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RAFAEL SILVEIRA PORTO
CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
CAMPINAS
2015
ii
iii
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE QUÍMICA
RAFAEL SILVEIRA PORTO
CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS BIOATIVOS E
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
ORIENTADORA: PROFA. DRA. SUSANNE RATH
COORIENTADORA: DRA. SONIA CLAUDIA DO NASCIMENTO
DE QUEIROZ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA
AO INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA
ÁREA DE QUÍMICA ANALÍTICA.
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA
POR RAFAEL SILVEIRA PORTO, E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. SUSANNE RATH.
_______________________
Assinatura da Orientadora
CAMPINAS
2015
iv
vi
vii
“(...)Two roads diverged in a wood, and I—
I took the one less traveled by,
And that has made all the difference.”
The Road Not Taken – Robert Frost (1916)
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AGRADECIMENTOS
Primeiramente, ao meu pai, Eduardo, e à minha mãe, Ana Lucia, pelo apoio
incondicional e pelo incomensurável esforço em criar as melhores condições
possíveis para que eu pudesse chegar onde cheguei. A eles, devo tudo.
À professora Dr.ª Susanne Rath pela brilhante orientação, pela incansável
paciência e pela confiança em mim depositada. Não fosse seu imprescindível
auxílio, meu mestrado não teria nem sequer começado.
À Dr.ª Sonia Queiroz, coorientadora deste projeto, pela sua inabalável
empolgação com nossa pesquisa, combustível essencial para o sucesso dessa
empreitada.
Aos meus amigos Eduardo, Sabrina e Amilcar, que tão de perto
acompanharam minhas angústias e meus sucessos, sempre dispostos a ajudar no
que fosse preciso.
Aos meus amigos do laboratório, Fabrício e Andreza, que não pouparam
esforços para me auxiliar no projeto, oferecendo não só apoio técnico, mas também
muitas risadas.
À toda equipe do Laboratório de Bioanalítica Paracelsus, tanto do primeiro
quanto do segundo lote, pelo companheirismo e pelas boas horas que passamos
juntos.
À equipe da Embrapa Meio Ambiente, em especial à Drª Suikinai Nobre, ao
Dr. Daniel Terao e ao meu amigo Rodrigo Castanha, idealizadores dos ensaios
microbiológicos e apoio constante nessa área outrora desconhecida por mim.
À equipe do Laboratório de Síntese de Produtos Naturais e Fármacos,
especialmente ao prof. Dr. Fernando Coelho e ao Bruno. À equipe do Laboratório
de Cromatografia Gasosa, especialmente ao prof. Dr. Fábio Augusto e à Gaby. À
professora Dr.ª Regina Buffon e ao Renan. Agradeço pelo uso dos equipamentos
de seu laboratório e pela enorme prestatividade com que me auxiliaram nas
atividades.
Ao CNPq e à FAPESP pelo apoio financeiro.
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CURRICULUM VITAE
Currículo Lattes: http://lattes.cnpq.br/1886425603184398
DADOS PESSOAIS Nome: Rafael Silveira Porto Data de Nascimento: 06/01/1989 Estado Civil: solteiro E-mail: [email protected] Telefone: (19) 9-8197-5230
FORMAÇÃO ACADÊMICA
2013 – 2015 Mestrado em Química Analítica. IQ/UNICAMP, Campinas/SP,
Brasil
Título: Conyza canadensis: determinação de compostos, bioativos e avaliação da atividade antifúngica.
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
2007 – 2012 Bacharelado em Química (com atribuições tecnológicas).
IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil.
ATUAÇÃO PROFISSIONAL
2011 – 2012 DuPont do Brasil S/A. Paulínia/SP, Brasil.
Cargo: Estagiário (analista de laboratório)
2010 Iniciação Científica em Química Analítica. IQ/UNICAMP,
Campinas/SP, Brasil
Cargo: Bolsista SAE/UNICAMP
Projeto: Controle de qualidade de medicamentos de uso veterinário à base de penicilinas associadas a anestésicos e antimicrobianos
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
xii
2009-2010 Iniciação Científica em Química Analítica. IQ/UNICAMP,
Campinas/SP, Brasil
Cargo: Bolsista CNPq
Projeto: Controle de qualidade de medicamentos de uso veterinário: penicilina G e penicilina G procaína
Orientadora: Profa. Dra. Susanne Rath
2008-2009 Iniciação Científica em Físico-Química. IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil
Cargo: Bolsista CNPq
Projeto: Ataque ácido a argamassas de cimento com agente impermeabilizante PVAOH + silicato de sódio.
Orientadora: Profa. Dra. Ines Joekes (in memoriam)
MONITORIAS
2º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil
Disciplina: QA582 – Química Analítica Instrumental I
1º sem/2014 Programa de Estágio Docente (PED C). IQ/UNICAMP, Campinas/SP, Brasil
Disciplina: QA316 – Química Analítica III
APRESENTAÇÃO DE TRABALHO EM EVENTOS CIENTÍFICOS
05/2014 PORTO, R. S.; RATH, S.; QUEIROZ, S. C. N. Isolamento e caracterização de substâncias fungicidas da planta Conyza canandensis. In: 37ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química (RASBQ). Natal/RN, Brasil
xiii
RESUMO
CONYZA CANADENSIS: DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS
BIOATIVOS E AVALIÇÃO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA
O Brasil é um dos maiores produtores de frutas do mundo, no entanto, estima-se
que doenças pós-colheita possam gerar perdas de até 50% em sua produção. A
forma mais comum de tratamento para essas doenças envolve a aplicação de
fungicidas sintéticos. Contudo, nos últimos anos, a demanda por tratamentos
alternativos tem crescido, com destaque para o uso de biopesticidas, produtos
desenvolvidos a partir de plantas, microrganismos e insetos. Este trabalho teve
como objetivo investigar a presença dos compostos bioativos (4Z)-lachnophyllum
lactona, (4Z,8Z)-matricaria lactona e (2Z,8Z)-matricaria ester nos espécimes
brasileiros da planta Conyza canadensis, bem como avaliar a atividade antifúngica
dessas substâncias isoladas contra diversos fungos associados a doenças pós-
colheita de frutas. Por cromatografia flash preparativa foi possível isolar a
(4Z)-lachnophyllum lactona e a (4Z,8Z)-matricaria lactona a partir de extratos da
planta obtidos com diclorometano. Os compostos foram caracterizados por
GC-MS/MS, NMR 1H e 13C, 1H-1H COSY e 1H-13C HSQC. Foram realizados ensaios
de difusão em disco com 10 fungos filamentosos causadores de doenças pós-
colheita em frutas. Os fungos Aspergillus niger, Cladosporium spp. e Penicillium
digitatum se mostraram susceptíveis ao tratamento e, para eles, a concentração
mínima inibitória dos compostos variou de 32 a 64 µg mL-1. Também foi
desenvolvido um método de extração empregando água quente pressurizada, no
qual foram otimizados os parâmetros de temperatura (100 °C), tempo de ciclo
(1 min) e número de ciclos (quatro). Com essa técnica foi possível obter um
rendimento de 1,46 mg g-1 e 0,24 mg g-1 para a (4Z)-lachnophyllum lactona e a
(4Z,8Z)-matricaria lactona, respectivamente. O extrato aquoso da Conyza
canadensis pode ser aplicado diretamente nos frutos com a vantagem de não conter
resíduos de solventes orgânicos tóxicos.
xiv
xv
ABSTRACT
CONYZA CANADENSIS: DETERMINATION OF BIOACTIVE
COMPOUNDS AND EVALUATION OF ANTIFUNGAL ACTIVITY
Brazil is one of the largest fruit producers in the world. Nevertheless, it is estimated
that postharvest diseases can lead to losses of up to 50% in its production. The most
common treatment for these diseases involves the application of synthetic
fungicides. Nonetheless, in recent years, the demand for alternative treatments has
increased, especially for the use of biopesticides, products developed from plants,
microorganisms and insects. This study aimed to investigate the presence of the
bioactive compounds (4Z)-lachnophyllum lactone, (4Z,8Z)-matricaria lactone and
(2Z,8Z)-matricaria ester in Brazilian specimens of the weed Conyza canadensis, as
well as to evaluate the antifungal activity of these isolated substances against
several fungi associated with postharvest diseases of fruits. With the use of
preparative flash chromatography it was possible to isolate (4Z)-lachnophyllum
lactone and (4Z,8Z)-matricaria lactone from plant extracts obtained with
dichloromethane. The compounds were characterized by GC-MS/MS, NMR 1H e
13C, 1H-1H COSY and 1H-13C HSQC. Disk diffusion assays were performed in order
to investigate the activity of the isolated compounds against 10 filamentous fungi
regarded as common postharvest pathogens of fruits. Aspergillus niger,
Cladosporium spp. and Penicillium digitatum proved susceptible to the treatment
and, for them, the minimum inhibitory concentration of the compounds varied from
32 to 64 µg mL-1. An extraction method using pressurized hot water was also
developed, in which the parameters of temperature (100 ° C), cycle time (1 min) and
number of cycles (four) were optimized. By using this technique, it was possible to
obtain a yield of 1.46 mg g-1 and 0.24 mg g-1 for the (4Z)-lachnophyllum lactone and
(4Z,8Z)-matricaria lactone, respectively. The aqueous extract of Conyza canadensis
can be applied directly on fruits with the advantage of not containing residues of toxic
organic solvents.
xvi
xvii
Sumário LISTA DE TABELAS ................................................................................................................. xix
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................. xxi
I. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1
I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA ...................................................................................... 3
I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS ............................................................................ 6
I.2.1. Controle Biológico ................................................................................................ 7
I.2.2. Indutores de resistência....................................................................................... 8
I.2.3. Pesticidas Bioquímicos ........................................................................................ 8
I.2.4. Biopesticidas e o Mercado .................................................................................. 9
I.3. A PLANTA Conyza canadensis ................................................................................ 10
I.3.1. Descrição ............................................................................................................ 10
I.3.2. Efeitos alelopáticos ............................................................................................ 11
I.3.3. Ação antifúngica ................................................................................................. 13
I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho .................................................................... 14
I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO ..................................................................................... 16
I.4.1. Técnicas convencionais..................................................................................... 17
i. Maceração .............................................................................................................. 17
ii. Extração em aparelho de Soxhlet ........................................................................ 18
iii. Hidrodestilação ....................................................................................................... 19
I.4.2. Técnicas não-convencionais ............................................................................. 20
i. Extração com fluido supercrítico (SFE) ................................................................ 20
ii. Extração assistida por ultrassom (UAE) .............................................................. 21
iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE) ......................................................... 22
iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quente
pressurizada (PHWE) .................................................................................................... 23
I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO ........................................................ 26
II. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 29
III. PARTE EXPERIMENTAL ............................................................................................. 33
III.1. EQUIPAMENTOS ...................................................................................................... 35
III.2. REAGENTES E SOLVENTES .................................................................................. 35
III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS ........................................ 36
III.4. PROCEDIMENTOS ................................................................................................... 36
xviii
III.4.1. Coleta de plantas. .............................................................................................. 36
III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos. ............ 36
III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas. ............................................ 38
III.4.4. Teste preliminar: extração dos analitos de interesse da planta por PHWE. . 39
III.4.5. Otimização da extração via PHWE................................................................... 39
III.4.5.1. Temperatura ................................................................................................ 40
III.4.5.2. Tempo de ciclo............................................................................................ 40
III.4.5.3. Número de ciclos ........................................................................................ 40
III.4.5.4. Repetitividade do procedimento de extração ........................................... 41
III.4.6. Determinação dos analitos de interesse nos extratos purificados ................. 41
III.4.7. Bioensaios .......................................................................................................... 43
III.4.7.1. Ensaios de difusão em disco ..................................................................... 44
III.4.7.2. Concentração Mínima Inibitória ................................................................. 45
IV. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................................... 47
IV.1. Coleta das plantas ................................................................................................. 49
IV.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos extratos ................. 50
IV.3. Caracterização das Substâncias Puras Isoladas ................................................ 51
IV.3.1. Análises por GC-MS e GC-MS/MS................................................................... 51
IV.3.2. Análises por NMR de 1H e 13C .......................................................................... 55
IV.3.3. Análises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY ............................................. 59
IV.4. Teste preliminar para a extração dos bioativos da planta por PHWE ............... 64
IV.5. Curvas analíticas .................................................................................................... 65
IV.6. Otimização da extração via PHWE ...................................................................... 67
IV.6.1. Temperatura ....................................................................................................... 67
IV.6.2. Tempo de ciclo ................................................................................................... 69
IV.6.3. Número de ciclos ................................................................................................ 71
IV.7. Bioensaios .............................................................................................................. 74
IV.7.1. Ensaio de difusão em disco .............................................................................. 74
IV.7.2. Concentração Mínima Inibitória ........................................................................ 75
V. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................................. 79
V.1. Conclusões ................................................................................................................. 81
V.2. Perspectivas Futuras ................................................................................................. 82
VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 85
xix
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Concentrações em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID. 43
Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliação da atividade antifúngica
dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. ....................................................................... 44
Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios
de NMR de 1H e 13C. ............................................................................................ 55
Tabela 4 - Parâmetros da regressão linear referente às curvas analíticas obtidas e
seus respectivos desvios....................................................................................... 66
Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e
rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 68
Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e
rendimento global da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g). ....... 70
Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-ensaio para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML ................. 74
Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra
diferentes fungos associados a doenças pós colheita em frutas. .......................... 75
Tabela 9 - Atividade antifúngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo
método de microdiluição em caldo. ....................................................................... 76
xx
xxi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta
(Botrytis cinerea) em morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e
antracnose (Colletotrichum spp.) em manga (dir.) (adaptado BATISTA, 2010). ..... 5
Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer)
em pêssegos (esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde
(Penicillium spp.), respectivamente, em limões (dir.) (adaptado de HOLMES,
2009). ...................................................................................................................... 5
Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis ........................................................ 11
Figura 4 – Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis ........ 15
Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado de
TEO et al., 2010). .................................................................................................. 24
Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em
diferentes pressões: □ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002) 25
Figura 7 - Disposição do inóculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o
ensaio de difusão em disco. .................................................................................. 45
Figura 8 - Teste de microdiluição em caldo para a determinação de MIC. ........... 46
Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu
respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).
Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240
°C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura
do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de
arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 52
Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu
respectivo espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm).
Programa de temperatura de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240
°C, temperatura da transferline 200 °C, temperatura da fonte 230 °C e temperatura
do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de
arraste 1 mL min-1 e concentração da amostra 200 μg mL-1. ................................ 53
Figura 11 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL). ................. 54
xxii
Figura 12 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML). .......... 55
Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL. 56
Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.56
Figura 15 – Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-
ML. ........................................................................................................................ 57
Figura 16 – Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.
.............................................................................................................................. 58
Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL. ................. 60
Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML. ........... 61
Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL. ................... 63
Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML. .............. 64
Figura 21 – Cromatograma (TIC) obtido em análise de GC-MS de um extrato feito
via PHWE. Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de
90-150 °C (3 °C min-1), 150-280 °C (20 °C min-1) e 280 °C por 5 minutos.
Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C e temperatura
do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão do gás de
arraste 1 ml min-1 e concentração da amostra 1,0 mg mL-1. ................................. 65
Figura 22 - Cromatograma obtido em análise de GC-FID de um extrato feito via
PHWE (100 °C, 3 ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 μm x 0,25 μm).
Programa de temperatura de 115 °C (19 minutos), 115-200 °C (20 °C min-1.
Temperatura do injetor 200 °C e temperatura do detector 300 °C. Volume de
injeção 1 μL, split 1:50, vazão do gás de arraste 2 mL min-1. Concentração da
amostra 1,0 mg mL-1, concentração do padrão interno (cumarina) 15 µg mL-1 ..... 67
Figura 23 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nos extratos purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100,
110 e 130 °C). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ...... 69
Figura 24 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nos extratos purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e
30 min). Teor dado em miligramas de composto por grama de planta. ................ 71
Figura 25 – Proporção, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo
avaliado. ................................................................................................................ 72
xxiii
Figura 26 - Proporção, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo
avaliado. ................................................................................................................ 73
Figura 27 – Ensaios de difusão em disco mostrando um exemplo no qual o
composto não apresentou atividade antifúngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o
composto apresentou atividade antifúngica (fig. 27B). .......................................... 75
xxiv
1
I. INTRODUÇÃO
2
3
I.1. DOENÇAS PÓS-COLHEITA
O Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do mundo, com uma produção que,
em 2010, foi estimada em quase 39 milhões de toneladas, ficando atrás apenas da
China e da Índia (FAO, 2013). Dessa produção, cerca de 760 mil toneladas foram
exportadas no mesmo ano (IBRAF, 2011). No entanto, parte desta produção é
ameaçada pelas doenças pós-colheita, que ocasionam perdas quantitativas e
qualitativas (TERAO et al., 2008) em diversas etapas do processamento das frutas,
tais como: colheita, transporte, armazenagem e venda (COATES; JOHNSON, 1997;
PRUSKY, 2011). A porcentagem de perdas devido a doenças pós-colheita em frutas
é difícil de ser estimada, devido à escassez de dados, tanto para o Brasil quanto
para o mundo. Os poucos dados que existem fazem referência às perdas totais,
incluindo os descartes promovidos por consumidores e fornecedores e não
discriminam as perdas provocadas apenas por doenças pós-colheita. Estima-se
que, em países em desenvolvimento, essas perdas atinjam 50% da produção. Já
em países desenvolvidos, essa estimativa não ultrapassa os 23% (KADER, 2005;
PRUSKY, 2011), valor ainda alto, considerando-se que a produção de frutas é
medida em milhões de toneladas nos países com maior produção (FAO, 2013).
Sabe-se, no entanto, que as doenças pós-colheita são uma das principais
responsáveis pela perda de frutas ao longo da cadeia produtiva (PRUSKY, 2011;
SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
Uma diferença relevante entre países desenvolvidos e em desenvolvimento é
que, nos primeiros, as perdas ocorrem mais significativamente junto aos
revendedores e consumidores, principalmente devido à exigência dos compradores
por frutas esteticamente perfeitas. Já nos últimos, as perdas ocorrem nas fases de
colheita, pós-colheita e processamento, principalmente devido à falta de estrutura,
tecnologia e investimentos adequados (PRUSKY, 2011). As condições inadequadas
de armazenagem e de transporte podem ocasionar lesões nas frutas e permitir a
entrada de elementos patogênicos. Na maior parte dos casos, as perdas advêm de
doenças provocadas por fungos que se manifestam em condições propícias: baixo
pH, grande quantidade de água e nutrientes e debilidade do mecanismo de defesa
da fruta colhida (NUNES, 2012).
4
O impacto das doenças pós-colheita vai além da redução nos lucros das vendas
internas e das exportações. Com o crescimento populacional e o consequente
aumento da demanda global por alimentos, uma redução nas perdas provocadas
por essas doenças poderia diminuir a necessidade de se intensificar a produção de
frutas no futuro. Além disso, as perdas na pós-colheita representam não só um
desperdício das frutas em si, mas também do solo utilizado no cultivo, da água
utilizada na irrigação, da mão-de-obra no campo e de insumos agrícolas como
fertilizantes, defensivos e maquinário. Sendo assim, a redução das perdas na fase
de pós-colheita garante não só o lucro dos produtores e a maior disponibilidade de
alimentos, mas também o uso mais sustentável e eficiente dos recursos naturais
(PRUSKY, 2011). Além dos fatores econômicos e ambientais, as doenças pós-
colheita podem se mostrar um grande problema para a saúde humana, pois
determinados fungos, como aqueles dos gêneros Fusarium, Alternaria e Penicillium,
podem secretar micotoxinas, que são nocivas ao ser humano e podem apresentar
propriedades carcinogênicas (COATES; JOHNSON, 1997; LIU et al., 2013).
Doenças pós-colheita em frutas são causadas, geralmente, por fungos e
bactérias. Entretanto, o baixo pH da maioria das frutas inibe grande parte das
espécies de bactérias causadoras de podridões, tornando as doenças bacterianas
menos relevantes nesse campo. As doenças pós-colheita podem ser classificadas
de acordo com a forma com que se desenvolvem na fruta. Existem as doenças
quiescentes, nas quais o patógeno se instala na fruta antes da colheita, mas
permanece num estado de dormência até que os tecidos do hospedeiro passem por
uma mudança fisiológica que propicie a reativação da infecção. Essa mudança pode
ser provocada, por exemplo, pelo processo de amadurecimento do fruto após a
colheita. Exemplos desse tipo de doença são a podridão cinzenta, causada pelo
fungo Botrytis cinerea e a antracnose, causada por fungos do gênero Colletotrichum
em frutas tropicais (Figura 1) (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;
BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
5
Figura 1 - Exemplos de doenças pós-colheita quiescentes. Podridão cinzenta (Botrytis cinerea) em
morangos (esq.) (adaptado de REIS; COSTA, 2011) e antracnose (Colletotrichum spp.) em manga
(dir.) (adaptado de BATISTA, 2010).
Por outro lado, existem aquelas doenças que se instalam durante e após a
colheita, infectando o fruto a partir de lesões provocadas por choques mecânicos
ou por insetos. Os choques mecânicos ocorrem comumente na fase de colheita e
se apresentam na forma de cortes, abrasões e danos por pressão ou impacto. Como
exemplos desse tipo de doença, podemos citar a podridão (transit rot) causada pelo
fungo Rhizopus stolonifer e a podridão azul e verde provocada por fungos do gênero
Penicillium (Figura 2) (COATES; JOHNSON, 1997).
Figura 2 - Exemplos de doenças pós-colheita. Podridão mole (Rhizopus stolonifer) em pêssegos
(esq.) (adaptado de BAGGIO, 2012) e podridão azul e verde (Penicillium spp.), respectivamente,
em limões (dir.) (adaptado de HOLMES, 2009).
Uma das formas mais comuns de controle das doenças pós-colheita é a
aplicação de fungicidas sintéticos. Essa aplicação pode ocorrer tanto na fase de
pré-colheita quanto na fase de pós-colheita e o que determina o intervalo e o tempo
6
das aplicações é o tipo de infecção que se deseja combater. Normalmente, para as
infecções que se estabelecem nas frutas antes de elas serem colhidas, são
necessárias aplicações de sprays fungicidas já na fase de crescimento, aliadas a
aplicações regulares ao longo do desenvolvimento da fruta. Contra aquelas
infecções que se manifestam na fase de pós-colheita ou para os patógenos
quiescentes, a aplicação se dá, em geral, por imersão ou aspersão de soluções
fungicidas sobre a fruta já colhida (COATES; JOHNSON, 1997; SIVAKUMAR;
BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
Durante os últimos 25 anos, esforços vêm sendo realizados no sentido de
reduzir o uso de fungicidas sintéticos, tanto para atender à crescente demanda do
mercado consumidor por produtos “verdes”, quanto para cumprir com as normas
cada vez mais rigorosas dos países importadores. Desde 1987, a ONU vem
demonstrando preocupações com relação ao uso de produtos químicos sintéticos
em alimentos, devido ao seu impacto negativo na saúde humana e no ambiente
(DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013). Com o uso contínuo e indiscriminado dos
fungicidas sintéticos, o surgimento de cepas de fungos resistentes a esses
tratamentos convencionais são outra fonte de preocupação (NUNES, 2012), bem
como os danos ao ambiente causados pelo descarte das formulações fungicidas,
que podem atingir o solo e os corpos aquáticos (SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS,
2014). Assim, existe grande necessidade de se substituir os fungicidas sintéticos
por métodos alternativos de controle das doenças pós-colheita.
I.2. TRATAMENTOS ALTERNATIVOS
Existem diversos tratamentos alternativos para as doenças pós-colheita que
podem substituir completa ou parcialmente o uso de fungicidas sintéticos ou,
simplesmente, complementar sua ação. O controle do ambiente de armazenagem
(temperatura, umidade e porcentagem de O2) e as boas práticas de higiene ao longo
de todo o processo são fundamentais para a minimização das infecções nas frutas.
No entanto, esses tratamentos alternativos atuam somente retardando o
desenvolvimento das infecções, sem, de fato, eliminar os patógenos. Já os
7
tratamentos com calor e com radiação ionizante podem, eventualmente, matá-los,
mas, muitas vezes, os níveis de radiação e/ou calor exigidos para tal, são
prejudiciais às frutas, depreciando sua qualidade (COATES; JOHNSON, 1997).
Tratamentos mais sofisticados envolvem o uso de microrganismos antagonistas
(controle biológico), técnicas de indução de resistência e aplicação de pesticidas
bioquímicos (COATES; JOHNSON, 1997; COPPING; MENN, 2000; DUKE et al.,
2002; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SEIBER et al., 2014).
I.2.1. Controle Biológico
Os microrganismos antagonistas utilizados no chamado controle biológico de
doenças pós-colheita podem ser bactérias, leveduras ou até mesmo outros fungos
filamentosos, isolados a partir das mais diversas fontes (COATES; JOHNSON,
1997). A grande maioria dos agentes de controle biológico são, no entanto,
leveduras (DROBY et al., 2009). Elas são isoladas, principalmente, a partir da
superfície de frutas e vegetais, contudo, também podem ser obtidas a partir de
raízes, solos e água do mar (LIU et al., 2013). Seu mecanismo de ação envolve,
normalmente, competição por nutrientes e espaço com o fungo causador da doença
pós-colheita, todavia é sabido que outros mecanismos podem estar envolvidos,
como por exemplo, secreção de substâncias antimicrobianas e de enzimas,
parasitismo direto e indução de resistência na fruta. Ainda hoje, no entanto, o uso
de microrganismos antagonistas como forma de controle biológico para as doenças
pós-colheita é restrito, devido à inconsistência na eficácia dos produtos em
condições comerciais, dificuldades na produção em escala industrial, problemas no
registro junto às agências reguladoras e desafios na manutenção da viabilidade
celular (DROBY et al., 2009; LIU et al., 2013; NUNES, 2012; SHARMA; SINGH;
SINGH, 2009).
8
I.2.2. Indutores de resistência
Muitas vezes, as próprias plantas têm a capacidade de se defenderem contra
os elementos patogênicos, tanto por mecanismos já presentes em seu metabolismo
(resistência constitutiva), quanto por mecanismos ativados em resposta às
infecções (resistência induzida). Contudo, conforme o fruto amadurece, em geral, a
concentração dos compostos com ação antifúngica produzidos pelo metabolismo
da planta tende a decair, passando a níveis abaixo da concentração letal. As
técnicas de indução de resistência operam no sentido de estimular a produção
dessas substâncias antifúngicas através do emprego de indutores químicos
(quitosana, ácido salicílico), biológicos (antagonistas microbianos) e físicos (calor,
radiação UV). Essas técnicas, entretanto, podem produzir frutas menos palatáveis
e saudáveis, impróprias para o consumo devido às elevadas concentrações de
compostos antifúngicos. A indução também está associada a riscos ecológicos,
podendo afetar insetos polinizadores e micróbios benéficos presentes nas plantas,
além de reduzir a capacidade das plantas de competir por recursos ou responder a
ataques de herbívoros (CIPOLLINI; HEIL, 2010; COATES; JOHNSON, 1997;
TERRY; JOYCE, 2004).
I.2.3. Pesticidas Bioquímicos
Os pesticidas bioquímicos se destacam como uma das mais importantes e
promissoras alternativas para o tratamento de doenças pós-colheita. Eles são
substâncias de ocorrência natural, desenvolvidos a partir de compostos bioativos
obtidos em plantas, microrganismos e insetos, podendo ser utilizados para o
controle de pragas de diversas naturezas, atuando como fungicidas, algicidas,
herbicidas, entre outros (COPPING; MENN, 2000). Os compostos bioativos
presentes em plantas são, normalmente, metabólitos secundários, ou seja,
substâncias que não possuem função reconhecida na manutenção dos processos
vitais da planta (crescimento, reprodução, etc.), mas são utilizados por ela como
estratégia de defesa natural contra diversas pragas (AZMIR et al., 2013;
MIRESMAILLI; ISMAN, 2014; ZHONG, 2011).
9
Muitas vezes, os pesticidas bioquímicos apresentam mecanismos de ação
diferentes dos pesticidas convencionais. A elucidação desses mecanismos torna
possível o surgimento de novos tratamentos fitossanitários, uma vez que é comum
que a estrutura molecular de um produto natural sirva de base para o
desenvolvimento de novas moléculas com ação pesticida. O uso de produtos
naturais contribui, ainda, para minimizar o desenvolvimento de pragas resistentes
aos tratamentos convencionais, sendo possível sua aplicação em regimes de
tratamento alternados com os pesticidas sintéticos. Como outras vantagens, os
pesticidas bioquímicos apresentam uma alta especificidade contra os organismos
alvo e um período de carência mais curto do que os agrotóxicos convencionais, o
que torna sua aplicação mais sustentável e amigável ao ambiente e menos
agressiva aos organismos não alvo (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002;
SEIBER et al., 2014).
I.2.4. Biopesticidas e o Mercado
A Agência de Proteção Ambiental dos EUA (US EPA) divide o termo
biopesticida em três principais categorias: i) pesticidas bioquímicos, ii) pesticidas
microbianos (controle biológico) e iii) protetores incorporados à planta (PIP). As
duas primeiras categorias foram abordadas acima e, quando o termo “biopesticida”
for empregado neste trabalho, serão a elas e, principalmente aos pesticidas
bioquímicos, que estaremos nos referindo. Já os PIP, que são substâncias
pesticidas que uma planta passa a produzir a partir de material genético incorporado
a ela, não são considerados biopesticidas pela maioria das outras agências
regulatórias do mundo e, por isso, foram excluídos dessa discussão (SEIBER et al.,
2014). No Brasil, não foi encontrada definição oficial para o termo “biopesticida” no
site das principais agências regulatórias – MAPA, ANVISA e IBAMA.
Economicamente, os biopesticidas acompanham a tendência cada vez maior de
se produzir alimentos “orgânicos”, cujas vendas vêm crescendo mundialmente,
principalmente em países mais desenvolvidos. Além disso, esses compostos
oferecem aos países emergentes uma oportunidade para que eles desenvolvam
10
seus próprios pesticidas, com a vantagem de que, normalmente, produtos naturais
não possuem normas tão rigorosas quanto os compostos sintéticos para seu uso e
registro (COPPING; MENN, 2000; DUKE et al., 2002; SEIBER et al., 2014).
Atualmente, o mercado de biopesticidas no Brasil está se expandindo. O país
é o maior consumidor de agrotóxicos do mundo, mas o interesse dos produtores e
consumidores em tecnologias mais amigáveis ao meio ambiente vem crescendo.
Em 2012, os biopesticidas foram responsáveis por 1% do faturamento no setor de
defensivos agrícolas, o que corresponde a um valor de 97 milhões de reais. No
entanto, a estimativa da Associação Brasileira das Empresas de Controle Biológico
(ABCBio) é de que essa fatia chegue a 15% nos próximos 15 anos, principalmente
agora que grandes empresas, como a Monsanto, Bayer CropScience, Syngenta e
BASF estão apostando em investimentos no setor (RAMOS, 2013). Atualmente, no
país, segundo dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
(MAPA), estão registrados somente 22 produtos fitossanitários com uso aprovado
para agricultura orgânica (MAPA, 2014). Todos eles são constituídos por
microrganismos antagonistas, nenhum com ação fungicida, demonstrando que os
biopesticidas para esse fim são um nicho ainda inexplorado no mercado de
tratamentos alternativos para doenças pós-colheita, com muitas oportunidades de
crescimento.
I.3. A PLANTA Conyza canadensis
I.3.1. Descrição
Tendo em vista a importância do desenvolvimento de novos biopesticidas,
bem como a investigação do seu espectro de ação, uma pesquisa recente realizada
pela Embrapa Meio Ambiente e o Departamento de Agricultura dos Estados Unidos
(USDA) apontou resultados promissores com a planta alelopática Conyza
canadensis (L.) Cronquist (QUEIROZ et al., 2012). Esta planta (Figura 3),
pertencente à família Asteraceae (ou Compositae), é originária da América do Norte,
mas amplamente distribuída pelo mundo, sendo encontrada no Brasil
principalmente nas regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste. Ela foi descrita pela
11
primeira vez por C. Linnaeus em 1753, na sua obra Species Plantarum, então com
o nome de Erigeron canadense. Conhecida popularmente como buva, é infestante
característica da entressafra, com seu desenvolvimento ocorrendo em áreas de
pouca cobertura vegetal ou pouca palhada. Dissemina-se por intermédio de
sementes de tamanho muito pequeno que são produzidas em grandes quantidades
e carregadas com facilidade pelo vento. Estima-se que uma única planta possa
produzir entre 100 mil a 200 mil sementes. C. canadensis infesta pomares, vinhas,
culturas de campo, tais como soja, milho e algodão, principalmente em culturas
resistentes a herbicidas, onde sistemas de plantio direto são empregados
(LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008).
Figura 3 - Espécime de Conyza canadensis
I.3.2. Efeitos alelopáticos
Por ser uma planta alelopática, ou seja, por liberar substâncias conhecidas
como aleloquímicos que podem inibir o crescimento de plantas vizinhas (DEL
FABBRO; PRATI, 2015), a Conyza canandensis é uma fonte potencial de
compostos bioativos (DUKE et al., 2002). Suas propriedades alelopáticas têm sido
reportadas por estudos que, em geral, testam seus extratos aquosos (obtidos a frio)
contra outras plantas, verificando se ocorrem inibições na germinação da semente
e/ou no crescimento da plântula (broto).
12
Kobayashi et al. (1980), até onde sabemos, foram os primeiros a estudar o
potencial alelopático da C. canadensis. Estes pesquisadores estudaram os efeitos
inibitórios da fração hexânica oriunda da partição de extratos da planta obtidos com
metanol e verificaram que compostos acetilênicos, um dos quais presentes neste
trabalho, inibiram o crescimento de plântulas de arroz.
Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) reportaram atividades inibitórias
provocadas pelo extrato aquoso da planta na germinação e no crescimento de
plântulas de tomate, rabanete, trigo, milho, milheto e feijão-da-china.
Gao et al. (2009) verificaram que os extratos aquosos provocaram os
mesmos efeitos em ensaios com pepino (Cucumis sativus), nabo (Brassica
campestres), capim-colchão (Digitaria sanguinalis), capim-arroz (Echinochloa
crusgalli) e bredo (Amaranthus retroflexus).
Marinov-Serafimov (2010) também reportou que esse mesmo tipo de extrato
apresentou efeitos inibitórios na germinação e no crescimento da plântula nas
espécies Glycine max (soja), Pisum sativum (ervilha) e Vicia sativa.
Hu e Zhang (2013), também realizando ensaios com os extratos aquosos da
planta, dessa vez obtidos tanto da parte aérea quanto da raiz, reportaram que houve
atividade inibitória na germinação, bem como redução no tamanho do broto, nas
seguintes espécies de ervas daninhas nativas: Plantago asiatica, Digitaria
sanguinalis e Youngia japônica. Houve inibição em todas as concentrações de
extrato testadas, no entanto não foram observados efeitos inibitórios significativos
na germinação ou no tamanho do broto quando os extratos foram testados contra a
própria C. canadensis, demonstrando que a planta não possui efeito autotóxico.
Uma tendência geral nestes trabalhos é a ausência de interesse em isolar e
identificar os compostos fitotóxicos. Apenas Kobayashi et al. (1980) identificaram
alguns compostos acetilênicos que apresentaram efeitos inibitórios. Mais
simplificadamente, Shaukat, Munir e Siddiqui (2003) consideraram que os efeitos
alelopáticos da C. canandensis estariam sendo causados, provavelmente, por
compostos fenólicos presentes no extrato aquoso (ácido vanílico, ácido gálico, ácido
siríngico e catecol). Eles não descartaram, contudo, a possibilidade de que outros
13
compostos não-fenólicos estariam contribuindo para os efeitos inibitórios
observados.
I.3.3. Ação antifúngica
Compostos bioativos também podem apresentar, além de efeitos fitotóxicos,
efeitos fungitóxicos (DUKE et al., 2002). Assim, também existem estudos que
aplicam os extratos de C. canandensis em ensaios contra diversos tipos de fungos.
Curini et al. (2003) reportaram que o óleo essencial da planta C. canadensis
inibiu o crescimento dos fungos fitopatogênicos Rhizoctonia solani, Fusarium solani
e Colletotrichum lindemuthianum em concentrações que variavam de 400 a 1600
mg/kg. Os ensaios antifúngicos foram realizados mediante incorporação do óleo
essencial em meio de cultura semifundente e comparação do diâmetro das culturas
neste meio e no meio de controle após determinados dias de incubação. Neste
trabalho, a composição do óleo essencial também foi determinada, evidenciando-
se o limoneno como composto majoritário, contudo, a atividade antifúngica não foi
atribuída a nenhum composto em específico.
Franzener et al. (2007) avaliaram a atividade antifúngica do hidrolato (fase
aquosa obtida na hidrodestilação da planta) contra o fungo Alternaria brassicae, que
causa doenças em plantas do gênero Brassica (couve, nabo, etc.). Para os ensaios,
o hidrolato foi incorporado em meio de cultura semifundente e foi avaliada a sua
capacidade de inibir a germinação de esporos do fungo. Neste teste, o hidrolato
demonstrou uma capacidade significativa na redução do tamanho dos tubos
germinativos, evidenciando a presença de compostos antifúngicos em sua
composição.
Mais recentemente, Veres et al. (2012) reportaram que óleos essenciais,
tanto da parte aérea quanto da raiz, da planta C. canadensis, obtidos por
hidrodestilação, apresentaram atividade contra diversos fungos patogênicos, entre
esses, Candida albicans, Candida glabrata, Candida kefyr, Candida parapsilosis,
Candida tropicalis, Cryptococcus neoformans, Rhodotorula glutinis e Trichophyton
interdigitalis. Neste trabalho, o método de difusão em disco foi empregado para a
obtenção de dados semi-quantitativos (halo de inibição) acerca dos efeitos
14
antifúngicos dos óleos essenciais. Já para a quantificação desse efeito, a
concentração mínima inibitória (MIC) dos óleos foi determinada pelo método de
microdiluição em caldo, utilizando placa de Elisa. Os valores de MIC variaram de
1,25 a 20,00 µg mL-1.
Novamente, nos trabalhos abordados nesta revisão, não houve interesse em
investigar quais seriam os compostos com ação antifúngica presentes nos diversos
extratos avaliados. É nesse contexto que o trabalho de Queiroz et al. (2012) se
insere. Estes pesquisadores se ocuparam não só da investigação da ação
antifúngica de extratos da planta C. canadensis, como também da determinação de
quais substâncias estariam causando esse efeito. Os compostos identificados
constituem os bioativos de interesse do presente trabalho.
I.3.4. Bioativos de interesse do trabalho
No trabalho de Queiroz et al. (2012), foi realizado um fracionamento
sistemático guiado por bioensaio nos extratos da planta C. canadensis para
identificar os compostos fitotóxicos e fungitóxicos da sua parte aérea. Três
substâncias fungitóxicas, cujas estruturas estão mostradas na Figura 4, foram
identificadas: (4Z)-lachnophyllum lactona (4Z-LL), (4Z,8Z)-matricaria lactona
(4Z,8Z-ML) e (2Z,8Z)-matricaria éster (2Z,8Z-ME). Após terem sido isolados,
4Z-LL e 4Z,8Z-ML foram submetidos a ensaios contra os seguintes fungos
fitopatogênicos: Colletotrichum acutatum, Colletotrichum fragariae e Colletotrichum
gloeosporioides. Os resultados obtidos foram positivos. No estudo de dose-
resposta contra seis fungos fitopatogênicos, 4Z-LL foi mais ativo do que o fungicida
comercial contendo azoxistrobina contra os fungos Col. acutatum, Col. fragariae e
Col. gloeosporioides e com atividade próxima do fungicida comercial Captan contra
Col. gloeosporioides, enquanto que 4Z,8Z-ML foi menos ativo nessas situações
(QUEIROZ et al., 2012). O composto 2Z,8Z-ME já possuía atividade fungicida
reportada na literatura contra os fungos citados (MEEPAGALA et al., 2002).
Interessante ressaltar que as substâncias 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME já
foram reportadas nos óleos essenciais, tanto das raízes quanto da parte aérea da
C. canadensis e também nos extratos obtidos a partir de solventes orgânicos
15
(HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988; LIS; GÓRA, 2000; LIS; PIGGOTT;
GÓRA, 2003; TZAKOU et al., 2005; VERES et al., 2012; XIE; GAO; JIA, 2007), o
que demonstra a possibilidade de que esses compostos possam ser um dos
responsáveis pelas atividades antifúngicas observadas no óleo essencial e no
hidrolato obtidos a partir da planta (CURINI et al., 2003; FRANZENER et al., 2007;
VERES et al., 2012).
4Z-LL 4Z,8Z-ML 2Z,8Z-ME
Figura 4 – Compostos obtidos a partir dos extratos da Conyza canadensis.
O composto 2Z,8Z-ME foi reportado pela primeira vez na planta C.
canadensis nos trabalhos de Sørensen e Stavholt (1950). Nessa mesma década,
ele foi encontrado em 29 espécies do gênero Erigeron (classificação a qual
pertencia a C. canadensis anteriormente) (HOLME; SØRENSEN, 1954).
Entretanto, sua estrutura era conhecida desde 1941, quando foi isolado pela
primeira vez a partir da planta Matricaria indora L. (SØRENSEN; STENE, 1941).
O composto 4Z,8Z-ML foi encontrado pela primeira vez nas partes aéreas da
planta Matricaria caucasica em 1967 (BOHLMANN; MÖNCH; BLASZKIEWICZ,
1967). Sua estrutura foi desvendada a partir da estrutura de seu isômero (4E-8Z),
descoberto em 1957 (BOHLMANN; BURKHARDT; ZDERO, 1973). Até onde
sabemos, esse composto foi encontrado em extratos de C. canadensis pela primeira
vez em 1988, reportado nos trabalhos de Hrutfiord, Hatheway e Smith (1988).
O composto 4Z-LL foi reportado e isolado pela primeira vez em 1970, a partir
de extratos da parte aérea da própria planta C. canadensis (BOHLMANN;
BURKHARDT; ZDERO, 1973; BOHLMANN; ZDERO, 1970).
Mais recentemente, alguns dos compostos foram descritos em trabalhos
como o de Veres et al. (2012), em que os óleos essenciais da parte aérea e da raiz
da planta C. canadensis foram separados em coluna DB-5ms (30 m x 0,25 mm x
16
0,25 µm) e analisados por cromatografia a gás associada à espectrometria de
massas (GC-MS). No óleo obtido das partes aéreas da planta foram identificados
34 compostos, sendo o limoneno de teor majoritário (79,2%). Foi identificada a
presença do composto 2Z,8Z-ME (2,1%) e traços de 4Z,8Z-ML. Já o óleo obtido da
raiz apresentou, como componente majoritário, o composto 2Z,8Z-ME, com um teor
médio de 91,1%. Nesse óleo, a 4Z,8Z-ML estava presente com um teor médio de
2,4%.
I.4. TÉCNICAS DE EXTRAÇÃO
A eficiência na obtenção de moléculas bioativas a partir de plantas está
intimamente relacionada com a etapa de extração (AZMIR et al., 2013).
Considerada uma parte crucial da etapa de preparo de amostra, a extração pode
ser vista como a etapa inicial do processo de separação, possuindo baixa
seletividade, porém alta capacidade. A escolha da técnica de extração mais
apropriada tem grande influência na qualidade da análise e pode ser um fator
determinante na identificação e quantificação cromatográfica (SMITH, 2003). Desse
modo, pode-se dizer que a correta separação e caracterização de um composto
bioativo só podem ser atingidas mediante o emprego de um método de extração
adequado (AZMIR et al., 2013).
O objetivo das técnicas de extração, de uma maneira geral, é separar o
analito de interesse da sua matriz, utilizando, para tanto, um solvente que
proporcione o maior rendimento e seletividade possíveis. É necessário empregar
um método que minimize a presença de interferentes, independa de variações na
matriz, sendo robusto e reprodutível e concentre os analitos de interesse,
aumentando a sensibilidade do ensaio. A extração de produtos naturais pode ser
obtida por diversas técnicas, algumas delas convencionais, empregadas há mais de
100 anos, outras mais contemporâneas (AZMIR et al., 2013; SMITH, 2003).
17
I.4.1. Técnicas convencionais
As técnicas convencionais de extração normalmente envolvem o emprego de
calor e/ou agitação aliadas ao poder extrator de um determinado solvente. As
técnicas mais comuns são: maceração, extração em aparelho de Soxhlet e
hidrodestilação (AZMIR et al., 2013).
i. Maceração
A maceração envolve, primeiramente, a moagem da matéria-prima vegetal,
com o intuito de aumentar a superfície de contato entre a matriz e o solvente. O
material moído é, então, posto em contato com o solvente extrator, podendo haver
ou não o emprego de agitação (maceração dinâmica), aquecimento (digestão) e
renovação do solvente (remaceração) (AZMIR et al., 2013; SONAGLIO et al., 1999).
Conforme citado anteriormente, essa técnica foi empregada por diversos
trabalhos recentes com o intuito de investigar a presença de compostos alelopáticos
em extratos aquosos da planta C. canadensis (GAO et al., 2009; HU; ZHANG, 2013;
MARINOV-SERAFIMOV, 2010; SHAUKAT; MUNIR; SIDDIQUI, 2003). Além da
água, solventes orgânicos também são empregados na maceração. Por exemplo,
nos estudos pioneiros acerca da alelopatia da planta C. canadensis realizados por
Kobayashi et al. (1980), a extração da planta macerada foi realizada com metanol
e, mais recentemente, Queiroz et al. (2012) obteve compostos bioativos dessa
mesma planta a partir de extrações realizadas com diclorometano.
A maceração é uma técnica de extração de baixo custo (AZMIR et al., 2013),
no entanto, diversos trabalhos buscam substituí-la devido ao seu elevado tempo de
extração (CHAN et al., 2011). Por exemplo, no trabalho de Jacques et al. (2007), a
extração de compostos da planta Ilex paraguarienses por maceração foi comparada
com a técnica de extração assistida por ultrassom (UAE). O trabalho mostrou que a
técnica de maceração obteve rendimento semelhante à UAE quando metanol foi
empregado (14,4 e 12,6% (m/m), respectivamente). Contudo, enquanto a extração
por UAE foi realizada em apenas 180 min, a maceração requereu 10 dias para obter
18
os mesmos resultados, o que demonstra sua desvantagem com relação ao tempo
de extração.
ii. Extração em aparelho de Soxhlet
A extração em aparelho de Soxhlet foi proposta pelo químico alemão Franz
Ritter von Soxhlet em 1879, primariamente com o intuito de extrair lipídeos. Hoje em
dia, é utilizada para extrair diversos compostos naturais presentes em matrizes
sólidas com o emprego de solventes voláteis. Nesta técnica, o solvente extrator é
aquecido no frasco de destilação e condensado sobre o cartucho poroso contendo
a matriz sólida. Quando o solvente atinge a altura do sifão, ele é sifonado de volta
para o frasco de destilação carregando consigo os solutos extraídos, e o processo
recomeça. Como o solvente é reciclado continuamente, a amostra está sempre em
contato com solvente renovado, possibilitando uma extração altamente eficiente
utilizando-se uma quantidade reduzida de solvente. A extração via Soxhlet é
comumente empregada como modelo de comparação para avaliação da eficiência
de outros métodos de extração (AZMIR et al., 2013; FALKENBERG; SANTOS;
SIMÕES, 1999; SMITH, 2003).
Apesar de não terem sido encontrados exemplos na literatura da aplicação
desta técnica na obtenção de extratos da planta C. canadensis, é possível encontrar
diversos trabalhos comparando o uso do aparelho de Soxhlet a outros métodos de
extração na obtenção de compostos bioativos a partir de plantas (AZMIR et al.,
2013). Exemplo disso é o trabalho de Herzi et al. (2013), que reportou o rendimento,
o tempo de extração e a composição de extratos das folhas de Tetraclinis articulata
obtidos por extração via Soxhlet com etanol ou hexano. Estes extratos foram
comparados com aqueles obtidos por hidrodestilação e extração com fluido
supercrítico (SFE). Foi demonstrado que a extração por Soxhlet levou aos maiores
rendimentos (21,2 – 40,4 g kg-1) quando comparada à hidrodestilação (0,6 g kg-1) e
à SFE (0,6 g kg-1). No entanto, seu tempo de extração foi o mais longo de todos,
durando 480 minutos contra 180 minutos da hidrodestilação e 30 minutos da SFE.
Foi também o processo menos seletivo, extraindo não só componentes voláteis,
mas também compostos de maior massa molecular, o que explica o seu maior
19
rendimento. Outras desvantagens apontadas foram a presença de solvente residual
nos extratos obtidos por Soxhlet e uma possível degradação dos compostos de
interesse (antioxidantes) pela temperatura empregada na extração.
iii. Hidrodestilação
A hidrodestilação é uma técnica de extração empregada na obtenção do óleo
essencial de plantas. Normalmente, esses óleos são ricos em compostos bioativos
que apresentam atividade antimicrobiana, alelopática, antifúngica e antioxidante,
atuando como defensivos naturais dos vegetais. Em escala laboratorial, utiliza-se
um aparato denominado Clevenger, no qual partes da planta (folhas e/ou raízes),
usualmente frescas, são aquecidas em um frasco de destilação juntamente com
água até a temperatura de ebulição. Os óleos voláteis da planta são arrastados pelo
vapor d’água e coletados em um separador, após sua passagem pelo condensador.
Em contrapartida à simplicidade da técnica, a temperatura elevada pode degradar
determinados compostos termolábeis e ocasionar a perda de substâncias mais
voláteis (AZMIR et al., 2013; HERZI et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;
SIMÕES; SPITZER, 1999; SIVAKUMAR; BAUTISTA-BAÑOS, 2014).
Esta técnica foi empregada em estudos avaliando a atividade antifúngica de
compostos bioativos da planta C. canandensis. Conforme citado anteriormente,
Curini et al. (2003) e Veres et al. (2012) obtiveram o óleo essencial da planta,
submetendo-o a bioensaios contra diversos fungos patogênicos e fitopatogênicos.
Já Franzener et al. (2007) empregou o hidrolato, fração rica em compostos
hidrofílicos da planta, em ensaios com a mesma finalidade.
Apesar do uso recorrente de óleos essenciais da parte aérea da planta em
bioensaios contra fungos, o baixo rendimento normalmente obtido pela técnica de
hidrodestilação (COSTA et al., 2012; HERZI et al., 2013; JERKOVIC et al., 2007)
aliado às baixas concentrações encontradas para os compostos de interesse deste
trabalho nos óleos essenciais (< 3,0%) (HRUTFIORD; HATHEWAY; SMITH, 1988;
LIS; GÓRA, 2000; LIS; PIGGOTT; GÓRA, 2003; VERES et al., 2012) torna a
escolha da técnica desvantajosa para a aplicação desejada neste trabalho.
20
I.4.2. Técnicas não-convencionais
As técnicas convencionais abordadas anteriormente possuem desvantagens
como o uso excessivo de solventes, a baixa seletividade e o tempo de extração
prolongado. Para superar essas dificuldades, técnicas mais sofisticadas têm sido
desenvolvidas e aplicadas, destacando-se a extração por fluido supercrítico (SFE),
a extração assistida por ultrassom (UAE), a extração assistida por micro-ondas
(MAE) e a extração com líquido pressurizado (PLE), da qual deriva a técnica de
extração com água quente pressurizada (PHWE) (AZMIR et al., 2013; HENG et al.,
2013).
i. Extração com fluido supercrítico (SFE)
A SFE emprega um fluido supercrítico, usualmente CO2, como solvente
extrator. A viscosidade e tensão superficial baixas e o alto coeficiente de difusão
dos fluidos supercríticos facilitam sua penetração na matriz, aumentando,
consequentemente, a transferência de massa e a eficiência da extração. A
capacidade de extração do fluido supercrítico pode ser modificada por alterações
na pressão e na temperatura de operação e o sistema pode trabalhar, inclusive, a
temperaturas ambientes, permitindo extração de compostos termolábeis. Outra
vantagem é a facilidade no descarte do CO2, que não gera impactos ao ambiente e
à saúde humana, podendo ser reciclado no processo. As desvantagens da técnica
são o alto custo dos equipamentos de alta pressão e a baixa eficiência na extração
de compostos mais polares, mesmo com a adição de modificadores, como o
diclorometano, ao CO2 (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013).
Costa et al. (2012) investigaram o perfil químico de extratos das folhas de
Lavandula viridis obtidos por SFE com CO2, comparando-o com o do óleo essencial
obtido por hidrodestilação. Ambos os extratos se mostraram ricos em monoterpenos
oxigenados, mas o rendimento global das extrações via SFE foi maior, variando de
3,41 a 9,27% (m/m), enquanto o da hidrodestilação foi de apenas 0,53% (m/m).
Contudo, foi observado que uma variedade maior de compostos estava presente
nos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação.
21
Conforme citado anteriormente, no trabalho de Herzi et al. (2013), o extrato
das folhas de T. articulata obtido por SFE apresentou um dos menores rendimentos
globais (1,6 g/kg). Contudo, foi o extrato com a maior atividade antioxidante,
indicando alta seletividade para compostos com tal ação. A SFE foi, ainda, o
processo de extração mais rápido (30 min) em comparação com Soxhlet (480 min)
e hidrodestilação (180 min).
Ambos os trabalhos reforçam uma característica marcante da SFE, que é a
seletividade, uma vez que o poder de solvatação do fluido supercrítico pode ser
ajustado facilmente por mudanças na temperatura e na pressão do processo
(AZMIR et al., 2013).
ii. Extração assistida por ultrassom (UAE)
A UAE faz uso do fenômeno de cavitação provocado pelas ondas de
ultrassom para aumentar a eficiência da extração com solvente. Quando a onda
passa pelo meio líquido, ela cria pontos de expansão e compressão que levam à
formação, crescimento e colapso de bolhas. Desse processo, surgem forças de
cisalhamento que, associadas a efeitos mecânicos e térmicos, atuam destruindo
paredes celulares e reduzindo o tamanho das partículas da matriz, aumentando a
transferência de massa e a eficiência do processo de extração. As vantagens dessa
técnica estão relacionadas com a redução no tempo e na temperatura de extração
e também no uso de solventes. No entanto, a eficiência da técnica tem se mostrado
variável, ficando abaixo da dos métodos convencionais em algumas matrizes. Outro
problema envolvendo a UAE está na formação de radicais livres pelos efeitos da
cavitação, o que pode ocasionar a degradação dos analitos de interesse (AZMIR et
al., 2013; HENG et al., 2013; VILKHU et al., 2008; ZHANG et al., 2015).
No trabalho de Both, Chemat e Strube (2014), o emprego de UAE na extração
de polifenóis a partir de chá preto (Camellia sinensis) aumentou em 15% a
quantidade desses analitos no extrato, quando comparado com a técnica de
maceração convencional. Também foi detectado uma redução no tamanho das
partículas, o que pode ter favorecido a extração devido ao aumento da superfície
22
de contato entre o solvente e a matriz. Já no trabalho de Hossain et al. (2012), foi
reportado que, após otimização, a UAE aumentou significativamente os
rendimentos de diversos compostos antioxidantes extraídos de manjerona
(Origanum majorana) quando comparada à maceração tradicional.
No entanto, no trabalho de Yan et al. (2010), a UAE foi menos eficiente na
extração de compostos bioativos das raízes de Astragalus membranaceus que a
extração da raiz macerada feita sob refluxo com o mesmo solvente – etanol:água
(80:20 v/v).
iii. Extração assistida por micro-ondas (MAE)
As micro-ondas geram o calor necessário para a extração ao interagirem com
os componentes polares da matriz através de mecanismos de condução iônica e
rotação de dipolos. Com a temperatura elevada, os solutos são separados da matriz
e, em seguida, se difundem e são liberados para o solvente. Os principais fatores a
serem controlados para garantir a eficiência da extração são a temperatura e o tipo
de solvente empregado, no entanto a frequência e a duração da radiação também
devem ser considerados. Na extração de compostos bioativos, a MAE apresenta
maior rendimento, seletividade e rapidez quando comparada às técnicas de
extração convencionais e até mesmo às não-convencionais, podendo ser utilizada
tanto com água quanto com solventes orgânicos. Seu custo é moderado, sendo
consideravelmente mais baixo, por exemplo, que a técnica de SFE. As
desvantagens da técnica estão relacionadas com a limitação da polaridade do
solvente a ser empregado, já que solventes muito apolares são menos afetados
pela radiação. Além disso, a técnica apresenta baixa seletividade e, por isso, etapas
posteriores, como a extração líquido-líquido (LLE), podem ser necessárias para a
purificação de seus extratos (AZMIR et al., 2013; CHAN et al., 2011; HENG et al.,
2013).
Martino et al. (2006) reportaram que, na extração de cumarina e compostos
correlatos das flores de Melilotus officinalis, a MAE apresentou ganhos não só em
tempo, mas também em eficiência com relação às extrações realizadas por UAE e
por Soxhlet. Para a cumarina, por exemplo, a MAE levou a um rendimento de
23
3,98 mg g-1 em 10 minutos de extração, enquanto a UAE levou a 3,57 mg g-1 em
60 minutos e Soxhlet 2,16 mg g-1 em 8 horas.
Dahmoune et al. (2015) realizaram extração de ácido gálico e outros
polifenóis em folhas de Myrtus communis. A extração por MAE, empregando uma
mistura de etanol e água, foi otimizada e comparada com os rendimentos obtidos
em extrações feitas por UAE e por maceração sob aquecimento. A MAE levou aos
maiores rendimentos tanto na extração de fenóis totais, quanto na de taninos
condensados e flavonoides. Também houve ganho de tempo, uma vez que a
extração por MAE foi executa em 1 minuto, comparada com a UAE e a maceração,
que levaram 15 e 120 minutos, respectivamente.
iv. Extração com líquido pressurizado (PLE) e extração com água quente
pressurizada (PHWE)
A PLE, introduzida pela Dionex Corporation em 1995, é uma técnica que se
utiliza de solventes a altas temperaturas e pressões com o intuito de aumentar a
transferência de massa e a solubilidade dos analitos, obtendo maiores rendimentos
do que as técnicas de extração em condições ambientes. No caso da água ser o
solvente extrator, a técnica é denominada PHWE (do inglês, Pressurized Hot Water
Extraction). A técnica opera em duas modalidades: dinâmica ou estática. No modo
dinâmico, bombas de alta pressão promovem a passagem constante do solvente
através da cela de extração aquecida, que contém a amostra. São comumente
empregadas vazões entre 1,0 e 1,5 mL min-1 durante 20-30 minutos, com pressões
variando de 10 a 50 bar. No modo estático, a pressão pode ser utilizada numa faixa
maior, de 35 a 200 bar e a extração é feita em ciclos (5-15 minutos), com renovação
do solvente a cada ciclo. Ao final, purga-se a cela com algum gás inerte (e.g. N2),
para remover o solvente remanescente e evitar perdas. Em geral, nas extrações via
PLE e PHWE, a temperatura varia entre 25 e 200°C, mas valores maiores podem
ser empregados (AZMIR et al., 2013; HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER,
2011; TEO et al., 2010).
24
Existem equipamentos de PLE/PHWE disponíveis comercialmente, no
entanto é possível montá-los em laboratório (TEO et al., 2010). A Figura 5 mostra o
esquema de um equipamento de PHWE para extração em modo dinâmico.
Figura 5 - Esquema de equipamento para PHWE no modo dinâmico (adaptado de TEO et al.,
2010).
Em linhas gerais, a eficiência da PHWE está associada ao uso de
temperaturas elevadas na extração, o que diminui substancialmente a constante
dielétrica (ε) da água (Figura 6), reduzindo sua polaridade. Isso faz com que a água
se torne capaz de solubilizar compostos com caráter mais apolar. Além disso, o
aumento na temperatura da água diminui a sua viscosidade, facilitando a
penetração do solvente na matriz e melhorando a remoção dos analitos. Ocorre
também uma diminuição na tensão superficial da água, facilitando a formação de
cavidades de solvente dentro da matriz e permitindo que os analitos se solubilizem
mais rapidamente. Outro fator que influencia a eficiência da técnica, porém em
menor extensão que a temperatura, é a aplicação de pressões elevadas. A pressão
mantem o solvente em seu estado líquido, auxilia na penetração do solvente no
poro da matriz e reduz a formação de bolhas (MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et
al., 2010).
A PHWE apresenta como vantagem a redução no uso de solventes
orgânicos, principalmente os clorados, atendendo à crescente demanda em busca
de técnicas mais sustentáveis e menos prejudiciais ao ambiente. A água é um
solvente de baixo custo, atóxico, altamente disponível e de descarte simples e
25
pouco impactante ao ambiente, o que torna a PHWE uma técnica de extração
atrativa e eficiente para matrizes como solos, alimentos e plantas. Outras vantagens
são a possibilidade de automação, a reprodutibilidade superior e a redução no
tempo e na quantidade de solvente necessários para a extração (AZMIR et al., 2013;
TEO et al., 2010).
Figura 6 - Variação da constante dielétrica da água com a temperatura em diferentes pressões:
□ 33 bar; ■ 129 bar; ◊ 322 bar (adaptado de SMITH, 2002)
As desvantagens da técnica são, principalmente, o alto custo do
equipamento devido às altas pressões necessárias, a degradação dos analitos pela
temperatura, e a eventual necessidade de empregar a extração líquido-líquido como
forma de purificar os extratos. Com relação ao custo, é possível mitigá-lo utilizando-
se equipamentos construídos no próprio laboratório (HENG et al., 2013; MUSTAFA;
TURNER, 2011; TEO et al., 2010). A degradação dos analitos pode ser contornada
empregando-se uma temperatura mais branda, ou até mesmo temperatura
ambiente na extração, como fizeram ONG et al. (2007), na extração de gastrodina
e álcool vanílico da planta Gastrodia elata em um equipamento de PLE dinâmico.
Aplicações recentes da técnica podem ser vistas, por exemplo, no trabalho
de Pérez et al. (2013), no qual foram analisados poluentes polialogenados em
diferentes plantas utilizando como técnicas de extração a PLE (com clean-up) e
UAE (com e sem clean-up). Para PLE, foram otimizadas a temperatura (60 °C), o
Temperatura (°C)
Consta
nte
die
létr
ica
26
agente de clean-up (Florisil + carbono grafitizado), o solvente (hexano:acetato de
etila 80:20 v/v) e o número de ciclos empregados (2 ciclos de 10 minutos). Quando
comparado a ambas as modalidades de UAE, a PLE apresentou melhores valores
de recuperação para os analitos avaliados em amostras de planta fortificadas e foi
a técnica escolhida para análise de amostras nas quais alguns dos poluentes foram,
de fato, encontrados.
Já no trabalho de del Valle et al. (2005), folhas de boldo-do-Chile (Peumus
boldus) foram submetidas a extração por PHWE, Soxhlet (metanol) e SFE. A
extração por PHWE levou ao maior rendimento (51,4% m/m) comparado às outras
técnicas avaliadas (Soxhlet com 36,6 % e SFE com média de 4,3% m/m). Uma
maior atividade antioxidante também foi encontrada nos extratos obtidos com
PHWE.
Outro exemplo de aplicação está no trabalho de Herrero et al. (2010), em que
a PLE (com etanol) e a PHWE foram empregadas em diversas temperaturas para
a extração de compostos bioativos da planta Rosmarinus officinalis. A eficiência da
técnica foi comparada com a extração por SFE e, a 200 °C, tanto a PLE quanto a
PHWE levaram aos maiores rendimentos (38,6 e 37,9% m/m, respectivamente),
quando comparados com o rendimento da SFE que foi de 6,5% m/m em sua melhor
condição. A atividade antioxidante dos extratos obtidos também foi avaliada, bem
como a quantidade de fenóis totais e os maiores valores determinados foram,
novamente, para os extratos da PHWE.
I.5. IMPORTÂNCIA DO PRESENTE TRABALHO
A importância desse trabalho reside na busca de conhecimentos acerca da
atividade fungitóxica de substâncias produzidas pela C. canadensis, o que pode
levar à obtenção de um produto viável para aplicações agrícolas e que apresente
melhorias com relação aos produtos comercialmente disponíveis, principalmente no
que se refere à sua eficácia e à sua toxicidade. Mais especificamente, embora seja
conhecida a atividade antifúngica dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME,
presentes na C. canadensis contra os fungos C. acutatum, C. fragariae e C.
27
gloeosporioides, ainda não se conhece a atividade contra os fungos Alternaria
alternata, Aspergillus niger, Botryosphaeria dothidea, Cladosporium sp., Fusarium
pallidoroseum, Lasiodiplodia theobromae e Penicillium digitatum. O controle destes
fungos é de grande importância na pós-colheita de vários tipos de frutas, tais como
uva, manga, melão, laranja, dentre outros (CAMARGO et al., 2011; TERAO et al.,
2008).
Este trabalho objetivou dar continuidade aos estudos de Queiroz et al. (2012)
com a C. canadensis utilizando, para tanto, espécimes da planta coletados no Brasil.
O foco foi estudar a viabilidade dos compostos bioativos puros e dos extratos
aquosos da planta como fungicidas naturais na agricultura. O uso do extrato possui
como vantagens: a maior facilidade de obtenção a partir das plantas, uma menor
probabilidade de danos à saúde humana e ao ambiente e um menor risco de
desenvolvimento de novos mecanismos de resistência devido ao uso contínuo, uma
vez que o extrato pode possuir diversos princípios ativos com efeito sinergético
(BAKKALI et al., 2008; BURT, 2004).
De modo a se obter extratos da planta que fossem viáveis para futuras
aplicações em frutas pós-colheita, optou-se pela técnica de PHWE para se realizar
as extrações, uma vez que os extratos gerados seriam aquosos e isso eliminaria a
presença de solventes tóxicos. Como a PHWE tem sido extensivamente empregada
na extração de compostos bioativos em plantas e também na obtenção de seus
óleos essenciais voláteis, apresentando uma eficiência semelhante ou maior à das
outras técnicas aqui abordadas (HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011;
TEO et al., 2010), esta técnica se mostra ideal para a aplicação desejada neste
trabalho. Este pensamento é reforçado, ainda, pelo grande interesse em se
substituir a extração por maceração, empregada em Queiroz et al. (2012), dado ser
este um método que consome tempo e envolve um maior número de etapas de
purificação, consumindo grandes volumes de solventes orgânicos tóxicos
(SIQUEIRA et al., 2011).
28
29
II. OBJETIVOS
30
31
O objetivo geral deste trabalho foi investigar a presença dos princípios ativos
descritos por Queiroz et al. (2012) nos espécimes brasileiros de C. canadensis, bem
como avaliar a atividade antifúngica dessas substâncias isoladas contra diversos
fungos associados à doenças pós-colheita de frutas.
Como objetivos específicos, pretendeu-se:
i. Isolar e identificar os compostos fungicidas presentes nos espécimes de C.
canadensis coletados no Estado de São Paulo.
ii. Desenvolver e otimizar um método para a extração dos princípios ativos com
a utilização da técnica de PHWE em um sistema de extração acelerada por
solvente (ASE® Dionex)
iii. Estabelecer um método analítico baseado em cromatografia a gás com
detecção por ionização em chama (GC-FID), a fim de determinar o teor dos
princípios ativos nos extratos das plantas coletadas.
iv. Submeter os princípios ativos puros a bioensaios para averiguação de sua
atividade antifúngica contra diversos fungos associados a doenças pós-
colheita em frutas.
v. Avaliar a concentração mínima inibitória dos princípios ativos para os fungos
que se mostraram susceptíveis ao tratamento.
32
33
III. PARTE
EXPERIMENTAL
34
35
III.1. EQUIPAMENTOS
o Banho de ultrassom Ultracleaner 700 (Unique, Brasil);
o Bomba de diafragma Vario® MZ 2C NT (Vacuubrand, Alemanha);
o Câmara de germinação BF2 CGFP 275 (Biofoco, Brasil);
o Concentrador rotativo a vácuo RVC 2-25 CD plus (Martin Christ, Alemanha);
o Armadilha fria para solventes do tipo Cooling trap CT 02-50 SR (Martin
Christ, Alemanha);
o Espectrômetro de Ressonância Magnética Nuclear Avance III 400 MHz
(Bruker, Alemanha);
o Cabine de segurança biológica Pa420 Classe II, tipo A1 (Pachane, Brasil);
o Cromatógrafo a gás modelo 3900 com detector ion trap modelo Saturn
2100T (Varian, EUA);
o Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector quadrupolo modelo 5975C
inert XL MSD (Agilent, EUA);
o Cromatógrafo a gás modelo 7890A com detector por ionização em chama
(Agilent, EUA);
o Cromatógrafo a gás modelo GC-2010 Plus com detector triplo quadrupolo
modelo TQ8040 (Shimadzu, Japão);
o Microscópio óptico Leitz Dialux 22 (Leica, EUA);
o Moinho de facas TE 340 (Marconi, Brasil).
o Purificador de água Milli-Q Academic (Millipore, EUA);
o Rotaevaporador RII (Büchi, Alemanha);
o Sistema de extração acelerada por solvente ASE® Dionex 350 (Thermo
Scientific, EUA);
o Sistema de cromatografia flash Isolera Four (Biotage, Suécia);
III.2. REAGENTES E SOLVENTES
o Acetato de etila, grau HPLC (Tedia, EUA);
o Clorofórmio (Carlo Erba, Itália);
o Cloreto de sódio (Synth, Brasil);
36
o Diclorometano (Carlo Erba, Itália);
o Dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich, EUA);
o Hexano (Mallinckrodt, EUA);
o Metanol (Synth, Brasil);
o Sulfato de magnésio seco (MgSO4) (Vetec Química Fina, Brasil).
o Meio de cultura em pó BDA (Himedia, Índia)
III.3. PADRÕES ANALÍTICOS E COMPOSTOS ISOLADOS
o 4Z-Lachnophyllum lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);
o 4Z,8Z-Matricaria lactona (isolada a partir da planta C. canadensis);
o Cumarina (pureza ≥ 99,9%) (Synth, Brasil)
o Nistatina (potência ≥ 4400 U.USP/mg) (Sigma-Aldrich, EUA)
III.4. PROCEDIMENTOS
III.4.1. Coleta de plantas.
As plantas foram coletadas no município de Casa Branca/SP (junho/2013) e
no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, em Jaguariúna/SP
(agosto/2013). As exsicatas foram depositadas no herbário do Instituto de Biologia
da Unicamp (UEC) sob os números 179014 e 179015, respectivamente.
III.4.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos
extratos.
i) Extração: a parte aérea (caule, folhas e flores) das plantas coletadas foi seca
em estufa a 40 °C durante o período de uma semana. As plantas secas foram
moídas em um moinho de facas. Posteriormente, 250 g de planta moída
foram transferidos para um erlenmeyer e foi realizada uma extração com
solvente sob agitação magnética. Foram empregados 500 mL de
37
diclorometano (DCM) em 3 ciclos de 24 h a temperatura ambiente. A cada
ciclo, foi efetuada a renovação do solvente. Ao final, o solvente de cada ciclo
foi combinado e removido em rotaevaporador (40 °C).
ii) Partição do extrato: o extrato seco obtido com DCM foi dissolvido em 150 mL
de uma mistura metanol:água (90:10, v/v) usando banho de ultrassom. Em
seguida, o extrato foi particionado com 3 x 200 mL de hexano e a fração
hexânica foi reservada. Na fração metanólica remanescente, uma quantidade
de água foi adicionada a fim de que a proporção metanol:água passasse a
ser 70:30, v/v. Em seguida, a fração metanólica foi particionada com 3 x 200
mL de clorofórmio. A fração clorofórmica obtida foi seca com MgSO4 e o
solvente foi removido em rotaevaporador (40 °C).
iii) Análises por GC-MS: as frações hexânica e clorofórmica obtidas na partição
foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a gás com
detector de massas do tipo ion trap e ionização por elétrons. A separação
dos compostos foi realizada com uma coluna Restek Rxi-5ms (30 m x 0,250
mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 60-240 °C (3 °C min-1) e
240 °C por 5 minutos. A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da
transferline foi de 250 °C e a temperatura do ion trap foi de 180 °C. O volume
de injeção utilizado foi de 1 μL (modo splitless), a vazão do gás de arraste foi
de 1 mL min-1 e a concentração dos extratos foi de 1 mg mL-1 em
diclorometano.
iv) Isolamento dos compostos por cromatografia preparativa tipo flash: o extrato
clorofórmico foi submetido a uma separação no sistema de cromatografia
flash utilizando-se um cartucho SNAP KP-Sil 100 g (39×157 mm, 40-50 μm,)
com 132 mL de volume de coluna (CV), uma vazão de 25 mL min−1, uma fase
móvel composta por hexano:acetato de etila (A:B) com eluição por gradiente:
2% B por 2 CV, 2 – 20% B por 10 CV e 20% B por 2 CV. As frações do
número 70 ao 90, que apresentaram sinais no detector UV do equipamento
(254 e 280 nm), foram conduzidas para a análise em GC-MS, a fim de se
avaliar sua composição. Baseado nos cromatogramas obtidos, seis frações
38
foram agrupadas e identificadas como sendo o composto 4Z-LL e outras seis
frações como sendo o composto 4Z,8Z-ML. Nove frações intermediárias
foram agrupadas para uma posterior purificação, já que apresentaram
impurezas ou eram misturas dos dois compostos obtidos.
III.4.3. Caracterização das substâncias puras isoladas.
i) Análises por GC-MS: as substâncias purificadas pela cromatografia flash
preparativa foram analisadas por GC-MS. Foi utilizado um cromatógrafo a
gás com detector de massas do tipo quadrupolo e ionização por elétrons
(70 eV). A separação foi realizada com uma coluna Agilent HP-5ms (30 m x
0,250 mm x 0,25 μm). A programação de temperatura foi 120-240 °C (8 °C
min-1). A temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da transferline foi
de 200 °C, a temperatura da fonte foi de 230 °C e a temperatura do
quadrupolo foi de 150 °C. O volume de injeção utilizado foi de 1 μL, com split
1:100, a vazão do gás de arraste foi de 1 mL min-1 e a concentração das
substâncias foi de 200 μg mL-1 em acetato de etila.
ii) Análises por GC-MS/MS: a identidade das moléculas foi confirmada, ainda,
por análise por GC-MS/MS. Foi utilizado um cromatógrafo a gás com detector
de massas triplo quadrupolo e ionização por elétrons (70 eV). A separação
foi realizada com uma coluna Restek Rtx-5MS (30 m x 0,250 mm x 0,25 μm).
Foi empregada uma corrida isotérmica a 115 °C por 19 minutos. A
temperatura do injetor foi 240 °C, a temperatura da transferline foi de 200 °C
e a temperatura da fonte de íons 230 °C. O volume de injeção utilizado foi de
2 μL (modo splitless), a vazão do gás de arraste (nitrogênio) foi 2 mL min-1 e
a concentração das substâncias foi de 50 μg mL-1 em acetato de etila. O
sistema foi operado no modo SIM/Scan com energia de colisão de 12 V e
argônio como gás de colisão. Para cada composto o íon precursor foi seu
próprio íon molecular: m/z 162 (4Z-LL) e m/z 160 (4Z,8Z-ML).
iii) Análises por NMR de 1H e 13C: amostras de 10 mg dos compostos 4Z-LL e
4Z,8Z-ML previamente isolados conforme descrito na seção III.4.2, foram
analisadas por NMR de 1H e 13C. As amostras foram diluídas em CDCl3 e
39
analisadas em um espectrômetro de NMR da marca Bruker, modelo Avance,
nas frequências de 400 MHz (1H) e 100 MHz (13C) para o composto 4Z-LL e
nas frequências 500 MHz (1H) e 125 MHz (13C) para o composto 4Z,8Z-ML.
iv) Análises por NMR 2D (1H-13C HSQC e 1H-1H COSY): também foram
realizados experimentos 2D de 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY para auxiliar na
caracterização estrutural dos analitos. As frequências empregadas foram as
mesmas dos experimentos 1D descritos anteriormente.
III.4.4. Teste preliminar: extração dos analitos de interesse da
planta por PHWE.
i) Extração: uma porção de 5,0 (± 0,1) g da planta moída foi submetida à
extração por PHWE. A extração foi realizada a 100 °C em 3 ciclos de 20
minutos. Esse procedimento gerou cerca de 40 mL de extrato bruto.
ii) Partição líquido-líquido do extrato: o extrato bruto obtido por PHWE foi
particionado com 3 x 100 mL de acetato de etila. A fração orgânica obtida foi
seca com MgSO4 e, em seguida, o solvente foi removido em rotaevaporador
(40 °C).
iii) Análise por GC-MS: O extrato purificado obtido foi analisado por GC-MS
conforme descrito no item (i) da sessão III.4.3, excetuando-se a rampa de
aquecimento empregada, que foi de 90-150 °C (3 °C min-1), 150-280 °C (20
°C min-1) e 280 °C por 5 minutos. Anterior a análise, os extratos foram diluídos
com acetato de etila para uma concentração de 1,0 mg mL-1. A presença dos
compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi identificada pelos espectros de massas dos
picos obtidos no cromatograma.
III.4.5. Otimização da extração via PHWE
A otimização da extração via PHWE foi realizada alterando-se, de maneira
univariada, os parâmetros de temperatura, tempo de ciclo e número de ciclos, de
modo a verificar o efeito de cada um, separadamente, na eficiência da extração.
40
III.4.5.1. Temperatura
i) Extração: Porções de 5 g da planta moída foram submetidas à extração por
PHWE em cinco diferentes temperaturas: 70, 90 100, 110 e 130 °C. O
número de ciclos foi fixado em 3 e o tempo de cada ciclo em 20 minutos. As
extrações foram realizadas em duplicata para cada temperatura, gerando
~40 mL de extrato aquoso bruto por extração.
ii) Partição: Após a extração, 20 mL de cada extrato aquoso foram transferidos,
em duplicata, para tubos tipo Falcon (50 mL). A partição foi feita com
3 x 15 mL de acetato de etila. As três frações de acetato de etila obtidas foram
reunidas em outro tubo tipo Falcon (50 mL) e o solvente foi evaporado com
auxílio de N2 até que seu volume tivesse sido reduzido a aproximadamente
10 mL. O solvente remanescente foi seco com MgSO4 e filtrado em seringa
com filtro de celulose reconstituída (0,22 µm). Já seco, o solvente foi
transferido para um tubo Falcon (15 mL, previamente pesado) e removido em
evaporador rotativo a vácuo (2 horas, 50°C). Os extratos secos tiveram,
então, suas massas determinadas.
III.4.5.2. Tempo de ciclo
i) Extração: Porções de 5 g da planta moída foram submetidas à extração por
PHWE em cinco diferentes tempos de ciclo: 1, 5, 10, 20 e 30 minutos. O
número de ciclos foi fixado em 3 e a temperatura foi mantida em 100 °C As
extrações foram realizadas em duplicata para cada tempo.
ii) Partição: a partição foi realizada conforme descrito no item (ii) da sessão
III.4.5.1.
III.4.5.3. Número de ciclos
i) Extração: uma mesma cela de extração contendo 5 g da planta moída foi
submetida a 4 extrações consecutivas, de modo a simular 4 ciclos de
extração. Assim, os extratos representando cada um dos ciclos foram obtidos
41
separadamente. As extrações foram realizadas a uma temperatura de 100
°C com ciclos de 1 minuto. O procedimento foi realizado em duplicata.
ii) Partição: a partição foi realizada conforme descrito no item (ii) da sessão
III.4.5.1.
III.4.5.4. Repetitividade do procedimento de extração
Neste trabalho, foi avaliada a repetitividade intra-dia e inter-dia do método de
extração. O coeficiente de variação (CV) intra-dia foi determinado por meio da
análise, no mesmo dia, de soluções do extrato purificado nas concentrações
descritas na Tabela 1 (pág. 38). O extrato foi obtido em quintuplicata para essa
determinação. O CV inter-dia foi determinado modificando-se o dia da análise. As
concentrações das soluções de extrato purificado analisadas neste ensaio também
se encontram na Tabela 1. Neste caso, o extrato foi obtido em triplicata.
A extração e a purificação do extrato se deram da seguinte forma:
i) Extração: porções de 5 g da planta moída foram submetidas à extração por
PHWE nas condições otimizadas previamente: temperatura de 100 °C, com
4 ciclos de 1 minuto cada.
ii) Partição: a partição foi realizada conforme descrito no item (ii) da sessão
III.4.5.1, com uma modificação. Neste ensaio, o extrato aquoso bruto obtido
foi avolumado em balão de 50 mL e somente uma alíquota de 20 mL foi
particionada.
III.4.6. Determinação dos analitos de interesse nos extratos
purificados
Em todos os extratos purificados por partição deste trabalho, os analitos de
interesse (4Z-LL e 4Z,8Z-ML) foram quantificados da seguinte forma:
i) Condições cromatográficas: foi utilizado um cromatógrafo a gás com sistema
de detecção por ionização em chama (FID). A separação foi realizada em
42
uma coluna Agilent HP-5 (30 m x 0,320 mm x 0,25 μm). Para a obtenção da
curva analítica, foi empregada uma corrida isotérmica a 115 °C por 19
minutos e, na análise dos extratos, foi adicionada a esta condição uma rampa
de limpeza de 115 a 200 °C (20 °C min-1). A temperatura do injetor foi de
200 °C e a temperatura do detector foi de 300 °C. O volume de injeção
utilizado foi de 1 μL, com split 1:50. A vazão do gás de arraste (nitrogênio) foi
de 2 mL min-1
ii) Preparo das soluções-padrão: as soluções-estoque dos compostos 4Z-LL e
4Z,8Z-ML isolados da planta foram preparadas separadamente em acetato
de etila, na concentração de 1000 µg mL-1.
iii) Curva analítica: a curva analítica foi obtida a partir de soluções de trabalho
preparadas em acetato de etila contendo os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
nas concentrações de 5, 10, 20, 30, 40 e 50 µg mL-1. Foi utilizado
padronização interna com cumarina na concentração de 15 µg mL-1
iv) Análise dos extratos purificados por partição: as amostras de extrato
purificado foram preparadas nas concentrações descritas na Tabela 1 e
analisadas nas condições cromatográficas citadas anteriormente. Para cada
um dos dois compostos, foi necessária a utilização de uma determinada
concentração de extrato, de modo a fazer com que as áreas dos seus picos
sempre estivessem dentro da faixa linear de trabalho.
43
Tabela 1 - Concentrações em que cada extrato obtido foi analisado por GC-FID.
Etapa Concentração do extrato (mg mL-1)
4Z-LL 4Z,8Z-ML
Otimização da temperatura (°C)
(3 ciclos de 20 minutos)
70 0,40 1,60
90 0,20 1,00
100 0,25 1,00
110 0,30 1,00
130 0,70 1,00
Otimização do tempo de ciclo (min)
(3 ciclos a 100 °C)
1 0,16 1,00
5 0,16 1,00
10 0,24 1,00
20 0,30 1,00
30 0,36 1,00
Otimização do número de ciclos
(ciclos de 1 min a 100 °C)
1º ciclo 1,00 1,00
2º ciclo 1,00 1,00
3º ciclo 1,00 1,00
4º ciclo 1,00 1,00
Repetitividade
(4 ciclos de 1 minuto a 100°C)
Intra-dia 0,25 1,00
Inter-dia 0,25 1,00
III.4.7. Bioensaios
Os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML, isolados da planta C. canadensis, tiveram
suas atividades antifúngicas avaliadas contra 10 fungos associados a doenças pós-
colheita de frutas. Os fungos utilizados foram isolados a partir de diferentes frutas
(laranja, manga, melão e uva) e estão identificados na Tabela 2. Foi realizado um
screening via ensaio de difusão em disco com o intuito de averiguar quais fungos
se mostrariam susceptíveis aos compostos avaliados para, posteriormente,
estabelecer qual a concentração mínima inibitória de cada composto contra os
fungos afetados.
44
Tabela 2 - Fungos utilizados nos bioensaios para avaliação da atividade antifúngica dos
compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML.
Código Fungo Fruta
CCMA 1129 Colletotrichum gloeosporioides
Manga CCMA 1130 Alternaria alternata CCMA 1131 Lasiodiplodia theobromae CCMA 1133 Botryosphaeria dothidea
CCMA 1132 Aspergillus niger
Uva CCMA 1135 Alternaria alternata CCMA 1136 Cladosporium sp.
CCMA 1134 Fusarium pallidoroseum
Melão CCMA 1137 Alternaria alternata
CCMA 1190 Penicillium digitatum Laranja
CCMA: Coleção de Cultura de Microrganismos de Importância Agrícola e Ambiental.
III.4.7.1. Ensaios de difusão em disco
i) Meio de cultura: Foram preparados 500 mL de meio de cultura BDA (batata-
dextrose-ágar) em erlenmeyer (1000 mL). O meio foi autoclavado a 120 °C
por 20 min e, após o resfriamento, vertido em placas de Petri descartáveis
(90 x 15 mm).
ii) Preparação dos discos de celulose: Discos de celulose esterilizados (Ø = 6
mm) foram impregnados com 10 µL de solução de amostra (4Z-LL ou 4Z,8Z-
ML) em acetato de etila na concentração de 5 mg mL-1, o que corresponde a
50 µg de substância por disco. Os discos foram depositados sobre as placas
conforme mostrado na Figura 7. Como controle (C), foram utilizados discos
impregnados apenas com acetato de etila puro.
45
Figura 7 - Disposição do inóculo e dos discos de celulose na placa de Petri para o ensaio de
difusão em disco.
iii) Preparo do inóculo: Os fungos de baixa esporulação e/ou crescimento mais
rápido (CMAA 1129, 1130, 1131, 1133, 1134, 1135 e 1137) foram inoculados
com um plug micelial circular obtido a partir de uma cultura do fungo isolado.
O plug foi colocado no centro da placa (Figura 7) de modo a se obter um
crescimento o mais uniforme possível. Já os fungos de esporulação mais
intensa e/ou crescimento mais lento (CMAA 1132, 1136 e 1190) foram
inoculados com uma suspensão de 106 esporos mL-1. A concentração de
esporos na solução foi determinada por contagem em câmara de Neubauer.
iv) Incubação: as placas foram incubadas em câmara de germinação a 28±1 °C
por um período que variou de 2 a 20 dias, conforme a velocidade de
crescimento de cada fungo.
III.4.7.2. Concentração Mínima Inibitória
Os ensaios de MIC foram realizados pelo método de microdiluição em caldo
empregando-se microplacas com 96 poços. Esse método foi adaptado da norma
M38-A do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute): “Referência para
Testes de Diluição em Caldo para a Determinação da Sensibilidade a Terapia
Antifúngica dos Fungos Filamentosos” (CLSI, 2002).
46
Em cada poço da microplaca foram dispensados 95 µL de meio de cultura
(RPMI 1640), 100 µL de solução com determinada concentração da substância
avaliada diluída no meio de cultura e 5 µL de solução de esporos na concentração
de 106 esporos mL-1. As soluções das substâncias avaliadas foram preparadas em
diferentes concentrações a partir de uma solução estoque na concentração de
128 µg mL-1 em meio de cultura contendo 10% de DMSO. As concentrações finais
dos compostos em cada poço foram de 64, 32, 16, 8 e 4 µg mL-1. Como controle
positivo (CI) foram utilizados 100 µL de uma solução de nistatina (64 µg mL-1) e
como controle negativo (CII) foram utilizados 100 µL de solução de NaCl
(0,85% m/v). Tanto o controle (CI e CII) quanto as soluções dos compostos em
diferentes concentrações foram avaliados em quintuplicata. As placas foram
incubadas por 48 horas a 35±2 °C. A Figura 8 esquematiza o teste de microdiluição
empregado. Os fungos avaliados foram Aspergillus niger (CMAA 1132),
Cladosporium spp. (CMAA 1136) e Penicillium digitatum (CMAA 1190). A MIC foi
determinada observando-se quais poços não apresentavam crescimento visível dos
fungos após o período de incubação.
Figura 8 - Teste de microdiluição em caldo para a determinação de MIC.
47
IV. RESULTADOS E
DISCUSSÃO
48
49
Os resultados apresentados envolvem o isolamento e a caracterização dos
compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML encontrados nos espécimes de C. canadensis
brasileiros; os ensaios visando a extração destes compostos por PHWE; a
otimização do método de extração e os bioensaios para avaliação da atividade
antifúngica das substâncias obtidas contra os fungos descritos na Tabela 2
(pág 39).
IV.1. Coleta das plantas
Inicialmente, para que este trabalho pudesse se concretizar, foi necessário
coletar e investigar a presença dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e 2Z,8Z-ME nos
espécimes de C. canadensis nativos do Brasil. Apesar desses compostos terem
sido encontrados em plantas nativas dos EUA, não necessariamente eles seriam
encontrados em plantas brasileiras, uma vez que são metabólitos secundários cujo
mecanismo de produção pode estar associado a fatores de estresse específicos de
cada região (temperatura, patógenos, insetos, deficiência de nutrientes, entre
outros) (MAZID; KHAN; MOHAMMAD, 2011; MIRESMAILLI; ISMAN, 2014;
ZHONG, 2011).
Visando coletar espécimes em quantidade suficiente para os ensaios, foi feita
uma busca por locais onde a C. canadensis era encontrada em abundância. Como
essa planta se estabelece em lavouras (entressafra) e áreas com manejo reduzido
do solo (LAZAROTO; FLECK; VIDAL, 2008), não houve dificuldades em se
encontrá-la numa fazenda no município de Casa Branca/SP em junho de 2013 (UEC
179014) e no campo experimental da Embrapa Meio Ambiente, no município de
Jaguariúna/SP, em agosto de 2013 (UEC 179015).
As plantas coletadas foram secas por uma semana em estufa a 40 °C e
moídas conforme procedimento descrito no item i da sessão III.4.2.
50
IV.2. Extração e isolamento das substâncias puras a partir dos
extratos
A extração e o isolamento dos compostos alvo foram realizados inicialmente
conforme descrito por Queiroz et al. (2012) e detalhado sessão III.4.2. A partir de
250 g da planta foram obtidos 13,1 g de extrato bruto. Após partição deste extrato
com diferentes solventes, as frações clorofórmica e hexânica foram analisadas por
GC-MS para averiguar a eventual presença dos compostos 4Z-LL, 4Z,8Z-ML e
2Z,8Z-ME. Na análise, foi constatado que os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML estavam
presentes em quantidades significativas tanto na fração clorofórmica quanto na
fração hexânica. O composto 2Z,8Z-ME também foi encontrado em ambas as
frações, no entanto, em quantidades muito reduzidas, impossibilitando seu
isolamento com o procedimento adotado.
A baixa concentração de 2Z,8Z-ME encontrada nos extratos da planta difere
do resultado obtido por Queiroz et al. (2012), no qual este é o composto isolado em
maior quantidade. No entanto, isso não é surpreendente, uma vez que diversos
artigos reportam variações na composição do óleo essencial de C. canadensis,
conforme o local coletado e a fase de crescimento da planta (LIS; PIGGOTT; GÓRA,
2003; TZAKOU et al., 2005).
Como a fração clorofórmica foi aquela que apresentou menos concomitantes,
ela foi submetida à separação em sistema de cromatografia flash preparativa para
o isolamento dos analitos de interesse. Possivelmente devido à semelhança entre
as moléculas de 4Z-LL e 4Z,8Z-ML (Figura 4), a técnica não foi capaz de separá-
las completamente. Das frações coletadas, seis delas foram agrupadas e
identificadas como sendo o composto 4Z-LL (~338 mg) e outras seis como sendo o
composto 4Z,8Z-ML (~53 mg). No entanto, nove frações intermediárias (~476 mg)
foram agrupadas para uma posterior purificação, já que eram misturas dos dois
compostos obtidos ou apresentaram impurezas.
51
IV.3. Caracterização das Substâncias Puras Isoladas
IV.3.1. Análises por GC-MS e GC-MS/MS
As análises de GC-MS das frações descritas no item IV.2 indicaram que o
isolamento dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi atingido com sucesso. A existência
de um único pico nos cromatogramas aliada à presença dos fragmentos
característicos de cada molécula no espectro de massas, são fortes indicativos de
que ambos os compostos foram isolados e estavam puros. As Figura 9 Figura 10
mostram os cromatogramas obtidos para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML,
respectivamente, após o processo de isolamento. Também são apresentados os
espectros de massas correspondentes a cada pico. Os espectros obtidos estão de
acordo com a literatura e confirmam a identidade das moléculas (BÄR; SCHULTZE,
1996; CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).
52
Figura 9 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z-LL (acima) e seu respectivo espectro
de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de
120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C,
temperatura da fonte 230 °C e temperatura do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split
1:100, vazão do gás de arraste 1 mL min-1, concentração do composto 200 μg mL-1, solvent delay
5 minutos.
LACH MATR MATRES
53
Figura 10 - Cromatograma (TIC) obtido para o composto 4Z,8Z-ML (acima) e seu respectivo
espectro de massas (abaixo). Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura
de 120-240 °C (8 °C min-1). Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da transferline 200 °C,
temperatura da fonte 230 °C e temperatura do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split
1:100, vazão do gás de arraste 1 mL min-1, concentração do composto 200 μg mL-1, solvent delay
5 minutos.
LACH MATR MATRES
54
De modo a confirmar a identidade dos compostos isolados e identificados por
GC-MS, a cromatografia a gás associada à espectrometria de massas sequencial
(GC-MS/MS) foi utilizada. Para ambos os analitos, o íon precursor foi o seu próprio
íon molecular, monitorado no modo SIM (Single Ion Monitoring). Após a sua
fragmentação, os íons produto forneceram espectros de massas cujos padrões de
fragmentação foram consoantes com as estruturas das moléculas.
A Figura 11 mostra o espectro MS2 do íon molecular do composto 4Z-LL
(m/z 162). Seus íons produto estão de acordo com a fragmentação proposta na
literatura, apresentando picos em m/z 147 [M-CH3]+, m/z 133 [M-C2H5]+, m/z 119
[M-C3H7]+, m/z 105 [M-C2H5-CO]+, m/z 91 [M-C3H7-CO]+ e m/z 82 [C4H2O2]+
(QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).
Figura 11 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 162 (composto 4Z-LL).
A Figura 12 mostra o espectro MS2 do íon molecular do composto 4Z,8Z-ML,
(m/z 160). A fragmentação de seus íons produto foi proposta com base na
fragmentação de seu isômero 4E,8Z-ML, uma vez que, somente para este
composto, foi encontrada descrição do padrão de fragmentação na literatura (BÄR;
SCHULTZE, 1996). O espectro apresenta picos em m/z 145 [M-CH3]+,
m/z 131 [M-C2H5]+, m/z 104 [M-C2H4-CO]+, e m/z 78 [M-C4H2O2]+.
55
Figura 12 - Espectro MS2 do íon [M+] em m/z 160 (composto 4Z,8Z-ML).
IV.3.2. Análises por NMR de 1H e 13C
As análises de NMR de 1H e 13C confirmaram as estruturas dos compostos
4Z-LL e 4Z,8Z-ML isolados a partir de extratos da planta C. canadensis. A Tabela 3
mostra os deslocamentos químicos de carbono e de hidrogênio atribuídos a cada
um dos compostos. Os dados estão em conformidade com a literatura, indicando
que os analitos de interesse foram isolados adequadamente (CSUPOR-LÖFFLER
et al., 2011; QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989).
Tabela 3 - Deslocamentos químicos dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos ensaios de NMR de 1H e 13C.
4Z-LL (C10H10O2) 4Z,8Z-ML (C10H8O2)
Posição δ 1H (ppm), J (Hz) δ 13C (ppm) δ 1H (ppm), J (Hz) δ 13C (ppm)
1 -- 168,9 -- 168,8 2 6,22 (1H, d, J = 5,2) 120,1 6,25 (1H, dd, J = 5,4 e 0,5) 120,4 3 7,37 (1H, d, J = 5,2) 142,6 7,40 (1H, d, J = 5,0) 142,4 4 -- 156,0 -- 155,9 5 5,31 (1H, t, J = 2,4) 95,1 5,48 (1H, d, J = 2,5) 94,6 6 -- 104,6 -- 88,0 7 -- 74,8 -- 99,4 8 2,43 (2H, td, J = 7,2 e 2,4) 21,8 5,72 (1H, dm, J = 10,5) 109,9 9 1,62 (2H, sext, J = 7,2) 22,1 6,16 (1H, dq, J = 10,5 e 7,0) 141,8
10 1,03 (3H, t, J = 7,2) 13,5 1,97 (3H, dd, J = 7,0 e 1,5) 16,5
Os espectros de NMR 1H e 13C para o composto 4Z-LL estão mostrados nas
Figura 13 e Figura 14, respectivamente.
56
Figura 13 - Espectro de NMR 1H a 400 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.
Figura 14 - Espectro de NMR 13C a 100 MHz em CDCl3 para o composto 4Z-LL.
CHDDD
Cl3
TMS 3 2 5
8 9
10
CHCl3
10 9
7
5
6
2 3
4 1
CDCl3
8
57
Os espectros de NMR 1H e 13C para o composto 4Z,8Z-ML estão mostrados
nas Figura 15 e Figura 16, respectivamente.
Figura 15 – Espectro de NMR 1H a 500 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.
TMS
CHCl3 3 2
9 8 5
10
58
Figura 16 – Espectro de NMR 13C 125 MHz em CDCl3 para o composto 4Z,8Z-ML.
No espectro de NMR 1H da Figura 13, é importante ressaltar que a integração
do sinal em 1,62 ppm foi de 2,8 e não de aproximadamente 2, como era esperado
para a molécula de 4Z-LL. Isso ocorreu devido à presença de água na amostra ou
no solvente, pois, em CDCl3, o deslocamento químico da água ocorre em,
aproximadamente, 1,56 ppm (GOTTLIEB; KOTLYAR; NUDELMAN, 1997). A
presença de tal deslocamento também pode ser observada no espectro da Figura
15, porém, nesse caso, ele não interferiu com nenhum outro sinal.
As análises de NMR foram imprescindíveis para a determinação da
estereoisomeria dos compostos isolados. Tal dado é relevante, pois entre as
espécies da tribo Astereae – a qual pertence a planta C. canadensis – é comum
encontrarem-se os isômeros E e Z dos analitos de interesse (CHRISTENSENT;
LAM, 1991; CSUPOR-LÖFFLER, 2012). No caso do composto 4Z-LL, que foi
encontrado na planta, é possível diferi-lo do isômero 4E-LL principalmente pelo
deslocamento químico do H-5, que ocorre em torno de 5,30 ppm para o isômero Z,
TMS
CDCl3
TMS 1 4
3 9
2 8 10
6
5
7
59
mas é deslocado para menor campo (0,35–0,45 ppm) no isômero E (RIVERA;
ARANCIBIA; CASTILLO, 1989). Para o composto 4Z,8Z-ML, obtido a partir dos
extratos da planta, temos uma situação semelhante. Sua diferenciação do isômero
4E,8Z-ML, cuja presença foi reportada em exemplares de C. canadensis por
Csupor-Löffler et al.(2011), é possível, novamente, graças ao deslocamento
químico do H-5, que ocorre em torno de 5,48 ppm para o isômero 4Z,8Z, mas em
torno de 5,79 ppm para o isômero 4E,8Z (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011).
IV.3.3. Análises por NMR 1H-13C HSQC e 1H-1H COSY
A análise por NMR 1H-13C HSQC traz informações acerca do acoplamento
entre o carbono e o(s) hidrogênio(s) ligado(s) diretamente a ele (1JCH). A sigla HSQC
quer dizer heteronuclear single quantum coherence (coerência quantica
heteronuclear única), o que significa que dois diferentes tipos de núcleo (no caso,
1H e 13C) são correlacionados em um experimento 2D. Os picos desse tipo de
espectro aparecem no cruzamento entre o sinal do carbono (vertical) e o sinal do
hidrogênio (horizontal), indicando que existe correlação entre estes dois núcleos, ou
seja, que existe uma ligação simples entre eles (JACOBSEN, 2007a).
Para o composto 4Z-LL, o espectro de NMR 1H-13C HSQC (Figura 17)
confirmou a estrutura da molécula, mostrando correlações entre os três hidrogênios
(H-10) em 1,03 ppm e o carbono (C-10) em 13,5 ppm; entre o hidrogênio (H-5) em
5,31 ppm e o carbono (C-5) em 95,1 ppm; entre o hidrogênio (H-3) em 7,37 ppm e
o carbono (C-3) em 142,6 ppm e entre o hidrogênio (H-2) em 6,22 ppm e o carbono
(C-2) em 120,1 ppm.
Com o auxílio desta técnica, também foi possível descobrir um equívoco na
atribuição encontrada na literatura para os carbonos C-8 e C-9 do composto
4Z-LL (RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO, 1989). Via de regra, espera-se que,
quanto maior a proximidade da ligação tripla, maior o deslocamento do sinal do
hidrogênio no espectro de NMR 1H para campos menores (maiores frequências),
devido à redução de sua blindagem pelo efeito anisotrópico dos elétrons π da
instauração (PAVIA; LAMPMAN; KRIZ, 2001). Desse modo, no espectro de
60
NMR 1H (Figura 13), os hidrogênios em 1,62 e 2,43 ppm devem ser atribuídos a
H-9 e H-8 respectivamente, como atesta a literatura anteriormente citada. No
entanto, estes mesmo artigos atribuem aos carbonos C-9 e C-8, os sinais
encontrados, respectivamente, em 21,8 e 22,1 ppm, no espectro de NMR 13C
(Figura 14). Contudo, o espectro de NMR 1H-13C HSQC revela que o hidrogênio
H-9 se correlaciona com o carbono em 22,1 ppm e, portanto, este sim deveria ser
identificado como C-9. O hidrogênio H-8, por sua vez, se correlaciona com o
carbono em 21,8 ppm, sendo este aquele que deveria ser identificado como C-8.
Estes dados são, ainda, compatíveis com tabelas encontradas na literatura para o
deslocamento de carbonos e hidrogênios próximos a triplas ligações (PRETSCH;
BÜHLMANN; BADERTSCHER, 2009).
Figura 17 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z-LL.
61
Para o composto 4Z,8Z-ML, o espectro de NMR 1H-13C HSQC (Figura 18)
apenas confirmou a estrutura da molécula, mostrando correlações entre os três
hidrogênios (H-10) em 1,97 ppm e o carbono (C-10) em 16,5 ppm; entre o
hidrogênio (H-9) em 6,16 ppm e o carbono (C-9) em 141,8 ppm; entre o hidrogênio
(H-8) em 5,72 ppm e o carbono (C-8) em 109,9 ppm; entre o hidrogênio (H-5) em
5,48 ppm e o carbono (C-5) em 94,6 ppm; entre o hidrogênio (H-3) em 7,40 ppm e
o carbono (C-3) em 142,4 ppm e entre o hidrogênio (H-2) em 6,25 ppm e o carbono
(C-2) em 120,4 ppm. Especial destaque à região ampliada do espectro, que
diferencia com clareza os carbonos C-3 e C-8 a partir dos hidrogênios diretamente
ligados a eles. Estes dados estão de acordo com o descrito na literatura para o
composto 4Z,8Z-ML (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011).
Figura 18 - Espectro de NMR 1H-13C HSQC para o composto 4Z,8Z-ML.
62
A análise por NMR 1H-1H COSY correlaciona um próton a outro através de
seus acoplamentos, usualmente com duas ou três ligações de distância (2J e 3J) e,
em alguns casos, com quatro ou cinco ligações (4J e 5J). A sigla COSY significa
correlation spectroscopy (espectroscopia de correlação) e os seus espectros
mostra, nos dois eixos, as frequências de um mesmo isótopo, no caso, o 1H. Existem
dois tipos de picos nos espectros gerados por esse experimento: os picos diagonais,
que possuem a mesma frequência em ambos os eixos e são equivalentes aos picos
do espectro de NMR 1H e os picos cruzados, que são espelhados acima e abaixo
da diagonal e marcam o acoplamento entre os dois núcleos que o formam
(JACOBSEN, 2007b).
Para o composto 4Z-LL, o espectro de NMR 1H-1H COSY (Figura 19)
confirmou a estrutura molecular do composto e a atribuição realizada para os
prótons na literatura (QUEIROZ et al., 2012; RIVERA; ARANCIBIA; CASTILLO,
1989), identificando os acoplamentos existentes entre eles.
63
Figura 19 - Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z-LL.
Para o composto 4Z,8Z-ML, o espectro de NMR 1H-1H COSY (Figura 20)
também confirmou a estrutura molecular do composto e a atribuição realizada para
os prótons na literatura (CSUPOR-LÖFFLER et al., 2011), identificando os
acoplamentos existentes entre eles.
64
Figura 20 -Espectro de NMR 1H-1H COSY para o composto 4Z,8Z-ML.
IV.4. Teste preliminar para a extração dos bioativos da planta
por PHWE
Um estudo preliminar foi realizado a fim de investigar a capacidade da técnica
de PHWE de extrair os princípios ativos de interesse. Como a extração foi feita
exclusivamente com água, optou-se por particionar o extrato obtido com acetato de
etila, de modo a verificar se esse solvente seria adequado para remover os analitos
65
da fase aquosa e permitir sua determinação por GC. A Figura 21 mostra o
cromatograma obtido para o extrato testado. Os resultados foram satisfatórios e
mostraram que, de fato, a técnica de PHWE é capaz de extrair os compostos 4Z-LL
e 4Z,8Z-ML da planta. Observa-se, ainda, uma preponderância significativa de
4Z-LL nos extratos, resultado coerente com o observado na extração por maceração
(item IV.2).
A obtenção de um extrato aquoso destes compostos representa um avanço
no que se refere à aplicação direta de extratos em frutos pós-colheita, pois, quando
comparado com aqueles obtidos a partir de solventes clorados, o extrato aquoso
oferece menos riscos em sua utilização.
Figura 21 – Cromatograma (TIC) obtido em análise de GC-MS de um extrato feito via PHWE.
Coluna HP-5 (30 m x 250 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de 90-150 °C (3 °C min-1),
150-280 °C (20 °C min-1) e 280 °C por 5 minutos. Temperatura do injetor 240 °C, temperatura da
transferline 200 °C e temperatura do quadrupolo 150 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:100, vazão
do gás de arraste 1 mL min-1 e concentração do extrato 1,0 mg mL-1.
IV.5. Curvas analíticas
Embora tenha sido empregado anteriormente o GC-MS para a determinação
dos dois compostos de interesse, foi avaliada também a possibilidade de realizar as
4Z-LL
4Z,8Z-ML
66
análises por GC-FID, uma vez que esta técnica é de fácil operação e de menor custo
e esse equipamento possuía uma maior disponibilidade de uso. Pelos
cromatogramas obtidos por GC-FID dos extratos (Figura 22) não foi verificada a
presença de outros compostos da matriz que pudessem causar interferência e,
portanto, a curva analítica foi obtida também nesta técnica e as subsequentes
determinações realizadas por esta. Para a determinação da linearidade e da faixa
linear foram construídas curvas analíticas por padronização interna em seis níveis
de concentração no intervalo de 5 a 50 µg mL-1. Como padrão interno foi utilizada a
cumarina em uma concentração de 15 µg mL-1. Cada ponto da curva foi analisado
em duplicata independente. Na Tabela 4 são apresentados os coeficientes
angulares, lineares e de correlação (r) determinados pelo método dos mínimos
quadrados ordinários, bem como seus respectivos desvios.
Tabela 4 - Parâmetros da regressão linear referente às curvas analíticas obtidas e seus
respectivos desvios.
Composto Coeficiente
Angular (mL µg-1) Desvio
(mL µg-1) Coeficiente
Linear Desvio
Coeficiente de correlação
1 0,0476 0,0002 -0,045 0,009 0,999 2 0,0595 0,0009 -0,107 0,027 0,997
A Figura 22 é um exemplo de cromatograma característico obtido para a
quantificação por GC-FID dos compostos nos extratos.
67
Figura 22 - Cromatograma obtido em análise de GC-FID de um extrato feito via PHWE (100 °C, 3
ciclos de 20 minutos). Coluna HP-5 (30 m x 320 μm x 0,25 μm). Programa de temperatura de
115 °C (19 minutos), 115-200 °C (20 °C min-1. Temperatura do injetor 200 °C e temperatura do
detector 300 °C. Volume de injeção 1 μL, split 1:50, vazão do gás de arraste 2 mL min-1.
Concentração do extrato 1,0 mg mL-1, concentração do padrão interno (cumarina) 15 µg mL-1
IV.6. Otimização da extração via PHWE
Dentre os principais fatores que afetam a eficiência e a seletividade da
extração por PHWE, estão a temperatura, o tempo do ciclo e o número de ciclos
empregados. Desse modo, é fundamental a otimização desses parâmetros para
que se atinja uma extração adequada dos analitos de interesse (HENG et al., 2013;
TEO et al., 2010).
IV.6.1. Temperatura
A temperatura é um fator determinante para a eficiência da extração via
PHWE, afinal sua influência regula a polaridade do solvente extrator e a sua
capacidade de penetrar na matriz através da redução da tensão superficial e da
4Z-LL
4Z,8Z-ML
Cumarina
68
viscosidade da água. Além disso, a escolha adequada da temperatura é
fundamental para prevenir a degradação de compostos termolábeis e evitar a
ocorrência de reações de hidrolise e oxidação em temperaturas mais elevadas
(HENG et al., 2013; MUSTAFA; TURNER, 2011; TEO et al., 2010).
Desse modo, foi de grande importância avaliar o seu efeito na extração em
questão. Como ponto de partida, a temperatura de 100 °C foi selecionada, pois era
comumente encontrada em trabalhos envolvendo extração de produtos naturais a
partir de plantas (TEO et al., 2010). Como forma de estabelecer uma condição de
contorno, as temperaturas de 70, 90, 110 e 130 °C também foram selecionadas
para integrar o estudo de otimização.
Após a realização das extrações em diferentes temperaturas, as massas de
extrato purificado seco foram determinadas e estão compiladas na Tabela 5,
juntamente com o rendimento de cada extração com relação à massa inicial de
planta (5,0 g). Observou-se que o aumento da temperatura de extração provocou
um aumento na massa dos extratos, denotando que, de fato, quanto maior a
temperatura, maior a eficiência da água como solvente extrator. No entanto, massas
maiores não necessariamente indicam que os analitos de interesse foram extraídos
com maior rendimento. Assim, faz-se necessária a quantificação dos compostos
4Z-LL e 4Z,8Z-ML em cada extrato obtido.
Tabela 5 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes temperaturas e rendimento global da
extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g).
Temperatura (°C) Replicata Massa (mg) Rendimento
70 1 63 1,2% 2 56 1,1%
90 1 70 1,4% 2 59 1,2%
100 1 85 1,7% 2 81 1,6%
110 1 88 1,8% 2 87 1,7%
130 1 108 2,2% 2 120 2,4%
69
No intuito de verificar se a extração dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML seria
afetada pela temperatura os extratos obtidos foram analisados por GC-FID e os
resultados estão apresentados na Figura 23
Figura 23 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos extratos
purificados em cada uma das temperaturas avaliadas (70, 90, 100, 110 e 130 °C). Teor dado em
miligramas de composto por grama de planta.
Como é possível observar, a extração a 100 °C foi aquela que levou ao maior
rendimento para ambos os analitos. Nas temperaturas de 70 e 90 °C, foram obtidos
menores rendimentos, provavelmente devido à redução menos significativa da
tensão superficial e da viscosidade da água, o que prejudicou sua capacidade de
penetrar na matriz e extrair os analitos. Já acima de 100 °C, embora não tenha sido
possível observar produtos de degradação no cromatograma, provavelmente,
houve degradação dos analitos pela temperatura.
IV.6.2. Tempo de ciclo
O processo de extração por PHWE pode ser descrito em quatro etapas:
i) dessorção dos compostos a partir dos sítios ativos da matriz; ii) difusão dos
compostos pela matriz até atingirem a interface entre o solvente e a matriz; iii)
solubilização dos analitos na fase extratora e iv) eluição dos analitos da cela
extratora para o frasco coletor (TEO et al., 2010). Como em amostras compostas
0,66
1,32
1,55
1,30
0,82
4Z-LL
Teo
r d
e co
mp
ost
o n
a p
lan
ta
(mg
g-1)
0,050,20
0,250,21 0,16
4Z,8Z-ML
70
por material vegetal as etapas limitantes são aquelas que envolvem processos de
difusão e solubilização do composto (MUSTAFA; TURNER, 2011), espera-se que,
quanto maior o tempo da extração, maior a sua eficiência. Contudo, há de se
considerar que aquecimentos prolongados podem levar à degradação dos
compostos de interesse (TEO et al., 2010). Sendo assim, o tempo de ciclo é outro
fator decisivo na otimização da extração por PHWE.
Após a realização das extrações em diferentes tempos de ciclo, as massas
de extrato purificado seco foram determinadas e estão compiladas na Tabela 6,
juntamente com o rendimento de cada extração com relação à massa inicial de
planta (5,0 g).
Tabela 6 - Massas dos extratos secos obtidos em diferentes tempos de ciclo e rendimento global
da extração comparado à massa inicial de planta (5,0 g).
Tempo (min) Replicata Massa (mg) Rendimento
1 1 65 1,3% 2 62 1,2%
5 1 65 1,3% 2 63 1,3%
10 1 75 1,5% 2 70 1,4%
20 1 86 1,7% 2 78 1,6%
30 1 80 1,6% 2 80 1,6%
Observou-se que o aumento do tempo de ciclo provocou um aumento na
massa dos extratos, confirmando que, de fato, a eficiência da técnica pode ser
incrementada com maiores tempos de extração. No entanto, novamente, massas
maiores não necessariamente indicam que os analitos de interesse foram extraídos
com maior rendimento.
No intuito de verificar se a extração dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML seria
afetada pelo tempo do ciclo de extração, os extratos purificados obtidos foram
analisados e os resultados estão apresentados na Figura 24.
71
Figura 24 – Média (n=2) e desvio médio do teor dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML nos extratos
purificados em cada um dos tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e 30 min). Teor dado em
miligramas de composto por grama de planta.
Como é possível observar, a extração utilizando ciclos de 1 minuto foi mais
eficiente para ambos os analitos. Aqui, novamente, pode-se levantar a hipótese de
que o aquecimento prolongado esteja degradando os analitos antes de sua eluição
da cela de extração, no entanto, produtos de degradação não foram encontrados
nos cromatogramas analisados de modo a confirmar esta hipótese.
IV.6.3. Número de ciclos
Quando a PHWE é empregada no modo estático, como foi o caso deste
trabalho, sua eficiência depende fortemente da constante de partição e da
solubilidade dos compostos naquela temperatura. Assim, algumas extrações em
modo estático podem ser incompletas, devido ao volume limitado de solvente
comportado pela cela de extração. Uma forma de minimizar este problema é
empregar um maior número de ciclos na extração (TEO et al., 2010).
Buscou-se investigar qual seria a parcela dos analitos de interesse extraída
em cada ciclo separadamente e quantos ciclos seriam necessários para extrair
quantidades significativas desses compostos sem que um grande volume de extrato
1,911,87
1,73
1,47
1,30
4Z-LL
Teo
r d
e co
mp
ost
o n
a p
lan
ta
(mg
g-1)
0,31 0,28 0,28 0,24 0,19
4Z,8Z-ML
72
fosse gerado. Assim, a composição de 4 ciclos de extração consecutivos foi
investigada e, ao contrário da quantificação dos analitos realizada na otimização da
temperatura e do tempo, optou-se pela simples comparação das áreas dos analitos
extraídos em cada um dos diferentes ciclos. Os gráficos das Figura 25 e Figura 26
mostram, para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML, respectivamente, a porcentagem
de analito extraída em cada um dos ciclos, quando comparada com a soma das
áreas de cada ciclo.
É possível verificar que, para o composto 4Z-LL, o segundo ciclo apresenta
um maior rendimento, enquanto que o quarto e último ciclo é responsável por, em
média, apenas 6,8% da quantidade total da substância presente no extrato
purificado. Já para o composto 4Z,8Z-ML, o primeiro e o segundo ciclo possuem
rendimentos médios comparáveis (44,3% e 41,3%, respectivamente), enquanto que
o quarto ciclo é responsável por, em média, 3,2% da quantidade total da substância
presente no extrato purificado.
Figura 25 – Proporção, em porcentagem, do composto 4Z-LL em cada ciclo avaliado.
34,1%
47,0%
13,7%
5,2%
27,2%
42,3%
22,3%
8,3%
CICLO 1 CICLO 2 CICLO 3 CICLO 4
Eficiência dos ciclos de extração: 4Z-LL
Replicata 1 Replicata 2
73
Figura 26 - Proporção, em porcentagem, do composto 4Z,8Z-ML em cada ciclo avaliado.
Como a presença de ambos os compostos no quarto ciclo foi baixa, quando
comparada aos outros ciclos, o emprego de quatro ciclos de extração foi
considerado adequado e suficiente. Optou-se pela não inclusão de mais ciclos no
processo de extração para que o volume de extrato aquoso gerado não fosse
excessivo, exigindo maior quantidade de acetato de etila para a partição. Ademais,
a inclusão de mais ciclos, por aumentar o volume de solvente, acabaria por diluir os
compostos, reduzindo sua concentração no extrato aquoso.
Em geral, os resultados obtidos na quantificação dos compostos durante a
otimização da temperatura, do tempo e do número de ciclos, reforçam a viabilidade
e a eficiência da PHWE na extração de metabólitos secundários da C. canadensis.
As quantidades obtidas são compatíveis com o fato de que metabólitos secundários,
quando presentes, normalmente compõem menos de 1% da massa seca das
plantas (ZHONG, 2011).
Uma vez estabelecidos os parâmetros de operação do PHWE para a
extração dos bioativos da planta (temperatura de 100 °C, 4 ciclos de 1 min cada),
foi avaliada a repetitividade deste procedimento de extração. Para tanto, extrações
sucessivas (5 replicatas independentes) foram realizadas em um mesmo dia e mais
três replicatas foram feitas em um segundo dia. A dispersão dos resultados para
47,1%
41,9%
8,3% 2,7%
41,5% 40,8%
13,9%
3,7%
CICLO 1 CICLO 2 CICLO 3 CICLO 4
Eficiência dos ciclos de extração: 4Z,8Z-ML
Replicata 1 Replicata 2
74
esses dois ensaios, intra- e inter-dia, foi expressa como o coeficiente de variação.
A quantificação dos bioativos no extrato obtido foi realizada por GC-FID conforme
método descrito na sessão III.4.6.
O CV foi calculado em porcentagem pela razão entre a estimativa do desvio
padrão (s) e a média das concentrações experimentais (�̅�) conforme Equação 1.
𝐶𝑉(%) =𝑠
�̅�× 100 (𝑒𝑞𝑢𝑎çã𝑜 1)
Os valores de CV intra-dia e inter-dia para os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
estão apresentados na Tabela 7. Todos os valores foram menores do que 7% e são
considerados aceitáveis para os objetivos propostos.
Tabela 7 - Valores de CV intra e inter-dia para 4Z-LL e 4Z,8Z-ML
CV (%)
Intra-ensaio (n=5) Inter-ensaio (n=8)
4Z-LL 6,3 5,7
4Z,8Z-ML 5,8 6,7
IV.7. Bioensaios
IV.7.1. Ensaio de difusão em disco
Os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML apresentaram atividades antifúngicas
semelhantes. Ambos inibiram o crescimento dos fungos Aspergillus niger (CMAA
1132) e Cladosporium sp (CMAA 1136). Para este último, no entanto, 4Z-LL foi mais
ativo que 4Z,8Z-ML. Adicionalmente, apenas 4Z-LL inibiu significativamente o
crescimento do fungo Penicillium digitatum (CMAA 1190) (Tabela 8).
75
Tabela 8 - Resumo das atividades dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML contra diferentes fungos
associados a doenças pós colheita em frutas.
Código Fungo Substâncias
4Z-LL 4Z,8Z-ML CCMA 1129 Colletotrichum gloeosporioides - - CCMA 1130 Alternaria alternata - - CCMA 1131 Lasiodiplodia theobromae - - CCMA 1133 Botryosphaeria dothidea - - CCMA 1132 Aspergillus niger + + CCMA 1135 Alternaria alternata - - CCMA 1136 Cladosporium spp. ++ + CCMA 1134 Fusarium pallidoroseum - - CCMA 1137 Alternaria alternata - - CCMA 1190 Penicillium digitatum + -
Score: (-) inativo, (+) ativo (halo ≤ 15 mm), (++) altamente ativo (halo > 15 mm).
A Figura 27 exemplifica um ensaio de difusão em disco no qual os compostos
não apresentaram bioatividade (Figura 27A) e um caso onde eles apresentaram-na
(Figura 27B), destacando-se o halo de inibição tipicamente obtido nesse teste para
compostos bioativos.
Figura 27 – Ensaios de difusão em disco mostrando um exemplo no qual o composto não
apresentou atividade antifúngica (fig. 27A) e um exemplo no qual o composto apresentou atividade
antifúngica (fig. 27B).
IV.7.2. Concentração Mínima Inibitória
A concentração mínima inibitória dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML foi
determinada a partir de ensaio de microdiluição em caldo proposto pela norma
A B
76
M38-A da CLSI. O intuito desse teste é avaliar qual a quantidade mínima de cada
composto que provoca a inibição do crescimento do fungo em questão. Tal
informação é relevante para que futuros testes envolvendo a aplicação do extrato
aquoso da planta C. canadensis em frutas possam ser realizados com
concentrações adequadas dos compostos.
Todos os três fungos avaliados tiveram seu crescimento inibido em alguma
das concentrações testadas dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. O composto 4Z-LL
apresentou maior atividade contra o fungo Penicillium digitatum (32 µg mL-1) e o
composto 4Z,8Z-ML apresentou maior atividade contra o fungo Aspergillus niger
(32 µg mL-1). Os resultados obtidos para o ensaio de MIC estão listados na
Tabela 9.
Tabela 9 - Atividade antifúngica (MIC) dos compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML obtida pelo método de
microdiluição em caldo.
Fungo MIC (µg mL-1)
4Z-LL 4Z,8Z-ML
Aspergillus niger (CMAA 1132) 64 32
Cladosporium spp. (CMAA 1136) 64 64
Penicillium digitatum (CMAA 1190) 32 64
Os resultados obtidos neste ensaio são promissores, uma vez que os fungos
que se mostraram susceptíveis ao tratamento são patógenos comuns no pós-
colheita de frutas e legumes (COATES; JOHNSON, 1997). O fungo Aspergillus niger
é causador da doença conhecida como mofo preto e de outras podridões em
cítricos, uvas, figos, pêssegos, mangas, maçãs e morangos. Além disso, é um dos
responsáveis no Brasil pela contaminação de uvas e vinhos com ocratoxina A
(VARGA et al., 2008), uma micotoxina com efeitos nefrotóxicos, teratogênicos,
hepatotóxicos e imunotóxicos em animais e possivelmente em humanos, sendo
classificada ainda como uma possível substância carcinogênica (IARC, 1993;
POZO-BAYÓN et al., 2012). Os fungos do gênero Cladosporium são causadores de
podridões em melões, berries, tomates e berinjelas (COATES; JOHNSON, 1997;
TERAO et al., 2008). O fungo Penicillium digitatum é o agente causador do bolor
verde em frutas cítricas, sendo o principal responsável pelas suas perdas na pós-
77
colheita. Estudos indicam que 60 a 80% das perdas de citros durante a
armazenagem sejam causadas pela podridão associada a esse fungo (BALLESTER
et al., 2011).
78
79
V. CONCLUSÕES E
PERSPECTIVAS
FUTURAS
80
81
V.1. Conclusões
Em linhas gerais, este trabalho apresentou um estudo da composição de
extratos da planta Conyza canadensis com relação a compostos de ação antifúngica
reportados na literatura (MEEPAGALA et al., 2002; QUEIROZ et al., 2012). Mais
especificamente, o foco do trabalho foi a busca dos compostos 4Z-lachnophyllum
lactona, 4Z,8Z-matricaria lactona e 2Z,8Z-matricaria ester em espécimes brasileiros
da planta C. canadensis, uma vez que estes compostos haviam sido reportados por
Queiroz et al. (2012) em plantas da mesma espécie coletadas nos EUA.
A partir de extratos obtidos por maceração com agitação empregando
diclorometano como solvente extrator, foi possível isolar dois dos três bioativos
identificados nas plantas norte-americanas. Os compostos 4Z-lachnophyllum
lactona e 4Z,8Z-matricaria lactona foram isolados com o auxílio de cromatografia
flash preparativa e caracterizados mediante análises de GC-MS,
GC-MS/MS e NMR de 1H e 13C, além dos experimentos de NMR 2D de 1H-1H COSY
e 1H-13C HSQC. Os dados obtidos estão em conformidade com a literatura existente
sobre esses compostos, no entanto, os experimentos de NMR 2D acrescentaram
novidades à atribuição de dois carbonos do composto 4Z-LL. Os referidos carbonos
(C-8 e C-9) compunham, juntamente com C-10, um radical propila próximo à uma
tripla ligação. Contudo, a atribuição de seus deslocamentos estava invertida, de
modo que o valor outrora atribuído ao C-8 deveria ser atribuído ao C-9 e vice-versa.
Foi também demonstrada a capacidade da técnica PHWE de gerar extratos
contendo os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML. A utilização desta técnica, em
detrimento da técnica convencional de maceração com agitação empregada por
Queiroz et al. (2012), gera menos impactos ao ambiente e abre portas para uma
possível aplicação segura dos extratos em frutos pós-colheita. De modo a se
otimizar o método de extração por PHWE, foi realizado um estudo do efeito da
temperatura, do tempo de ciclo e do número de ciclos no rendimento da extração,
bem como uma avaliação da repetitividade do método em ensaios intra e inter-dia.
Dentre as cinco temperaturas testadas (70, 90, 100, 110 e 130 °C), aquela que se
mostrou mais eficiente na obtenção dos bioativos de interesse foi a de 100 °C.
82
Dentre os tempos de ciclo avaliados (1, 5, 10, 20 e 30 min), aquele que se mostrou
mais eficiente foi o de 1 minuto. Nessas condições (100 °C e 1 minuto de ciclo), a
composição de 4 ciclos consecutivos foi avaliada separadamente e conclui-se que
o quarto ciclo apresentou, em média, apenas 6,8 % do composto 4Z-LL e 3,2% do
composto 4Z,8Z-ML, quando as concentrações neste ciclo foram comparadas a
quantidade total extraída. Desse modo, a condição ótima de extração foi definida
como sendo 4 ciclos de 1 minuto cada a 100 °C. Nessas condições, o CV obtido
para cinco replicatas independentes da extração realizadas em um dia e três
realizadas em um dia diferente ficou abaixo de 7,0%, valor considerado aceitável
para a aplicação desejada.
Com relação aos bioensaios, os compostos 4Z-LL e 4Z,8Z-ML apresentaram
atividade contra três dos dez fungos avaliados nos ensaios de difusão em disco. Os
fungos susceptíveis foram Aspergillus niger, Cladosporium spp., e Penicillium
digitatum e o ensaio de MIC revelou que as concentrações mínimas inibitórias dos
compostos para esses fungos variaram entre 32 e 64 µg mL-1. Tal resultado é
promissor, pois os fungos afetados são patógenos comuns na pós-colheita de frutas
e legumes (BALLESTER et al., 2011; COATES; JOHNSON, 1997; POZO-BAYÓN
et al., 2012; TERAO et al., 2008; VARGA et al., 2008).
V.2. Perspectivas Futuras
Este trabalho está inserido em um projeto da Embrapa Meio Ambiente
(Jaguariúna/SP) coordenado pela Dr.ª Sonia Queiroz e financiado pelo CNPq, que
se intitula “Avaliação de atividade antimicrobiana, ecotoxicológica e uso na pós-
colheita de frutas de extratos e substâncias isoladas de Conyza canadensis”. Sendo
assim, será dada continuidade aos estudos aqui desenvolvidos para que,
eventualmente, um biopesticida viável para aplicação na pós-colheita de frutas
possa ser obtido. As próximas etapas compreendem a aplicação dos extratos
aquosos brutos obtidos por PHWE em frutas colhidas, a avaliação da estabilidade
dos compostos nesses extratos e o desenvolvimento e validação de um método de
quantificação dos analitos de interesse nos extratos por GC-MS/MS. Também serão
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realizados ensaios ecotoxicológicos a fim de averiguar a toxicidade dos extratos
aquosos brutos e das substâncias puras para microrganismos fitoplanctônicos e
microcrustáceos. Mais estudos são necessários, ainda, com relação à composição
dos extratos da planta ao longo do ano e nos diferentes estágios de crescimento da
C. canandensis.
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VI. REFERÊNCIAS
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