Quelques rappels Modifications des anticorps …€¦ · Techniques pour l’amélioration de l’affinité Mutagenèse dirigée Nécessite: ... cellules B en usine à anticorps,

C.Sirac M2Immunotech 2011

Ingénierie moléculaire et cellulaire des anticorps monoclonaux thérapeutiques

- Quelques rappels - Modifications des anticorps - Systèmes d’expression mammifères - Modifications cellulaires - Systèmes de production


Différents fragments d’anticorps monoclonaux utilisés en thérapeutique

Rappels sur les anticorps recombinants

+ Protéines de fusion avec fragments Fc: Etanercept (TNFRc-Fc)



Hypermutations somatiques Site de fixation de l’antigène = CDR 1,2,3

VL VH

Ag

CDR1 CDR2 CDR3


Rappels sur les anticorps recombinants Rôle des différentes parties d’un anticorps

Chimerisation/humanisation


Les différents types d’anticorps recombinants monoclonaux

Induction HAMA (Human Anti-Murine

Antibody) Fréquent Induction HACA

(Human Anti-Chimeric Antibody) Plus rare

Non-immunogènes

Ac humanisé Ac humain



Modification des anticorps Chimérisation des anticorps

VHm

VLm

CHm

CLm

Obtention Hybridome

VHm

VLm

Amplification par PCR des régions variables chaînes lourdes et légères

Prom polyA

VHm CHh

Prom polyA

VLm CLh

1

2

3 Clonage dans un vecteur d’expression possédant les domaines constants humain

Prom polyA

VHm CHh

Prom polyA

VLm CLh

Ac de souris

Ac Chimérique

Transfection dans une lignée productrice

4


Optimisation des anticorps Humanisation

Exemple d’un anticorps humanisé: anti-CD52 (Campath ou Alemtuzumab)

-Conservation des séquences animales uniquement dans le site de liaison à l’antigène (CDRs): « CDR grafting » -Modification des AA exposés au solvants: « Resurfacing »

FR1 CDR1 FR2 CDR2 FR3 CDR3 FR4 Rat EVKLLESGGGLVQPGGSMRLSCAGS GFTFTDFY MNWIRQPAGKAPEWLGF IRDKAKGYTT EYNPSVKGRFTISRDNTQNMLYLQMNTLRAEDTATYYC AREGHTAAPFDY WGQGVMVTVSS Campath QVQLQESGPGLVRPSQTLSLTCTVS GFTFTDFY MNWVRQPPGRGLEWIGF IRDKAKGYTT EYNPSVKGRVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYC AREGHTAAPFDY WGQGSLVTVSS


Optimisation des anticorps Humanisation

Banques de domaines variables humains Ex: Morphosys > 7 VL et 7 VH puis changement CDRs > 1,6x1010 possibilités

Phage display


Techniques pour l’amélioration de l’affinité Mutagenèse aléatoire

Optimisation des anticorps


Optimisation des anticorps Techniques pour l’amélioration de l’affinité

Mutagenèse aléatoire cellulaire

- Lignées cellulaires mutagènes (BL-2)

IgH

kappa

Induction d’hypermutations (Ag + PBL)

Test affinité anticorps muté

Vecteurs de transfections

BL2



Mutagenèse aléatoire

- Hybridomes - Phage display - Ribosome display - RNA display

Intégrée dans les systèmes de sélection d’un anticorps



Mutagenèse dirigée

Nécessite: Structure 3D

Permet: Alanine-scanning Mutagenèse combinatoire


Rappels sur les anticorps recombinants Rôle des différentes parties d’un anticorps

Chimerisation/humanisation


Optimisation des anticorps Optimisation des régions Fc: rôles sur les fonctions effectrices

Importance des interactions Fc/RcFc

Permet de déterminer les AA importants dans la fixation de

l’Ac sur le récepteur Fc

Mutagenèse aléatoire ou dirigée

Exemple d’une interaction avec le récepteur FcRn


Optimisation des anticorps Optimisation des régions Fc: rôles sur les fonctions effectrices

Mutagenèse dans la région Fc:

Amélioration de l’ADCC (Fixation sur RcFγIII + RcFγI) Amélioration de la CDC (Fixation à C1q)

Mais aussi: inhibition d’une fonction ex: Telixizumab (anti-CD3) IgG1 muté pour inhiber ADCC et CDC

Optimisation des régions Fc: rôles sur la pharmacocinétique

Amélioration de la demi-vie des anticorps par optimisation de la fixation au FcRn

PEGylation (ScFv)


Récepteurs Fc: activateurs et inhibiteurs

CD64 et CD16 (NK): Récepteurs Fc activateurs (ITAM), phagocytose ou cytotoxicité (ADCC) CD32: Récepteurs Fc inhibiteurs (ITIM), rôle dans ma régulation de la réponse immune

> Certains allotypes de CD16 fixent moins les IgG: diminution de l’ADCC NK


Récepteurs FcRn: Néonatal Fc récepteur

Rôle dans le transport des IgG de la mère vers l’enfant (placenta)

Exprimé par les cellules endothéliales et les macrophages: permet le recyclage des IgG après endocytose > augmentation de la ½ vie sérique des IgG


Vecteurs d’expression

HK416-31 10349 bp

DHFR

Light Chain

néo

Heavy Chain

intron

intron Amp

PolyA polyA

polyA polyA

promoteur

Promoteur/enhancer

Promoteur/enhancer

Promoteur

ScaI

Exemple d’un vecteur d’expression pour cellules mammifères


HK416-31 10349 bp

DHFR

Ckappa

néo

HC Gamma1 (CH1, 2, 3) Amp

PolyA polyA

polyA polyA

promoter

prom/enh promoter

Prom/enh

VH

VL

Vecteurs d’expression Vecteur générique d’Ac recombinant

Possibilité d’intégrer n’importe quel domaine variable



HK416-31 10349 bp

DHFR

LC

néo

HC

intron

intron Amp

PolyA polyA

polyA polyA

promoter

prom/enh promoter

Prom/enh

Promoteurs/Enhancers: hCMV, LTR RSV, pEF1α, Eµ/pVH, etc… Doivent être testés dans la lignée de production (parfois lignée-spécifique comme Eµ) Enhancers (contiennent des sites de fixations à des facteurs de transcription) peuvent être situés dans le promoteur ou séparément de celui-ci

Intron: Placé en amont ou dans le gène d’intérêt (jamais après le codon STOP: NMD), Stabilisation et exportation de l’ARN. Forte augmentation des taux de production

Gène d’intérêt: Séquence de Kozak (GCCGCC(A/G)CCATGG), éviter les séquences fortes en GC en amont du site d’initiation de la traduction, séquence leader optimale.

Site de polyadénylation: BGHpolyA, HGHpolyA, late SV40 polyA, polyA synthétique, etc… Comme pour promoteur, doit être testé dans la lignée de production choisie

Gène de sélection: Néo, Puro, Hygro, GPT, etc… Sert à sélectionner les clones ayant intégré le vecteur d’expression

Les incontournables



HK416-31 10349 bp

DHFR

LC

néo

HC

intron

intron Amp

PolyA polyA

polyA polyA

promoter

prom/enh promoter

Prom/enh Les « plus »

Gène d’amplification: DHFR (dihydrofolate reductase) ou GS (glutamine synthetase). Systèmes de sélection permettant l’amplification du nombre de copies du transgène en présence respectivement de MTX (méthotrexate) ou MSX (methionine sulfoximine)

Gène de sélection « diminué »: permet, en parallèle à des doses élevées d’antibiotiques, de cibler des sites à haute activité transcriptionnelle

IRES: expression bicistronique de deux gènes. Permet des taux d’expression équivalents de deux gènes


Modifications cellulaires Simplification et augmentation de la productivité

Lignées « taguées » dans un hot-spot de transcription

Transfection classique

H1

L1

GS FRT

FRT

Vecteur de

ciblage

Lignée d’expression

Clone fort producteur Ac n° 1

1

GS H1 L1

Site d’intégration

2

Lignée “taguée”

Transfection transitoire

Vecteur Flp ou Cre

FRT


Clone fort producteur Ac n° 2, …, n

Co-transfection avec vecteur Flp

3

L2

H2 GS

Vecteur d’expression

nouvel anticorps

GS H2 L2


Autre méthode: knock-in dans site connu (locus Ig par ex.)


Modifications cellulaires Augmentation de la productivité

Surexpression de protéines anti-apoptotiques (Bcl2, Bcl-XL) Diminution de l’expression de protéines apoptotiques par ARN interférence (Caspase3)

Inhibition du cycle cellulaire (expression de kinase inhibitrices du cycle cellulaire telles que p21CIP ou p27KIP)

Surexpression de protéines chaperones (BiP, HSP70)

Surexpression de facteurs de transcription (SRF, TFII-I, etc…)

Contrôle de l’apoptose

Contrôle de la croissance (biomasse)

Amélioration de la sécrétion

Amélioration de la transcription


Modifications cellulaires Augmentation de la productivité

Leçon de la nature: Mécanismes impliqués dans la transformation des cellules B en usine à anticorps, les plasmocytes

UPR: unfolded protein response

Blimp1 augmente expression Ig

Réponse UPR: XBP1s augmente capacités sécrétoires de la cellule

Application aux lignées productrices d’Ac: surexpression de XBP1s


Modifications cellulaires Optimisation de la glycosylation: rôle sur les fonctions effectrices

Surexpression de la GalTIII (beta 1,4 N-

acetylglucosaminyltransferase) : amélioration de l’ADCC

E/T=1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

mAb concentration (ng/ml)

% o

f lys

is

2 20 200 2000

CHO

YB2/0 Exemple d’ADCC dans CHO versus YB2/0: rôle du fucose

KO ou diminution par ARNi de Fut8: amélioration de l’ADCC (Lignées CHO Lec-13, YB2/0 ou KO Fut8)


Voir dia 18-21 KI ou hot-spots

Introns, polyA...

Xbp1s, optimisation codons…

Bip, Xbp1s, peptide leader, glycosyl transferases, choix lignée…

Résumé (non exhaustif !) des moyens permettant d’améliorer la production des anticorps (et protéines thérapeutiques en général)


Systèmes de production des anticorps thérapeutiques Lignées mammifères

CHO: Chinese Hamster Ovary 70% des anticorps du marché sont produits dans CHO -Bon taux de production, stabilité et connaissance du génome, adhérentes ou en suspension, adaptation aux milieux sans sérum, bien adaptées scale-up (fermenteurs)

NSO: Myélome murin non sécréteur d’Ig -Bon taux de production, peut servir à fusion avec cellules de souris humanisées, génome moins stable que CHO, uniquement en suspension, adaptation milieu sans sérum plus délicat

Sp2/0, YB2/0: hybridomes - Partenaires de fusion avec cellules de souris humanisées, problèmes de stabilité du génome (perte de chromosomes ou du transgène), adaptation sans sérum délicate, peu adaptés au scale-up

Autres lignées: BHK21 (hamster), Per.C6 (humaine), EBx (aviaire) Arrivent sur le marché en connaissant les défauts des autres lignées…


Systèmes de production des anticorps thérapeutiques Les autres systèmes de production

Bactéries Levures (glycoFi, Glycode) Cellules d’insectes Plantes et cellules végétales Animaux transgéniques (GTC Biotech/LFB)

Principales difficultés: glycosylations


Systèmes de production: Optimisation des milieux

Adapter le milieu à la lignée utilisée et au mode de culture (batch, fed-batch etc…)

Diminuer ou éliminer le sérum animal (réglementaire et purification)


T-flasks

Rollers

Systèmes de production


filtrat

Perfusion

Chemostat

Cuvée-alimentée (fedbatch)

Cuvée (batch)

Les types de fermenteurs



Systèmes de production Les fibres creuses (hollow fibers)


Bioréaction: les paramètres

• Température • pH (CO2, NaOH) • Composition du milieu

(Glutamine, Glucose) • Agitation • Aération (oxygène) • Asepsie



Exemple d’étapes nécessaires à la réalisation d’une Working Cell Bank (WCB)

Congélation MCB/WCB


Acide Folique Bases Puriques (Adénine, Guanine) + Thymidine

DHFR

MTX (méthotrexate) Blocage de l’enzyme

Acide Folique Bases Puriques (Adénine, Guanine) + Thymidine

DHFR

MTX (méthotrexate) Blocage insuffisant

Clone amplifié (x nombre de copies transgène)

Amplification par DHFR


NEO Prom Faible

Site à faible activité transcriptionnelle

Transcription de Neo insuffisante à forte dose de G418

Ciblage de sites à forte activité transcriptionnelle

polyA faible

NEO

Site à forte activité transcriptionnelle

Transcription de Neo suffisante même à forte dose de G418

Kozak non optimal

Documents

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