QIAGEN Bioinformatics - Filgen, Inc....Sample to Insight NGSデータ解析の3つの注意点 3 • 解析ツールの使い方が分からない、難しい。多くの学習時間を必要とする。•

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株式会社キアゲンアプライドアドバンストゲノミクス

宮本真理, PhD

[email protected]

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QIAGEN Bioinformatics

疾患ゲノム解析セミナー～変異検出から解釈まで～

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アジェンダ

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Biomedical Genomics Workbench

ケーススタディ

Ingenuity Variant Analysis


まとめ

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NGSデータ解析の3つの注意点

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• 解析ツールの使い方が分からない、難しい。多くの学習時間を必要とする。

• 解析ツールを正しく使っているか分からない。もっと検討しないといけないのでは？

• 解析結果を解釈できない。それらしいバリアントのリストは出来たけど・・・

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QIAGEN® Clinical Insight

Ingenuity Pathway Analysis

GenomeTrax™

HGMD®

PGMD™

Inova Genomes

Biomedical

Genomics

Workbench

&

Biomedical

Genomics Server

Solution

GeneRead Library

Prep Kits

GeneRead Size

Selection Kit

GeneRead

DNAseq Library

Quant Array

GeneRead

DNAseq PanelGeneRead DNA FFPE Kit

QIAamp Circulating NA Kit

exoRNeasy Kits

REPLI-g® Single Cell Kits

GeneRead DNA

QuantiMIZE Kit

RNeasy Kits

Any Sequencer

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CLC Genomics Workbench vs. Biomedical Genomics Workbench

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Biomedical Genomics Workbench は疾患解析専用

GWB BxWB

疾患専用解析パイプライン

Ingenuity Variant Analysisプラグイン

解析基本ツール（マッピングなど）

ヒト・マウス・ラットゲノムダウンロード

植物・バクテリアゲノムダウンロード

De novoアセンブリ

これからヒト疾患解析ソフトウェアを購入される場合は、Biomedical Genomics Workbench!

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Biomedical Genomics Workbench 2.5

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変異解析フロー

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全体の流れ

インポート

QC、トリミング

マッピング

マッピング補正

変異検出

アノテーション

フィルタリング

実はとても煩雑

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煩雑な解析をより簡単に実行できるように

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お客様からの要望の反映

バッチツールワークフローツール

• 各解析ツールをバッチで処理可能に• マッピングを一度に10検体などの処理が可能に

• フローチャート形式で解析ワークフローを作成できるツール搭載

ワークフロー組み込み型

• 疾患解析に特化した解析ワークフローを多数搭載• 雛形としても利用できるため、すぐに解析が始められる

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カバレッジが200以上の際の検出感度は98％以上。特異度は99.99%以上

詳細は

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体細胞癌解析ワークフロー

体細胞癌

https://www.qiagenbioinformatics.com

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体細胞癌

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Introduction- Rare & Hereditary Diseases

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希少疾患遺伝性疾患

de novo 変異や compound heterozygous

を検出遺伝性疾患の原因遺伝子の検出

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遺伝性疾患

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End-to-end workflows for hereditary diseases

検出感度は97.7％以上。特異度は99.99%以上

https://www.qiagenbioinformatics.com/

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遺伝性疾患

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BxWBワークフローの実施と結果の閲覧

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バリアント特定

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カスタマイズも容易に可能

ワークフロー

• ドラッグアンドドロップでツールを追加• 不要な解析は削除• アウトプットも選択可能

• デフォルトのパラメータを変更したり、実行時にはデフォルトでのみ実行できるようにロックする事も可能。

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ワークフロー以外のツール群

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バリアントへの情報付加

• エクソン番号の付加• アミノ酸置換の情報を付加• 様々なデータベースの変異情報を付加• 立体構造での変化を調べる

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ワークフロー以外のツール群

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立体構造で薬のターゲット領域など機能作用部位にバリアントが見つかったかどうかを調べる

Chr Region Type Ref. Allele

PROTEIN

change GENE IMPACT

Link to 3D protein

structure Effect on drug binding site

4 55594258 SNV T C p.V654A KIT missense KIT Val654Ala 242 drug hits (Val654Ala)

6 32632645..32632646 MNV GG CC p.T103R HLA-DQB1 in-frame HLA-DQB1 Thr103Arg 12 drug hits (Thr103Arg)

6 32632649..32632650 MNV CC TG p.G102Q HLA-DQB1 in-frame HLA-DQB1 Gly102Gln 9 drug hits (Gly102Gln)

KIT KIT(Val654Ala)

BxWBのみで、ここまで解析できます。

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急性骨髄性白血病解析

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• 高齢者（60歳～）で急性骨髄性白血病（AML）の治療に導入療法を用いる

と、癌の複雑さから症状の悪化や寛解率の低下が見られ慎重な対応が必要であった。

• 細胞診による染色体の核型を調べる方法が有効な方法であるが、数週間の時間を要する。AMLでは10％においてTP53の変異が細胞診の結果と

関連があり、細胞診の結果が悪い場合にTP53に変異が入っている場合がある。

• そこで60歳～のAML患者においてTP53のバリアントをNGSで解析し、変異の状況を調べている。

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急性骨髄性白血病解析

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結果

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Biomedical Genomics Workbench 2.5（BxWB 2.5）

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1. 参照配列管理がより容易に。hg38にも対応

Mouse and rat reference data can be used for transcriptomics analysis

Tutorial data is part of the supplied reference data

The concept “Reference Data Set” has been introduced (consisting of “Reference Data

Elements”)

Reference data soon to come: UCSC, RefSeq release 70, ensembl v81

2. 新しくhereditary disease (遺伝性疾患)ワークフローを搭載

3. Ingenuity Variant Analysis Plugin が機能拡張。BxWBとIngenuity Variant Analysisの連携もより強化。

4. エピゲノミクス分野も更にツールを強化:

Bisulfite Sequencing Plugin

Histone ChIP-Seq Plugin

新しい機能

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• インターフェース付きの解析ソフトに解析ワークフローがあらかじめ搭載されている事で、容易に解析を始める事ができる。

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Ingenuity Variant Analysis Knowledge Base Fact

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IVAを使って解析されたヒトサンプル数

エキスパートによりキュレーションされた表現型が関連付けられているFindings 数

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Comprehensive Curation of the Scientific Literature

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15年以上にわたりメンテナンスされているナレッジベース

ナレッジベースに登録されているもの

• 既知の biological processes/pathways

• 既知のバリアントと遺伝子

• 既知の表現型と遺伝子の関係

• 既知の薬物とターゲット、パスウェイの関係

THE QIAGEN KNOWLEDGE BASE

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コンテンツにコンテキスト（文脈=背景）を紐付け

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整理された情報を分かりやすく意味ある情報にして提供。

パスウェイやネットワークで視覚化されているため直感的に理解できる。

THE QIAGEN KNOWLEDGE BASE

CURATION

Unified Ontology

Disease models

Pathways

Biomarkers

Causal Networks

Regulatory

Hereditary

Experimental

Somatic

Mouse Ortholog Models

Associations

Copy number

PGx & Clinically Validated

Bio

log

ica

l M

od

els

Mu

tatio

n C

on

ten

t

LITERATURE & DATABASES

FDA LABELS, GUIDELINES

PRIVATE VARIANT DB

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論文情報に加え様々なデータベースの情報を搭載

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Mouse Genome Database

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データをクラウドへアップロード。インタラクティブなフィルタリングにより様々な設定、順番で視覚的に分かりやすく絞り込みが行えます。

• 塩基のクオリティのフィルター

• ACMG（American Collage of Medical Genetics）の基準に基づいたバリアントの影響予測

• ShiftやPolyphenといったツールによる機能へのダメージの予測

• 1000人ゲノムなどの変異情報のフィルタリング

• バリアント型（Homoe, Hetero, Hemi etc. ）

• がんに関連する様々な表現形との関連が論文やデータベースなどで知られているかどうか

※フィルタリングの一例です。

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パスウェイによる意味づけ

• 絞り込まれたバリアントを持つ遺伝子はどういったパスウェイで多く見られるのか、統計的に解析し順位付け。

• パスウェイ上にバリアントを持つ遺伝子がハイライトされ、瞬時に影響が出る箇所を見つけることが可能です。

• さらに薬のターゲットとなる遺伝子かどうかを重ねがきすることも可能です。

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Biological Context Filter

• 興味の対象となるキーワードを入れ、関連するバリアントを絞り込む。

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Biological Context Filter

• キーワードは患者に見られる症状なども入力可能。

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バリアントリストから、機能への影響を調べる、Path to Phenotype 機能

• バリアントが表現型とどのように関係しているか、中間の分子も含めて関係を表示。

• これらの関係はすべて博士号を保有するエキスパートにより急レーションされた論文の実験結果から得られた知見をまとめたデータベース（ナレッジベース）に基づき、決定されています。

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HGMD情報も既に搭載済み

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QIAGEN Bioinformatics ソリューション

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Biomedical Genomics Workbench + Ingenuity Variant Analysis = a strong team!

Biomedical Genomics

Workbench & Server

よりシームレスな解析を

Prepare

Sequence

Data Analysis

] Interpretation

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Biomedical Genomics Workbench & Ingenuity Variant Analysis Plugin

Ingenuity Variant Analysis (IVA)はBiomedical Genomics Workbenchからプラグイン経由で利用できます。

あらかじめ設定したフィルタリングでBxWBからIVA へフィルタリングをかけることも可

能です。

プラグインを使う事で、自動でデータがアップロードされ、結果も自動でインポー

トされます。

絞り込んだバリアントを再度マッピング結果で確認するステップが非常に簡単になり

ます。

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ユーザー事例

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すでに様々な論文が発表されています。

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論文紹介

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Whole Exomeによる疾患原因バリアントの特定

• 気管支拡張や末梢神経障害が見られた患者にWhole Exome を実施し、IVAを使った解析により原因と見られるバリアントを特定。

• バリアントのVCFデータをIVAでフィルタリングした結果

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お客様の声

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Case Study

• 難聴のコホートの患者サンプルからExomeシークエンスデータとコピー数バリアントのデータを用い、難聴に関連した新規LociをIngenuity Variant Analysisを使って発見。

• “You only have to upload your data once, and Variant Analysis allows you to manipulate it, query all of the external databases,and run all the algorithm you want to use– all at the click of a button”

“データを1度Variant Analysisへアップロードするだけで、データをうまくコントロールできるようになり、外部のデータベースや実行したいアルゴリズムを使えるようになりました。-すべてボタンをクリックするだけで。”

• “It allows people who aren’t experts in genomics to quickly ask questions about the data without having to worry aboutputting all the components together to make the best informatics pipelines”

“ゲノミクスのエキスパートでなくとも、最高のインフォマティクスの結果を得るために、解析に不安を覚えることもなく、データについて迅速に調べることが出来ました。”

スタンフォード大学Rajini Haraksingh

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お客様の声

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Case Study

• イギリスのオックスフォードメディカルリサーチセンターでは脳の機能不全を持つ家系データに対してWhole Exomeシークエンスを実施。病気により流産した胎児のデータから、原因となるバリアントの候補を特定。

• 原因となるバリアントは、劣性遺伝によるものと考えられたが、生殖系細胞のモザイシズムによる可能性もあった。

• “Having this software was quite useful because you can changethe order that all the filtering is performed and you can

very quickly switch from the recessive mechanism to this de novo parental mosaicism model.”

“このソフトウェアは、とても便利でした。フィルターの順番を変えて実行でき劣性遺伝によるメカニズムなのか、de novo のモザイシズムによるものなのかをすばやく変更できました。”

その他のユーザー事例は、以下よりご覧いただけます。

https://www.qiagenbioinformatics.com/insights/featured-researchers/

オックスフォードバイオメディカルリサーチセンターDr. Alistair Pagnamenta

https://www.qiagenbioinformatics.com/insights/featured-researchers/

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希少疾患の原因遺伝子の特定

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The Rienhoff story

2003年にベアトリスが生まれた時、長く細い足と、曲がった指、そして成長するにつれて体重が増えず、何か問題があるに違いないと考えたReinhoffは様々なデータを集め研究を開始。

詳細を調べるために家族全員（両親とベアトリス、もう二人の子供）のExomeをNGSでシークエンス。

* Rienhoff Jr HY, Yeo CY, Morissette R, Khrebtukova I, Melnick J, et al. (2013) A mutation in

TGF-ß3 associated with a syndrome of low muscle mass, growth retardation, distal

arthrogryposis and clinical features overlapping with Marfan and Loeys-Dietz syndromes.

Am J Med Genet A 161: 2040–2046.

* Personal genomics: His daughter's DNA.(2007) Nature 449, 773-776

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The Rienhoff story

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Rienhoff Case Study – Comparison false positives

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Rienhoff Case Study

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BxWBでの再解析：トリオ解析

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Rienhoff Case Study

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BxWB + Ingenuity Variant Analysis including Biological Context フィルター

Sample to Insight

結果

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Sample to Insight


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• Ingenuity Variant Analysis を使う事でバリアントのリスト同士の関連を

過去の論文を元に精査し、ストーリーを作る事ができ、新たな仮説を立てる事が容易になる。

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• 商用ソフトウェアは製品だけでなくテクニカルサポートも含まれます。解析ツールを熟知したサポートが解析のトレーニングから疑問点まで質問に回答します。また開発を行っているディベロッパーが社内にいるため、製品への要望なども行えます。

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データ解析環境

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データ解析環境

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Genomics

WB

Genomics

Server

Genomics

WB

Genomics

WBGenomics

WBGenomics

WBGenomics

WBGenomics

WB

研究者1人で少数のサンプル解析

+

Sit

uati

on

Pro

du

ct

Genomics

Server

+Commercial

Add-ons

“Modules”

Commercial

Add-ons

“Modules”

Commercial

Add-ons

“Modules”

1つのソフトウェアでいくつかの解析

計算ノードを使って効率的に解析

保存ディスクを大きくし、大量なデータ管理とユーザー管理

Pro

研究者1人で大量のサンプル解析

共同利用研究施設など、複数の人が多くの解析を実行

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CLC Genomics Server

+ CLC Genomics Workbench (Network license)

・・・・・・

・・・

2TB memory

事例: Osaka University

1TB memory

500GB memory

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まとめ

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• 疾患患者に対するゲノム解析への期待は非常に高く、これから益々行われていくものと思われます。正確な解析が求められる一方、解析者不足も指摘されています。しっかりと使いこなせ、相談できる解析環境を見つける事がとても大切です。

• Biomedical Genomics WorkbenchとIngenuity Variant Analysisは解析結果の作成から解釈までをスムーズにサポートする製品です。

• テクニカルサポートを利用する事で解析の初歩から論文作成に辿り着けるようサポートしています。

• キアゲンバイオインフォマティクスの解析環境は小規模から大規模まで対応しているため、小規模で開始してから長い間拡張しつつご利用いただけます。

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ご清聴ありがとうございました。

Question?

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[email protected]

株式会社キアゲンアプライドアドバンストゲノミクス

宮本真理

mailto:[email protected]

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