisasi, dan Karakterisasi β-Galaktosidase dari Enterobacter cloacae serta Potensinya terhadap Susu UHT. Kegiatan Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juli hingga November 2010 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), di Jalan Raya Bogor km 46, Cibinong. Penelitian ini dibiayai Proyek Puslitbang Biologi LIPI dari dana Program Insentif Penelitian dan Perekayasa, Ristek 2010.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS dan Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc. yang telah memberikan bimbingan dan pengarahan selama berlangsungnya penelitian serta dalam penyusunan karya ilmiah. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc. selaku penguji luar komisi yang telah memberikan saran dalam penulisan tesis. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada orang tua, adik, dan Abi yang telah memberi dukungan materi, non materi, dan doa kepada penulis dalam penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih penulis tujukan kepada staf Laboratorium Biokimia Mikroba LIPI Biologi, Neneng Karimaryati, A.Md. AL, Bapak Abdul Kholiq, S.Pd, dan Resti Siti Mutmainah atas kerja samanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, April 2011 Sitaresmi Yuningtyas
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 13 Juni 1987 dari ayah Ir. Suyono dan ibu Lina Herlina. Penulis merupakan anak pertama dari dua bersaudara. Tahun 2004 penulis terdaftar sebagai mahasiswa pada program sarjana Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB dan menamatkannya pada tahun 2008. Penulis pernah bekerja sebagai Asisten Peneliti di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2009. Kesempatan untuk melanjutkan program pascasarjana S2 pada program studi yang sama diperoleh pada tahun 2009.
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..............................................................................................xiii
DAFTAR GAMBAR ..........................................................................................xiii
DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xiv
PENDAHULUAN ................................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA Enzim β-Galaktosidase ................................................................................. 4
Enterobacter cloacae .................................................................................... 7 Susu UHT ..................................................................................................... 8 Purifikasi Enzim ......................................................................................... 10 Teknik Amobilisasi ..................................................................................... 12 Karakterisasi Enzim .................................................................................... 14
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ........................................................................................... 17 Metode Penelitian ....................................................................................... 18
HASIL DAN PEMBAHASAN Waktu Optimum Produksi β-Galaktosidase ................................................. 26
Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase ..................................................... 27 Karakterisasi β-Galaktosidase ..................................................................... 32 Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae .................................................................................. 40 Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi β-Galaktosidase .............. 42 Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT ................................................. 43 Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil ................................ 46
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan .................................................................................................... 48 Saran .......................................................................................................... 48 DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 49
LAMPIRAN ........................................................................................................ 53
DAFTAR TABEL Halaman
1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase ........................................................ 6
2 Komponen utama susu ....................................................................................... 9
3 Purifikasi β-galaktosidase dari E.cloacae ......................................................... 30
DAFTAR GAMBAR Halaman
1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase ................................................... 5
2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase .......................................................... 5
3 Enterobacter cloacae ........................................................................................ 7
4 Teknik amobilisasi enzim ................................................................................ 14
5 Kurva pertumbuhan E.cloacae dan kurva produksi β-galaktosidase ................ 27
6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase ................................................ 28
7 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan amonium sulfat .......... 29
8 Aktivitas total dan protein total hasil purifikasi dengan kromatografi filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200 ............................................... 31
9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 32
10 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 34
11 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 35
12 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas dan teramobil .................................................................................................. 36
13 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari E. cloacae ................................... 38
14 Kurva Lineweaver Burk dari enzim β-galaktosidase bebas dan enzim β-galaktosidase teramobil ...................................................................... 39
15 Variasi optimum penentuan sel amobil ............................................................ 41
16 Produk yang dihasilkan pada penentuan optimasi amobisisasi enzim ............... 43
17 Aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil dan sel teramobil ................. 46
18 Penggunaan berulang enzim teramobil dan sel teramobil ................................. 47
DAFTAR LAMPIRAN Halaman
1 Tahapan umum penelitian ............................................................................... 54
2 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase .............................................................. 55
3 Morfologi Enterobacter cloacae ...................................................................... 55
4 Kurva standar oNP .......................................................................................... 56
5 Kurva standar protein ...................................................................................... 57
6 Penentuan waktu produksi optimum ................................................................ 58
7 Hasil purifikasi β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat ............. 58
8 Hasil kromatografi filtrasi gel .......................................................................... 59
9 Optimasi dan Stabilitas Suhu ........................................................................... 59
10 Optimasi dan stabilitas pH ............................................................................... 61
11 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase ........................................................... 62
12 Penentuan parameter kinetik enzim bebas dan enzim teramobil ....................... 63
13 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi variasi sel dan alginat untuk amobilisasi sel ....................................................................................... 65
14 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi enzim .................................................................................. 65
15 Potensi hidrolisis laktosa ................................................................................. 66
16 Penggunaan berulang enzim amobil dan sel amobil ......................................... 67
PENDAHULUAN
Susu merupakan bahan pangan yang memiliki komponen spesifik seperti
lemak, protein, karbohidrat susu (laktosa), vitamin, dan mineral. Laktosa adalah
karbohidrat utama susu dengan proporsi 4,7% dari total susu (Chaplin 2004).
Laktosa adalah disakarida yang terdiri dari galaktosa dan glukosa yang
dihubungkan dengan ikatan β-(1,4)-glikosidik (Fox & McSweeney 1981).
Keberadaan laktosa dalam susu merupakan salah satu keunikan dari susu itu
sendiri karena laktosa tidak terdapat di alam kecuali sebagai produk dari kelenjar
susu. Laktosa merupakan zat makanan yang menyediakan energi bagi tubuh.
Namun, laktosa ini harus dipecah menjadi glukosa dan galaktosa oleh enzim β-
galaktosidase agar dapat diserap oleh usus, masuk ke pembuluh darah, dan
kemudian diedarkan ke seluruh tubuh untuk digunakan sebagai bahan bakar.
Laktosa intoleran adalah ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi
glukosa dan galaktosa karena enzim β-galaktosidase yang rendah pada brush
border pada usus halus (Marsh & Riley 1998). Jika seseorang tidak mempunyai
cukup β-galaktosidase maka laktosa menjadi tidak tercerna dan tidak dapat
diserap masuk ke dalam darah. Bahan-bahan ini akan menumpuk di dalam usus.
Oleh bakteri usus, tumpukan gula susu ini akan diubah menjadi asam-asam
organik dan gas karbon dioksida, gas metan, dan hidrogen. Deposit asam ini
merangsang timbulnya gerakan usus. Hal ini menyebabkan diare dengan tinja
berair, berbusa, dan berbau asam. Penderita laktosa intoleran di dunia terdapat
pada suku bangsa: Indian Amerika sekitar 95-100%, Mediterania 80-85%, Afrika
85-90%, Asia 90-100%, Eropa Utara 40-55%, dan Meksiko 50-75% (Rusynyk &
Still 2001).
Susu dapat dimodifikasi bagi penderita laktosa intoleran dengan ultrafiltrasi,
fermentasi (Fox & McSweeney 1981), dan hidrolisis (Winarno 1999). Proses
ultrafiltrasi akan menghilangkan makromolekul berbobot molekul besar seperti
laktosa dan protein akibat filtrasi sehingga ini akan mengurangi nutrisi (Fox &
McSweeney 1981). Proses fermentasi akan mengubah susu menjadi produk-
produk baru, misalnya susu asam dan yoghurt yang pada umumnya dapat
menurunkan 25% kadar laktosa (Winarno 1999). Hidrolisis laktosa dilakukan
2
secara enzimatik menggunakan β-galaktosidase yang akan menghidrolisis laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa yang masih memiliki nilai energi tinggi namun
aman bagi penderita laktosa intoleran. Selain itu, penderita laktosa intoleran dapat
juga mengkonsumsi suplemen β-galaktosidase. Enzim β-galaktosidase yang sudah
dijual di pasaran adalah Maxilact yaitu β-galaktosidase dari Kluyveromyces lactis.
Enzim ini berupa kapsul maupun cairan. Jika enzim ini ditambahkan ke dalam
susu dan didiamkan selama semalam dalam suasana dingin akan mampu
menghidrolisis laktosa sebesar 70% (Mahoney 2004). Metode ini memang
terbukti efektif mereduksi gejala yang berhubungan dengan malabsorbsi laktosa
tetapi obat ini harganya mahal (Fox & McSweeney 1981).
Penggunaan enzim dalam keadaan bebas, yakni terlarut dalam air, kurang
menguntungkan karena enzim hanya dapat digunakan untuk satu kali reaksi. Salah
satu metode agar enzim tersebut dapat dipakai berulang adalah menggunakan
teknik amobilisasi (Palmer 1991). Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian
pergerakan dan pertumbuhan secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau
organel. Proses ini biasanya menghasilkan bentuk tidak larut dalam air. Sel atau
enzim yang teramobil sering digunakan pada industri karena dapat digunakan
secara terus menerus sebagai biokatalis sehingga dapat menghemat biaya produksi
(Mahoney 2004).
Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan dari hewan dan mikroorganisme.
Salah satunya adalah Enterobacter colacae. E. cloacae B5 menghasilkan β-
galaktosidase dengan aktivitas transglikosilasi sebesar 55% (Lu et al. 2009).
Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong telah mengidentifikasi kemampuan E.
cloacae dalam memproduksi enzim ini. Isolat tersebut merupakan isolat dari
buah-buahan yang berasal dari Gunung Salak. Pemilihan E. cloacae karena isolat
ini belum diteliti dan diharapkan isolat ini menghasilkan enzim β-galaktosidase
yang potensial dalam mendegradasi laktosa pada susu UHT.
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan purifikasi, amobilisasi, dan
karakterisasi β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Selain itu, untuk
mengetahui aktifitas penurunan kadar laktosa pada susu UHT oleh sel E. cloacae
bebas, sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase bebas, dan β-galaktosidase
teramobil. Hipotesis penelitian ini adalah Enterobacter cloacae menghasilkan
3
enzim β-galaktosidase yang dapat menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.
Aktivitas penurunan kadar laktosa oleh sel E. cloacae teramobil, β-galaktosidase
bebas, dan β-galaktosidase teramobil berbeda satu sama lain. Penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai aktivitas β-
galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Enzim β-galaktosidase ini dapat juga
digunakan dalam pembuatan susu UHT bebas laktosa untuk penderita laktosa
intoleran.
TINJAUAN PUSTAKA
Enzim β-Galaktosidase
Enzim β-galaktosidase (EC 3.2.1.23) termasuk enzim hidrolase yang dapat
menghidrolisis ikatan β-D-galaktosida pada ujung nonreduksi residu β-D-
galaktosa (Gambar 1). Nama sistematiknya adalah β-D-galaktosida
galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain laktase (IUBMB Enzyme
Nomenclature 1980). Cara kerja enzim ini adalah menghidrolisis ikatan β-(1,4)-
glikosida pada laktosa. Penggunaan enzim β-galaktosidase dalam proses hidrolisis
ini mempunyai kekurangan dimana hidrolisis laktosa secara keseluruhan tidak
mungkin terjadi karena enzim dihambat oleh terbentuknya galaktosa didalam
reaksi hidrolisis (Boyer 2002).
Enzim β-galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan yeast
sedangkan pada fungi bersifat ekstraseluler. Enzim ini pun bersifat induktif karena
akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004).
Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase dapat dilihat pada Tabel 1. Enzim β-
galaktosidase dari bakteri seperti Lactobacillus bulgaricus bersifat aktif pada pH
rendah (dibawah pH 5,5) dengan suhu berkisar 30-60ºC (Itoh et al. 1980; Cesca et
al. 1984). Enzim β-galaktosidase dari yeast seperti Kluyveromyces lactis dan
Kluyveromyces fragilis bersifat aktif pada pH 6-8 dengan suhu berkisar 25-40ºC.
Enzim yang sama hasil produksi dari fungi seperti Aspergillus niger dan
Aspergillus oryzae aktif pada pH rendah berkisar 2,5-6,0 serta bersifat
termostabil (Mahoney 2004).
Matthews (2005) menyatakan enzim ini berbentuk tetramer yang terdiri 4
rantai polipeptida (monomer) serta bobot molekul sekitar 464 kDa. Setiap
monomer terdiri dari 1023 asam amino. Enzim ini mempunyai situs aktif pada
Glu 461, Glu 537, dan Trp 999. Glu 461 terlibat pada stabilisasi elektrostatik pada
keadaan transisi. Glu 537 berperan sebagai nukleofili. Trp 999 berperan mengikat
ligan. Ion natrium akan berinteraksi dengan gugus hidroksil dari ligan (Huber et
al. 1994). Langkah pertama mekanisme katalitiknya adalah laktosa membentuk
intermediet dengan nukleofil Glu 537 dan dibantu dengan asam (A: Glu 461 atau
ion Magnesium). Selanjutnya Glu 461 mendonorkan proton dengan memberikan
5
H+ pada oksigen glikosidik yang disertai pemutusan ikatan glikosidik dan
pelepasan glukosa. Langkah kedua adalah pembentukan intermediet transient
triagonal oxocarbonium yang dibantu oleh basa (B: Glu 461) lalu terjadi
protonasi dari Glu 461 yang dikatalisis air dan diakhiri dengan transfer galaktosil
ke air atau gula lain. Jika akseptor berupa air maka akan terjadi proses hidrolisis
sehingga terbentuk glukosa dan galaktosa. Jika akseptornya berupa gula lain maka
akan terjadi proses transglikosilasi yang akan membentuk galaktooligosakarida
(Gambar 2) (Matthews 2005).
Gambar 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase.
Gambar 2 Mekanisme katalitik dari β-galaktosidase (Matthews 2005).
β-Galaktosidase
Laktosa D-Galaktosa D-Glukosa
+ H2O +
Laktosa
Pembentukan intermediet
Glukosa
Pemutusan ikatan
Intermediet transient triagonal
6
Tabel 1 Mikroorganisme penghasil β-galaktosidase (Mahoney 2004).
Sumber Jenis-jenis Yeast Candida pseudotropicalis, Saccharomyces anamensis, Kluyveromyces
bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus, Pichia pastoris
Fungi Alternaria alternata, Alternaria palmi, Aspergillus foetidus, A. fonsecaeus, A. niger, A. oryzae, Bauvaria bassiana, Curvalaria inaequalis, Fusarium moniliforme, Mucor meihei, Mucor pusillus, Paecilomyces varioti, Penicillium conescens, P. chrysogenum, P. notatum, P. simplicissum, P. melloti, Rhizomucor spp., Saccharopolyspora rectivirgula, Scopulariopsis spp., Sirobasidium magnum, Streptomyces violaceus, Trichoderma reesei
Bakteri Arthrobacter spp., Bacillus acidocaldarius, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus megaterium, Bacillus stearothermophilus, Bacilus subtilis, Bacteroides polypragmatus, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium infantis, Clostridium acetobutylicum, Clostridium thermosulfurogens, Corynebacterium murisepticum, Enterobacter agglomerans, Enterobacter cloacae, Erwinia aroieae, Escherichia coli, Klebsiela pneumoniae, Lactobacillus acidophilus, L. crispatus, L. delbruecki, L. bulgaricus, L. kefiranofaciens, L. helveticus, L. lactis, L. sporogenes, L. thermophilus, Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc citrovorum, Pediococcus acidilacti, Pediococcus pento, Pseudoalteromonas haloplanktis, Pseudomonas fluorescens, Streptococcus thermophillus, Sulfolobus solfataricus, Thermoanaerobacter spp., Thermus ruber, Thermus thermophillus, Vibrio cholerae, Xanthomonas campestris
Perbandingan reaksi transglikosilasi laktosa dan hidrolisis laktosa
tergantung dari jumlah substrat yang tersedia. Reaksi transglikosilasi akan terjadi
pada konsentrasi laktosa yang tinggi sekitar 15-50% sehingga akan terbentuk
galaktooligosakarida (Greenberg & Mahoney 1983). Jika konsentrasi laktosa
rendah yaitu sekitar 5% maka akan terjadi reaksi hidrolisis yang akan membentuk
glukosa dan galaktosa (Burvall & Dahlqvist 1979). Oleh karena itu, enzim ini
digunakan pada industri pangan untuk mereduksi laktosa pada susu dan whey
serta produksi galaktooligosakarida (Mahoney 1998).
β-galaktosidase terdapat pada usus halus manusia yang dapat menghidrolisis
laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta mempunyai pH optimum 6 (Campbell
7
et al. 2005). Jika laktosa tidak dapat dihidrolisis oleh β-galaktosidase, laktosa
yang mempunyai sifat osmotik yang tinggi ini dapat menarik air dan cairan tubuh
ke dalam saluran pencernaan usus kecil. Masuknya cairan tubuh ke dalam usus
kecil akan merangsang gerakan peristaltik dinding usus menjadi lebih cepat. Hal
ini akan mendorong isi usus kecil berpindah secara cepat pula ke dalam usus
besar. Di dalam usus besar ini bakteri-bakteri akan memfermentasikan laktosa
menghasilkan berbagai asam organik dan gas. Akibatnya, akan timbul gejala sakit
perut, mulas, kejang perut, pengeluaran gas, dan diare (Winarno 1999). β-
galaktosidase dapat diaplikasikan untuk penderita laktosa intoleran dengan cara
hidrolisis laktosa pada susu serta konsumsi suplemen β-galaktosidase (Rusynyk &
Still 2001).
Enterobacter cloacae
Bakteri ini memiliki klasifikasi sebagai berikut kingdom Bacteria, filum
Proteobacteria, kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili
Enterobacteriaceae, genus Enterobacter, dan spesies Enterobacter cloacae.
Bakteri ini mempunyai dua subspesies yaitu E. cloacae subsp. cloacae dan E.
cloacae subsp. dissolvens (Holt et al. 1994). E. cloacae merupakan bakteri
berbentuk batang (Gambar 3), Gram negatif, anaerobik fakultatif, ukurannya
berkisar (0,3-0,6) µm × (0,8-2,0) µm, dan motil. Bakteri ini bergerak dengan
menggunakan flagelum peritrikus yaitu flagela yang secara merata tersebar
diseluruh permukaan sel. E. cloacae dapat hanya menggunakan sitrat dan asetat
sebagai sumber karbon. Bakteri tersebut dapat diisolasi dari buah-buahan, usus
hewan, tanah, dan perairan (Pelczar & Chan 1988).
Gambar 3 Enterobacter cloacae.
8
E. cloacae menghasilkan enzim β-galaktosidase, arginin dihidrolase, dan
ornitin dekarboksilase (Huber 1999). β-Galaktosidase dari E. cloacae B5 yang
diisolasi dari tanah mempunyai aktivitas transglikosilasi dan menghasilkan
galaktooligosakarida sekitar 55% dari 275 g/L laktosa pada suhu 50ºC selama 12
jam. Enzim β-galaktosidase ini merupakan homotetramer dengan bobot molekul
442 kDa. Suhu optimumnya pada 35ºC dan aktif pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et
al. 2009)
Susu UHT
Susu adalah hasil ekskresi normal kelenjar susu induk mamalia betina untuk
memberi makan anaknya. Secara kimiawi susu merupakan emulsi lemak dalam
air yang mengandung gula, garam-garam mineral, dan protein dalam bentuk
suspensi koloidal (Rahman et al. 1992). Menurut Walstra et al. (1999), komponen
utama susu adalah air, lemak, protein, laktosa, asam organik, dan mineral (Tabel
2). Selain komponen-komponen dengan persentase besar, di dalam susu juga
terdapat komponen lainnya seperti vitamin (vitamin B, C, dan D) dan enzim
(fosfatase, peroksidase, lipoprotein lipase, protease). Berdasarkan kandungan
lemaknya susu terbagi menjadi dua macam, yaitu susu berlemak (whole milk) dan
susu skim (skim milk). Susu skim mengandung lemak yang lebih rendah
dibanding susu berlemak.
Susu merupakan media yang baik untuk pertumbuhan mikroorganisme
karena komposisinya yang sangat kompleks. Hal ini menyebabkan susu mudah
sekali mengalami kerusakan oleh mikroorganisme, terutama oleh beberapa jenis
bakteri patogen. Bakteri tersebut akan merusak susu sehingga menurunkan daya
simpannya (Kusnawati 2004). Salah satu upaya untuk mengurangi jumlah bakteri
patogen adalah dengan pemanasan.
Fennema (1996) menyatakan bahwa ada tiga jenis pemanasan pada proses
pengolahan susu, yaitu sterilisasi, pasteurisasi, dan ultra high temperature (UHT).
Sterilisasi biasa dilakukan pada suhu 107-115ºC selama 20-40 menit atau pada
suhu 120-130ºC selama 8-12 menit. Proses ini berpengaruh besar terhadap
kandungan protein karena protein akan tereduksi hingga lebih dari 20%.
Pasteurisasi terdiri dari Holding Methode dan High Temperature Short Time
9
(HTST). Holding Methode merupakan pemanasan dengan suhu 63ºC selama 30
menit. Sedangkan HTST merupakan pemanasan pada suhu 72ºC selama 15 detik.
Tujuan pasteurisasi adalah untuk menghilangkan bibit penyakit sehingga
mengurangi jumlah total bakteri untuk meningkatkan kualitas simpan. Semua
produk pasteurisasi harus disimpan pada suhu rendah karena masih mengandung
bakteri yang tahan panas seperti bakteri termofilik, bakteri asam laktat, bakteri
penghasil spora, dan beberapa jenis bakteri aerobik dan bakteri aerobik fakultatif
seperti Bacillus spp. (Early 1998). UHT merupakan pemanasan pada suhu yang
sangat tinggi diatas 135ºC dalam waktu yang sangat singkat.
Susu UHT dibuat dari susu cair segar yang diolah dengan menggunakan
pemanasan pada suhu tinggi dan dalam waktu yang singkat untuk membunuh
seluruh mikroba sehingga memiliki mutu yang baik. Proses UHT biasanya
dilakukan pada suhu 136-138ºC selama 5-8 detik atau pada suhu 140-145ºC
selama 2-4 detik (Fennema 1996). Kelebihan susu UHT adalah susu ini sangat
higienis karena bebas dari mikroba dan spora sehingga potensi kerusakan
mikrobiologis sangat kecil. Enzim-enzim pada susu seperti fosfatase, protease,
katalase, lipoprotein lipase, laktoperoksidase, sulfhidril oksidase, dan xantin
oksidase mengalami inaktivasi sehingga tidak akan merusak susu (Walstra et al.
1999). Oleh sebab itu, susu UHT mempunyai daya simpan yang panjang pada
suhu kamar hingga 6 bulan. Kontak panas yang sangat singkat pada proses UHT
menyebabkan mutu sensori seperti warna, aroma, dan rasa relatif tidak berubah
(Fennema 1996). Nutrisi yang terkandung sedikit menurun seperti terjadinya
reduksi protein berkisar 2-4%, menurunnya kadar vitamin B dan C, dan reaksi
Maillard yang lebih rendah. Reaksi Maillard merupakan reaksi pencoklatan non
enzimatik yang terjadi antara laktosa dan protein susu akibat proses pemanasan
(Walstra et al. 1999).
Tabel 2 Komponen utama susu (Walstra et al. 1999)
Komponen Rata-rata (%) Kisaran Normal (%) Air 87,1 85,3-88,7
Laktosa 4,6 3,8-5,3 Lemak 4,0 2,5-5,5 Protein 3,25 2,3-4,4 Mineral 0,7 0,57-0,83
Asam organik 0,17 0,12-0,21
10
Purifikasi Enzim
Pemekatan Enzim
Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses purifikasi sebelum
tahap purifikasi selanjutnya (seperti kromatografi) dan dapat digunakan untuk
keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode
yaitu analitik dan preparatif. Metode analitik menggunakan pengendapan asam
(contohnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan
denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap
mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif
misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik,
ultrafiltrasi, liofilisasi, dan dialisis (Bollag & Edeistein 1991). Metode pemekatan
β-galaktosidase biasanya menggunakan pengendapan dengan garam.
Pengendapan protein pada tahap awal purifikasi berfungsi untuk
memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan
memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim yang tidak dikehendaki.
Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang
berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan
daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Pengendapan dengan garam
biasanya menggunakan garam divalen seperti MgCl2, MgSO4, dan amonium
sulfat biasanya lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH4Cl, dan
KCl (Boyer 2000). Efek salting-in tidak dipengaruhi oleh sifat garam netral tetapi
dipengaruhi oleh konsentrasi dan jumlah muatan pada tiap ion dalam larutan.
Kelarutan protein meningkat pada kenaikan konsentrasi garam, kenaikan
kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan
garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein akan menurun (salting-out).
Konsentrasi garam yang optimum ini sekaligus menurunkan aktivitas enzim, hal
ini karena sebagian protein mengalami denaturasi dan rusak oleh pengaruh
perlakuan selama pengendapan. Semakin banyak molekul air yang berikatan
dengan ion-ion garam akan menyebabkan penarikan molekul air yang
mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling
berinteraksi, teragregasi, dan mengendap (Scopes 1993).
11
Pemilihan garam amonium sulfat untuk pengendapan β-galaktosidase
karena beberapa keuntungan seperti kelarutannya tinggi, tidak bersifat toksik,
murah, dan stabilitasnya terhadap enzim. Pada proses pengendapan, terjadi
penurunan kadar protein pada supernatan dan akan terjadi peningkatan protein
pada endapan. Penambahan garam dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk
pada suhu rendah, hal ini bertujuan untuk menghindari timbulnya buih yang dapat
menyebabkan denaturasi protein.
Tahap selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses pemisahan
molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh membran
semipermeabel. Kantong dialisis selofan (MWCO 10 kD) dalam bufer mampu
memisahkan molekul-molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti
ion logam, inhibitor, peptida kecil, dan lainnya. Molekul yang besar dan
mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam membran
seperti β-galaktosidase. Setelah enzim dimasukkan ke kantong dialisis dan
direndam dalam larutan bufer maka akan terjadi proses difusi dan osmosis.
Konsentrasi garam di dalam kantong dialisis lebih tinggi sehingga larutan bufer
akan masuk ke dalam kantong dialisis menggantikan garam yang keluar sehingga
terjadi proses kesetimbangan (Scopes 1993).
Kromatografi Filtrasi Gel
Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran
molekulnya. Pemisahan akan berlangsung di dalam kolom yang berisi gel dalam
bentuk granula dan terdiri atas struktur tiga dimensi dari polimer yang berikatan
silang. Ikatan silang ini menghasilkan pori-pori di dalam granula. Ukuran pori
dipengaruhi oleh tingkatan ikatan silang, makin besar tingkatan ikatan silang
maka makin kecil ukuran pori. Polimer yang membentuk gel matrik harus
mempunyai syarat: tidak mudah bereaksi; harus stabil di dalam kisaran pH, suhu,
dan kekuatan ionik yang lebar; kandungan gugus ion harus kecil untuk mencegah
efek pertukaran ion; mempunyai rigiditas mekanik yang tinggi untuk menahan
laju aliran yang cepat; ukuran partikel harus seragam; dan tersedia untuk berbagai
jenis gel sehingga dapat membedakan ukuran protein yang beraneka ragam
(Boyer 2000).
12
Gel yang dapat digunakan untuk kromatografi filtrasi gel berupa dekstran,
poliakrilamida, agarosa, kombinasi poliakrilamida-dekstran, dan kombinasi
dekstran-agarosa. Gel yang pertama dikembangkan adalah dekstran yang berasal
dari polisakarida. Dekstran mempunyai nama dagang sephadex. Jika dekstran
berikatan silang dengan N,N-metilenbisakrilamida dinamakan Sephacryl. Gel
poliakrilamida diproduksi dari kopolimerisasi akrilamida dengan N,N-
metilenbisakrilamida. Agarosa terbuat dari galaktosa dan anhidrogalaktosa. Nama
dagang gel agarosa adalah Bio Gel-A, Sepharose, dan Superose. Kombinasi
poliakrilamida-dekstran mempunyai nama dagang Ultragel. Sedangkan kombinasi
dekstran-agarosa dinamakan Superdex (Boyer 2000).
Superdex tersusun dari pengikatan kovalen antara dekstran dan agarosa.
Superdex 200 dapat memisahkan fraksi protein dengan bobot molekul sekitar
10.000-600.000 Dalton dengan ukuran gelnya berkisar 13 µm. Superdex 200
stabil antara pH 1-14. Superdex 200 mempunyai keunggulan yaitu tingkat resolusi
yang tinggi walaupun dalam keadaan laju alir yang cepat (Hellberg, Ivarsson,
Johansson 1996).
Teknik Amobilisasi
Amobilisasi didefinisikan proses pengendalian pergerakan dan pertumbuhan
secara total atau sebagian pada enzim, sel, atau organel. Metode amobilisasi yang
ideal harus mudah pengerjaannya dan tidak merusak substansi yang mengalami
amobilisasi. Faktor-faktor seperti suhu, perubahan pH, dan radikal bebas selama
proses amobilisasi harus ditetapkan kondisi optimumnya (Cao 2005). Bahan
penyangga yang digunakan bersifat inert dan teraktivasi.
Menurut Illanes et al. (2008), teknik amobilisasi terdiri atas penempelan
pada permukaan padat (adsorpsi), ikatan kovalen (covalen bonding), ikatan silang
(crosslinking), mikroenkapsulasi, dan penjebakan (entrapment) (Gambar 4).
Teknik amobilisasi adsorpsi berdasarkan interaksi ikatan ionik, interaksi ikatan
hidrogen, ikatan hidrofobik atau gaya Van der Waals antara enzim atau sel mikrob
dan bahan penyangga (Ramakrishna & Prakasham 1999). Bahan penyangga yang
biasa digunakan adalah alumina, kaca, tanah liat dan penukar ion. Amobilisasi
dengan pengikatan kovalen adalah pembuatan ikatan antara gugus fungsi enzim
seperti –OH, -SH, -NH2, dan -COOH atau sel mikrob dengan bahan penyangga
13
anorganik untuk membentuk ikatan kovalen yang stabil. Pembentukan ikatan
kovalen ini akibat penambahan agen pengikat. Bahan penyangga yang digunakan
adalah silika gel yang terlapisi glutaraldehida. Glutaraldehida digunakan untuk
membangun protokol antara gugus fungsi enzim dan bahan penyangga.
Amobilisasi dengan menggunakan teknik pengikatan silang dilakukan dengan
menggunakan dua atau lebih pereaksi. Bahan yang digunakan adalah
polietilenglikol (PEG) dan glutaraldehida. Polietilenglikol sebagai agen presipitasi
dan glutaraldehida sebagai pembentuk ikatan silang (Illanes et al. 2008). Teknik
mikroenkapsulasi adalah suatu teknik yang menggunakan enzim atau sel mikrob
dilingkupi oleh membran polimer semipermeabel yang bulat dengan diameter 1-
100 µm. Walaupun molekul enzim atau sel mikrob dilingkupi oleh membran,
substrat maupun produk dapat berdifusi secara bebas melalui membran. Bahan
yang digunakan adalah liposom-polimer (Cao 2005). Teknik amobilisasi dengan
penjebakan adalah membuat enzim atau sel mikrob terjebak di dalam polimer
butiran gel (Illanes et al. 2008).
Prinsip metode penjebakan adalah inklusi sel atau enzim di dalam jaringan
rigid yang berfungsi mencegah sel atau enzim berdifusi keluar medium namun
substrat masih tetap dapat masuk ke dalam butiran gel (beads). Butiran gel berupa
polisakarida (seperti agar, alginat, karagenan, dan selulosa), protein (kolagen dan
gelatin), dan sintetik (poliakrilamida). Matriks alginat, karagenan, dan
poliakrilamid paling luas dipakai pada teknik amobilisasi sel maupun enzim.
Alginat adalah heteropolisakarida linear dari asam D-manuronat dan L-guluronat
(Najafpour et al. 2004). Alginat berasal dari alga coklat yang secara luas telah
dipakai sebagai pengental, penstabil, gel, dan film.
Penjebakan sel atau enzim menggunakan alginat karena alginat tidak larut
air, pengerjaannya mudah, dan tidak berbahaya. Campuran sel atau enzim dengan
natrium alginat diteteskan ke dalam larutan yang mengandung kation multivalen
misalnya kalsium klorida akan membentuk reaksi antara alginat dan kation
multivalen menjadi kalsium alginat. Alginat akan mengalami pemadatan oleh
adanya ion kalsium tetapi tidak menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan
tekanan osmotik yang drastis. Sel atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi
kalsium alginat dalam bentuk butiran gel (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium
14
alginat secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi
yang dapat meningkatkan kestabilan kimia butiran gel tanpa membatasi transfer
masa.
Keuntungan teknik amobilisasi adalah lebih mudah memisahkan produk
yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, penggunaan kembali biokatalis,
produktivitas volumetrik yang tinggi, dan mereduksi biaya produksi. Enzim yang
teramobilisasi mempunyai half-live lebih panjang dan dapat diprediksi rata-rata
kerusakannya (Cao 2005).
Gambar 4 Teknik amobilisasi enzim. (a) pengikatan kovalen; (b)pengikat silang;
(c) adsorpsi; (d) penjebakan; (e) enkapsulasi.
Karakterisasi Enzim
Suhu dan pH
Suhu mempunyai dua pengaruh yang saling bertentangan. Suhu dapat
meningkatkan aktivitas enzim, tetapi dapat pula merusak struktur enzim. Suhu
optimum merupakan batas keduanya (Dixon & Webb 1978). Peningkatan suhu
sebelum tercapai suhu optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi katalitik
enzim karena energi kinetik molekul-molekul yang bereaksi, yaitu pada saat
15
kompleks enzim-substrat melampaui energi aktivasi terlalu besar, sehingga
memecah ikatan sekunder pada konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini
mengakibatkan enzim terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya (Martin
1981).
Efek pH pada enzim berkaitan dengan keadaan ionisasi dari sistem yang
dikatalisis, termasuk substrat, dan enzim itu sendiri. Perubahan pH dapat
mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim
sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Kadar pH
yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan ketidakstabilan pada
konformasi enzim sehingga menyebabkan struktur pada enzim rusak. Enzim
mempunyai pH optimum yang khas yang akan menyebabkan aktivitas maksimal.
Keadaan optimum ini dihubungkan dengan saat gugus pemberi proton atau
penerima proton yang aktif pada sisi enzim berada pada kondisi ionisasi yang
tepat. Keadaan optimum tidak harus sama dengan pH lingkungannya (Lehninger
2004).
Aktivator dan Inhibitor
Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila
komponen tambahan tersebut berupa senyawa anorganik disebut kofaktor,
sedangkan jika senyawa organik disebut koenzim. Pada beberapa enzim, kofaktor
dan koenzim terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi ada juga yang
berfungsi sebagai pembawa gugus fungsional tertentu. Hampir semua enzim dapat
dihambat oleh senyawa kimia tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat,
senyawa organik, bahkan substrat enzim itu sendiri (Lehninger 2004). Ion K+ dan
Mg2+ dibutuhkan agar aktivitas enzim β-galaktosidase optimum (Mahoney 2004).
Parameter Kinetik
Kecepatan reaksi yang dikatalisis enzim sangat dipengaruhi oleh berbagai
konsentrasi substrat terhadap kecepatan reaksi awal apabila konsentrasi enzim
dijaga konstan. Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan
reaksi amat rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya
konsentrasi substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini
16
dilampaui, kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan
bertambahnya konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh
substratnya dan tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004).
Michaelis dan Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan
sebagai tetapan Michaelis-Menten (KM) adalah konsentrasi substrat tertentu pada
saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Kecepatan maksimum
(vmaks) adalah kecepatan yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi substrat
tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk
hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi
substrat ([S]), kecepatan awal (v0), vmaks, dan KM (Lehninger 2004). Persamaan
Michaelis-Menten adalah sebagai berikut.
[S] K[S] v
vM
maks0
Persamaan Michaelis – Menten dapat ditransformasikan ke suatu
persamaan lain yang disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini akan
menghasilkan nilai vmaks dan KM yang lebih tepat karena pemetaan 1/v0 terhadap
1/[S] menghasilkan garis lurus. Garis ini akan memiliki sudut KM/vmaks,
perpotongan garis pada sumbu y sebesar 1/vmaks dan perpotongan pada sumbu x
sebesar -1/KM (Lehninger 2004). Persamaan Lineweaver-Burk adalah sebagai
berikut.
maksmaks
M
0 v
1
S
1K1
][.
vv
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan antara lain biakan berupa Enterobacter cloacae yang
merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong. Media kultur dan media
produksi terdiri atas 20 g laktosa, 10 g pepton, 20 g ekstrak khamir, dan 10 g
NaCl yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades. Bufer yang digunakan adalah bufer
fosfat 0,05 M. Bahan untuk penentuan aktivitas enzim β-galaktosidase, pembuatan
kurva standar, dan penentuan karakterisasi enzin adalah enzim β-
galaktosidase,bufer fosfat 0,1 M pH 7, o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida
(oNPGal), Na2CO3 1 M, o-nitrofenol (oNP), CaCl2.2H2O, CoCl2.6H2O,
ZnSO4.7H2O, CuCl2.2H2O, MnCl2.4H2O, HgCl2, MgSO4.7H2O Bahan untuk
penentuan kadar protein metode Bradford dan kurva standar adalah enzim β-
galaktosidase, pereaksi Bradford (100 mg coomassie briliant blue dalam 50 ml
etanol 95% kemudian ditambahkan 100 ml H3PO4 85% lalu ditera dengan
akuades hingga 1 liter), dan bovine serum albumin (BSA). Bahan untuk
pengendapan enzim yaitu amonium sulfat dan membran selofan. Pengisi kolom
kromatografi berupa Superdex 200 dan glasswol. Bahan untuk amobilisasi enzim
dan sel adalah Na-alginat dan CaCl2. Bahan untuk mengetahui potensi β-
galaktosidase pada susu UHT adalah susu UHT, sel E. cloacae amobil, sel E.
cloacae bebas, enzim β-galaktosidase amobil, dan enzim β-galaktosidase hasil
kromatografi filtrasi gel, dan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (Cypress
Diagnostics).
Alat-alat yang digunakan untuk penentuan waktu produksi optimum, uji
aktivitas enzim β-galaktosidase dan karakterisasinya, penentuan kadar protein,
dan produksi β-galaktosidase adalah mikropipet, tabung reaksi, erlenmeyer,
termometer, neraca analitik, vorteks, penangas air Memmert, penangas es,
stopwatch, pH meter HM-25G TOADKK, kuvet, spektrofotometer UV-Vis 1700
Shimadzu, inkubator Isuzu, botol sentrifus, High Speed Refrigerated Centrifuge
6500 KUBOTA, dan sonikator Eyela. Alat-alat yang digunakan untuk purifikasi
enzim adalah kolom kromatografi, kolektor fraksi, dan ruang pendingin. Alat
18
yang digunakan untuk amobilisasi dan aplikasi β-galaktosidase pada susu UHT
adalah pengaduk bermagnet, syringe, dan penangas bergoyang.
Metode Penelitian
Penentuan Waktu Produksi β-Galaktosidase Optimum
Sebanyak 2% inokulum bakteri Enterobacter cloacae dengan kerapatan
optik 0,7 diinokulasi ke dalam 300 ml media kultur kemudian diinkubasi pada
suhu 37ºC. Sampling dilakukan setiap 6 jam dalam dua hari pada hari ke-0 hingga
hari ke-2 sebanyak 15 ml. Jumlah bakteri diukur pada panjang gelombang 600 nm
kemudian sampel disentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm (15.880 g) selama 10
menit pada suhu 4ºC. Pelet yang diperoleh dicuci dengan bufer fosfat 0,05 M pH
6,5 kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit
pada suhu 4ºC. Peletnya dilarutkan dalam 1 ml bufer fosfat 0,05 M pH 6,5
kemudian dilakukan pemecahan sel dengan glass bead selama 5 menit.
Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10
menit pada suhu 4ºC. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas β-
galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009).
Produksi β-Galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997)
Sebanyak 2% inokulum E. cloacae dengan kerapatan optik 0,7 setara
dengan 1,40×1010 sel/ml diinokulasikan ke dalam 1.000 ml media produksi yang
telah steril, diinkubasi pada suhu 37°C. Sel dipanen pada waktu fermentasi yang
menunjukkan waktu produksi β-galatosidase optimum. Setelah fermentasi selesai,
cairan disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C.
Peletnya dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan bufer fosfat 0,05 M pH
6,5. Pelet yang diperoleh dilarutkan dalam bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian
dilakukan pemecahan sel dengan sonikator 50 kHz selama 10 menit pada suhu
4°C. Selanjutnya suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit pada suhu 4°C. Supernatan yang diperoleh merupakan ekstrak kasar β-
galaktosidase.
19
Purifikasi β-Galaktosidase
Pengendapaan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1993). Pengendapan
enzim dilakukan dengan membuat fraksi pengendapan amonium sulfat 10%, 20%,
30%, 40%, 50%, 60%, dan 70% secara bertahap. Ekstrak kasar β-galaktosidase
diendapkan dengan amonium sulfat dengan cara ekstrak kasar ditambahkan
dengan amonium sulfat secara bertahap hingga konsentrasi 10% lalu diaduk
dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 60 rpm selama 20 menit pada
suhu 4ºC. Setelah itu campuran didiamkan selama 1 jam pada suhu 4ºC.
Selanjutnya campuran disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit dengan suhu 4ºC. Endapan enzim dipisahkan dan dilarutkan dalam bufer
fosfat 0,05 M pH 6,5 kemudian diukur aktivitas β-galaktosidase dan kadar
protein. Supernatan ditambahkan amonium sulfat kembali seperti prosedur diatas
untuk fraksi pengendapan selanjutnya. Jumlah amonium sulfat (gram) yang
digunakan untuk melarutkan 1 liter larutan enzim menggunakan rumus dibawah
ini dengan S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat sedangkan S2
merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat. Angka 533 menunjukkan bahwa
untuk membuat larutan jenuh 100% dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per
liter. Aktivitas spesifik β-galaktosidase yang tertinggi menunjukan persentase
kejenuhan amonium sulfat yang optimum dan selanjutnya digunakan dalam tahap
purifikasi berikutnya.
Jumlah amonium sulfat (gram/liter) = 0,3S2 - 100
S1) -(S2 533
Dialisis. Potongan membran selofan dibasahi dan direbus dengan natrium
bikarbonat 10 mM selama 10 menit. Selanjutnya membran selofan ditiriskan dan
direbus kembali dengan Na2EDTA 10 mM selama 10 menit. Membran selofan
dicuci beberapa kali dengan akuades. Salah satu ujung membran selofan diikat
dan enzim dimasukkan ke dalam kantung dialisis. Kantung dialisis dimasukkan ke
dalam bufer fosfat 0,01 M pH 6,5 sambil digoyang dengan pengaduk bermagnet
dengan kecepatan 100 rpm. Dialisis dilakukan pada suhu 4°C selama 24 jam.
Kromatografi Filtrasi Gel (Rao & Dutta modifikasi 1981). Matriks
Superdex 200 dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang berdiameter 2,5 cm
dan tinggi 100 cm, pada bagian dasar kolom diberi glasswool sebagai penahan.
20
Volume enzim yang dimasukkan adalah 1 ml. Matriks dielusi dengan bufer fosfat
0,05 M pH 6,5 dengan kecepatan elusi 0,2 ml/menit. Volume fraksi yang
ditampung masing-masing sebanyak 3 ml. Fraksi eluen yang ditampung dalam
tabung diukur aktivitas enzim β-galaktosidase dan kadar protein. Kadar protein
diukur dengan mengukur eluen pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
A280 merupakan panjang gelombang yang menyerap protein, A260 merupakan
panjang gelombang yang menyerap asam nukleat, 1,55 adalah koefisien serapan
maksimum dari protein, dan 0,76 adalah koefisien serapan maksimum dari asam
nukleat (Boyer 2002). Grafik profil elusi dibuat dengan memplotkan sumbu X
berupa nomor fraksi dan sumbu Y berupa nilai kadar protein dan nilai aktivitas β-
galaktosidase.
Konsentrasi Protein (mg/ml) = 1,55 A280 – 0,76 A260
Uji Aktivitas Enzim β-Galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009).
Uji aktivitas β-galatosidase dilakukan dengan cara sebanyak 1.000 µl bufer
fosfat 0,1 M pH 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu
diinkubasi pada suhu 35°C selama 5 menit. Kemudian ditambahkan 200 µl o-
nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) 2 mg/ml dan diinkubasi pada suhu
35°C selama 10 menit. Pada menit ke-10 ditambahkan 1.000 µl Na2CO3 1 M
untuk menghentikan reaksi. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer
UV VIS pada panjang gelombang 420 nm.
Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara membuat berbagai
konsentrasi oNP dari 0-0,500 µmol dengan selang 0,010 µmol yang dilarutkan
dalam bufer fosfat 0,01 M pH 7. Sebanyak 1.000 µl bufer fosfat 0,1 M pH 7 dan
100 µl akuades dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 200
µl oNP berbagai konsentrasi. Inkubasi pada suhu 35°C selama 10 menit.
Selanjutnya campuran ditambahkan 1.000 µl Na2CO3 1 M. Larutan divorteks dan
intensitas warna kuning yang terbentuk diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 420 nm. Hasil pembacaan aktivitas β-galatosidase sampel akan
diplotkan pada hasil kurva standar. Satu unit aktivitas β-galaktosidase dinyatakan
sebagai banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari
substrat oNPGal permenit pada kondisi percobaan.
21
Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976).
Enzim β-galaktosidase sebanyak 20 µl ditambahkan 1 ml pereaksi Bradford.
Larutan divorteks dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada
panjang gelombang 595 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan
adalah bovine serum albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dari 0,05-1,25
mg/ml dengan selang 0,05 mg/ml serta perlakuan yang sama dengan penentuan
kadar protein.
Karakterisasi Enzim β-Galaktosidase
Pengaruh suhu terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase diuji dengan cara mereaksikan
larutan enzim dengan substrat selama 10 menit pada berbagai suhu antara 25-50ºC
dengan selang 5ºC (Lu et al. modifikasi 2009). Aktivitas β-galaktosidase dihitung
dengan mengukur oNP yang terbentuk. Stabilitas enzim terhadap suhu diuji
dengan menginkubasikan larutan enzim pada berbagai suhu (25-50ºC dengan
selang 5ºC) selama 1 jam. Setelah inkubasi selesai larutan enzim dengan cepat
didinginkan di dalam penangas es. Selanjutnya aktivitas enzim tersisa diuji pada
kondisi standar reaksi enzimatis β-galaktosidase (Lu et al. modifikasi 2009). Nilai
aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase dibandingkan dengan kontrol
(enzim tanpa perlakuan).
Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase.
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim diuji dengan cara mereaksikan larutan
enzim dengan substrat pada suhu 35ºC selama 10 menit (Lu et al. modifikasi
2009) pada berbagai kondisi pH larutan bufer (pH 5,5-8,0 dengan selang 0.5 unit).
Aktivitas β-galaktosidase dihitung dengan mengukur oNP yang terbentuk.
Stabilitas enzim terhadap pH diuji dengan menginkubasikan larutan enzim dalam
0,1 M larutan bufer berbagai pH (5,5-8,0 dengan selang 0.5 unit) selama 1 jam.
Setelah inkubasi selesai, dengan cepat diuji aktivitas enzim β-galaktosidase
tersisanya pada kondisi optimum reaksi enzim β-galaktosidase (Lu et al.
modifikasi 2009). Nilai aktivitas enzim tersisa dinyatakan dalam persentase
dibandingkan dengan kontrol (enzim tanpa perlakuan). Bufer yang digunakan
yaitu bufer asetat (pH 5,5-6.0) dan bufer fosfat (pH 6,5-8,0).
22
Pengaruh logam kation terhadap aktivitas β-galaktosidase. Pengaruh
kation terhadap aktivitas β-galaktosidase diuji dengan cara menambahkan kation
(konsentrasi 0,01 M) ke dalam campuran substrat-bufer-enzim, dan diinkubasikan
pada kondisi optimal reaksi enzimatis (Lu et al. modifikasi 2009). Penghambatan
atau peningkatan aktivitas β-galaktosidase oleh kation dinyatakan dalam
persentase aktivitas β-galaktosidase dibandingkan dengan kontrolnya (tanpa
penambahan kation logam). Kation yang ditambahkan dalam bentuk larutan
CaCl2, CoCl2, ZnSO4, CuCl2, MnCl2, HgCl2, dan MgSO4.
Penentuan parameter kinetik. Sebanyak 1.000 µl bufer fosfat 0,1 M pH
optimum, 100 µl enzim, dan substrat oNPGal berbagai konsentrasi (0,01-5 mg/ml
dengan selang 0,5 mg/ml) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Campuran
diinkubasi selama 25 menit pada suhu optimum reaksi enzimatis. Setiap 5 menit
sekali campuran diangkat dan ditambahkan 1.000 µl Na2CO3 1 M untuk
menghentikan reaksi. Larutan dianalisis menggunakan spektrofotometer UV VIS
pada panjang gelombang 420 nm. Grafik dibuat dengan memplotkan hubungan
antara waktu (sumbu X) dan kadar oNP yang terbentuk (sumbu Y) dari berbagai
konsentrasi substrat awal dimana nilai kecepatan reaksi (v) merupakan nilai
kemiringan grafik tersebut. Selanjutnya grafik Lineweaver-Burk dibuat untuk
menentukan nilai KM dan Vmaks. Grafik Lineweaver-Burk diperoleh dari hubungan
antara 1/[S] sebagai sumbu X dan 1/v sebagai sumbu Y. Kecepatan reaksi (v)
diukur sebagai kecepatan pembentukan produk persatuan waktu.
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae dan β-Galaktosidase Optimasi Konsentrasi Alginat dan Jumlah Sel untuk Amobilisasi Sel
(Becerra et al. modifikasi 2001). Sebelum melakukan amobilisasi sel E.cloacae,
penentuan konsentrasi alginat dan sel optimum terlebih dahulu dilakukan dengan
menggunakan variasi natrium alginat steril 4%, 5%, dan 6% serta variasi bobot sel
sebanyak 10%, 20%, dan 40% (b/v). Variasi butiran gel yang diperoleh kemudian
diinkubasikan pada substrat o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) selama
1 jam pada suhu 37°C. Formula konsentrasi alginat dan bobot sel yang
menghasilkan aktivitas pembentukan produk yang paling tinggi merupakan
komposisi optimum yang digunakan untuk amobilisasi sel.
23
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Enzim (Haider dan
Husain modifikasi 2007). Sebelum melakukan amobilisasi enzim, penentuan
konsentrasi alginat optimum terlebih dahulu dilakukan dengan menggunakan
variasi natrium alginat steril 4%, 5%, dan 6% serta enzim β-galaktosidase 10%
(v/v). Variasi butiran gel yang diperoleh kemudian diinkubasikan pada substrat o-
nitrofenil-β-D-galaktopiranosida (oNPGal) selama 24 jam. Konsentrasi alginat
yang menghasilkan aktivitas pembentukan produk yang paling tinggi merupakan
konsentrasi optimum alginat yang digunakan untuk amobilisasi enzim.
Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae dan β-Galaktosidase
Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae (Becerra et al. modifikasi 2001).
Sel E. cloacae hasil pemanen jam ke-18 ditambahkan ke dalam natrium alginat
steril. Butiran gel yang dibuat dengan meneteskan suspensi sel dalam natrium
alginat dengan syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 0,2 M steril sambil diaduk
dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm selama proses
pembentukkan butiran gel. Butiran gel yang sudah terbentuk dibiarkan selama 2
jam dalam larutan CaCl2 0,2 M pada suhu 4ºC supaya gel yang terbentuk lebih
mengeras. Selanjutnya butiran gel disaring dengan kertas saring steril kemudian
dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril untuk dicuci dengan akuades steril
sebanyak 3 kali. Pencucian dengan akuades steril bertujuan untuk menghilangkan
larutan kalsium klorida yang masih menempel pada butiran gel dan sel yang tidak
terjebak oleh natrium alginat. Butiran gel yang telah dicuci diaplikasikan untuk
menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.
Amobilisasi Enzim β-Galaktosidase (Haider & Husain modifikasi
2007). Enzim β-galaktosidase hasil kromatografi filtasi gel ditambahkan ke dalam
natrium alginat steril (konsentrasi optimum). Butiran gel yang dibuat dengan
meneteskan suspensi dengan syringe ke dalam 50 ml larutan CaCl2 0,2 M steril
sambil diaduk dengan pengaduk bermagnet dengan kecepatan 100 rpm selama
proses pembentukkan butiran gel. Butiran gel yang sudah terbentuk dibiarkan
selama 2 jam dalam larutan kalsium klorida. Setelah 2 jam, butiran gel disaring
dengan kertas saring steril kemudian dipindahkan ke dalam labu erlenmeyer steril
24
untuk dicuci dengan akuades steril sebanyak 3 kali. Butiran gel yang telah dicuci
diaplikasikan untuk menurunkan kadar laktosa pada susu UHT.
Aplikasi β-Galaktosidase pada Susu UHT
Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT (Haider & Husein modifikasi 2007).
Sel amobil, sel bebas, β-galaktosidase amobil, dan β-galaktosidase hasil
kromatografi filtrasi gel masing-masing dimasukkan ke dalam susu UHT dengan
perbadingan susu UHT dan butiran gel adalah 1:1 (v/v). Sampel diinkubasi
goyang dengan kecepatan 100 rpm pada suhu optimum selama 24 jam. Setiap 3
jam dilakukan pengambilan sampel sebanyak 250 µl. Analisis penurunan kadar
laktosa menggunakan kit enzimatik analisis glukosa GOD-POD (glukosa
oksidase-peroksidase).
Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil. Sel amobil dan
enzim amobil masing-masing dimasukan ke dalam susu UHT. Sampel diinkubasi
goyang pada suhu 37°C untuk sel amobil dan 40°C untuk enzim amobil.
Pengambilan sampel setelah waktu optimasi amobilisasi sel dan amobilisasi
enzim. Analisis penurunan kadar laktosa menggunakan kit enzimatik analisis
glukosa GOD-POD.
Analisis Laktosa Menggunakan Kit Enzimatik GOD-POD. Sampel
diambil sebanyak 10 µl kemudian ditambahkan 1 ml reagen GOD-POD kemudian
diinkubasi selama 5 menit pada suhu 37°C. Larutan dianalisis menggunakan
spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 505 nm. Absorbansi yang
diperoleh dibandingkan dengan absorbansi standar glukosa 100 mg/dL. Jumlah
laktosa yang terhidrolisis setara dengan jumlah glukosa yang terbentuk pada
kondisi percobaan.
Analisis Statistika
Analisis statistik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam
Rancangan Acak Lengkap (RAL). Penelitian ini dilakukan dengan tiga kali
ulangan. Model linier (Matjik & Sumertajaya 2002) yang digunakan adalah:
Yij = µ + λi + βj+ εij
25
Keterangan:
: pengaruh rataan umum; λi: pengaruh hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase
pada jam ke-i; βj: pengaruh ulangan ke-j; ij: pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh
β-galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j; i= jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18,
21, dan 24; j = 1, 2, 3.
Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada
tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data dilakukan dengan program
SPSS 10.0. Jika hasil uji berbeda nyata maka dilanjutkan dengan uji Duncan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Waktu Optimum Produksi β-Galaktosidase
Kultur Enterobacter cloacae ditumbuhkan pada media yang mengandung
substrat laktosa 2% yang berperan sebagai energi, karbon, dan induser enzim β-
galaktosidase. Keberadaan suatu substrat tertentu dapat memicu suatu
mikroorganisme untuk mensekresi metabolit selnya. Pepton dan ekstrak khamir
sebagai sumber karbon, asam amino, nitrogen, dan vitamin. NaCl berperan
sebagai sumber mineral yang digunakan untuk metabolisme. Nutrisi-nutrisi
tersebut dibutuhkan untuk pertumbuhan bakteri, berkembang biak, dan
menghasilkan enzim yang diinginkan.
Pertumbuhan sel perlu diamati untuk mengetahui sel yang telah diinokulasi
dapat tumbuh di dalam media pertumbuhan. Tujuan lain dari pengamatan tersebut
adalah untuk mengamati pola pertumbuhan dari mikrob tersebut. Prinsip dari
penelitian ini adalah media tumbuh (cair) yang sudah diinokulasi sel diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm setiap interval waktu tertentu.
Penentuan waktu produksi optimum berdasarkan aktivitas enzim β-
galaktosidase tertinggi. Satu unit aktivitas β-galaktosidase dinyatakan sebagai
banyaknya enzim yang diperlukan untuk menghasilkan 1 µmol oNP dari substrat
oNPGal permenit pada kondisi percobaan. Gambar 5 menunjukan bahwa aktivitas
enzim tersebut dari jam ke-12 hingga jam ke-24 mengalami peningkatan hingga
3,712 U/ml dan akan mengalami penurunan pada jam ke-30 hingga jam ke-48.
Penurunan aktivitas enzim ini disebabkan telah terbentuknya produk berupa
glukosa atau galaktosa. Menurut Mahoney (2004), glukosa dan galaktosa ini akan
menghambat kerja β-galaktosidase dalam menghidrolisis substrat laktosa.
Pemanenan sel E. cloacae dilakukan pada waktu produksi β-galaktosidase
optimum yaitu pada jam ke-24 dengan aktivitas sebesar 3,712 U/ml. Selain itu,
bakteri tersebut menghasilkan β-galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam
ke-24 dengan nilai OD berkisar 1,849 atau setara 3,70×1010 sel/ml (Lampiran 6).
Pada fase tersebut, sel membelah dengan laju yang konstan, masa menjadi dua
kali lipat dengan laju yang sama, aktivitas metabolik yang konstan, dan
menghasilkan enzim untuk pertumbuhan (Pelczar & Chan 1988).
27
Bobot basah dan bobot kering sel perlu diamati untuk menyeragamkan sel
yang digunakan untuk fermentasi. Berdasarkan penelitian yang dilakukan,
didapatkan bobot basah sel sebesar 0,558 g/50 ml media setelah 24 jam masa
inkubasi pada suhu 37°C. Hasil ini diikuti dengan didapatnya bobot kering sel
sebesar 0,066 g/50 ml media dan mempunyai jumlah sel sebanyak 3,70×1010
sel/ml.
Gambar 5 Kurva pertumbuhan E.cloacae (■) dan kurva
produksi β-galaktosidase (♦).
Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase
Produksi β-galaktosidase dari E.cloacae dilakukan pada media cair yang
mengandung 2% laktosa lalu diinkubasi berdasarkan penentuan waktu produksi
optimum yaitu pada suhu 37°C selama 24 jam tanpa pengocokan. Hal ini
disebabkan bakteri tersebut bersifat anaerobik fakultatif. Pemanenan sel dilakukan
dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu
4°C, untuk mencegah kerusakan enzim. Dengan demikian, sel yang berbobot
molekul lebih besar dari larutan media akan mengendap karena gaya gravitasi. Sel
yang diperoleh kemudian dicuci dua kali dengan buffer fosfat 0,05 M pH 6,5 agar
terbebas dari pengotor yang berasal dari media. Selanjutnya sel mengalami
pemecahan sel dengan metode sonikasi. Metode ini bertujuan untuk memecah
dinding sel dengan frekuensi gelombang suara yang tinggi. Sel dipecah di dalam
buffer fosfat 0,05 M pH 6,5 pada suhu 4°C agar enzim tidak rusak. Sel dipisahkan
dari ekstrak enzim dengan sentrifugasi. Menurut Lu et al. (2009), enzim β-
galaktosidase pada bakteri E. cloacae merupakan enzim intraseluler sehingga
memerlukan pemecahan dinding sel.
28
Gambar 6 Reaksi hidrolisis oNPGal oleh β-galaktosidase (Miller 1972).
Metode analisis aktivitas β-galaktosidase pada penelitian ini menggunakan
substrat o-nitrofenil-β-galaktopiranosida (oNPGal). Dalam keadaan normal,
oNPGal tidak berwarna. Ketika β-galaktosidase menghidrolisis oNPGal maka
akan menghasilkan galaktosa dan o-nitrofenol (oNP). Reaksi ini dihentikan
dengan penambahan Na2CO3 sehingga pH di dalam larutan menjadi basa sekitar
pH 10-11. Pada pH tersebut oNP akan berubah menjadi bentuk anionik yang
berwarna kuning dan β-galaktosidase menjadi inaktif (Gambar 6). Jumlah oNP
sebanding dengan jumlah β-galaktosidase yang bereaksi sehingga intensitas warna
kuning yang dihasilkan dari oNP dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi
enzim. Jumlah oNP yang terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada
λ = 420 nm (Miller 1972). Berdasarkan hasil percobaan, aktivitas spesifik enzim
β-galaktosidase kasar yang diperoleh sebesar 3,364 U/mg (Tabel 3).
Setelah didapatkan enzim kasar, proses purifikasi selanjutnya adalah dengan
pengendapan menggunakan garam amonium sulfat. Pengendapan protein pada
tahap awal pemurnian berfungsi untuk meningkatkan konsentrasi protein enzim,
mereduksi volume larutan enzim dan memisahkan protein target dari sebagian
kontaminan yang tidak dikehendaki. Terjadinya pengendapan protein pada saat
penambahan garam amonium sulfat dikarenakan terjadinya netralisasi muatan
pada permukaan protein enzim, pengurangan aktivitas kimia protein dan
pengurangan konsentrasi efektif air oleh garam amonium sulfat. Konsentrasi
garam yang diperlukan agar terjadi pengendapan suatu protein berhubungan
dengan jumlah dan distribusi residu bermuatan dan residu polar ionik pada
permukaan protein, jumlah dan distribusi residu hidrofobik yang terekspos pada
permukaan protein serta ukuran dan bentuk protein (Scopes 1993). Proses
pengendapan dengan amonium sulfat dilakukan dalam suasana dingin agar tidak
terjadi peningkatan suhu karena pembebasan energi selama penambahan amonium
sulfat dan mencegah terjadinya denaturasi protein. Amonium sulfat ditambahkan
oNPGal (tidak berwarna)
H2O
β-Galaktosidase
Galaktosa oNP (kuning)
29
sedikit demi sedikit dengan kecepatan konstan agar konsentrasi amonium sulfat
dapat merata dalam berinteraksi dengan enzim. Enzim β-galaktosidase diperoleh
dengan cara sentrifugasi karena enzim akan mengendap. Pelet yang diperoleh
kemudian dilarutkan dengan bufer fosfat 0,05 M pH 6,5 untuk menjaga stabilitas
enzim.
Pengendapan dilakukan dengan cara penambahan amonium sulfat dengan
beberapa konsentrasi dimulai dari 10% hingga 70%. Gambar 7 menunjukan
bahwa pengendapan enzim dengan amonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik
tertinggi pada fraksi 30% dan 40% (Data pada Lampiran 7). Aktivitas spesifik β-
galaktosidase akan menurun pada fraksi lebih dari 40% karena pada fraksi
tersebut enzim yang terendapkan bukan enzim yang diinginkan sehingga aktivitas
β-galaktosidase rendah sedangkan kadar protein tinggi. Oleh sebab itu fraksi
enzim hasil semipurifikasi amonium sulfat 30-40% yang diperoleh aktivitas
spesifik 22,804 U/mg. Aktivitas spesifik enzim hasil pengendapan dengan
amonium sulfat lebih tinggi dibandingkan dengan enzim kasar karena konsentrasi
protein yang diperoleh pada tahap semipurifikasi dengan amonium sulfat ini
mempunyai konsentrasi yang lebih sedikit yaitu 6,524 mg protein (Tabel 3).
Tingkat kemurnian presipitat pun meningkat dari 1 kali menjadi 6,78 kali.
Sementara itu, rendemen β-galaktosidase pada tahap pengendapan dengan
amonium sulfat yang diperoleh sebesar 8,21%.
Gambar 7 Aktivitas total (■) dan protein total (♦) hasil purifikasi dengan
amonium sulfat.
30
Tabel 3 Purifikasi β-galaktosidase dari E.cloacae
Tahapan Total
Aktivitas (U)
Total Protein
(mg)
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Rendemen (%)
Kemurnian (kali)
Enzim Kasar1 1812,057 538,645 3,364 100,00 1,00 Pengendapan amonium sulfat 30-40%
148,781 6,524 22,804 8,21 6,78
Dialisis 126,868 2,026 62,609 7,00 18,61 Superdex 200 111,939 1,100 101,781 6,18 30,26 1 Berasal dari 8 gram bobot basah pelet sel E.cloacae
Tahap purifikasi selanjutnya adalah dialisis. Dialisis merupakan proses
pemisahan molekul pada larutan berdasarkan perbedaan ukuran molekul oleh
membran semipermeabel serta proses yang terjadi adalah difusi dan osmosis. Pada
proses ini, kantong dialisis selofan yang digunakan adalah membran selofan
dengan MWCO (molecular weight cut-off) 10 kD. Tujuannya agar molekul-
molekul kecil yang berukuran lebih kecil dari 10 kD seperti ion logam, inhibitor,
peptida kecil, dan lainnya akan keluar dari membran tersebut sedangkan molekul
besar dan mempunyai ukuran lebih besar dari 10 kD akan tertahan di dalam
membran seperti β-galaktosidase. Pada tahap dialisis ini total aktivitas yang
diperoleh adalah 126,868 U dan kadar protein 2,026 mg sehingga aktivitas
spesifiknya meningkat hingga 62,609 U/mg. Rendemen yang dihasilkan sekitar
7,00% dan kemurniannya meningkat hingga 18,61 kali (Tabel 3).
Kromatografi filtrasi gel merupakan pemisahan molekul menurut ukuran
molekulnya. Saat sampel diaplikasikan ke dalam kolom maka partikel dengan
ukuran besar akan bergerak turun lebih cepat dari partikel yang berukuran kecil
karena partikel besar dapat bergerak turun tanpa melalui pori-pori gel. Sementara
itu, partikel yang lebih kecil akan masuk ke dalam pori-pori gel sehingga
mengalami hambatan untuk sampai ke ujung kolom bagian bawah. Profil elusi
filtrasi gel menggunakan Superdex 200 (Gambar 8) memperlihatkan adanya satu
puncak protein utama yang terelusi pada fraksi 7 hingga fraksi 20. Rendahnya
aktivitas β-galaktosidase pada puncak protein menunjukkan bahwa pada fraksi
tersebut masih terdapat protein-protein lain yang memiliki bobot molekul yang
besarnya relatif lebih kecil dibandingkan bobot molekul β-galaktosidase. Hasil
31
pengujian aktivitas β-galaktosidase menunjukkan adanya satu puncak aktivitas
enzim dimana aktivitas yang tertinggi pada fraksi 12. Pada fraksi nomor 12
memiliki total aktivitas sebesar 111,939 U dan kadar protein 1,100 mg sehingga
aktivitas spesifiknya sebesar 101,781 U/mg (Data pada Lampiran 8). Rendemen
yang dihasilkan adalah 6,18% dan kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali.
Aktivitas spesifik β-galaktosidase E. cloacae hasil purifikasi ini lebih besar
jika dibandingkan dengan aktivitas spesifik dari Arthrobacter psychrolactophilus
F2 yaitu 20,4 U/mg (Nakagawa et al. 2006). Tetapi hasil aktivitas spesifik β-
galaktosidase dari penelitian ini lebih rendah jika dibandingkan Arthrobacter
acidocaldarius sebesar 112,7 U/mg (Gul-Guven et al. 2007), Bacillus
stearothermophilus sebesar 125 U/mg (Chen et al. 2008), dan Arthrobacter sp.
HB7 sebesar 108,7 U/mg (Trimbur et al. 1994). Perbedaan aktivitas ini
disebabkan perbedaan jumlah induser (laktosa) yang diberikan pada saat produksi
enzim dan perbedaan perlakuan pada saat purifikasi enzim. Selain itu, ekspresi
genetik β-galaktosidase yang berbeda dari berbagai mikroorganisme juga
mempengaruhi perbedaan aktivitas spesifik enzim yang dihasilkan seperti pada
Streptococcus themophilus LMD9 sebesar 464 U/mg (Rhimi et al. 2010) dan
Lactobacillus acidophilus R22 sebesar 230 U/mg (Nguyen et al. 2002).
Peningkatan aktivitas enzim β-galaktosidase dapat disebabkan akibat rekombinasi
genetik seperti pada S. themophilus LMD9 dan L. acidophilus R22.
Gambar 8 Aktivitas total (■) dan protein total (♦) hasil purifikasi dengan
kromatografi filtrasi gel menggunakan matriks Superdex 200.
32
Karakterisasi β-Galaktosidase
Suhu
Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim.
Penentuan suhu optimum dan stabilitas suhu dilakukan pada rentang suhu 25-
50°C. Gambar 9 menunjukan aktivitas β-galaktosidase E. cloacae bebas dan
teramobil meningkat hingga suhu 40°C. Sebelum suhu optimum, aktivitas enzim
meningkat karena terjadi peningkatan energi kinetik yang mempercepat gerak
vibrasi, translasi, serta rotasi enzim dan substrat sehingga memperbesar peluang
keduanya untuk saling bertumbukan. Suhu yang lebih besar dari suhu optimum
menyebabkan protein enzim mengalami perubahan konformasi yang
menyebabkan aktivitasnya berkurang. Selain itu, penurunan aktivitas enzim
dikarenakan terputusnya ikatan sekunder enzim karena besarnya energi kinetik
dari molekul enzim melebihi untuk mempertahankan ikatan sekunder. Ikatan
sekunder yang terputus menyebabkan hilangnya struktur sekunder dan tersier
enzim disertai berkurangnya atau hilangnya aktivitas enzim. Substrat juga dapat
mengalami perubahan konformasi sehingga sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau
mengalami hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim pada suhu tinggi.
Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase diperlihatkan pada
Gambar 9. Aktivitas β-galaktosidase bebas maupun teramobil meningkat seiring
meningkatnya suhu hingga mencapai 40ºC. Enzim β-galaktosidase bebas dan
teramobil pada suhu 40ºC menunjukkan aktivitas tertinggi dengan nilai aktivitas
masing-masing sebesar 17,620 U/ml dan 0,026 U/ml (Data pada Lampiran 9).
Selanjutnya aktivitasnya akan menurun pada suhu 45ºC dan akan kehilangan
aktivitasnya pada suhu 50ºC. Teknik amobilisasi enzim dengan penjebakan enzim
menggunakan kasium alginat tidak mengubah suhu optimum dari enzim yang
bersangkutan. Pada suhu yang lebih tinggi dari suhu optimum, aktivitas relatif β-
galaktosidase teramobil lebih besar dibandingkan aktivitas relatif β-galaktosidase
bebas. Jika pada suhu 50°C, aktivitas relatif β-galaktosidase bebas hanya sebesar
0,95% tetapi aktivitas relatif β-galaktosidase teramobil masih bisa dipertahankan
hingga 21,39%.
33
Gambar 9 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase
bebas (♦) dan teramobil (■).
Kestabilan suatu enzim bergantung pada ikatan hidrogen, ikatan hidrofobik,
interaksi ion, dan jembatan disulfida. Kestabilan enzim terhadap panas dapat
terjadi karena pelipatan asam amino penyusun protein membentuk konformasi
tertentu yang tahan terhadap efek denaturasi akibat panas. Gambar 10a
menunjukan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas. Enzim β-
galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran
suhu 25-40°C karena masih menyisakan aktivitasnya diatas 50%. Selanjutnya
mengalami penurunan pada suhu 45°C dan 50°C dengan menyisakan masing-
masing 7,41% dan 2,42% dari aktivitasnya (Data pada Lampiran 9).
Gambar 10b menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-
galaktosidase teramobil. Enzim β-galaktosidase teramobil relatif stabil setelah
diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran suhu 25-40°C. Hal ini disebabkan pada
kisaran suhu tersebut aktivitas β-galaktosidase masih dapat menyisakan
aktivitasnya sekitar 60%. Selanjutnya mengalami penurunan pada suhu 45°C dan
50°C dengan menyisakan masing-masing 40,31% dan 14,86% dari aktivitasnya
(Data pada Lampiran 9). Penurunan aktivitas pada enzim teramobil pada suhu 45-
50°C tidak terlalu signifikan karena penjebakan enzim di dalam kalsium alginat
dapat meminimalkan protein enzim yang dapat terdenaturasi akibat peningkatan
suhu karena enzim terlingkupi dalam suatu gel.
Sebagai perbandingan, suhu optimum β-galaktosidase E. cloacae B5 sekitar
35°C dan enzim ini stabil pada suhu dibawah 30°C (Lu et al. 2009). Enzim β-
34
galaktosidase dari Streptococcus themophilus LMD9 mempunyai suhu optimum
berkisar 25-40°C (Rhimi et al. 2010), Lactobacillus bulgaricus berkisar 35-50°C
(Rhimi et al. 2009), dan Kluyveromyces lactis adalah 40°C (Kim et al. 2003).
(a)
(b)
Gambar 10 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b). Enzim β-galaktosidase diinkubasi pada berbagai suhu selama 1 jam, selanjutnya aktivitas β-galaktosidase diuji pada kondisi pH dan suhu optimum.
pH Pengaruh pH terhadap aktivitas dan stabilitas β-galaktosidase diuji dengan
menggunakan 2 jenis bufer yaitu bufer asetat (pH 5,5-6.0) dan bufer fosfat (pH
6,5-8,0). Gambar 11 menunjukkan β-galaktosidase bebas dan teramobil
mempunyai aktivitas tertinggi pada pH 7,0 dengan masing-masing aktivitasnya
18,181 U/ml dan 0,025 U/ml (Data pada Lampiran 10). Selanjutnya aktivitas β-
galaktosidase menurun seiring dengan penigkatan pH. Aktivitas relatif enzim β-
galaktosidase bebas pada kondisi mendekati pH 7,0 meningkat dari 26,87%
35
menjadi 100%. Selain itu, aktivitas relatif enzim β-galaktosidase teramobil
mendekati pH 7,0 pun meningkat dari 31,20% menjadi 100%. Berdasarkan
penelitian ini, pH optimum enzim bebas tidak berbeda dengan enzim teramobil
sehingga menunjukan penjerapan enzim di dalam kalsium alginat tidak akan
membuat perubahan pH yang dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-
asam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya
dengan molekul substrat.
Menurunnya aktivitas enzim karena perubahan pH larutan yang tidak terlalu
besar (sedikit dibawah atau diatas pH optimalnya) disebabkan oleh berubahnya
keadaan ion enzim dan seringkali juga keadaan ion substrat. Perubahan kondisi
ion enzim dapat terjadi pada residu asam amino yang berfungsi katalitik mengikat
substrat maupun pada residu asam amino yang berfungsi untuk mempertahankan
struktur tersier dan kuartener enzim yang aktif. Aktivitas enzim yang mengalami
penurunan tersebut dapat dipulihkan kembali dengan merubah kondisi reaksi
enzimatis pada pH optimalnya. Pada pH tertentu perubahan muatan ion pada
rantai samping yang dapat terionisasi dari residu asam amino enzim menjadi
terlalu besar sehingga mengakibatkan terjadinya denaturasi enzim yang disertai
dengan hilangnya aktivitas katalitik enzim. Disamping itu, perubahan struktur
tersier menyebabkan kelompok hidrofobik (yang pada mulanya tersembunyi
dibagian dalam molekul enzim) kontak dengan air sehingga solubilitas enzim
menjadi berkurang. Berkurangnya solubilitas enzim dapat mengakibatkan
turunnya aktivitas enzim secara bertahap (Palmer 1991).
Gambar 11 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase
bebas (♦) dan teramobil (■).
36
(a)
(b)
Gambar 12 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap stabilitas β-galaktosidase
bebas (a) dan teramobil (b). Enzim β-galaktosidase diinkubasi pada berbagai pH selama 1 jam, selanjutnya aktivitas β-galaktosidase diuji pada kondisi pH dan suhu optimum.
Kestabilan enzim berhubungan dengan ketahanan enzim dalam
mempertahankan konformasinya terhadap kondisi lingkungan sehingga tidak
mengubah kedudukan sisi aktif (Lehninger 2004). Pengaruh pH terhadap stabilitas
enzim dimodifikasi oleh jenis dan konsentrasi bufer, ketersediaan substrat,
kekuatan ion, dan konstanta dielektrik medium (dipengaruhi oleh penambahan
pelarut organik), efek kofaktor, dan aktivator. Gambar 12a menunjukan pengaruh
pH terhadap stabilitas β-galaktosidase bebas. Enzim β-galaktosidase bebas relatif
stabil setelah diinkubasikan selama 1 jam pada kisaran pH 5,5-8,0 karena masih
37
menyisakan aktivitasnya diatas 60% (Data pada Lampiran 10). Gambar 12b juga
memperlihatkan β-galaktosidase juga relatif stabil pada kisaran pH 5,5-8,0 (Data
Lampiran 10). Aktivitas β-galaktosidase relatif stabil pada kisaran pH tersebut
artinya ion-ion hidrogen tidak banyak mempengaruhi gugus-gugus fungsional
enzim pada kisaran pH 5,5-8,0 sehingga konformasi enzim tetap terjaga. Selain
itu, penjerapan dengan kalsium alginat tidak membuat perubahan terhadap
kestabilan enzim terhadap pH yang dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari
asam-asam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya
dengan molekul substrat.
Sebagai perbandingan, β-galaktosidase dari E. cloacae B5 aktif dan stabil
pada kisaran pH 6,5-10,5 (Lu et al. 2009). Enzim β-galaktosidase dari
Streptococcus themophilus LMD9 stabil pada kisaran pH 6,5-7,5 (Rhimi et al.
2010), dan Kluyveromyces lactis berkisar pada pH 7,0 (Kim et al. 2003).
Szczodiak (2000) menyatakan β-galaktosidase yang dapat digunakan untuk
biokonverter laktosa pada susu harus dapat aktif pada pH 6,7-6,8 dan biokonverter
pada whey dapat aktif pada pH 5,5-6,0. Berdasarkan penelitian ini, β-
galaktosidase dari E. cloacae mempunyai kisaran pH yang luas sehingga enzim
ini dapat digunakan untuk aplikasi biokonverter laktosa untuk produk susu.
Aktivator dan Inhibitor
Ikatan inhibitor atau aktivator dengan enzim dapat mengubah kemampuan
enzim dalam mengikat substrat sehingga dapat mengubah daya katalisisnya.
Interaksi ion dengan residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif dapat
mengakibatkan berubahnya afinitas enzim terhadap substrat yaitu dapat
meningkatkan atau menurunkan afinitas terhadap substrat. Interaksi ion dengan
residu asam amino yang mempertahankan konformasi aktif enzim mengakibatkan
berubahnya konformasi enzim menjadi lebih aktif atau nonaktif. Kation Hg2+ dan
Cu2+ merupakan inhibitor kuat β-galaktosidase dari E. cloacae karena dapat
menurunkan aktivitas sebesar 99,15% dan 89,09% dari kontrol enzim yang tidak
diberikan perlakuan penambahan kation (Gambar 13). Hal ini disebabkan Hg2+
dan Cu2+ merupakan logam berat yang dapat membentuk endapan logam proteinat
dengan ikatan yang terbentuk sangat kuat sehingga akan memutuskan jembatan
38
disulfida sehingga protein mengalami denaturasi. Kation Ca2+ dan Zn2+
menghambat aktivitas β-galaktosidase sebesar 5,45% dan 10,85% terhadap
kontrolnya. Berbeda dengan kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ yang merupakan
aktivator bagi β-galaktosidase dari E. cloacae karena aktivitasnya akan meningkat
5,01%, 32,24%, dan 20,99% dari aktivitas kontrolnya (Data pada Lampiran 11).
Logam Mg2+ berperan sebagai penstabil reaksi katalisis β-galaktosidase dan
substrat karena Mg2+ berikatan dengan nukleofili Glu 537 sehingga sisi aktif
terstabilkan dan lebih memudahkan reaksi antara enzim dan substrat (Matthews
2005).
Lu et al. (2010) menyatakan bahwa kation Hg2+, Cu2+, dan Ag2+ bersifat
sebagai inhibitor kuat terhadap β-galaktosidase yang berasal dari E.cloacae B5.
Kation Co2+, Mg2+, Mn2+, DTT, EDTA, dan imidazol tidak berefek terhadap
aktivitas β-galaktosidase dari E.cloacae B5. Selain itu, kation Zn2+ dan SDS
menghambat secara parsial terhadap aktivitas enzim dengan masing-masing nilai
penghambatannya 82% dan 51%.
Gambar 13 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari E. cloacae.
Parameter Kinetik
Konsentrasi substrat yang amat rendah menyebabkan kecepatan reaksi amat
rendah tetapi kecepatan akan meningkat dengan meningkatnya konsentrasi
substrat. Pada akhirnya, akan tercapai titik batas, dan setelah titik ini dilampaui,
kecepatan reaksi hanya akan meningkat sedemikian kecil dengan bertambahnya
konsentrasi substrat. Pada batas ini, enzim menjadi jenuh oleh substratnya dan
tidak dapat berfungsi lebih cepat (Lehninger 2004). Penentuan nilai KM dan vmaks
Kontrol Ca2+ Co2+ Zn2+ Cu2+ Mn2+ Hg2+ Mg2+ Kation
39
secara lebih tepat dan mudah dilakukan pemetaan data dengan memanfaatkan
transformasi aljabar persamaan Lineweaver Burk (Gambar 14). Persamaan
Lineweaver Burk untuk β-galaktosidase bebas dari E. cloacae adalah y = 0,663x +
1,526 dengan nilai r2 sebesar 0,986 sehingga kecepatan maksimum aktivitas β-
galaktosidase sebesar 0,655 µmol/menit dan nilai KM sebesar 0,434 mM. Pada β-
galaktosidase teramobil, peningkatan konsentrasi substrat juga meningkatkan
kecepatan reaksi. Persamaan Lineweaver Burk untuk β-galaktosidase teramobil
adalah y = 176,465x + 86,787 dengan nilai r2 sebesar 0,943 sehingga kecepatan
maksimumnya sebesar 0,012 µmol/menit dengan nilai KM sebesar 2,068 mM
(Data pada Lampiran 12).
(a)
(b)
Gambar 14 Kurva Lineweaver Burk dari β-galaktosidase bebas (a) dan β-galaktosidase teramobil (b).
40
Semakin rendah nilai KM maka semakin kuat ikatan antara enzim dan
substrat. Dengan mengetahui nilai KM dan vmaks maka kecepatan reaksi suatu
enzim pada setiap konsentrasi substrat dapat dihitung. Selain itu, dengan
mengetahui nilai KM dapat mengetahui enzim tersebut berikatan kuat dengan
substrat atau ikatannya lemah, yang berarti dapat diketahui kesesuaian enzim
dengan substrat yang diberikan (Winarno 1999). Berdasarkan nilai diatas, nilai
KM enzim β-galaktosidase bebas dari E. cloacae lebih kecil dibandingkan nilai KM
dari β-galaktosidase teramobil sehingga β-galaktosidase bebas lebih kuat
mengikat substrat daripada β-galaktosidase yang teramobil. Nilai KM yang rendah
ini, menyebabkan energi yang diperlukan untuk memulai terjadinya reaksi
enzimatik lebih sedikit sehingga reaksi lebih mudah terjadi.
Nilai KM dari β-galaktosidase teramobil lebih tinggi dibandingkan KM dari
β-galaktosidase bebas tetapi vmaks β-galaktosidase teramobil lebih rendah
dibandingkan vmaks dari β-galaktosidase bebas. Keadaan ini disebabkan
perubahan konformasi pada molekul enzim yang terjerap di dalam butiran kalsium
alginat sehingga menurunkan daya gabung antara enzim dengan substrat.
Kecepatan reaksi enzim teramobil pun sangat rendah akibat adanya pengaruh
difusi substrat yang cukup lama agar dapat berinteraksi dengan enzim karena
harus melalui butiran kalsium alginat sebelum bereaksi dengan sisi aktif enzim.
Sebagai perbandingan, KM dan vmaks dari enzim β-galaktosidase dari E. cloacae
B5 adalah 0,01 mM dan 2 mM/menit (Lu et al. 2009). Nilai tersebut berimplikasi
bahwa enzim β-galaktosidase dari E. cloacae B5 lebih tinggi afinitasnya
dibandingkan β-galaktosidase dari E. cloacae yang dihasilkan dalam percobaan
ini. Hal ini disebabkan adanya perbedaan tahapan pada proses purifikasi enzim.
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi Sel Enterobacter cloacae
Campuran sel atau enzim dengan natrium alginat diteteskan ke dalam
larutan yang mengandung kation multivalen yaitu kalsium klorida akan
membentuk reaksi antara alginat dan kation multivalen menjadi kalsium alginat.
Alginat akan mengalami pemadatan oleh adanya ion kalsium tetapi tidak
menyebabkan perubahan temperatur, pH, dan tekanan osmotik yang drastis. Sel
atau enzim teramobilisasi di dalam presipitasi kalsium alginat dalam bentuk
41
butiran gel. Reaksi tersebut akan menjebak sel dengan bentuk butiran gel
berukuran pori antara 5-200 nm (Najafpour et al. 2004). Namun, kalsium alginat
secara kimia tidak stabil sehingga perlu ditentukan kondisi amobilisasi yang dapat
meningkatkan kestabilan kimia butiran tanpa membatasi transfer masa Pada
penelitian ini variasi alginat yang digunakan adalah 4, 5, dan 6% (b/v). Pada
konsentrasi alginat dibawah 4%, butiran gel alginat agak rapuh sehingga dapat
menyebabkan kebocoran pada saat proses pemakaian Pada konsentrasi alginat
diatas 6%, butiran gel yang terbentuk terlalu padat sehingga menyulitkan difusi
substrat.
Variasi konsentrasi alginat dan bobot sel yang digunakan untuk amobilisasi
merupakan hal yang peting untuk memperoleh aktivitas optimum. Pemilihan
konsentrasi alginat dan bobot sel dilakukan untuk mendapatkan variasi formula
yang dapat menjerap sel bakteri dengan baik tanpa mengurangi kemampuan sel
dalam menghasilkan β-galaktosidase. Interaksi antara berbagai variasi bobot sel
dan konsentrasi alginat menghasilkan produk oNP yang signifikan berbeda
(α=0,05) antar berbagai variasi yang digunakan (Data pada Lampiran 13).
Berdasarkan berbagai variasi yang dilakukan, terdapat 3 variasi yang
menghasilkan produk oNP yang tertinggi adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat
5%; bobot sel 20% (b/v) dan alginat 6%; serta bobot sel 40% (b/v) dan alginat 6%
(Gambar 15). Dari ketiga variasi tersebut, aktivitas β-galaktosidase sel E. cloacae
teramobil yang mempunyai aktivitas terbesar dengan variasi bobot sel 40% (b/v)
dan alginat 6% dengan produk yang dihasilkan sebesar 0,946 µmol. Setelah
dilakukan dengan uji lanjut Duncan (α=0,05), variasi tersebut berbeda nyata
dengan variasi bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% dengan produk oNP sebesar
0,898 µmol setelah 1 jam inkubasi pada suhu 37°C.
Gambar 15 Variasi optimum penentuan sel amobil. Angka yang diikuti oleh
huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
0,946 f 0,898 e 0,893 e
Sel 40%, alginat 6% Sel 10%, alginat 5% Sel 20%, alginat
Variasi Komposisi
42
Pada penelitian ini, variasi yang dipilih untuk amobilisasi sel adalah variasi
bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5%. Hal ini disebabkan sel yang dipakai lebih
sedikit sehingga lebih efisien. Selain itu, konsentrasi alginat yang dipakai tidak
terlalu tinggi menyebabkan pori-pori yang terbentuk tidak terlalu kecil sehingga
substrat dan nutrien tidak sulit masuk ke dalam gel.
Pada variasi alginat 5% (b/v), penggunaan bobot sel 20% dan 40% (b/v)
menghasilkan aktivitas pembentukan produk oNP yang rendah. Hal ini terjadi
karena pada waktu butiran gel dicuci dengan akuades steril, banyak sel bakteri
yang tidak terjerap akan ikut terbilas. Pencucian ini akan membuat sel yang
teramobilisasi hanya sebagian. Penggunaan konsentrasi alginat yang semakin
tinggi (alginat 6% (b/v)) maka dapat menjerap sel yang lebih banyak. Penjerapan
tersebut akan menurunkan viskositas alginat dan dapat meningkatkan porositas
dari gel tersebut. Proses tersebut akan menyebabkan tingginya produk yang
dihasilkan tetapi hal ini tidak efisien karena membutuhkan sel yang terlalu
banyak.
Optimasi Konsentrasi Alginat untuk Amobilisasi β-Galaktosidase
Variasi alginat yang digunakan untuk optimasi amobilisasi enzim β-
galaktosidase dari E. cloacae adalah enzim terpurifikasi 10% (v/v) yang
diamobilisasi dengan variasi konsentrasi alginat 4, 5, dan 6% (b/v) (Data pada
Lampiran 14). Gambar 16 menunjukan produk yang dihasilkan dari berbagai
konsentrasi alginat dengan konsentrasi produk dari enzim bebas sekitar 1,548
µmol setelah 24 jam inkubasi. Dari berbagai variasi tersebut, konsentrasi alginat
5% menghasilkan produk yang paling tinggi yaitu 1,009 µmol. Produk yang
dihasilkan tersebut lebih tinggi dan berbeda nyata (α=0,05) dibandingkan produk
yang dihasilkan dari variasi alginat 4% dan 6%. Konsentrasi alginat 6% hanya
menghasilkan produk sebesar 0,760 µmol karena butiran gel yang terbentuk
terlalu padat sehingga menyulitkan difusi substrat. Penggunaan konsentrasi
alginat 4% menghasilkan produk yang rendah yaitu 0,560 µmol. Hal ini terjadi
karena pada waktu butiran gel dicuci dengan akuades steril, banyak enzim yang
tidak terjerat akan ikut terbilas, sehingga hanya sebagian enzim yang
43
teramobilisasi. Hasil penelitian ini sesuai dengan Haider dan Husain (2007) yang
menyatakan bahwa konsentrasi alginat 5% merupakan konsentrasi alginat yang
optimum untuk mengamobilisasi β-galaktosidase dari Aspergillus oryzae karena
dapat meminimalkan kebocoran pada saat pemakain berulang dan pori-pori
butiran gel yang terbentuk tidak terlalu kecil.
Gambar 16 Produk yang dihasilkan pada penentuan optimasi amobilisasi enzim.
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%.
Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT
Laktosa merupakan kompenen utama karbohidrat yang berada pada susu
sekitar 4,8% (b/v). Jika laktosa pada susu dihidrolisis oleh β-galaktosidase maka
akan menghasilkan glukosa dan galaktosa karena enzim tersebut menghidrolisis
ikatan β-(1,4)-glikosidik dari laktosa sehingga akan meningkatkan kemanisan,
kelarutan, serta mudah dicerna oleh penderita laktosa intoleran. Pada penelitian ini
pengukuran hasil hidrolisis laktosa dengan menggunakan kit reagen glukosa
GOD-POD. Glukosa yang terbentuk sebanding dengan laktosa yang dihidrolisis
oleh β-galaktosidase. Glukosa yang terbentuk akan bereaksi dengan glukosa
oksidase dengan bantuan air sehingga menghasilkan asam glukonat dan hidrogen
peroksida. Peroksidase akan mengoksidasi hidrogen peroksidase, 4-
aminofenazon, dan fenol sehingga akan menghasilkan 4-(p-benzokuinon
monoimino)-fenazon yang berwarna merah muda dan air. Jumlah 4-(p-
benzokuinon monoimino)-fenazon yang terbentuk dapat dideteksi dengan
spektrofotometer pada λ = 505 nm (Sachnez-Manzanares et al. 1993). Kadar
laktosa total pada susu UHT yang digunakan pada penelitian ini adalah 4,77%
(b/v)
Perlakuan hidrolisis laktosa pada susu UHT dengan sel bebas dan sel amobil
dilakukan secara sistem batch selama 24 jam pada suhu 37°C. Selama 24 jam
0,560 a 1,009 b 0,760 c
1,548 d
Variasi Alginat
Alginat 4% Alginat 5% Alginat 6% Enzim bebas
44
dilakukan sampling setiap interval 3 jam dan dianalisis laktosa yang terhidrolisis
(Data pada Lampiran 15). Hasil penelitian menunjukan aktivitas hidrolisis laktosa
oleh sel E. cloacae bebas dan sel E. cloacae teramobil meningkat dari jam ke-0
hingga jam ke-18. Setelah jam ke-18, peningkatan hidrolisis laktosa tidak terlalu
signifikan tetapi cenderung stasioner karena produk hasil hidrolisis laktosa yaitu
glukosa dan galaktosa menghambat aktivitas β-galaktosidase atau bersifat feed
back inhibition. Aktivitas hidrolisis laktosa relatif pada jam ke-18 oleh E. cloacae
bebas sebesar 55,14% dari total laktosa yang berada di dalam susu UHT
sedangkan aktivitas hidrolisis laktosa relatif oleh E. cloacae teramobil sebesar
22,01% (Gambar 17).
Hidrolisis laktosa oleh sel amobil menghasilkan nilai optimum pada jam ke-
18 karena substrat berupa laktosa harus masuk ke dalam dinding sel bakteri.
Proses tersebut terjadi karena β-galaktosidase dari E. cloacae bersifat intraseluler.
Selain itu, sel bakteri yang teramobil menyebabkan lambatnya difusi substrat ke
dalam butiran gel, sehingga kontak antara substrat dan sel bakteri menjadi lambat.
Rendahnya nilai hidrolisis laktosa oleh sel teramobil juga dapat disebabkan
diameter butiran gel yang terlalu besar yaitu 5 mm. Idris dan Suzana (2006)
menyatakan diameter butiran gel optimum sebesar 2 mm karena semakin kecil
diameter butiran gel menyebabkan semakin besarnya luas permukaan kontak,
sehingga produk yang terbentuk pun semakin besar. Sel E. cloacae bebas yang
diaplikasikan ke dalam susu UHT setelah 24 jam akan menyebabkan pecahnya
emulsi susu. Bakteri ini merusak protein pada susu sehingga tidak bagus untuk
diaplikasikan pada susu dalam keadaan bebas. Sel teramobil tidak membuat
emulsi susu pecah karena sel E. cloacae terbatasi dengan butiran gel alginat
sehingga tidak terjadi kebocoran sel.
Perlakuan hidrolisis laktosa pada susu UHT dengan enzim bebas dan enzim
amobil dilakukan secara sistem batch selama 24 jam pada suhu 40°C. Selama 24
jam dilakukan sampling setiap interval 3 jam dan dianalisis laktosa yang
terhidrolisis (Data pada Lampiran 15). Hasil penelitian menunjukan aktivitas
hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil
meningkat dari jam ke-0 hingga jam ke-6. Aktivitas hidrolisis laktosa relatif pada
jam ke-6 oleh β-galaktosidase bebas sebesar 77,99% dari total laktosa yang berada
45
di dalam susu UHT sedangkan aktivitas hidrolisis laktosa relatif oleh β-
galaktosidase teramobil sebesar 28,09% (Gambar 17). Setelah jam ke-6, laju
reaksi enzimatis tidak terlalu terjadi peningkatan laju reaksi enzimatis secara
signifikan tetapi cenderung stasioner karena meningkatnya galaktosa yang bersifat
inhibitor kompetitif dan glukosa yang bersifat inhibitor nonkompetitif untuk β-
galaktosidase (Mahoney 2004).
Haider dan Husein (2009) menyatakan 54% laktosa pada susu dapat
dihidrolisis dengan 1000 U enzim β-galaktosidase Aspergillus oryzae teramobil
setelah 3 jam pada suhu 32°C. Rhimi et al. (2010) menyatakan 1000 U β-
galaktosidase teramobil Streptococcus thermophillus LMD9 menghidrolisis
laktosa pada susu sebanyak 77% setelah 6 jam pada suhu 45°C. Pada penelitian
ini, walaupun konsentrasi enzim yang digunakan hanya 37 U tetapi laktosa yang
dapat dihidrolisis oleh enzim teramobil sebesar 28,09%. Peningkatan konsentrasi
enzim perlu dilakukan untuk meningkatkan kelajuan hidrolisis laktosa pada susu.
Aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT yang rendah juga dapat
disebabkan efek ion-ion divalen yang berada pada susu yaitu Ca2+, Mg2+, dan
Zn2+. Enzim β-galaktosidase dari E. cloacae dapat dihambat oleh Ca2+ dan Zn2+
tetapi Mg2+ bersifat sebagai aktivator. Guy dan Bingham (1978) menyatakan
aktivitas β-galaktosidase dalam menghidrolisis laktosa pada susu dapat
mengalami penurunan karena pengaruh logam yang berada pada susu, jumlah
logam yang terdapat pada susu, dan kelarutan logam tersebut pada susu. Pada
penelitian ini, kalsium yang terdapat pada susu UHT sebesar 265 mg, seng sebesar
1 mg, dan magnesium sebesar 31 mg. Meskipun dalam susu UHT terdapat
magnesium, tetapi kuantitasnya lebih rendah dibandingkan kuantitas kalsium
sehingga β-galaktosidase E. cloacae dapat dihambat aktivitasnya dalam
mengidrolisis laktosa pada susu.
Gambar 17 menunjukan perbandingan aktivitas hidrolisis laktosa oleh
enzim teramobil dan sel teramobil. Aktivitas hidrolisis laktosa pada sel teramobil
lebih lambat dibandingkan enzim teramobil karena membutuhkan waktu sekitar
18 jam. Substrat berupa laktosa tidak hanya harus melintasi butiran gel alginat
tetapi harus masuk ke dalam dinding sel bakteri karena β-galaktosidase dari E.
cloacae bersifat intraseluler. Hal ini berbeda dengan aktivitas hidrolisis dengan
46
enzim teramobil yang lebih cepat menghidrolisis yaitu 6 jam. Pada enzim
teramobil, substrat hanya melintasi butiran gel lalu langsung berinteraksi dengan
sisi aktif enzim. Dari kedua variasi tersebut, penggunaan enzim teramobil lebih
efisien karena aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT lebih cepat dan tinggi
dibandingkan dengan sel teramobil.
Gambar 17 Aktivitas hidrolisis laktosa oleh enzim teramobil (■) dan
sel teramobil (♦).
Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil
Salah satu kelebihan penggunaan sel dan enzim teramobil adalah lebih
mudah memisahkan produk yang dihasilkan, sistem yang lebih stabil, dan
penggunaan kembali biokatalis. Setelah inkubasi pertama, sel teramobil dan
enzim teramobil disaring dan dicuci dengan akuades steril untuk menghilangkan
substrat dan produk yang mungkin terbawa. Selanjutnya butiran gel yang sudah
bersih dimasukan ke dalam susu UHT baru dan diinkubasi kembali sesuai kondisi
optimumnya. Pengulangan penggunaan butiran gel yang teramobilisasi dilakukan
sebanyak 6 kali.
Gambar 18a menunjukan aktivitas hidrolisis mengalami penurunan pada
penggunaan enzim amobil berulang. Penggunaan enzim teramobil secara berulang
mempunyai perbedaan aktivitas hidrolisis laktosa yang nyata dari pemakaian
berulang pertama hingga kelima (α=0,05) (Data Lampiran 16). Penurunan
aktivitas hidrolisis ulangan kelima terjadi hingga 78,89% dari aktivitas awalnya.
Penggunaan butiran gel enzim teramobil pada ulangan kelima dan keenam tidak
47
berbeda nyata (α=0,05). Gambar 18b menunjukan aktivitas hidrolisis mengalami
penurunan pada penggunaan sel teramobil berulang (Data Lampiran 16).
Penggunaan sel teramobil secara berulang mempunyai perbedaan aktivitas
hidrolisis laktosa nyata dari pemakaian berulang pertama hingga keempat
(α=0,05). Penurunan aktivitas hidrolisis ulangan keempat terjadi hingga 75,49%
dari aktivitas awalnya. Penurunan aktivitas hidrolisis ini disebabkan adanya lemak
susu yang menempel pada butiran gel pada saat penggunaan berulang. Hal ini
menyebabkan terhambatnya difusi substrat ke dalam butiran gel.
(a)
(b)
Gambar 17 Penggunaan berulang enzim teramobil (a) dan sel teramobil (b).
84,26 b
42,42 c
23,61 d 21,11 e 20,54 e
100,00 a
61,52 b 44,85 c
24,51 d 24,02 d 17,65 e
100,00 a
SIMPULAN Enterobacter cloacae menghasilkan β-galaktosidase optimum pada waktu
inkubasi jam ke-24 dengan suhu 37°C. β-galaktosidase terpurifikasi dari E.
cloacae menghasilkan aktivitas spesifik sebesar 101,781 U/mg dengan rendemen
6,18% dan tingkat kemurnian meningkat sebesar 30,26 kali dari enzim kasar yang
diperoleh. Enzim β-galaktosidase bebas dan teramobil mempunyai aktivitas
optimum pada suhu 40°C dan pH 7,0. Kation Co2+, Mn2+, dan Mg2+ merupakan
aktivator bagi enzim tersebut sedangkan Ca2+, Zn2+, Cu2+, and Hg2+ bersifat
sebagai inhibitor. Enzim β-galaktosidase bebas dan β-galaktosidase teramobil
secara berturut-turut mempunyai KM sebesar 0,434 mM dan 2,068 mM. Variasi
optimum untuk amobilisasi sel adalah bobot sel 10% (b/v) dan alginat 5% (b/v).
Variasi optimum untuk amobilisasi enzim adalah larutan enzim terpurifikasi 10%
(v/v) dan alginat 5% (b/v). Aktivitas hidrolisis laktosa pada susu UHT oleh β-
galaktosidase teramobil lebih tinggi yaitu sebesar 28,09% setelah 6 jam
dibandingkan dengan sel E. cloacae teramobil sebesar 22,01% setelah 18 jam.
Enzim β-galaktosidase bebas mempunyai aktivitas hidrolisis laktosa pada susu
UHT lebih tinggi sebesar 78,20% setelah 6 jam dibandingkan sel E. cloacae bebas
sebesar 55,14% setelah 18 jam.
SARAN Purifikasi untuk memperoleh β-galaktosidase murni dapat digunakan
kromatografi afinitas. Formulasi variasi teknik amobilisasi enzim atau sel perlu
dilakukan agar enzim amobil atau sel amobil dapat menghasilkan produk yang
tinggi dan butiran gel yang lebih stabil.
DAFTAR PUSTAKA
Beccera M, Baroli B, Fadda AM, Mendez JB, Siso MIG. 2001. Lactose bioconversion by calcium-alginate immobilization of Kluyveromyces lactis cells. Enzyme Microb Technol 29: 506-512.
Bollag DM, Edelstein SJ. 1991. Protein Methods. New York: Wiley-Liss.
Boyer R. 2000. Modern Experimental Biochemistry. San Fransisco: Adison Wesley Longman Inc.
Boyer R. 2002. Concepts in Biochemistry. United States: Brook Cole. Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254.
Burvall A, Dahlqvist A. 1979. Oligosaccharides formation during hydrolysis of lactose with S. lactis lactase. Food Chem 4: 243-250.
Campbell et al. 2005. The molecular basis of lactose intolerance. Sci Progress 88:157-202.
Cao L. 2005. Carrier-bound Immobilized Enzymes. Weinheim: Wiley-VCH Verlag.
Cesca et al. 1984. β-D-Galactosidase of Lactobacillus sp. J Microbiol 29: 288-294.
Chaplin M. 2004. The use of lactases in dairy industry. [terhubung berkala]. http://www. lsbu.ac.uk/biology/enztech/lactase.html. [10 Januari 2010].
Chen W, Chen H, Xia Y, Zhao J, Tian F, Zhang H. 2008. Production, purification, and characterization of a potential thermostable galactosidase for milk lactose hydrolysis from Bacillus stearothermophilus. J. Dairy Sci 91: 1751-1758.
Dixon M, Webb EC. 1978. Enzymes. New Yok: Academica Pr.
Early R. 1998. Liquid milk and cream. Dalam: The Tecnology of Dairy Products. London: Blackie Academic & Professional.
Euber JR, Brunner JR. 1979. Determination of lactose in milk products by high performance liquid chromatography. J Dairy Sci 62: 685-690.
Fennema OR.1996. Food chemistry. Ed 3th. New York: Maicel Dekker.
Fox PF, McSweeney PLH. 1981. Dairy Chemistry and Biochemistry. London: Blackie Academic and Professional.
50
Greenberg NA, Mahoney RR. 1983. Formation of oligosaccharides by β-galactosidase from Streptococcus thermophilus. Food Chem 10: 195-204.
Gul-Guven R, Guven K, Poli A, Nicolaus B. 2007. Purification and some properties of a β-galactosidase from the thermoacidophilic Alicyclobacillus acidocaldarius subsp. rittmannii isolated from Antarctica. Enzyme Microb Technol 40: 1570-1577.
Haider T, Husain Q. 2007. Calcium alginate entrapped preparations of Aspergillus oryzae β-galactosidase: Its stability and applications in the hydrolysis of lactose. Int J Biol Macromol 41: 72-80.
Hellberg U, Ivarsson JP, Johansson BL. 1996. Characteristics of Superdex ® Prep Grade Media for Gel Filtration Chromatography of Proteins and Peptides. Process Biochem 31 (2): 163-172.
Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Stalely JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th edition. Baltimore: Williams &Wilkins
Huber RE, Gupta MN, Khare SK. 1994. The active site and mechanism of the β-galactosidase from Escherichia coli. Int J Biochem 26 (3): 309-318.
Idris A, Suzana W. 2006. Effect of sodium alginat concentration, bead diameter, initial pH and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized Lactobacillus delbrueckii. Process Biochem 41: 1117-1123.
Illanes A, Fernandez-Lafuente R, Guisan JM, Wilson L. 2008. Heterogeneous Enzyme Kinetics. Di dalam: Enzyme Biocatalysis Principle and Aplication. Valpraiso: Spinger Science.
Itoh T, Ohhashi M, Toba T, Adachi S. 1980. Purification and properties of β-galactosidase from Lactobacillus bulgaricus. Milchwissenschaft 35: 593-597.
IUBMB Enzyme Nomenclature. 1980. EC 3.2.1.23. [terhubung berkala]. http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/EC3/2/1/23.html.[6 Maret 2008].
Kim CS, Ji ES, Oh DK. 2003. Expression and characterization of Kluyveromyces lactis β-galactosidase in Escherichia coli. Biotechnol Lett 25: 1769-1774.
Kusnawati Y. 2004. Aktivitas protease susu pasteurisasi yang ditambah Bifidobacterium bifidum pada berbagai waktu simpan. [Skripsi]. Bogor: IPB.
Lehninger AL. 2004. Principles of Biochemistry. Amhrest: Elsevier Science.
Lu LL, Xiao M, Li ZY, Li YM, Wang FS. 2009. A novel transglycosylating β-galactosidase from Enterobacter cloacae B5. Process Biochem 44: 232-236.
Mahoney RR. 1998. Galactosyl-oligosaccharide formation during lactose hydrolysis: a review. Food Chem 63:147–154.
51
Mahoney RR. 2004. Enzymes exogenous to milk in dairy technology. Di dalam: Encyclopedia of Dairy Science. Amhrest: Elsevier Science.
Marsh MN, Riley SA. 1998. Digestion and absorption of nutrients and vitamins. Sleisenger and Fordtran’s Gastrointestinaland Liver Disease 26:1495-1496.
Marshall VME, Tamime AY. 1997. Physiology and Biochemistry of Fermented Milks. New York: Chapman & Hall.
Martin DW. 1981. Harper’s Review of Biochemistry. California: Medical.
Matthews BW. 2005. The structure of E. coli β-galactosidase. CR Biologies 328: 529-556.
Mattjik AA, Sumertajaya M. 2002. Perancangan Percobaan dengan Aplikasi SAS dan Minitab. Bogor: IPB Pr.
Miller J. 1972. Experiments in Molecular Genetics. New York: Cold Spring Harbor Laboratory.
Najafpour G. Younesi H, Ismail KSK. 2004. Ethanol fermentation in an immobilized cell reactor using Sacharomyces cerevisiae. Bioresource Tech 92: 251-260.
Nakagawa T, Fujimoto Y, Ikehata R, Miyaji T, Tomizuka N. 2006. Purification and molecular characterization of cold-active β-galactosidase from Arthrobacter psychrolactophilus strain F2. Appl Microbiol Biotechnol 72: 720-725.
Nguyen TH, Splechtna B, Krasteva S, Kneifel W, Kulbe KD, Divne C, Haltrich D. 2007. Characterization and molecular cloning of a heterodimeric β-galactosidase from the probiotic strain Lactobacillus acidophilus R22. FEMS Microbiol Lett 269: 136-144.
Nur MA. Adijuana H, Kosasih. 1992. Teknik Laboratorium. Bogor: Pusat Antar Universitas Ilmu Hayati Institut Pertanian Bogor.
Palmer T. 1991. Understanding Enzymes. Ed ke-3. New York: Ellis Horwood.
Pelczar MJ, Chan ECS. 1988. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Ramakrishna SV, Prakasham RS. 1999. Microbial fermentation with immobilized cells. Current Sci 77:87-100.
Rao MVR, Dutta SM. 1981. Purification and properties of beta-galactosidase from Streptococcus thermophillus. J Food Sci 46: 1419-1423.
Rahman A, Fardiaz S, Rahayu WP, Suliantri, Nurwitri CC. 1992. Teknologi Fermentasi. Bogor: IPB Pr.
52
Rhimi M et al. 2010. Efficient bioconversion of lactose in milk and whey: immobilization and biochemical characterization of a β-galactosidase from the dairy Streptococcus thermophilus LMD9 strain. Res in Microbiol 161: 515-525.
Rhimi M, Aghajari N, Jaouadi B, Juy M, Boudebbouze S, Maguin E, Haser R, Bejar S. 2009. Exploring the acidotolerance of β-galactosidase from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus: an attractive enzyme for lactose bioconversion. Res Microbiol 160: 775-784.
Rusynyk AR, Still CD. 2001. Lactose intolerance. JAOA 101 :10-12.
Sachnez-Manzanares JA, Fernandez-Villacafias MR, Marin-Iniesta F, Laencina J. 1993. Determination of lactose by an enzymatic method. Food Chem 46: 425-427.
Scopes RK. 1993. Protein Purification. New York: RR Doneley and Sons.
Szczodrak J. 2000. Hydrolysis of lactose in whey permeate by immobilized β-galactosidase from Kluyveromyces fragilis. J Mol Catal B Enzymatic 10: 631-637.
Trimbur DE, Gutshall KR, Prema P, Brenchley JE. 1994. Characterization of a psychrotrophic Arthrobacter gene and its cold-active β-galactosidase. Appl Environ Microbiol 60: 4544-4552.
Walstra P, Geurts TJ, Noomen A, Jellema A, Van Boekel MAJS. 1999. Dairy Technology : Principles of Milk Properties and Processes. New York: Marcell Dekker.
Wang D, Sakakibara M. 1997. Lactose hydrolysis and β-galactosidase activity in sonicated fermentation with Lactobacillus strain. Ultrasonics Sonochem 4: 255-261.
Winarno FG. 1999. Enzim Pangan. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama.
LAMPIRAN
54
Lampiran 1 Tahapan umum penelitian
Optimasi konsentrasi
alginat
Amobilisasi sel
Aplikasi
terhadap susu UHT dan
Penggunaan berulang
Analisis Statistik
Enterobacter cloacae
Penentuan waktu produksi β-galaktosidase optimum
Produksi β-galaktosidase
Purifikasi β-galaktosidase
Amobilisasi β-galaktosidase
Penentuan Karakterisasi
enzim
Optimasi konsentrasi
alginat
55
Lampiran 2 Perhitungan aktivitas β-galaktosidase
Aktivitas (U/ml) = tVNP mikromol
o
Aktivitas Total (U) = volume enzim (ml) × Aktivitas (U/ml)
Total Protein (mg) = volume enzim (ml) × Kadar Protein (mg/ml)
Aktivitas spesifik (U/mg) = Total Aktivitas (U) / Total Protein (mg)
Rendemen (%) = Total aktivitas purifikasi × 100%
Total aktivitas ekstrak kasar
Tingkat kemurnian = Aktivitas spesifik purifikasi
Aktivitas spesifik ekstrak kasar
Aktivitas Relatif (%) = Aktivitas X × 100% Aktivitas yang paling besar
Lampiran 3 Morfologi Enterobacter cloacae
Pertumbuhan E. cloacae setelah diinkubasi 24 jam pada media agar LPY.
56
Lampiran 4 Kurva standar oNP
[ONP] (µmol)
Absorbansi Arerata ± SD Ulangan 1 Ulangan 2
0,010 0,016 0,015 0,016 ± 0,0007 0,020 0,031 0,031 0,031 ± 0,0000 0,040 0,073 0,065 0,069 ± 0,0057 0,060 0,101 0,108 0,105 ± 0,0049 0,080 0,141 0,147 0,144 ± 0,0042 0,100 0,176 0,177 0,177 ± 0,0007 0,200 0,382 0,370 0,376 ± 0,0085 0,400 0,753 0,729 0,741 ± 0,0170 0,500 0,874 0,889 0,882 ± 0,0106
y = 1,805x – 0,0005 R2 = 0,9993
57
Lampiran 5 Kurva standar protein
[ONP] (µmol)
Absorbansi Arerata ± SD Ulangan 1 Ulangan 2
0,010 0,016 0,015 0,016 ± 0,0007 0,020 0,031 0,031 0,031 ± 0,0000 0,040 0,073 0,065 0,069 ± 0,0057 0,060 0,101 0,108 0,105 ± 0,0049 0,080 0,141 0,147 0,144 ± 0,0042 0,100 0,176 0,177 0,177 ± 0,0007 0,200 0,382 0,370 0,376 ± 0,0085 0,400 0,753 0,729 0,741 ± 0,0170 0,500 0,874 0,889 0,882 ± 0,0106
y = 0,797 x + 0,014 R2 = 0,993
58
Lampiran 6 Penentuan waktu produksi optimum
Optical density pada pertumbuhan E. cloacae
Jam ke- OD1 OD2 ODrerata ± SD Jumlah Selrerata (sel/ml)
0 0,085 0,089 0,087 ± 0,0028 1,74×109 6 0,592 0,592 0,592 ± 0,0000 1,18×1010
12 1,601 1,605 1,603 ± 0,0028 3,21×1010 18 1,768 1,768 1,768 ± 0,0000 3,54×1010 24 1,850 1,847 1,849 ±0,0021 3,70×1010 30 1,849 1,849 1,849 ± 0,0000 3,70×1010 36 1,849 1,849 1,849 ± 0,0000 3,70×1010 42 1,801 1,796 1,799 ± 0,0035 3,60×1010 48 1,722 1,724 1,723 ± 0,0014 3,45×1010
Produksi β-galaktosidase dari E. cloacae
Jam ke- [oNP]1 (µmol)
[oNP]2 (µmol)
Aktivitas (U) Aktivitasrerata ± SD Ulangan 1 Ulangan 2
0 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 ± 0,000 6 0,030 0,027 0,020 0,018 0,019 ± 0,0010
12 3,075 2,742 2,050 1,828 1,939 ± 0,1567 18 3,573 3,186 2,382 2,124 2,253 ± 0,1828 24 5,568 5,568 3,712 3,712 3,712 ± 0,000 30 3,740 3,906 2,493 2,604 2,548 ± 0,0783 36 3,019 3,130 2,013 2,087 2,050 ± 0,0522 42 2,299 2,355 1,533 1,570 1,551 ± 0,0261 48 1,801 2,244 1,200 1,496 1,348 ± 0,2089
Lampiran 7 Hasil purifikasi β-galaktosidase dengan pengendapan amonium sulfat
Fraksi Total
Proteinrerata (mg)
Aktivitasrerata (U)
Aktivitas Spesifik ± SD
Aktivitas Relatif
(U/mg) (%) 10% 15,000 9,668 0,645 ± 0,084 5,98 20% 8,550 13,214 1,545 ± 0,213 14,33 30% 8,550 85,790 10,034 ± 0,271 93,03 40% 15,300 165,014 10,785 ± 0,417 100,00 50% 31,050 92,936 2,993 ± 0,618 27,75 60% 28,500 1,690 0,059 ± 0,082 0,55 70% 2,886 0,006 0,002 ± 0,000 0,02
59
Lampiran 8 Hasil kromatografi filtrasi gel
Fraksi [Protein] (mg/ml)
Volume (ml)
Aktivitas (U/ml)
Aktivitas (U)
[Protein] (mg)
Aktivitas spesifik (U/mg)
1 0,028 3 0,000 0,001 0,085 0,010 2 0,008 3 0,000 0,001 0,023 0,037 3 0,003 3 0,001 0,002 0,008 0,304 4 0,007 3 0,001 0,002 0,020 0,127 5 0,013 3 0,001 0,002 0,040 0,062 6 0,018 3 0,001 0,004 0,054 0,076 7 0,045 3 0,001 0,004 0,134 0,031 8 0,224 3 0,006 0,017 0,673 0,026 9 1,199 3 0,061 0,184 3,597 0,051
10 1,199 3 0,390 1,171 3,597 0,326 11 0,703 3 9,557 28,670 2,108 13,599 12 0,367 3 37,313 111,939 1,100 101,781 13 0,247 3 8,227 24,681 0,742 33,277 14 0,203 3 5,402 16,205 0,610 26,556 15 0,179 3 0,840 2,520 0,538 4,686 16 0,145 3 0,506 1,517 0,435 3,490 17 0,112 3 0,303 0,908 0,336 2,706 18 0,071 3 0,243 0,729 0,212 3,432 19 0,055 3 0,157 0,471 0,165 2,852 20 0,040 3 0,133 0,398 0,119 3,339
Lampiran 9 Optimasi dan Stabilitas Suhu
Optimasi suhu enzim bebas
Suhu (°C)
Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas Relatif (%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3
25 8,648 8,803 8,493 8,648 ± 0,115 49,08 30 10,510 10,587 10,510 10,536 ± 0,045 59,79 35 15,474 15,551 15,474 15,500 ± 0,045 87,97 40 17,568 17,645 17,645 17,620 ± 0,045 100,00 45 4,382 4,382 4,305 4,356 ± 0,045 24,72 50 0,116 0,194 0,194 0,168 ±0,045 0,95
60
Lanjutan Lampiran 9
Optimasi suhu enzim teramobil
Suhu (°C)
Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas Relatif
(%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3
25 0,011 0,011 0,020 0,014 ± 0,005 54,27 30 0,014 0,014 0,014 0,014 ± 0,000 54,51 35 0,016 0,016 0,016 0,016 ± 0,000 61,46 40 0,026 0,026 0,026 0,026 ± 0,000 100,00 45 0,012 0,012 0,012 0,012 ± 0,000 45,20 50 0,005 0,006 0,006 0,006 ± 0,000 21,39
Stabilitas suhu enzim bebas
Suhu (°C)
Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas tersisa
(%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 25 12,759 12,837 12,837 12,811 ± 0,045 72,71 30 13,147 13,147 13,147 13,147 ± 0,000 74,61 35 13,380 13,457 13,380 13,405 ± 0,045 76,08 40 10,355 10,432 10,355 10,380 ± 0,045 58,91 45 1,357 1,202 1,357 1,306 ± 0,090 7,41 50 0,427 0,427 0,427 0,427 ± 0,000 2,42
Aktivitasrerata kontrol: 17,620 U/ml
Stabilitas suhu enzim teramobil
Suhu (°C)
Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ± SD (U/ml)
Aktivitas tersisa
(%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 25 0,016 0,016 0,016 0,016 ± 0,0001 61,02 30 0,016 0,016 0,016 0,016 ± 0,0001 61,38 35 0,016 0,016 0,016 0,016 ± 0,0001 61,50 40 0,016 0,016 0,016 0,016 ± 0,0001 63,16 45 0,010 0,010 0,011 0,010 ± 0,0001 40,31 50 0,004 0,004 0,004 0,004 ± 0,0001 14,86
Aktivitasrerata kontrol: 0,026 U/ml
61
Lampiran 10 Optimasi dan stabilitas pH
Optimasi pH enzim bebas
pH Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ±
SD (U/ml) Aktivitas
Relatif (%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 5,5 4,848 4,848 4,958 4,885 ± 0,064 26,87 6,0 10,720 10,499 10,499 10,572 ± 0,128 58,15 6,5 17,535 14,820 14,820 15,725 ± 1,567 86,49 7,0 18,089 18,144 18,310 18,181 ± 0,115 100,00 7,5 13,435 13,324 15,263 14,007 ± 1,089 77,04 8,0 9,889 9,834 9,889 9,871 ± 0,032 54,29
Optimasi pH enzim teramobil
pH Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ±
SD (U/ml) Aktivitas
Relatif (%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 5,5 0,008 0,008 0,008 0,008 ± 0,000 31,20 6,0 0,009 0,009 0,009 0,009 ± 0,000 34,65 6,5 0,012 0,012 0,012 0,012 ±0,000 47,20 7,0 0,025 0,025 0,025 0,025 ± 0,000 100,00 7,5 0,017 0,017 0,017 0,017 ± 0,000 68,49 8,0 0,011 0,011 0,011 0,011 ± 0,000 43,38
Stabilitas pH enzim bebas
pH Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ±
SD (U/ml)
Aktivitas tersisa
(%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 5,5 13,535 13,612 13,612 13,586 ± 0,045 74,73 6,0 14,000 13,922 14,000 13,974 ± 0,045 76,86 6,5 14,078 14,078 14,078 14,078 ± 0,000 77,43 7,0 14,155 14,155 14,233 14,181 ± 0,045 78,00 7,5 11,828 11,751 11,751 11,777 ± 0,045 64,77 8,0 11,285 11,440 11,285 11,337 ± 0,090 62,36
Aktivitasrerata kontrol: 18,181 U/ml
62
Lanjutan Lampiran 10
Stabilitas pH enzim teramobil
pH Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ±
SD (U/ml) Aktivitas
tersisa (%) Ulangan 1 Ulangan 2 Ulangan 3 5,5 0,019 0,019 0,019 0,019 ±0,0002 50,95 6,0 0,021 0,022 0,022 0,022 ± 0,0003 58,77 6,5 0,027 0,027 0,027 0,027 ± 0,0002 73,49 7,0 0,035 0,035 0,035 0,035 ± 0,0001 93,88 7,5 0,020 0,020 0,020 0,020 ± 0,0001 54,69 8,0 0,010 0,010 0,010 0,010 ± 0,0001 28,24
Aktivitasrerata kontrol: 0,037 U/ml
Lampiran 11 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase
Kation Aktivitas (U/ml) Aktivitasrerata ±
SD
Aktivitas Relatif
(%)
ulangan 1
ulangan 2
ulangan 3
Kontrol 69,432 69,765 69,848 69,681 ± 0,220 100,00 Ca2+ 66,440 66,357 64,861 65,886 ± 0,889 94,55 Co2+ 72,341 74,003 73,172 73,172 ± 0,831 105,01 Zn2+ 62,202 61,953 62,202 62,119 ± 0,144 89,15 Cu2+ 7,936 7,355 7,521 7,604 ± 0,300 10,91 Mn2+ 91,122 93,864 91,454 92,147 ± 1,497 132,24 Hg2+ 0,374 0,873 0,540 0,596 ± 0,254 0,85 Mg2+ 82,645 87,133 83,144 84,307 ± 2,460 120,99
Keterangan: Kontrol adalah aktivitas enzim tanpa penambahan kation.
63
Lampiran 12 Penentuan parameter kinetik enzim bebas dan enzim teramobil
Enzim bebas Dari persamaan y = 0,663x + 1,526 diperoleh nilai 1/Vmaks = 1,526 dan nilai Km / Vmaks = 0,663. Maka nilai Vmaks = 0,655 µmol/menit dan nilai Km sebesar 0,434 mM.
[S] (mg/ml)
[S] (mM) 1/S
V (µmol/menit) 1/V
0,010 0,033 30,136 0,047 21,277 0,050 0,166 6,027 0,143 6,993 0,100 0,332 3,014 0,298 3,356 0,500 1,659 0,603 1,126 0,888
Kurva linier konsentrasi oNP vs waktu
Kurva Michaelis-Menten
Kurva Lineweaver-burk
64
Lanjutan Lampiran 12
Enzim teramobil Dari persamaan y = 179,465x + 86,787 diperoleh nilai 1/Vmaks = 86,787 dan nilai Km / Vmaks = 179,465. Maka nilai Vmaks = 0,012 µmol/menit dan nilai Km sebesar 2,068 mM.
[S] (mg/ml)
[S] (mM) 1/S
V (µmol/menit) 1/V
0,100 0,332 3,014 0,00160 625,000 2,000 6,637 0,151 0,00489 204,499 4,000 13,273 0,075 0,01423 70,274 5,000 16,591 0,060 0,02526 39,588
Kurva linier konsentrasi oNP vs waktu
Kurva Michaelis-Menten Kurva Lineweaver-burk
65
Lampiran 13 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi variasi sel dan alginat untuk amobilisasi sel
Bobot Sel (%b/v) Na-Alginat (%b/v)
4 5 6 10 0,854 e 0,898 e 0,865 e 20 0,597 c 0,732 d 0,893 e 40 0,124 a 0,288 b 0,946 f
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada baris dan kolom menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5% Lampiran 14 Produk oNP (µmol) yang terbentuk saat optimasi konsentrasi
alginat untuk amobilisasi enzim
[Na-Alginat] (%) [Produk] (µmol) [Produk relatif] (%)
4 0,560 a 36,18 a 5 1,009 b 65,16 b 6 0,760 c 49,11 c
Enzim bebas 1,548 d 100,00 d Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
66
Lampiran 15 Potensi hidrolisis laktosa
Jam ke-
Sel amobil Sel bebas
[Laktosa] terhidrolisis (g)
Aktivitas Hidrolisis
Relatif (%)
[Laktosa] terhidrolisis (g)
Aktivitas Hidrolisis
Relatif (%) 0 0,000 a 0,00 a 0,000 a 0,00 a 3 0,025 b 5,24 b 0,032 b 6,71 b 6 0,039 c 8,18 c 0,094 c 19,71 c 9 0,058 d 12,16 d 0,179 d 37,53 d 12 0,088 e 18,45 e 0,192 e 40,25 e 15 0,094 f 19,71 f 0,211 f 44,23 f 18 0,105 g 22,01 g 0,263 g 55,14 g 21 0,105 g 22,01 g 0,265 g 55,56 g 24 0,106 g 22,22 g 0,263 g 55,14 g
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
Jam ke-
Enzim teramobil Enzim bebas
[Laktosa] terhidrolisis (g)
Aktivitas Hidrolisis
Relatif (%)
[Laktosa] terhidrolisis
(g)
Aktivitas Hidrolisis
Relatif (%) 0 0,000 a 0,00 a 0,003 a 0,63 a 3 0,032 b 6,71 b 0,304 b 63,73 b 6 0,134 c 28,09 c 0,372 c 77,99 c 9 0,136 c 28,51 c 0,373 c 78,20 c 12 0,137 c 28,72 c 0,373 c 78,20 c 15 0,136 c 28,51 c 0,373 c 78,20 c 18 0,136 c 28,51 c 0,373 c 78,20 c 21 0,137 c 28,72 c 0,373 c 78,20 c 24 0,137 c 28,72 c 0,373 c 78,20 c
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5% Konsentrasi laktosa pada susu = 0,477 gram/10 ml susu UHT ≈ 4,77%
67
Lampiran 16 Penggunaan berulang enzim amobil dan sel amobil
Sel amobil
Ulangan [Laktosa] terhidrolisis (g) Aktivitas Hidrolisis Relatif (%) 1 0,105 a 100,00 a 2 0,065 b 61,52 b 3 0,047 c 44,85 c 4 0,026 d 24,51 d 5 0,025 d 24,02 d 6 0,019 e 17,65 e
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
Enzim amobil
Ulangan [Laktosa] terhidrolisis Aktivitas Hidrolisis Relatif (%) 1 0,134 a 100,00 a 2 0,113 b 84,26 b 3 0,057 c 42,42 c 4 0,032 d 23,61 d 5 0,028 e 21,11 e 6 0,028 e 20,54 e
Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%