7
Quantitative versus morphological assessment of liver fibrosis: semi-quantitative scores are more robust than digital image fibrosis area estimation Wright M, Thursz M, Pullen R, Thomas H, Goldin R. Quantitative versus morphological assessment of liver ®brosis: semi-quantitative scores are more robust than digital image ®brosis area estimation. Liver International 2003: 23: 28±34. ß Blackwell Munksgaard, 2003 Abstract: Background/Aim: Digital image analysis (DIA) allows quantitative assessment of ®brosis on liver biopsy. Accurate determination of a threshold greyscale level representing ®brous tissue is critical. This method has not been fully evaluated in clinical practice. Methods: Digital images of stained liver biopsy sections were captured by microscopy and converted to greyscale. A novel method of determining the threshold greyscale value at which to measure ®brosis area was developed (peak proportion area change (PPAC)). Reproducibility was tested in comparison with standard interactive thresholding and with semi-quantitative scoring using the Histological activity index (HAI) system by a histopathologist. Fibrosis areas for different sections from the same biopsy core were also compared by each method. Results: Comparison between PPAC and interactive thresholding method demonstrated superior reproducibility of the PPAC method: r > 0.7, P < 0.001 compared with r 0.19±0.64 (not all reaching signi®cance). On a single section, reproducibility was similar for PPAC and the modi®ed HAI system. When different sections from the same core were compared, the HAI system was more robust. Conclusions: The PPAC method is superior to standard interactive thresholding. However, variability in DIA scores between sections invalidates the technique for clinical use and semi-quantitative scoring systems remain the gold standard for ®brosis assessment. Mark Wright, Mark Thursz, Rebecca Pullen, Howard Thomas and Robert Goldin Hepatology Section, Faculty of Medicine, Imperial College, London W2 1NY, UK Key words: digital image analysis ± fibrosis ± morphology ± reproducibility ± semi quantitative Dr Mark Wright, Department of Medicine, Imperial College of Science, Technology and Medicine, St Mary's Hospital (QEQM Wing), South Wharf Road, London W2 1NY, UK. Tel: 44(0) 207 886 1247. Fax: 44(0) 207 886 1931. e-mail: [email protected] Received 1 May 2002, accepted 5 August 2002 The progression of fibrosis and the possibility of its reversal in chronic hepatic disorders such as hepatitis C (HCV), are important concepts, par- ticularly in the context of therapeutic trials. The histological assessment of fibrosis, based on the use of semi-quantitative scoring systems such as the modified Histological activity index (HAI) system (1), is considered to be insensitive, arbi- trary and subjective. There is therefore a current vogue to use digital image analysis (DIA) as an alternative method of assessment. The aim of this work was to evaluate a standard and a novel method of DIA and to compare their robustness with conventional histopathology. Digital images represent a histopathological slide as a two-dimensional array of pixels. DIA allows quantitative assessment of fibrosis in a liver biopsy by using pixel counting to enable calcula- tion of fibrosis area. The technology has been available for over a decade and several studies (2±4) have explored its use in comparison or competition with established semi-quantitative methods to assess fibrosis in liver disease. Good correlations between image analysis and semi-quantitative scores have been reported in these studies. Potential advantages over semi- quantitative scores are that the digital image an- alysis method is truly quantitative, and that, smaller changes between biopsies may be detected than is possible with the relatively blunt semi- quantitative scores, allowing differences pre and post treatment to be measured more precisely. In Liver International 2003: 23: 28±34 Printed in Denmark. All rights reserved Copyright ß Blackwell Munksgaard 2003 Liver International ISSN 1478-3223 28

Quantitative versus morphological assessment of liver fibrosis: semi-quantitative scores are more robust than digital image fibrosis area estimation

Embed Size (px)

Citation preview

������������ ������ �� ��������������� � ����� ������������������������ ����� ��� �� ������ �� ������� ���� ������� ���� ��������

���� � �� � ���� �� ������ �� � �� �� ���� �! ������������ �������� ������ ��������� � ����� "������ ���������������� ����� ��� ������� � �� ������� ���� "����� ���� ��������!#���� $����������� %&&'� %'� %()'*! � +���,-��� ���,������� %&&'

��������� ������� �����.������ ���� ����/��� 0.$12 ���-� ��������������������� � "����� � ����� ����/! 1������� ����������� � � � ��� �����/����� ����� ������������ "���� ������ �� ��������! � ���� � �� �� ��������/ ��������� �� �������� ��������!����� �� .������ ����� � ������� ���������/ ������� -��� �������� �/ ������/ ��� �������� � ���/�����!1 ���� �� � � ���������� � � � ��� �� ���/����� ����� �� - �� ������� "����� ���� -�� �������� 0���, ������� ���� � ���� 0��1322!�������������/ -�� ������ �� ������� -�� �������� ������������ ��� ����� ��� -�� ���������������� ������ ����� � � �����������������/ ����4 0�1$2 �/��� �/ � ������ �����! 5������ ����� �� ���������������� �� � � ��� ����/ ��� -��� ��� ������ �/ ��� �� �!�������� 3������ ���-��� ��13 ��� ����������� � ��� ����� �� ����������� ������� �������������/ � � � ��13 �� �� �� &!6��� &!&&7 ������ -�� �� &!78)&!9* 0�� ��� ���� ��� �����"�����2! :�� ������ ������� �������������/ -�� ������ �� ��13 ��� � � ��"�� �1$�/���!� �� ��������� ������� �� � � ��� ��� -��� ������� � � �1$�/��� -�� �� �����! ������������ � � ��13 �� � �� ������� ��������� ����������� � ��� �����! �-����� ����������/ �� .$1 ��������-��� ������� ����������� � � ��� ����� �� �������� ��� ������������������� ������ �/���� ����� � � ��� �������� �� "��������������!

���� ����� ���� ���� � ������������� ������ ����� ��� �����������

��������� ����� � ������ �� ������ ��

�������� �������� �� �� �� ���� ��

�� ���!" ������� ����� � ��!�! # ��$��!�! #

����%���� # ���������$���� # !���

&�� ������'�

(� ���) ����%�� (������� � �� ������ ��

�������� ������� �� ��� ��� *��% ���� � �

������ �� � ���+! ��!����� ,-.-� �� �/�

���% �%��� 0���� �� �� �� ���� ��1

*��"� 22,3/ �34 556 ��241��7"� 22,3/ �34 556 �89�1�:����" ���)1 ���%�;��1��1�)

0����'�� � �� �33��

�������� < =���!� �33�

� � ��������� � ������� ��� � � ���������/ ���� �������� �� � ���� ������ �������� ��� �� �������� 3 0�3;2� ��� ������� �������� ������������/ �� � � ����4� � � ��������� ������! � � ��������� ��������� � �������� ����� � � ���� � ���������������� ������ �/���� ��� ��� � ������ ���������� �������/ ����4 0�1$2�/��� 072� �� ��������� � �� ������������ ���������/ ��� ���<������! � ��� �� � ������ � ����������� � ��� ������� ���� ����/��� 0.$12 �� ������������� �� � � ���������! � � �� � � ��-�, -�� � �������� � �������� ��� � ������ � � .$1 ��� � ����� � ��� ���������-�� ���������� ������ ��/!.������ ����� ��������� � ������ ����������� �� � �-���������� ����/ � ��4���! .$1

���-� ������������ ��������� � ������� �� � ���������/ �/ ����� ��4�� ������� � ������ ����������� � ������� ����! � � ��� ���/ �� ������������� �� ��� � ������ ��� ������� �������0%)*2 ��� �4����� ��� ��� �� ������� ��������� -�� �������� �� ������������������ �� � ������ ������� �� ����� �������! ����������� ���-��� ���� ����/��� ������������������� ����� ��� ���� ������� ��� ��� �������! �������� ���������� ��� ���������������� ����� ��� � �� � � ������� ���� �����/��� �� � �� ����/ ������������� ��� � ��������� � ����� ���-��� ������� �/ �� ��������� �� �� ������� -�� � � ���������/ ����� ���������������� ������ ���-��� ����������� ��� ������ �������� � �� ������� �� ��������/! $�

����� ������������� ����� ��� �� �!

������ �� "�����# ��� ����� �������

��$%���� � ����&��� ������� ����

#���� $������������''( )!*�+����

��

�������� ��������� ��� ������ ��� �� � �� ��������� ������ � �������� �� � �� ������� ��������� ��� � ������ �� ���4���� ����������� �����/���!� � ����������� ����� ������� � �� ����� ��� � ��������� ������� � �������� 0=2! 3�������$� $$ ��� $$$ ��� ������� ��� �� ������/���� 092!$���� � ������� ������ �/ � �� �� ������������ � ���� ����� ����� �� � � ������������� � ������� ��� �������� �� ������� ���� �� ������!� �� � � �������� ���� ���� �� �������� ����/����� � ��� �� � ��� �� � ��� �� � ����������������/� ���� - �� ���������� �������� ��������������� ��� ���- - �� �� ������������������! � ��� ����� �� � � ���������� � ���/������ ����� �������� �������� ��� �����/ ��-�� ����, ������������ � � ���� � �������� 0� �������� ������� ������2 ��� - ��� � � ���,�����0����/� ��� ����2! 3����� ������ � ��� � ������ � ��������� � � ������� � ������� �������� �� � � ����/! 1������� ��� ���������������������� � � � ��� �� ���/����� ����� ������������� ������ ������ �� ��������! ������� ������� �/ � �� ����� 0%� '2 �� ���� >�����������? � ��� ������ �� - �� � � ������ ��<���� � � � ��� ���/ �/� ����� � � ��������� �����/ ���� ���������-�� - �� �� ���� � � � �����������/ �������������! 1�� �� ������� ����������� �� ���� �������� � �������������/� � �� �� � �� ����,��/ ��� ��������� �� �� ������ � ��� �� ���� ������ �� ���������� � ��� ��! $� �� ���/���<������� ���������/ -�� ����4 ����� ��� �� ����� �������! �������� ��� ��-�,��� 0*2�������/ ���������� � � ������/ � � ������������ ������ �� � ����������/ ���������� � � ��� �� ��� � �4����� ����� � �������� ������/���! � ��� ����� �� � �� -�, -�� ����� �� � ���������� � @������ �4�� ��,��� ��� � 062! �� ����� � ������ �/��� ������ ����� � � - �� ����!�� ������� ��� � ����� �<������ �� � �� ��� �� �����������! �������������/ � � ��� � �� ���������� �� ������� �� � ���� ����������� � ��� ����� ��� ���������������� �����! A����� � ����������/ �� � �������� �������� ������ ��� �4����� ��� � ������������ �� �������� ������/ � ��� �� ����������!

�����

*�!!�� !��� � �

� ���/ ����� ����/ ������� -��� �������� ������ �� � �������� � '&& �������� ���������� � �������/ �������� -�� � � �������� 3����� ��� -��� ������� -�� ����������� ���! B��

����/ -�� ����� ����� � � ������ �1$ 0$� �,2�/��� 072� �� ������� � ������� ���� ��������-�� ������� ���� ����/���! � � ������ �1$�/��� 0$� �,2 ���� � 6����� ����� �� ������������ 0&)92!

����� �������

$��� ���������� -�� �/ ���� ����� ����� ��� � ��� � ������� 0:�/��� +C=&2! �� ���� �'33. ����� 0A�/ .C3�'8&B '33. � +!� � ����� �� � � ����� �� ���� 0�������2��� -�� �������� � ������� �/ � 3�A68& �1#���� ������� ������ 0A��� 3��!� �.%76&7�DA12! � �� ���� � ������� ����� - �� -�� ��������� ����� � .��� .������� 4�A�9&& �������������! �� ���� >A��� $���? ���-��� 0A���3��!2 �� ��� -�, ��������� ���!� � ����� -�� ����-���� �� ���� � ������� ���,����� >����? ��� � � ����� �� �����������! �������/ -�� ������� ����� �� ������� ���������� ��� � ����� ������ ������ �� ���� ������� � � ��������� � � �� �<���� �� ������������/ ������� �/ � � ����������� ��� -�� �� ��������� � � �������� � � � ������� �����! $���� �� � ������ ������� �� ����/ -��� ������� ����������� � ���/�����! 1 ��������� ���/��������,����� ���� -�� ���������� �� ��� ������ ������ ���� � ������ �� ��/ ������������� ����������! � � ���� ���� � ������ 0����� ���4���2 -�� ���������� ����� � ��� ����� �� ���/����� �� 0��� ��������� ����� � � � ����� ��������� � ��� ����� ���������� � � � ���,������2! � � ��4�� ���� �� � � � ��� �� ���/����� 0��������� �/ �� � � � �� �� ���-2-�� � ��������� ��� ������� �/ � � ���� ���� ������ � ��������� � � ������� � ������ �������������� � � � �����! $��� ������� -�� �������� �� � *& 0�-2 ����������� 0���-��� � �- �� ����� � �� �������� �� � ������ ����2 ��� ��� *&& 0 �� 2 ������������! 1� �� ������������� ��� - �� �- ����������� ����� ��� ���������/ ��� �� � ������ �������� ����� � � ������-�� �������� -�� ��� ����� ����� � � ������ �������� ���� �� ���� ������! 3��� -�� ��,�� �� ������� ����� � � ����� ����!

*%��!%���� �" ���) ��������� ���� �%� �� ,>>=�/���%��

3�������� ������ �� �����������/ ������� ��� �� ���������� ����������� � �������� ��������/ � � ������������� �������! � � �������� �� ���-���� � ���/����� ����� ��� ��4�� ���� ����������� � ��������� ���-��� ��������� ��� ������������ ������! � � ����� � � � ���/����� ��� � ���� - ��� � �� ����� ���������� � � � ��� ��� �� - �� ������� ���������� �� �������!

��

���� ��� �������

1 ����������� � �������� ��������/ -�� �4���� ���� �� � � � ��� �� ����� �� ������� �� � ������ �� ��������! $� ��������� � � ������ � ������������ -�� �� � � ���� ��� �� ������/ ��������� �� ������ 05��! 71 ��� +2! � � � ���� �� �������-��� ��4�� ����� �� ���������� ���/ ������ ����� ������� �/ � � ��4�� ���� �� � � ��������������/ ����� � ���� � ������� ���� � ����! � �������� �� � ����� � �� ����� �- ���,�! � � ��������, ���������� � � ������� ���� � ���� �������� �� � ���� �������� �����! � � ���/ ����� �� � ������� ���,� - �� ���� �� � ��� ��� ����� �����������/ ��������� �������� -�� >�/ �/�? ��������� � ������ ������ �������� 05��! %2! � ���� ��� �������� �������� � �� � � >���, �������1��� 3 ���� 0��132? �� �! � � ��13�� �-�� � ������ ������ -�� � � ��������>$����������? � ��� ����� �� ��������� ����- ���0%)*2! +�����/� ����������� � ��� ����� �������� � ��� ��� ������ �� ���� ���������� ���������� �� � �� � � ������ ������/ � ��� � �� ��� �� ����� � >�/ �/�? �������� � ������������ ��������!

����!����� ���%��!

�������������/ � � � �������� ��������� �������� �� ������� ���� ����/��� -�� ������������� ������ ���������� �������� ������������ ��� � � ����������� ��������� ����������!

� � ����������� ��������� ���������� �� � ����������� � � � ,���� ���� ������� � ��������� ���������! � � ������� ����������� ���������� ������� �� � � �1$ -��� ������ �����-��� ��� ,���� �����!

�������!� �� %��% � � �� ��� �?����� �����!� ��!�� $ $��% � �������'� � � >>=� ���%��!

$���������� ��� ��13 � ��� ����� -��� ������� ��� �� � *& 0�-2 ��� � *&& 0 �� 2 ������������! 1� ��������� � �����������/ -����������! �������������/ -�� �������� �/ ��������� ������� ������ ����������� ������������������� ��� ��������� � �������� ���� �������� ��� ������� ���� �������� 0* ���� -�� '&�������2 �� ��� �� �! � � ��� ������������� -��� ���� �� �� � ��� ����� �� ��!$� �� �� �� -��� ������� -� -��� �4������������� ������� �� � ����� ����������� ���-����� �� ��� ��������� ���, ����- �� ������������������ �� � ����� �� �! ����� �� ������ ��� A������ ���, ���������� -���������� �� 0����� 72! A��������� -��� ������������ A�AA�!

0��������$���� �� !���:&�� ������'� !����!

� � '& ������ ���� ���� -��� ����� ��� �������� �/ �- ������ ������ -�� � �������

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

9000

Series1

Threshold

Grey level

Pix

el c

ount

Unstained tissue Stained tissue

(A)

(B)

1 7 13 19 25 31 37 43 49 55 61 67 73

,�# )# 012 � �������� ��������������� ���� � � ��� ����� �� �7&&E �����"� �����!0+2 ���� ���� ������� � ���/ ������ ������� ������������� � � ���"����/ ��������� �� ��� �� �����!

��

����� �� ���

�������� �� ����� ������� ����� � � ������ �1$���������������� ������ �/��� 072 ��� ������������� �/ -��� ��� ,���� ���������� 0���5��! '12!

@������� ��%� $���! ����!

$� �� �� ������� �� �����/ � ����������/ � ��,�������� ���� �� � ������ �������! �� ���

����� � �� � � ��� � ������ ��,�� �� ����� ����/�� �������������� � � � - �� ����� ��� � ���������� ������� �� � � ��� ��� -��� /���� � ���� ���������! $� ���� � ������ �� �- ���������� ������ � ����������/ ����/ �������� ���������/ ��� � ��,���� � ������ �������� � � �����������/ ���� � � � '& ������ -��� ��������� ������� ������� ��� ��� ������� �� ��������� ����!� ��� ������ -��� �������� �/ ���������� ������� ��/ ��� .$1 ��� ������ -�� � � �������� ������� 0��� 5��! '+2!

�� ��

=!!�!!�� � �� >>=� �%��!%���� � ���%��" ������� !%��$�� �� >>=� � � ����'�� ?$��!�! ����

� � ��13�� � ����� � ����� ���, �� � � ��� ������� �� �� ��������-�� ���<������ � ��� ������ � � � ���� 0��� 5��! %2! � �� -��� ���/ � ��������� ��� �������������/ � ��� ���-! $�� � �� �-�� ������� �� �����-�� �������/ ������������ ������ ��� �� � �� �� ���� ���������� � � ��� � � � � 7�� ���, �� ����! � ���������� ��������, �� ���,�� �� ������ �������)��������/ ��� � �����/ �� ���������!�-����� ��� � - �� ����/ �� �4����� �� � *& ������������� ����������� � � � ������ ������ ������� � �7�� ���, ���-��� �� �<������ ��������� �� ��� �� � �� ��� ��� �������� �� ���� ���� �������� -�� � � ������ ���������!

Proportion area change

0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0 20 40 60 80 100 120Grey scale Threshold 23

,�# �# � ��� ����� ����� ������� ���� ����/���!

*�$�� �$1 ���������� ! $�� �� ��$��!�! ����! ����'�� $ �!� � � ���:����'� � � ���) ��������� ���� �%� �� �%��!%���� � ���%��! ��� � 23� � � 233 ��� �������� !

�������!� >���!� ����������

�� ��� �������� �* ������ >>=� �� 314�6� �� 3133�

���% ��� �������� �* ������ >>=� �� 316<4� �� 3133�

>>=�� ���) ��������� ���� �%� �� ���%��A �*� � �������'� �%��!%:���� � ���%��1

*�$�� ��1 ���������� ! $�� �� ��$��!�! ����! �� �� ,� 23/ � � %��%,� 233/ ��� �������� ! ��� � �������'� ,�*/ � � ���) ��������� �����%� �� ,>>=�/ �%��!%���� � ���%��!

�������!� ������ �� ) ����������

>>=��� ������ %��% ��� �������� �� 31662� �� 3133�

�*�� ������ %��% ��� �������� �� 31<59� �� 3133�

���� ��� �������

��

�������!� �� %��% � � �� ��� �?����� �����!� ��!�� $ $��% � �������'� � � >>=� ���%��!

� ��� �� ������� ��������� ���-��� �� �� ��� � �- ����������� ����� 0�� &!6%9 0� *&�����������2 ������ �� &!9=6 0�*&& ������������22! � ��� �� ������� ���, ��������� ���-���������� ����� � �� ��� �- ���������������� - �� � � � ��� �� �� ��������� �/��13 � �� �/ ����������� � ��� ����� 0$�20�� &!99* ������ �� &!=('2 0��� ����� 7� ��� 7�2!+��-��� 7& ��� '& ����� ���� � �� ��,�� ������� � � ����/ �� �� ����������� ������� -�� ��/ 7 � % �� � � �- ��������������� �������! B�� ���� �, ����4�����/=�� � ������� ������ � �� �� �� ������������� ������� �, �� � �- ��� � ��� ��� �������!1� �- ������������ � � ��13 �� � -�� �� �/ ��������� -�� � � ������ �1$ ���������������� ������� ���� 0�� &!9%7� �� &!&&&%2!����� % � -� � � ����������� � $� �, ������������ �� �� �����!

0��������$���� ,� ��� �$!��'�� �����/

5� � � ��13 �� � ���������� � �� &!6��� &!&&7 -��� ������� ���-��� ��� ����������������� ��� � ����������� ���������� -��������� -�� �������� ������� �����0�� &!6'2 $���������� ��������� ���������� -��&!(= 0��� ����� '�2!5� ����������� � ��� ����� ������� -��� ���� ���������� -�� ���������� 0�� &!78)&!9*2 �� ������� ��� ������������� �������� ������� �����0�� &!&(2! � � ����������� ��������� ����������-�� &!*9 0����� '�2!

0��������$���� �� !���:&�� ������'� � � ������� ������ ��!�! !���� � !!���!

A��������������� ��� .$1 �/���� ��� �������� � ��� �������������/ �� ����� ��� ����� ������������ ��� ���-��� ������ ������� �� � � ������ ������� *! +� �� �� � -�� ����� �������� ������� ��������� 0�� &!((8 ��� �� &!('6�� .$1� �� &!(6( ��� �� &!669 �� � � �������1$ ���������������� ������ �/���2! �-�����- �� ��������� ������� �� � � ��� ����/ ������ �4����� ������ � ��������� ����� �����������/�� .$1 0�� &!' ������ �� &!9*8 �� $� �,2!

Operator 1

(A)

Operator 2

Score 1 (1)Ishak

Score 2 (1)Ishak

Score 1(2)Ishak

Single core

Cut and stain 1

(B)

Cut and stain 2

Score 1(1)DIA /Ishak

Score 2 (1)DIA /Ishak

Score 1(2)DIA /Ishak

Single core

,�# �# 012 $���� ��� $���� ������� �������������/� ����������-��� ���������������� ������ ��/ ����� 0$� �,2! 0+2$���� ������� �������������/ � ��������� ������ ������� ��� � ��� ����/ ���� ������� ���-��� ���������������� ������ ��/ ���� 0$� �,2 ��� ������� ���� ����/��� 0.$12!

*�$�� �1 �!%�) ��$��!�! !����! ��� �%� $���!��! �!�� � ����� � ��!�!

�!%�) ��$��!�! !���� ���&�� �

3 �� 6� 69 42 2< �6 9

*�$�� 9�1 >��) ��������� ���� �%� ��" �������� ���!����� �! � �%�!��� !����� ! # >���!� ���������� ��������� �!

���!��� � � 9 2

� � 314� 3148 318�� � 3182 31529 � 31582 �

�� 931 =�� ���������� ! !�� ����� � �� �� 3133�,� ������/1

*�$�� 9$1 � �������'� �%��!%���� �" �������� ���!����� �! � �%� !���!����� ! # >���!� ���������� ��������� �!

���!��� � � 9 2

� � 31�9� 31693BB 3162�BB� � 31�82 319<2B9 � 319<2B2 �

BB�� 313�A B313�� �� 313< ,� ������/1

����� �� ���

��

�� �� ���

�� ��� ��������� � ���� �� � � ����������� � � ��� �� �� - �� � ������ ������� ���������� ������� ���� ����/��� � ����� ����/�������! � � >���, ������� 1��� 3 ����0��132? �� �� ��������� ���� �� ����������� ��� �� �� ���� ����/��� � ����� ������� �� ���<������� ������������ ����� ��� ��������� � � �������� ����������� � ��� �����!$� ���� � �����������/� ���� ����/��� �� �-������������� ����� ������� �������������/���������� -��� -�� ��� �� ����������� ����������� ��� �� 7&)%& ��� ������! D���� � � �-0- �� ����/ �� �� ����2 ����������� ��������� �������� ����������� ���� ��� � ������������ �/ ���� ���-��� ����� ��� ������������ ��� � ������ ��� �� ����! :� �����, �������� ������� - �� ��� �� ������� ��� �� ������ ��� ���- � � ����� � �������� �� �-����������� ��� � ������ � �� ������/ �������� � ������� ������� ����! D���� ������� ������������ ������/ ��������� � � ����� � ����� ��� �������� ��� �� ��/ �� %&)'& ����� �/���� � �� �������� �� � ������ ����/ - �� ���������� ��� � ��/� -�, ��� �� ����������!� � �������� ������������� � ����� - �� �������� ��� ��� � �������� ��� ��� � ���������������� ��� �� ������ ���������� ����� ������! � ������� ���� �� � ���� ���� �� � � ��� ����� ������ � �� �� ��<���� ��� �� � �� � ������������ �������� ������ ��/!�� ��� �/����������/ ���������.$1 ������ ������ ���������������� ����� �� ����� �������� ������� ����������/ ��� �� ������ ��� ������������ ����������/ ��� ��� ���������� � ��� ����<� ������! �� ��� �� ��� ��� - ���������� � � ��������� � ������� �� � ��������/�� ��������� ������ �� � �� - �� � � �������� ����/ ��� �� � ���� �� ������ ��,�� ��� ��������� ���������/ � ��� �� ���/ �� ������������-��� � � �- ������� 0�� &!'� �� ��2 �� .$10��� � � ������ �4���� �� ���������� ������� ��/ � �� � � ������ �� �� �����2! $�

���� �� ������ � �� � � �������������� ���������/ ����� � �������� ��� ������ �� �� ����� ���! �-����� -� ��� ���������� � �� � ���������/��� ��������� � ������ ���������� ������ � ����������/� - �� ����� �� �����/����������! 3�����/ �� � ��� �� � �� �� ����������/�� � � ��� ��� � ������ � �� �� �� ����,��/� �� ��/ ������ �������� -��� �� ������� �/������� ��������� ���� � ������ ��,�� ����������� ����!� � �� ��������� ���-��� ��������� ����������� �� �4������� �� � ��� -�/�� �������� ���������� ��������/� �������� �� ������ � ��,������� ���� �������� �� � � ���� � ��������������� -�� �� � � ������! � � � ��� ����� �/���� ��� ��,� ������ � ��� ��������� �� � ������� � ��,���� � �������� ��������/� ��� ������������� - �� -��� �� ������� � � � ��������/�� ��� �� ����! $� �� � ������ �� ��,��/ � ��� � ���� � ��������� ������ �� � ����/ ���������-��� ������� ��� � � � ��������� ������ ��- �� ���������� ��� �� ����� ������ ��� ���!1 ������������/ ��� ����� ����� �/ ����/ �������� ���� �� ���� �� � ������ � ��� �� ��� �������! � �� -��� ������ � � ���� � ��������������� �/ .$1 ��� �� � � ������� ����! ���� ������ ��������� ��� �� � � ������ �1$ ������������� � � � �������� �������� �������� �/ ��,� ��� ������ � ����� �� ��� ����������� �� <��� � � ���� � ������� �������� ��� � ������! $� �������� � ������� ������ ���������� �� ������ �������� �� ���� � ����� ���������� �������� ������ ��� � �������� �� ���������� ����������� � ��������! ������/ ���� ��������� ���� ����/��� ������� � ����� �- ��������� 0*2 ��� ���� � � �������� ������ �������� ��� ������ � ��,���� ������������/� ��� � ��� � ��� �-�� ������ �� �����������-��� ��������� ������� �� � � ��� ���!1�� �� ��/ �� ��<����� � � ���, � ��������������/ �� .$1 ��������� � �� ��� ���������� �����,���! $� � � ������� ������� ��������� �/ ���������� �/ ��������� ���������� � � � - ������� ��� �� ��� ������ ��������� �������

*�$�� 21 0��������$���� �� !���:&�� ������'� � � ������� ����� � ��!�! !���� � !!���!

C$!��'�� � ������*�!!�� !����� �

C$!��'�� �*�!!�� !����� �

C$!��'�� �*�!!�� !����� �

C$!��'�� � �� 31558� �� 3133� �� 31594� �� 3133� �� 31933� �� 3162*�!!�� !����� � ���� 31545 ���� 31595 ���� 31�58(�=

C$!��'�� � �� 31545� �� 3133� �� 31446� �� 3133� �� 31628� �� 3133�*�!!�� !����� � ��� 3154 ��� 315� ��� 314�!%�)

���� � ��� ���!! ���������� ��������� �A ��� ���%��� )����1

���� ��� �������

��

������ 0(2 ��� ��������� � ����� ��������- �� ���� ��������� ���������!�� ������� � �� �� ������ ��������� ����������� ����� � � ��� �������� �� ��������������������!

���������

7! $���� @� +���� 1� +���� #� �� ��! ���������� ���������� ������� � � ���� ��������! F ������ 788=G %%� 989)8!

%! @�� �� A������ @� H������� B� @������ $��� :�I����! #������ ������� � ������� �� � ���� ��������� � ���� ��� �� �������� -�� �������� 3! ��� �����

����/��� � �������� �������! �������/ 7886G %=� 7&%()'7!

'! �� 3� ����� � � 3� + ����� �� �� ��! ������� ������� ��������� � ����� �������� ������������ ���� ����/���

��! ���������������� �����! 3������ -�� ����

��,���! F ������ 788(G %(� *'8)*9!

*! ���� ����� 3����� �� �� :?;��� 5� . ������ � ��� � ���� ��1�. ������� !1������ �������������� ����� �������� ������ ��� ��������� � � ��- ���� ����/���

�� �! 3������ -�� ���������������� ����4�� � �����

���! F ������ %&&&G '%� *=')9*!

=! ����� � �� � ���� A H� ������� 5 A! 1�� ������/��������� �� �������� ������������J 3 ����� ��� ���� ��

���� ������������! ����� �����/ 78((G ((� %*')=9!

9! F���� �� # 3� +� ��� � �! 1 ����� ��� ���������

�� � �� � � ������������ �������� � �������! 1��� +��

� � 7868G 8*� 89)8!

6! @��� �� :�� H� 1�� ���� � H! ��4�� ��,��� �

� ��� ����� ����� � �������� �4���� ����! �������

��������� 788%G %=� 7%'7)*&!

(! +���� � � F� 3��� F 3� D�� � B 3� �������� � F�

3������ . :! ���������� ������� ������� � ��- ��� �����������! +�F %&&7G '%%� 7%%%)=!

����� �� ���

��