Qual B.06.00 and All Ions MSMS Customer … · disolventes sin perdida de resolución! ¡Mayor sensibilidad! ... Elevando el Estandard en UHPLC para el Laboratorio 1260 Infinity LC

Agilent Solutions

Aplicaciones Prácticas para el

Control e Investigación en el

Análisis Alimentario de las

Diferentes Soluciones por

Cromatografía Líquida

1

Jaume C. Morales

LC-MS Product Specialist

Innovación Tecnológica para

Cromatografía Liquida

• Amplio Portfolio UHPLC 1220, 1260, 1290

• UHPLC - 1290 Infinity Cuaternario.

• UHPLC Bio-Inerte

• Portfolio de Nuevas Válvulas

• FlexCube Online Enrichment

• Nuevas Soluciones Multidimensionales

LC x LC

• Soluciones MaxLight DAD

x10 Sensibilidad UV: “Max-Light High Sensitivity”.

x30 Rango Dinámico: “HDR-DADTechnology”.

• Emulación ISET

Innovación Tecnológica para

Cromatografía Liquida

• Amplio Portfolio UHPLC 1220, 1260, 1290

• UHPLC - 1290 Infinity Cuaternario.

• UHPLC Bio-Inerte

• Portfolio de Nuevas Válvulas

• FlexCube Online Enrichment

• Nuevas Soluciones Multidimensionales

LC x LC

• Soluciones MaxLight DAD

x10 Sensibilidad UV: “Max-Light High Sensitivity”.

x30 Rango Dinámico: “HDR-DADTechnology”.

• Emulación ISET

Page 4

Pero ¿Que es UHPLC ?

UHPLC es : • Ultra High Pressure Liquid Chromatography. (≥ 600 bar)

• Cromatografía de alto rendimiento en columnas con relleno de partículas

sub-2-micron (STM) o de superfície porosa.

UHPLC NO es : • La alta presión NO es ninguna ventaja, sino un efecto colateral indeseado.

¡¡La Alta Presión no separa nada !!

• Cromatografía con columnas de 2.1mm. Cualquier diámetro de columna

puede empaquetarse con partículas de STM. (4.6 , 4.3, 3.0…)

Page 5

¿Que es UHPLC ?

1. Las partículas más pequeñas permiten una menor altura de

plato teórico mostrando pues una mayor resolución

cromatográfica.

2. La resolución cromatográfica sufre menos al incrementar el

flujo cuanto más pequeña es la partícula

Características de UHPLC

Resolución y Flujo

¿Que es UHPLC ?

April 28, 2014 6

ldh

L

V

VcA

P

C

R

ii

max

3. Small particles lead to narrower,

higher peaks.

40 mAU 150 mm, 5 µm

Tolu

ene

120 mAU

50 mm, 1.8 µm

Tolu

ene

3. Las partículas más pequeñas consiguen

picos más estrechos y más altos.

¿Que es UHPLC ?

April 28, 2014 7

Hd

VcA

C

ii

2max ~

La altura del pico decrece al

aumentar el flujo

Beneficios de la UHPLC

28 de abril de 2014 8

Las partículas más pequeñas

permiten una menor altura de

plato teórico mostrando pues

una mayor resolución

cromatográfica.

La resolución cromatográfica

sufre menos al incrementar el

flujo cuanto más pequeña es la

partícula

Las partículas más pequeñas

consiguen picos más estrechos

y más altos.

¡Mayor resolución!

¡Sin incremento de tiempo de

analisis!

¡Menor tiempo de

analisis!

¡Menor consumo de

disolventes sin perdida de

resolución!

¡Mayor sensibilidad!

Si no se aumenta el flujo

Page 9

Nueva Serie Agilent 1200 Infinity Elevando el Estandard en UHPLC para el Laboratorio

1260

Infinity LC

Modular

600 bar

80 Hz

2x ó 10x Sensivilidad UV

100% HPLC Compatible

Precio HPLC

Capacidades UHPLC

1220

Infinity LC

Integrado

600 bar

80 Hz

El más económico

HPLC y UHPLC

Tecnologia 1260/1290

1290

Infinity LC

Modular

1200 bar

160 Hz

Máximo rendimiento UHPLC

Máxima Flexibilidad

Coste Servicio HPLC

Herramienta transformación métodos

HPLC => UHPLC


“Method Translator and Cost Saving Calculator”

Esta avanzada calculadora le permite

calcular el ahorro en coste del análisis

basado no solo en los costes de

disolventes sino también de los gastos

regulares de un laboratorio.

Utilícela on-line aquí

ó

descárguela para instalarla en su PC.

http://www.chem.agilent.com/en-US/products-services/Instruments-Systems/Liquid-Chromatography/Pages/1200infinity_cost_calculator.aspx





http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

http://www.chem.agilent.com/Library/software/Public/Agilent1200InfinityMethodTranslator.exe

April 28, 2014 11

Aportaciones de la

UHPLC y MS en el

Análisis

Alimentario

Aplicaciones UHPLC Análisis Agro-Alimentario

April 28, 2014 12

Pesticidas,

Micotoxinas y

Otros

Contaminantes

Suplementos

Dietéticos,

Compuestos

Naturales y

Aditivos Autentificación

de Alimentos

Fármacos

Veterinarios

Análisis de

Suelos

Contenido

April 28, 2014 13

Análisis de Suelos

• PAHs in Soil

Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos

• Antioxidants in Orange Juice

• Total Sugar Content in Maple Sirup

• Plant Stanyl Fatty Acid Esters in Margarine by LC-GC coupling

• Water-soluble vitamins from multivitamin tablets

• Fat-soluble Vitamins from food matrix

• Flavonoids in Citrus Fruit

• Artificial sweeteners in diet colas

• Color additives in sweets

Contenido

April 28, 2014 14

Fármacos vetrinarios

• Growth Promoters in Animal Feedstuff

Pesticidas, Micotoxinas y otros Contaminantes

• Acaricides in Honey

• Sudan Red Compounds in Paprika Powder by online sample clean-up

• Bisphenol A leaching from baby bottles

• PAHs in Fish

• Hormones in Shrimp

Autentificación de Alimentos

• Natural and Artificial Vanilla Preparations

• Melamine in Milk

PAHs en suelos (Hidrocarburos Poli-Aromáticos)

Análisis de suelos

April 28, 2014 15

Agilent Application

Solution

Analysis of PAHs in

soil according

to EPA 8310 method

with UV and

fluorescence

detection

Agilent Application

Note 5990-8414EN

Background

April 28, 2014 16

• Son compuestos de alta toxicidad tanto mutagénica como carcinogénica que ha

llevado a una legislación específica y rigurosa.

• Los PAHs suelen generarse en combustiones incompletas de material orgánico

como los combustibles fósiles. A través de la atmosfera alcanzan el suelo y

sedimentos en áreas apartadas de las industrias, aeropuertos y carreteras.

• Otros factores como fugas de aceites o la falta de cuidado en su manejo

contribuyen también a la contaminación.

Análisis de la mezcla de Patrones

April 28, 2014 17

No: Name:

1 Napthalene

2 Acenaphtylene

3 Acenaphtene

4 Fluorene

5 Phenantrene

6 Anthracene

7 Fluoranthene

8 Pyrene

9 Benzo(a)anthracene

10 Chrysene

11 Benzo(b)fl uoranthene

12 Benzo(k)fl uoranthene

13 Benzo(a)pyrene

14 Dibenzo(a,h)anthracene

15 Benzo(g,h,i)perylene

16 Indeno(1,2,3-cd)pyrene

Column ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm

Mobile phase A Water

Mobile phase B Acetonitrile

Gradient at 0 min 40%B, at 20 min 95%B

Flow rate 1.5 mL/min

Col.temp.: 25 °C

Inj. volume 3 µL

Data acq. 230 nm (ref. 400 nm) (DAD), 260 nm (Ex.) 350 nm, 420 nm, 440 nm, 500 nm (Em.) (FLD)

Limites de Detección y Cuantificación

April 28, 2014 18

Análisis de muestra de suelo

April 28, 2014 19

No: Name:

1 Napthalene

2 Acenaphtylene

3 Acenaphtene

4 Fluorene

5 Phenantrene

6 Anthracene

7 Fluoranthene

8 Pyrene


10 Chrysene



13 Benzo(a)pyrene




Análisis de un blanco. Excepto para los más volátiles, todos los PAHs se

detectan en el blanco sin dopar. La máxima concentración detectada en el

blanco es de 0.63 mg/kg, lo cual indica una baja contaminación (MRL

10mg/Kg).

Column ZORBAX Eclipse PAH RRHT 2.1 x 50 mm, 1.8 μm





Col.temp.: 25 °C

Inj. volume 0.3 µL


Cambio a método UHPLC Ahorro de Tiempo y Disolvente

April 28, 2014 20

Ahorro de tiempo: 80 %

Ahorro en disolventes: 88 %

No: Name:

1 Napthalene

2 Acenaphtylene

3 Acenaphtene

4 Fluorene

5 Phenantrene

6 Anthracene

7 Fluoranthene

8 Pyrene


10 Chrysene



13 Benzo(a)pyrene




From :

ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm

Análisis de la mezcla de Patrones

April 28, 2014 21

No: Name:

1 Napthalene

2 Acenaphtylene

3 Acenaphtene

4 Fluorene

5 Phenantrene

6 Anthracene

7 Fluoranthene

8 Pyrene


10 Chrysene



13 Benzo(a)pyrene




Column ZORBAX Eclipse PAH 4.6 x 150 mm, 5 μm





Col.temp.: 25 °C

Inj. volume 3 µL


Rendimiento del método UHPLC

April 28, 2014 22

Metodo HPLC

Antioxidantes en Zumo de Naranja Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos

April 28, 2014 23

Agilent Application

Solution

Analysis of

ascorbic acid,

citric acid and

benzoic acid in

orange juice

Agilent Application

Note 5990-8720EN

Background


Acido ascórbico

O

OHOH

O

OH

OH OOH

OHOHOH

OO

OHO

Acido Benzoico Acido cítrico

• Los antioxidantes como el ácido ascórbico previenen la oxidación de la matriz

disminuyendo la cantidad de oxígeno disponible. El ácido ascórbico lo lleva a

cabo mediante su propia oxidación a ácido deshidroascórbico (DHA).

• Los conservantes, como el ácido cítrico y benzoico previenen o inhiben el

crecimiento de microorganismos en alimentos.

• Aunque éstos compuestos se encuentran de modo natural en algunas frutas

también se añaden para una mejor conservación de los zumos.

• Existe un cierto temor sobre la liberación del carcinógeno benceno debido a la

posible reacción del ácido benzoico con ácido ascórbico en ciertas condiciones.

• El método oficial para determinar vitamina C es oxidándola primero a DHA y

derivatizando para detectar pro FLD. El benzoico y cítrico se detectan por UV.

Análisis de Patrones

April 28, 2014 25

No: Name:

1 Ascorbic acid

2 Citric acid

3 Benzoic acid

1

2

3

min 2.5 5 7.5 10 12.5

mAU

0

200

400

600

800

Column Poroshell 120 EC-C18 4.6 x 100 mm, 2.7 μm

Mobile phase A 20 mM HK2PO

4 in water, pH 2.5

Mobile phase B Acetonitrile/methanol 40 : 60

Gradient at 0 min 5%B, at 2 min 5%B, at 2.1 min 25%B, at 13 min 25%B, at 13.1 min 90%B, at 18 min 90%B, at 18.1 min 5 % B

Stop time: 25 min

Flow rate 1 mL/min

Col.temp.: 20 °C

Inj. volume 5 µL

Sample therm.: 4 °C

Data acq. 210 nm, 230 nm, 243.5 nm, 10 Hz (DAD)

Análisis de Zumo de Naranja

April 28, 2014 26

Método UHPLC Ahorro de Tiempo y Disolvente

April 28, 2014 27



4 in water, pH 2.5


Gradient at 0 min 5%B, at 0.5 min 5%B, at 0.6 min 25%B, at 3 min 25%B, at 3.1 min 70%B, at 3.9 min 70%B, at 4 min 5 % B

Stop time: 5 min


Col.temp.: 20 °C

Inj. volume 4 µL



min 1 2 3

mAU

0

100

200

300

400

No: Name:

1 Ascorbic acid

2 Citric acid

3 Benzoic acid

1

2

3



Análisis de Patrones

April 28, 2014 28

No: Name:

1 Ascorbic acid

2 Citric acid

3 Benzoic acid

1

2

3

min 2.5 5 7.5 10 12.5

mAU

0

200

400

600

800



4 in water, pH 2.5


Gradient at 0 min 5%B, at 2 min 5%B, at 2.1 min 25%B, at 13 min 25%B, at 13.1 min 90%B, at 18 min 90%B, at 18.1 min 5 % B

Stop time: 25 min

Flow rate 1 mL/min

Col.temp.: 20 °C

Inj. volume 5 µL



Vitaminas Hidrosolubles Suplementos Dietéticos, Compuestos Naturales y Aditivos

April 28, 2014 29

Agilent Application

Solution

Analysis of water-

soluble vitamins

from multivitamin

tablets for

nutrition labeling

Agilent Application

Note 5990-7950EN

Compounds & Structure

April 28, 2014 30

N NH2

O

O

OHOH

O

OH

OH

N

NN

N

NH

NH2

OH

O

NH

OOH

OH

O

OHNH OH

OHH

OCH3 CH3 O

N

N

CH3

NH2

N+

S

CH3

OH

NH NH

S

HH

O

COOH

N

OH

O

N

CH3

OH

OH

OH

N

N

NH

N

O

O

CH3

CH3

OH

OH

OHOH

Biotin Riboflavin

Ascorbic acid

Nicotinic acid Pantothenic acid

Pyridoxine

Nicotinamide

Thiamine chloride

Folic acid Cyanocobalamine not shown

Analysis of Standard Mixture

April 28, 2014 31

Column Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm


4 in water


Gradient at 0 min 1%B, at 5 min 1%B, at 15 min 30%B, at 20 min 30%B, at 20.1 min 1%B

Stop time: 20.1 min

Post time: 5 min


Col.temp.: 35 °C

Inj. volume 5 µL


Data acq. 205 nm, 214 nm, 220 nm, 232 nm, 266 nm, 280 nm, 20 Hz (DAD)

No: Name:

1 Ascorbic acid

2 Nicotinic acid

3 Calcium pantothenate

4 Pyridoxine

5 Niacinamide

6 Thiamin

7 Folic acid

8 Biotin

9 Cyanocobalamine

10 Riboflavin

Fast UHPLC Method Ahorro de Tiempo y Disolvente

April 28, 2014 32



4 in water


Gradient at 0 min 1%B, at 0.56 min 1%B, at 1.66 min 30%B, at 2.2 min 30%B, at 2.22 min 1%B

Stop time: 2.22 min

Post time: 1 min

Flow rate 1 mL/min

Col.temp.: 35 °C

Inj. volume 1 µL



No: Name:

1 Ascorbic acid

2 Nicotinic acid


4 Pyridoxine

5 Niacinamide

6 Thiamin

7 Folic acid

8 Biotin

9 Cyanocobalamine

10 Riboflavin

From :

Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm

0.45 mL/min




April 28, 2014 33

Column Poroshell 120 EC-C18 3 x 150 mm, 2.7 μm


4 in water


Gradient at 0 min 1%B, at 5 min 1%B, at 15 min 30%B, at 20 min 30%B, at 20.1 min 1%B

Stop time: 20.1 min

Post time: 5 min


Col.temp.: 35 °C

Inj. volume 5 µL



No: Name:

1 Ascorbic acid

2 Nicotinic acid


4 Pyridoxine

5 Niacinamide

6 Thiamin

7 Folic acid

8 Biotin

9 Cyanocobalamine

10 Riboflavin

LOD/LOQ

April 28, 2014 34

Comparable sensitivity Time savings: 90 %

Solvent savings: 70 %

Acaricidas en Miel Pesticidas, Micotoxinas y otros Contaminantes

April 28, 2014 35

Agilent Application

Solution

Analysis of

acaricides in

honey

Agilent Application

Note 5990-8717EN


April 28, 2014 36

Column ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 x 150 mm, 5 μm



Gradient at 0 min 40%B, at 15 min 90%B, at 20 min 90%B, at 20.1 min 40%B, at 25 min 40%B

Stop time: 25 min

Flow rate 1 mL/min

Col.temp.: 30 °C

Inj. volume 20 µL

Data acq. 230 nm, 290 nm, 10 Hz (DAD)

No: Name:

1 Rotenone

2 Coumaphos

3 Bromopropylate

4 Amitraz

min 10 12 14 16 18

mAU

0

10

20

30

40

50

1 2

3 4

Identification of Acaricides Honey by UV Spectra

April 28, 2014 37

Match factor = 990

Rote

none

Coum

aphos

Am

itra

z

Bro

mopro

pyla

te

min 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

2

4

6

8

Rotenone

Match factor = 994

Amitraz

Fast UHPLC Method Ahorro de Tiempo y Disolvente

April 28, 2014 38

min 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

20

40

60

80

100

120

Ro

ten

on

e

Co

um

ap

ho

s

Am

itra

z

Bro

mo

pro

pyla

te

Ro

ten

on

e

Co

um

ap

ho

s

Am

itra

z

Bro

mo

pro

pyla

te

Column ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 2.1 x 50 mm, 1.8 μm



Gradient at 0 min 40%B, at 1.16 min 90%B, at 1.557 min 90%B, at 1.56 min 40%B, at 1.93 min 40%B

Stop time: 1.93 min


Col.temp.: 30 °C

Inj. volume 1.5 µL

Data acq. 230 nm, 290 nm, 40 Hz (DAD)



From :

ZORBAX Eclipse Plus C18 4.6 x 150 mm, 5 μm

Melamina en Leche Autentificación de Alimentos

April 28, 2014 39

Quantitative

Liquid

Chromatography

Analysis of

Melamine in Dairy

Products Using

Agilent's 1120

Compact LC and

1200 Rapid

Resolution LC

Agilent Application

Note 5989-9949EN

Melamina en Leche Background

April 28, 2014 40

• En Marzo de 2007, se detectaron ingredientes de alimentación para animales

contaminados con melamina que causaron fallos renales en los animales.

• Más tarde, en 2010, se detectó la melamina como adulterante en productos

lácteos como leche en polvo infantil proveniente de la China.

Analysis of Melamine Standard and Yoghurt Sample – HPLC Method

April 28, 2014 41

Column: ZORBAX SB-C8 4.6 x 250 mm, 5 μm

Buffer: 10 mM Citric acid, 19 mM Sodium Octane Sulfonate, pH = 3

Mobile phase: Buffer/Acetonitrile 92:8

Stop time: 20 min


Col.temp.: 30 °C

Inj. volume 20 µL

Data acq. 240 nm, (DAD, VWD)

Analysis of Melamine Standard and Yoghurt Sample – UHPLC Method

April 28, 2014 42

Column: ZORBAX SB-C8 RRHT 4.6 x 50 mm, 1.8 μm

Buffer: 10 mM Citric acid, 19 mM Sodium Octane Sulfonate, pH = 3


Stop time: 6 min


Col.temp.: 30 °C

Inj. volume 8 µL


Analysis of Melamine Mílk Powder Sample – Ion-exchange Method

April 28, 2014 43

Column: ZORBAX 300SCX 4.6 x 150 mm, 5 μm

Buffer: 50 mM Ammonium formate, pH = 3 (formic acid)


Stop time: 5.5 min

Flow rate 1 mL/min

Col.temp.: 30 °C

Inj. volume 10 µL


Application Notes & Systems

April 28, 2014 44

Soil Analysis

PAHs in Soil

• Agilent Application Solution: Analysis of PAHs in soil according to EPA 8310 method

with UV and fluorescence detection (5990-8414EN)

• Agilent 1290 Infinity LC, Agilent 1260 Infinity LC

Dietary Supplements, Natural Compounds & Additives

Antioxidants in Orange Juice

• Agilent Application Solution: Analysis of ascorbic acid, citric acid and benzoic acid in

orange juice (5990-8720EN)


Total Sugar Content in Maple Sirup

• Agilent Application Solution: Determining total sugar content in maple syrup to meet

FDA nutrition labeling requirements (5990-7935EN)

• Agilent 1260 Infinity LC


April 28, 2014 45


Plant Stanyl Fatty Acid Esters in Margarine by LC-GC coupling

• Analysis of plant stanyl fatty acid esters in enriched margarine using an on-line coupled

Agilent 1220 Infinity LC-7890 GC system

• Agilent 1220 Infinity LC, Agilent 7890 GC

Water-soluble vitamins from multivitamin tablets

• Agilent Application Solution: Analysis of water-soluble vitamins from multivitamin

tablets for nutrition labeling (5990-7950EN)


Fat-soluble Vitamins from food matrix

• Agilent Application Solution: Analysis of Fat-soluble Vitamins from food matrix for

nutrition labeling (in print)


Flavonoids in Citrus Fruit

• Rapid Gradient and Elevated Temperature UHPLC of Flavonoids in Citrus Fruit (5990-

6237EN)



April 28, 2014 46


Artificial sweeteners in diet colas

• Agilent Application Solution: Quantification of artificial sweeteners in diet colas using an

Agilent 1260 Infinity Binary LC system with UV detection


Color additives in sweets

• Analysis of color additives in sweets (5990-9525EN)



April 28, 2014 47

Veterinary Drugs

Growth Promoters in Animal Feedstuff

• Quantification of growth promoters olaquindox and carbadox in animal feedstuff with

the Agilent 1260 Infinity Binary LC system with UV detection (5990-8092EN)


Pesticides, Mycotoxins & Other Contaminants

Acaricides in Honey

• Agilent Application Solution: Analysis of acaricides in honey (5990-8717EN)


Sudan Red Compounds in Paprika Powder by online sample clean-up

• Online sample cleanup on the Agilent 1290 Infinity LC using a built in 2-position/ 6-port

valve - Analysis of Sudan red compounds in paprika powder (5990-5255EN)



April 28, 2014 48

Pesticides, Mycotoxins & Other Contaminants

Bisphenol A leaching from baby bottles

• Agilent Application Solution: Analysis of bisphenol A leaching from baby feeding bottles

(5990-9398EN)


PAHs in Fish

• Analysis of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Fish (5990-5441EN)


Hormones in Shrimp

• Determination of Hormones in Shrimp by Agilent 1290 Infinity LC with Agilent Poroshell

120 LC Column and Agilent QuEChERS for Sample Preparation (5990-6589EN)



April 28, 2014 49

Food Authentication

Natural and Artificial Vanilla Preparations

• Agilent Application Solution: Analysis of natural and artificial vanilla preparations (5990-

8716EN)


Melamine in Milk

• Quantitative Liquid Chromatography Analysis of Melamine in Dairy Products Using

Agilent's 1120 Compact LC and 1200 Rapid Resolution LC (5989-9949EN)


Estudio de viabilidad – Cuantificación de herbicidas a nivel de trazas

en muestras reales de agua por online SPE LC-MS(MS)

Participación in un ejercicio de validación interlaboratorio de acuerdo a

la norma Alemna DIN standard 38407-36.

Agilent 1200 Infinity Series Online-SPE

Application notes

5991-2140EN

5991-1738EN

5991-2405EN

Compounds

2,6-Dichlorbenzamide Ethofumesate

Alachlor Isoproturone

Atrazine Lenacil

Atrazine-desethyl Metalaxyl

Atrazine-desisopropyl Metamitrone

Boscalid Metazachlor

Bromacil Metolachlor

Carbamazepine Metribuzine

Chlorfenvinphos Pendimethalin

Chloridazone Quinoxyfen

Chloridazone-

methyldesphenyl Simazine

Chlorpyrifos Terbuthylazine

Chlortolurone Terbuthylazine-desethyl

Diuron

http://www.chem.agilent.com/Library/applications/5991-2140EN.pdf









Page 51

Ejercicio de validación interlaboratorio :Excelente

linearidad para una calibración de seis neiveles

e.g. Metolachlor en agua superficial


Serie de diluciones

desde 500 ng/l hasta

10 ng/l

QC a 100 ng/l

50 ng/l

5991-2405EN

//commons.wikimedia.org/wiki/File:Metolachlor.png





5991-2405EN

0

20

40

60

80

100

120

140

Re

co

ve

ry (

%)

Herbicides

Ejercicio de validación interlaboratorio : Buena recuperación –

muestra real de agua superficial

Average of n = 4 samples, spiked with conc. 50 – 300 ng/l, RSD of area < 5 %




Agilent Innovative

2D-LC Technology Aplicaciones en

Matrices Complejas

Page 53

When one dimension is not enough… Analysis of complex samples requiring high peak capacity

min 20 40 60 80 100

mAU

0

10

20

30

40

50

min 10 20 30 40 50

mAU

0

20

40

60 Column: 2.1 x 150 mm, 1.8 µm

Back pressure: 402 bar

Peak capacity: 313

Column: 2.1 x 300 mm*, 1.8 µm

Back pressure: 598 bar

Peak capacity: 406

*300 mm column by coupling two 150 mm columns

Page 54

Increasing Peak Capacity …into the 2nd Dimension

Page 55

LC

Peak capacity = 10

+ LC

Peak capacity = 10 Peak capacity = 20

x LC

Peak capacity = 10

LC

Peak capacity = 10 Peak capacity = 100 !

Comprehensive 2D-LC What is it?

Pump Autosampler Column 1

Pump 2

Column 2

Injector

Detector

2-dimensional LC:

Page 56

Modos de Operación LC-2D Soportados

Comprehensive LCxLC: • Standard: muestreo en continuo

• Time-/Peak-triggered: ahorra disolvente de la 2ª

dimensión (muestreo discontinuo).

Heart-cutting LC-LC: • Time-triggered

• Peak-triggered

level

1D chromatogram

2D sampling

2D gradient

level

Muestras Desconocidas/ Complejas:

Biofarma, Alimentación, Polímeros....

Muestras Conocidas/Aumentar la Confianza:

Farma, Desarrollo de métodos,...

2D sampling

2D gradient

2D sampling

2D gradient

2D sampling

2D gradient

Data Analysis GC Image LCxLC Edition Software from GC Image LLC

Key features offered:

• Direct Agilent datafile import

• Peak identification, integration, annotation

• Comparative Analysis and Visualization

• Compound-libraries

• MS-data handling

Page 58

Ejemplo Aplicación: Repetibilidad Cuantitativa

Polifenoles en matriz Alimentaria

1

2

3

4

5

6

7

8 9

10

11

12 13 14

15

16

17 18 19

20 21 22

23

24

25 26

Compound

RT 1st dim

(min)

RT 2nd dim

(sec) Peak Volume

Esculin mean 9.75 18.58 177,383

s.d. nd 0.11 4,713

RSD (%) nd 0.57 2.7 Rutin mean 13.65 33.68 72,375

s.d. nd 0.07 853

RSD (%) nd 0.22 1.2 Coumaric acid mean 13.00 25.57 660,541

s.d. nd 0.13 13,037

RSD (%) nd 0.52 2.1 Reservatrol mean 18.85 26.65 1,122,219

s.d. nd 0.10 16,089

RSD (%) nd 0.37 1.4 Salicylic acid mean 19.50 18.53 211,092

s.d. nd 0.10 6,895

RSD (%) nd 0.51 3.3 Luteolin mean 19.50 32.70 695,601

s.d. nd 0.11 17,592

RSD (%) nd 0.33 2.5 7-Hydroxy-

Flavone mean 22.75 34.26 1,388,226

s.d. nd 0.10 17,195

RSD (%) nd 0.30 1.2 Pinoslyvin mean 24.70 18,85 1,588,654

s.d. nd 0.23 57,580

RSD (%) nd 1.24 3.6 Chrysin mean 27.30 27.42 808,916

s.d. nd 0.11 14,768

RSD (%) nd 0.39 1.8 Flavone mean 28.60 26.35 1,008,012

s.d. nd 0.13 20,911

RSD (%) nd 0.48 2.1

RSD% Volumen picos:

Todos los compuestos <3.6% RSD

(1.2-3.6%)

Acople LC/MS

•6100 Single Quadrupoles

•6200 TOF

•iFunnel

•6400 Triple Quadrupoles

•DMRM, tMRM

•6500 QTOF

•RapidFire

•Qual/Quan

•MassHunter Software

La determinación de compuestos residuales puede abordarse con dos enfoques :

• Dirigido. Número acotado de compuestos a confirmar.

• Más sensible (*)

• El nº de compuestos depende principalmente del sistema cromatográfico y de la velocidad del MS.

• Sin capacidad de determinar NO esperados.

• Sin capacidad de análisis retrospectivo.

• NO Dirigido. Adquisición indiscriminada de Full Scan y/o MS/MS.

• El nº de compuestos a detectar es mucho mayor (casi ilimitado).

• La detección del compuesto se realiza a través algoritmos de deconvolución.

• La acotación de compuestos detectados viene limitada por la base de datos o librerías de los posibles compuestos a identificar

• Menos sensible (*)

Dos enfoques de Screening

61

(*) Depende del modelo de QQQ y TOF/QTOF

Innovation Tour

April 28, 2014

Dos enfoques de Screening

62

Dirigido

No dirigido

Innovation Tour

April 28, 2014

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con

iones del

“fondo” (API: ESI,

APCI,…)

Q1 sólo deja

pasar el ión

“precursor” 210

pass

190 210

210

Celda Colisión

rompe el ión 210 (y sus productos)

150 170 190 210

210 158

191

Q3 monitoriza sólo

los fragmentos 158 y

191 característicos

del ión 210 para

cuantificar y cualificar

con máx. sensibilidad

160

158

190

191

Características del diseño

Triple Cuadrupolo

Guía de iones octopolar

1º Cuadrupolo

Celda de colisión (hexapolo)

3º Cuadrupolo

Detector

Capilar dielectrico frio

Cuadrupolos hiperbolicos


Celda de colision hexapolar

Detección Off-axis

Una bomba turbo

TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)

MRM dinámico (DMRM)

Mejora de la sensibilidad basado en la

especificidad de la transición a su tiempo

Page 64

tMRM Confirmación espectral de los target sin barrido

ni perdida de sensibilidad

Optimizer

Si no se dispone de Kits de Agilent permite

buscar los valores de adquisición óptimos

para la cuantificación

Counts vs. Acquisition Time (min)

x105

1

2

3

4

5

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Segmento 1 Segmento 2

Segmento 3

Segmento 4

Análisis por segmentos vs. MRM dinámico

MRM Dinámico: No hay segmentos de tiempo

La lista de MRM se confecciona de modo dinámico basándose en el RT de los compuestos de interés

Menor tiempo de ciclo/Mejor definición de pico

Time >>>

Abundance >

>>

Concurrent

Compounds

MRM dinámico - Simulación

Typical results: 10 pg Atrazine on-column using Dynamic MRM

6460A QQQ with Jet Stream Technology

Avg. Signal Height: 15,650

Avg. Signal Area: 50,966

RSD: 3.2 %

Estimated LOQ: 100 fg or less

6-7 data points above FWHM

3 sec FWHM, 6 sec @10% valley

20 data points baseline-to-baseline

•

•

•

•

•

•

• •

• • •

• •

•

• • •

•

• • • •

3 sec FWHM

10% valley

Dynamic MRM of 300 Pesticides two Transitions Each

Page 68

Run with 1200-SL LC 2.1 x 100 C18 Eclipse PLUS 1.8 u

Fundamentos del tMRM

y aplicaciones

Screening Dirigido

69

Innovation Tour

28 de abril de 2014

Mayor confianza en la confirmación

170 210 250 290

210

222

268 280 165

Espectro con

iones del

“fondo” (API: ESI,

APCI,…)

Q1 sólo deja

pasar el ión

“precursor” 210

pass

190 210

210

Celda Colisión

rompe el ión 210 (y sus productos)

150 170 190 210

210 158

191

Q3 monitoriza sólo

los fragmentos 158 y

191 característicos

del ión 210 para

cuantificar y cualificar

con máx. sensibilidad

160

158

190

191

Triple Cuadrupolo


1º Cuadrupolo

Celda de colisión (hexapolo)

3º Cuadrupolo

Detector

Capilar dielectrico frio

Cuadrupolos hiperbolicos


Celda de colision hexapolar

Detección Off-axis

Una bomba turbo

TRANSICIONES (MRM) : 210 -> 158 (Quant) y 210 -> 191 (Qual)

¿Para qué sirve el triggered MRM? Cuantificación y Confirmación : Fingerprinting

71

Enfoque de barrido:

Barrido de la huella del compuesto

Estrategia tMRM:

Foco en las características (fragmentos)

del compuesto

Dos posibles escenarios:

- Confirmación de positivos con información adicional

(confirmación espectral)

- Eliminación de negativos debido a interferencias de la matriz

Innovation Tour

28 de abril de 2014


“Triggered MRM (tMRM) Data Dependent”: ~“Scan”

Especifico con la Sensibilidad y Rapidez de un MRM

Cuantificar e Identificar con la sensibilidad y rapidez de un MRM

1 MRM de monitorización por compuesto dispara hasta 8 MRM de

confirmación de cada uno de los compuestos detectados

Muy útil para cuantificación y confirmación masiva de analitos con Triple

Cuadrupolo: análisis multiresiduos, metabolitos …

Página 72

Threshold

Secondary MRM

Transitions are “Triggered”

Primary cycle (below threshold)

Triggered cycle (above threshold)

tMRM Product Ion Spectrum

x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340

334.2 171.1

145.0

132.1

117.0

105.1 91.1 76.0

tMRM Product Ion

Spectrum

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80

76.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100

91.1

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120

105.1

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120

117.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 100 140

132.1

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120

119.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 100 140 180

145.0 x103

8

7

6

5

4

3

2

1

0 100 140 180

147.0

x103 8

7

6

5

4

3

2

1

0 80 100 120 140 160 180

171.1

334 > 76 334 > 91 334 > 105 334 > 117 334 > 119

334 > 132 334 > 145 334 > 147 334 > 171

tMRM Library Searching

Tebufenpyrad Standard 50 ppb

Library match score: 96.75

LC/MS Application

Kits

Method

Standards

On Site Training

LC Column

tMRM Database

tMRM LC/MS Application Kits Targeted Screening with QQQ

75

Pesticides

-Test Mix: 253 compounds

-DB: ~700 compounds

-Library: ~250 compounds

Veterinary Drugs


-DB: ~1,000 compounds


Forensic Toxicology


-DB: ~2,500 compounds


Innovation Tour

28 de abril de 2014


0 .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0

tMRM Product Ion Scan < 50ms

Acquisition Time (seconds)

tMRM Scanning

Confirmación segura en el ESPACIO

76

Trigger

tMRM

tMRM Scans

Ideal situation: 1 Peak 1 sec wide, no Matrix

UHPLC compatible, good peak

shape, good quantitation

0 .1 .2 .3 .4 .5 .6 .7 .8 .9 1.0

QTrap Product Ion Scan = 200ms

Acquisition Time (seconds)

_Trap Scanning

Confirmación (lenta) en el TIEMPO

77

Trigger

Full Scan

Full Scan

Full Scan

Full Scan

Trap/Wave Solution?

LONGER RUN TIME WITH WIDER

PEAKS

Ideal situation: 1 Peak 1 sec wide, no Matrix

Poor peak shape,

poor quantitation

tMRM From The Customer’s Perspective

78

1. Inject Sample

2. Read tMRM Report

Compound

RT

Concentration

Library Match

Score

+ MRM (14.865-15.031 min, 13 scans) (334.2 -> * …

Mass-to-Charge (m/z)

50 100 150 200 250 300

C o u n t s

3 x10

-1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2 117.0

117.0

147.1

145.0 91.1

76.0

57.1 334.2

Lib Match Score=55.9

Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de

gengibre

79

Reference spectrum

Acquisition Time (min)

14.6 14.8 15 15.2 15.4

C o u n t s

5 x10

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

334.2 -> 117.0 , 334.2 -> 145.0

Ratio = 46.9 (209.9 %)

Innovation Tour

28 de abril de 2014

Muestras Reales– Tebufenpyrad en extracto de

gengibre

80

Reference spectrum

Innovation Tour

28 de abril de 2014

Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de

camamilla

81

Reference spectrum


9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 10

Co

un

ts 4x10

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0

Ratio = 40.3 (204.3 %)

Innovation Tour

28 de abril de 2014

Muestras reales – Tebuthiuron en extracto de

camamilla

82

Reference spectrum


9 9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8

Co

un

ts 4x10

-0.2

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

2.2

229.1 -> 172.1 , 229.1 -> 116.0

Ratio = 19.8 (100.6 %)

Innovation Tour

28 de abril de 2014

Compounds at a glance Eficaz herramienta gráfica y rápida de revisión de resultados

83 Innovation Tour

28 de abril de 2014

Application notes para su información

84

5990-8461EN 5991-1183EN

Mass Spectrometry

Technology

Products

Solutions

NEW

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Muchas Gracias por su

Atención

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Qual B.06.00 and All Ions MSMS Customer … · disolventes sin perdida de resolución! ¡Mayor sensibilidad! ... Elevando el Estandard en UHPLC para el Laboratorio 1260 Infinity LC