UFTCAMPUS GURUPI

FUNDAMENTOS DE GENÉTICA VOLTADOS À BIOTECNOLOGIA

PROFESSOR RAIMUNDO WAGNER

ASSUNTO: QUAL A DIFERENÇA DE PROPRIEDADES ENTRE FENOL E TRIZOL USADOS NAS TÉCNICAS DE ISOLAMENTO DE DNA, RNA E PROTEÍNAS.

ALUNA: MAUREN SILVEIRA

PROPRIEDADES DE SOLUÇÕES

CLOROFÓRMIO (ÁLCOOL ISOAMÍLICO) (E/OU

FENOL)

Os ácidos nucléicos devem ser separados das proteínas. Desnaturam as proteínas

tornando-as insolúveis à fase aquosa.

A utilização de solução fenol/clorofórmio seguida de clorofórmio /álcool isoamílico é

usada para remover qualquer traço de fenol remanescente. Nesse processo as

proteínas desnaturadas ficam na interface das fases fenólica e aquosa.

TRIZOL

Mantém intacto o RNA, enquanto degrada os outros componentes celulares.

Analisando os 4 métodos que utilizam trizol e fenol: Isolamento de RNA pelo trizol,

isolamento de DNA pelo trizol, isolamento de proteína pelo trizol e isolamento de DNA

de eucariotos, ficará mais clara a diferença e propriedades destes dois compostos:

ISOLAMENTO DE RNA PELO MÉTODO TRIZOL

Reagente para isolamento de RNA de células e tecidos.

É composto por uma solução mono fásica de fenol e guanidina isotiocianato.

Foi desenvolvido por Chomezynski e Sacchi.

Durante a homogeneização da amostra ou lise, o reagente Trizol mantém a integridade do

RNA durante a ruptura celular e dissolvimento dos componentes celulares.

A adição de clorofórmio seguido de centrifugação separa a solução em duas fases: aquosa e

orgânica. O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa.

Após a transferência da fase aquosa, o RNA é recuperado por precipitação com

álcool isopropílico.

Depois de removida a fase aquosa, o DNA e proteínas na amostra podem ser

recuperados por precipitação seqüencial.

A precipitação com álcool etanol resulta DNA a partir da interfase, e uma

precipitação adicional com álcool isopropílico resulta proteínas a partir da fase

orgânica.

Co-purificação do DNA pode ser útil na normalização de RNAs produzidos de amostra para

amostra.

Essa técnica é bem executada com pequenas quantidades de tecido (50 - 100 mg) e células

(5x106), e abundantes quantidades de tecido (> 1 g) e célula (> 107), de humanos, animais,

plantas ou origem bacteriana.

Todo processo pode ser completado em uma hora.

O RNA total isolado por Trizol é livre de contaminação protéica e DNA.

Isto pode ser útil para ser usado em análise por Northem blot,

hibridização Dot blot, seleção poli (A), translação in vitro, teste de

proteção de RNAse e clone molecular.

Para uso no PCR, o tratamento do isolado de RNA com amplificação gradual de DNAse I é

recomendado quando os dois primers posicionam-se dentro de um só exon.

O reagente Trizol facilita o isolamento de uma variedade de espécies de RNA de grande ou

pequeno tamanho molecular. Por exemplo, o RNA isolado de fígado de rato, eletroforesado

no gel de agarose, e corado com brometo de etídeo, mostra discreta banda de alto peso

molecular de RNA entre 7 Kb e 15 Kb no tamanho, (composto de RNAm e RNAhn) duas bandas

predominantes de RNA ribossomal de aproximadamente 5 Kb (28 S) e de aproximadamente 2

Kb (18 S), e RNA de baixo peso molecular entre 0,1 e 0,3 Kb (RNAt, 5 S). O isolado de RNA

tinha na A260/A280 razão de > 1.8 quando diluído em TE.

Reagentes para a técnica:

Clorofórmio

Álcool Isopropílico

Água livre de RNAse ou solução SDS 0,5% ( Para preparar água livre de RNAse, extrair água em

garrafas de vidro livre de RNAse. Adicionar DEPC 0,01% (v/v). Deixar parado durante a noite e

autoclavar. A solução de SDS pode ser preparada usando DEPC tratado e água autoclavada).

1. HOMOGENEIZAÇÃO

a) Tecidos

Homogeneizar amostras de tecido em 1 mL de reagente Trizol por 50-100 mg de tecido

usando um vidro- Teflon ou forte homogeneização (Polytron, ou Tissumizer ou equivalente).

O volume da amostra não pode exceder 10% do volume de reagente Trizol usada para

homogeneização.

b) Células de cultivo em meios de crescimento

Lisar celular diretamente no disco de cultura adicionando 1 mL de reagente Trizol para 3,5

cm de diâmetro do disco, passando as células lisadas diretamente para uma pipeta. A porção

de reagente Trizol adicionado é baseado na área do disco de cultura (1 mL por 10 cm2) e não

no número de células presentes. Uma porção insuficiente de reagente Trizol pode resultar

em contaminação do isolado de RNA com DNA.

c) Células de cultivo em suspensão

Fazer um pellet celular por centrifugação. Lise celular no Trizol por repetidas pipetagens.

Usar 1 mL do reagente por 5 – 10 x 106 células animais , vegetais ou leveduras, ou por 1 x 107

células bacterianas. Lavando as células antes de adicionar Trizol poderia ser evitado, todavia

isto aumenta de possibilidade de degradação de RNAm. Ruptura de algumas células fúngicas

e bactérias podem requerer o uso de homogeneizador.

2. FASE DE SEPARAÇÃO

Incubar a amostra homogeneizada por 5 min entre 15 a 30ºC para permitir completa

dissociação do complexo núcleo-protéico.

Adicionar 0,2 mL de clorofórmio para 1 mL de reagente Trizol.

Tampar os tubos de amostras com segurança.

Misturar vigorosamente manualmente por 15 segundos e incubá-los entre 15 a 30ºC entre 2 e

3 min.

Centrifugar as amostras por não mais de 12.000 xg por 15 min entre 2 e 8ºC.

Seguindo a centrifugação, a mistura isolada dentro do pouco vermelho, fase fenol-

clorofórmio, na interfase, e uma descolorida fase aquosa superior.

O RNA permanece exclusivamente na fase aquosa.

O volume de fase aquosa é por volta de 60% do volume de reagente Trizol usado para

homogeneização.

3. PRECIPITAÇÃO DE RNA

Transferir a fase aquosa para um tubo novo, e salvar a fase orgânica se desejar isolar DNA ou

proteína.

Precipitar o RNA da fase aquosa por mistura com álcool isopropílico.

Usar 0,5 mL de álcool isopropílico por 1 mL de reagente Trizol usado para iniciar a

homogeneização.

Incubar amostras entre 15 a 30º C por 10 min e centrifugar por não mais de 12.000 xg por 10

min entre 2 e 8ºC. O precipitado de RNA muitas vezes invisível antes da centrifugação forma

um gel como um pellet no lado e no fundo do tubo.

4. LAVAGEM DE RNA

Remover o sobrenadante.

Lavar o pellet de RNA uma vez com 75% de etanol, adicionando o mínimo de 1 mL dos 75%

de etanol por 1 mL de reagente Trizol usado para a homogeneização inicial.

Misturar a amostra em vórtex e centrifugar por não mais que 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8ºC.

5. REDISSOLVENDO O RNA

No final do procedimento, secar brevemente o pellet de RNA (ao ar ou em câmara de vácuo

por 5-10 min). Não secar o RNA por centrifugação a baixo vácuo. É importante não permitir

que o pellet de RNA seque completamente, visto que isto diminui grandemente sua

solubilidade.

Parcialmente dissolvida, a amostra de RNA tem uma razão A260/280 < 1.6.

Dissolver RNA em água livre de RNASe ou 0,5% de solução SDS por passagem solução uns

pouco de tempo através de uma ponta de pipeta e incubando por 10 min entre 55 e 60ºC.

(Evitar SDS quando o RNA for usado em reações enzimáticas subseqüentes)

O RNA pode também ser redissolvido em 100% de formamida (deionizada) e estocar a -70ºC.

Notas para o isolamento de RNA:

1. Isolamento de RNA de pequenas quantidades de tecido (1 a 10 mg) ou amostras

celulares (102 a 104): Adicionar 800 L de reagente Trizol para o tecido ou células.

Seguindo a lise da amostra, adicionar clorofórmio e proceder com a separação de

fase como descrito no item 2.

Prévia precipitação de RNA com álcool isopropílico, adicionar 5-10 g de glycogen livre

de RNAse conduzindo assim para a fase aquosa.

Para reduzir a viscosidade, cortar o DNA genômico com 2 passagens através de uma

agulha de 26 calibre primariamente para posterior adição de clorofórmio.

O glycogen sobra na fase aquosa e é co-precipitado com o RNA. Isto não inibe a

síntese first-strand para concentrações acima de 4 mg/mL e não inibe PCR.

2. Depois da homogeneização e antes da adição de clorofórmio, amostras podem ser

estocadas entre -60 e -70ºC por no máximo um mês.

3. Centrífugas de mesa que podem atingir um máximo de 2.600 xg são adequadas para

uso nestes protocolos se o tempo de centrifugação for aumentado para 30-60 minutos

nos itens 2 e 3.

ISOLAMENTO DE DNA PELO MÉTODO TRIZOL

Depois de completada a remoção da fase aquosa, como descrito no protocolo de isolamento

de RNA, o DNA pode ser isolado na interfase e fase fenólica a partir do homogeneizado

inicial.

Seguindo precipitação e uma série de banhos, o DNA é solubilizado em 8mM NaOH.

O DNA recuperado a partir de tecidos e culturas celulares permite o uso de reagente Trizol

para a determinação do DNA contido na análise de amostras.

Simultâneas extrações de DNA genômico permitem normalização de resultados de Northern

Blot por DNA genômico em vez de maior variação de peso de RNA total ou tecido.

(Dependendo da fonte, o pellet de DNA obtido pode requerer

purificação - ex. extração por fenol - primeiramente para outras

aplicações).

Reagentes requeridos:

Etanol

Citrato de sódio 0,1 M em 10% de etanol

Etanol 75%

NaOH 8 mM

Exceto sob outros aspectos, o experimento é transcorrido entre 15 a 30ºC.

1. PRECIPITAÇÃO DE DNA

Remover a fase aquosa remanescente demasiadamente a interfase e precipitar o DNA da

fase orgânica e da interfase com etanol.

Adicionar 0,3 mL de 100% de etanol por 1 mL de reagente Trizol. Reagente usado pela

homogeneização inicial, e misturar amostras por inversão. Depois estocar as amostras entre

15 a 30ºC por 2 a 3 minutos e sedimentar o DNA por centrifugação por não mais de 2.000 xg

por 5 min entre 2 e 8ºC.

Remover cuidadosamente a fase aquosa é crítico para a qualidade do isolado de DNA.

2. LAVAGEM DO DNA

Remover o sobrenadante etano-fenol e se desejar, salvar este para precipitação de

proteínas.

Lavar o pellet de DNA duas vezes numa solução contendo 0,1 M de citrato de sódio em 10%

de etanol. Usar 1 mL da solução por 1 mL de reagente Trizol usado na homogeneização

inicial.

Para cada lavagem, estocar o pellet de DNA em solução de lavagem por 30 minutos entre 15 a

30ºC (com mistura periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 e 8ºC.

Seguindo estas duas lavagens, suspender o pellet de DNA em 75% de etanol (1,5-2 mL de

etanol 75% por 1 mL de reagente Trizol), estocar por 10-20 minutos entre 15 e 30ºC (com

agitação periódica) e centrifugar a 2.000 xg por 5 minutos entre 2 a 8ºC.

Uma lavagem adicional em solução de citrato de sódio a 0,1 M (em etanol 10%) é requerida

para grandes pellets contendo 200g de DNA ou grandes quantidades de material que não

DNA.

3. REDISSOLVENDO O DNA

Secar o DNA ao ar de 5 a 15 minutos em tubo aberto. (Não secar em centrífuga; isso fará ficar

mais difícil para dissolver).

Dissolver o DNA em NaOH 8 mM de modo que esta concentração de DNA seja 0,2- 0,3 g/L.

Tipicamente, adicionar 300-600 L de NaOH 8 mM para DNA isolado de 107 células ou 50-70

mg de tecido.

Ressuspendendo em base fraca é ALTAMENTE recomendável desde que o isolado de DNA não

ressuspenda bem em água ou em Tris.

O pH de NaOH 8 mM é apenas 9 e deveria ser facilmente ajustado com TE ou HEPES uma vez

que o DNA está na solução. Para este estágio, a preparação de DNA (especialmente de tecidos)

pode conter material gel insolúvel (fragmentos de membranas, etc.). Remover o material

insolúvel por centrifugação de >12.000 xg por 10 minutos.

Transferir o sobrenadante contendo o DNA para um novo tubo.

O DNA solubilizado em NaOH 8 mM pode ser estocado toda noite a 4ºC; para períodos

prolongados, amostras podem ser ajustadas com HEPES para pH 7-8 e suplementados com 1

mM de EDTA. Uma vez que o DNA é ajustado, pode ser estocado a 4º C ou -20ºC.

Guia de Solução de ProblemasISOLAMENTO DE DNA

* Razão A260/280 < 1.70

Amostra de DNA foi diluída em água ao invés de TE primariamente para analise

espectrofotômetra.

O fenol não foi suficientemente removido da preparação de DNA. Lavar

o pellet de DNA uma vez adicional com citrato de sódio 0,1 M em 10% de

etanol.

ISOLAMENTO DE PROTEÍNAS USANDO O

MÉTODO TRIZOL

Proteínas são isoladas a partir do sobrenadante fenol-etanol obtidos

depois da precipitação de DNA com etanol. A preparação resultante

pode ser analisada pela presença de proteínas específicas por Western

Blotting.

Reagentes para a técnica:

Álcool isopropílico

Cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol

SDS 1%

1. PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNA

Precipitar proteínas a partir do sobrenadante etanol-fenol

(aproximadamente 0,8 mL por 1 mL de reagente Trizol) com álcool

isopropílico.

Adicionar 1,5 mL de isopropanol para 1 mL de reagente Trizol usado para

iniciar a homogeneização. Estocar amostras por 10 min entre 15 e 30ºC e

sedimentar as proteínas precipitadas a 12.000 xg por 10 min entre 2 e

8ºC.

2. LAVAGEM DE PROTEÍNAS

Remover o sobrenadante e lavar o pellet de proteína 3 vezes em solução contendo 0,3 M de

cloreto de Guanidina em 95% de etanol.

Adicionar 2 mL de solução de lavagem por 1 mL de reagente Trizol usado

para a homogeneização inicial.

Durante cada ciclo de lavagem estocar os pellets de proteína na solução de lavagem por 20

min entre 15 e 30ºC e centrifugar a 7.500 xg por 5 min entre 2 e 8ºC. Depois da lavagem final,

misturar 2 mL de etanol ao pellet de proteína em vórtex.

Estocar o pellet de proteína em etanol por 20 min entre 15 e 30ºC e centrifugar a 7.500 xg por

5 min entre 2 e 8ºC.

3. REDISSOLVENDO O PELLET DE PROTEÍNA

Secar o pellet de proteína a vácuo por 5-10 min.

Dissolver isto em SDS 1% com pipetagem.

Completar a dissolução do pellet de proteína pode requerer incubação da amostra a 50ºc.

Sedimentar qualquer material insolúvel por centrifugação a 10.000 xg por 10 min entre 2 e 8ºC

e transferir o sobrenadante para um tubo novo.

A amostra é lida usando Western Blotting ou pode ser estocada entre -5 e -20ºC para uso

futuro.

Notas para isolamento de proteínas:

1. Os pellets de proteína suspensos em cloreto de Guanidina 0,3 M em 95% de etanol ou

em etanol podem ser estocadas por no máximo um mês entre 2 e 8ºC ou por no

máximo um ano entre -5 e -20ºC.

2. O seguinte protocolo é uma alternativa aproximada que permite uma mais eficiente

recuperação de proteínas.

Dialisar o sobrenadante fenol-etanol contra três trocas de SDS1% entre 2 e 8ºC.

Centrifugar o material dialisado a 10.000 xg por 10 min.

Usar o sobrenadante limpo para Western Blotting.

1. Proteínas podem ser quantificadas pelo método Bradford já que a

concentração de SDS é o suficientemente baixa (<0,1%), então isto

não irá interferir. Métodos que não têm problemas de detergente-

interfase e que não são confiados em leituras a A260/A280 podem

ser usados (traços de fenol podem causar superestimação na

concentração de proteínas).

MÉTODO PARA EXTRAÇÃO DE DNA DE CÉLULAS

EUCARIÓTICAS

Preparação de DNA de células eucarióticas (Sambrook&Russel, 2001).

Método adequado para Southern Blot e para construção de banco genômico por obter um

DNA genômico de alta qualidade de elevada massa molecular.

Soluções e material

TBS

Tris-HCl 20mM; pH7.4

NaCl 150mM

Proteinase K

Tampão de extração

Tris HCl 10 mM ; pH 8.0

EDTA 0,1M

SDS 0,5%

RNAse a 20 g/mL

Dissolvida em tampão acetato de sódio 50 mM; pH 4.8 e fervida em banho-maria por vinte

minutos para eliminar qualquer DNAse contaminante. Conservar em eppendorf de 1,5 mL a -

20ºC.

Fenol equilibrado

1 volume de fenol

1 volume de Tris 1M

B-Hidroxiquinolina 0,1% (p/v)

B-Meracaptoetanol 0,2% (p/v)

Solução equilibrada com Tris-HCl 100mM; pH8.0; EDTA 1mM; NaCl

200mM

Etanol absoluto

Etanol 70% (v/v)

TE

Tris-HCl 10mM; pH8.0

EDTA 1mM; pH 8.0

Solução de ácido cítrico / glicose

Ácido cítrico 0,48 g

Citrato de sódio 1,32 g

Glicose 1,47 g

Água destilada q.s.p. 100 mL

Materiais: Incubadora com agitação, tubos de vidro e plástico, centrífuga, bastão de vidro em

forma de gancho.

Método

1. Usar 0,5 mL de TBS para raspar as células da placa de cultura

2. Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga e colocar no gelo

3. Lavar a placa 1x com 1 mL de TBS e juntar a primeira suspensão (pode ser utilizado 0,5 g de

tecido mole)

4. Centrifugar a 1500xg/10 min a 4ºC. Ressuspender as células em 5 a 10 volumes de TBS

gelado e repetir a centrifugação.

5. Transferir a solução para um enlermeyer (para uma suspensão de 1 mL de células, usar

frasco de 50 mL) e adicionar 10 mL de tampão de extração para cada 1 mL de suspensão de

células

6. Incubar a 37ºC por 1 hora

7. Adicionar proteinase K para uma concentração final de 100g/mL. Misturar lentamente com

um bastão de vidro

8. Incubar a 50ºC por 3 horas

9. Resfriar a temperatura ambiente

10. Transferir as células para um tubo de centrífuga e adicionar igual

volume de fenol equilibrado. Misturar lentamente.

11. Centrifugar a 5000xg/15 min à temperatura ambiente

12. Transferir a fase aquosa para um tubo limpo e repetir a extração mais duas vezes.

13. Para se obter DNA de alta massa molecular (= 200Kb), depois da 3ª

extração com fenol, dialisar a fase aquosa a 4ºC contra 4 litros de uma

solução de Tris-HCl 50mM; pH8.0; EDTA 10mM até que a A270 do

dialisado esteja menor que 0,05.

14. Para isolar DNA com tamanho entre 100 e 150 Kb, transferir a fase aquosa final para um

tubo de centrífuga novo e adicionar 0,2 volumes de etanol e, usando um bastão de vidro,

enrolar o DNA. Se o DNA precipitado tornar-se fragmentado, coletar por centrifugação a

5000 xg/5min à temperatura ambiente. Lavar o DNA com etanol 70%.

15. Secar e ressuspender o DNA em 1 mL de TE para cada 5x106 células. Deixar o DNA

dissolvendo na geladeira (4ºC) durante a noite.

16. Estimar a concentração por espectrofotometria a 260nm ou usar 1/10 do volume final para

análise em gel de agarose.

Preparação de DNA de tecidos

Mesmo protocolo a partir do item 7 . Congelar o tecido em nitrogênio líquido e pulverizar

usando cadinho. Deixar o nitrogênio evaporar e adicionar ao tecido aproximadamente 10

volumes de tampão de extração e transferir a suspensão para um tubo de centrífuga. Em

seguida iniciar passo 7.

Obs: Ao trabalhar com DNA cromossomal usar pipetas de grosso calibre ou cortar as

pontas das pequenas, pois o pequeno diâmetro pode causar quebra mecânica do DNA.

A estimativa da concentração de DNA depende do tipo e quantidade de

amostra disponível. Para amostras com certo grau de pureza, com baixo

nível de contaminação por proteínas, fenóis, polissacarídeos, álcool, ou

outros ácidos nucléicos, a estimativa por espectrofotômetro, medida

pela absorbância das bases a 260 nm consiste num método simples,

rápido e com certa precisão.

Para quantificação de DNA, as leituras devem ser feitas entre 230 nm até 320 nm. A leitura a

A260nm permite o cálculo da concentração de ácidos nucléicos na amostra.

Uma DO (Densidade óptica) de l corresponde aproximadamente a 50 g ml-1 para DNA dupla

fita, 40 g ml-1 para DNA e RNA fita simples, e cerca de 20 g ml-1 para oligonucleotídeos.

*A relação entre A260nm e A280nm (DO260/DO280) fornece uma estimativa da

pureza dos ácidos nucléicos. Soluções puras de DNA e RNA possuem

valores de DO260/DO280 entre 1,8 e 2, respectivamente. Se existe

contaminação com fenol ou proteínas, a relação DO260/DO280 será muito

menor, e a precisão nas quantidades de ácidos nucléicos será baixa.