1137

Rapid-cycle polymerase chain reaction法 を 用 い た 糞 便 中

Shiga-like toxin遺 伝 子 の迅 速 検 出 法 につ い て

天理ようつ相談所病院臨床病理部

小松 方 相 原 雅典 島川 宏一

山中 亨 松 尾 収二

(平成9年5月27日 受付)

(平成9年8月18日 受理)

Key words : Escherichia coli O157 : H7, PCR, Shiga-like toxin,

DNA extraction, feces

要 旨

シ リコ ンダ イ オ キ サ イ ド とグ ア ニ ジ ンチ オ シ ア ネー トに よ る 核 酸 精 製 法 お よ びRapidCycler(R)

(Idaho technology社)を 用 いたPCR法 を組 み合 わ せ(RC-PCR法),糞 便 中 か ら90分 以 内 に糞 便 中

Shiga-like toxin遺 伝 子 を検 出 で き る 方 法 を 開 発 し た.RapidCycler(R)の 性 能 はThermalCycler

9600-R(R)(Roche社)に よるPCR法(TC-PCR法)と の比較 で行 った.さ らに,Escherichia coli O157

を検 出 した患者 糞便22件 を対 象 とし,セ フ ィキシム ー亜 テルル酸 カ リウム添加 ソル ビ トール マ ッコンキー

寒 天培 地 お よびセ フ ィキ シムー亜 テル ル酸 カ リウム ーバ ン コマイ シ ン添加 トリプテ ィ ックソイ ブ ロスで増

菌 を併 用 した培 養結 果 と比較 した.

RC-PCR法 はDNAの4.1pgま でTC-PCR法 は410fgま で検 出 し得 た.糞 便 を直接 用 いた場 合,培 養,

RC-PCR法 お よびTC-PCR法 の成績 はそれ ぞれ5,7お よび10件 が,増 菌 後 で はそれ ぞれ7,9お よび

9件 が陽 性 とな った.

RC-PCR法 はTGPCR法 に比 べ検 出感 度 がや や低 か ったが,増 菌 培 養 を併 用 す る こ とで それ は改 善

した.し か し操 作性,検 出時 間 はTC-PCR法 を上 回 り,特 に急性期 の菌数 が多 く存在 す る検 体 の使 用 に

は問題 な く,迅 速 な結 果報 告 は早 期診 断 と適切 な治 療選 択 に貢献 可能 と考 えられた.

序 文

Escherlchla coli O157 : H7を 始めとするShiga-

like toxin産 生性大腸菌感染症の診断は,患 者糞

便中の菌 を培養で検 出す ることにより確定 され

る.し かし培養による菌検出法は煩雑かつ長時間

を有 し,と りわけ50種 を越える血清型のすべてを

網羅 した検査態勢 をしくことは不可能な状態であ

る.患 者からShiga-like toxin産 生性大腸菌をも

れなく検出するためには,全血清型に共通な毒素,

又は遺伝子を検出することが合理的であ り,かつ,

迅 速 診 断 お よび 検 体 の大 量 処 理 に もつ な が る と考

えた.そ こでRapidCycler(R)(Idaho Technology

社)に よ るpolymerase chain reaction(以 下

RC-PCR法)を 用 い て,短 時 間 に 糞 便 中 か ら

Shiga-like toxin遺 伝 子 を検 出 す る 方 法 の 開 発 を

試 み た.

対 象 お よび 方 法

1. 材 料 とプ ラ イ マ ー

材 料 はE.coli O157 : H7が 分 離 さ れ た22件 の 患

者 糞 便 を,-30℃ で 約6カ 月 間 凍 結 保 存 し た も の

を用 い た.プ ラ イ マ ー はBrianら1)に よ り報 告 さ

れ た 配 列(Table 1)を 用 い,1チ ュー ブ でShiga-

like toxin I (SLT-I)お よ びShiga-like toxin II

別刷請求先:(〒632)奈 良県天理市三島町200

天理 ようつ相談所病院臨床病理部

小松 方

平成9年11月20日

1138 小松 方 他

Table 1 Primer of Shiga-like toxin gene for detection of Esherichia coli O157 : H 7

(SLT-II)を 同 時 に検 出 す る系 を 採 用 した.ま た こ

れ ら プ ラ イ マ ー の性 能 を評 価 す る た め にE.coli

TH96-1001 (O157 : H7 RIMD0509894 ; 1996年 に

堺 市 集 団食 中 毒 例 よ り分 離 した菌)を 用 い て検 討

した.

2. 培 養 方 法

糞 便 中 のE.coli O157 : H7の 分 離 方 法9)は,ト

リプ トソ イ ブ ロス(以 下TSB)で10倍 希 釈 した糞

便10μlを,亜 テ ル ル 酸 カ リ ウム ーセ フ ィ キ シ ム ーソ

ル ビ トー ル マ ッ コ ン キ ー寒 天 培 地(ア ス カ 純 薬;

以 下TC-SMAC)に 直 接 接 種 す る方 法 と,亜 テル

ル 酸 カ リウム ーセ フ ィキ シム ーバ ン コ マ イ シ ン添 加

トリプ トソ イ ブ ロ ス(以 下TCV-TSB)3mlに 糞

便100μlを 接 種 し,35℃ で18時 間 増 菌 後,そ の10μl

をTGSMACに 接 種 す る方 法 で行 った.

3. DNAの 精 製 方 法

DNAの 精 製 は,Boomら2)の 報 告 した 方 法 を参

考 と した.即 ち,ト リプ トソイ ブ ロ ス に懸 濁 した

糞 便 あ る い は増 菌 液1mlを 遠 心 濃 縮 後,沈 渣 に10

mM Tris-HCI, 1mM EDTA (pH 8.0)を 加 え

て全 量 を1mlと し,そ の100μlを20%(w/v)Dia-

tomaceous earth(R) (Acid-washed, 95%SiO2;

Sigma)40μlお よびLysis buffer L6 (10M Guani-

dium hydrochloride-20mM EDTA-2.6% Triton

X-100-0.1M Tris hydrochloride (pH6 .4))900

μlの 混 液 に添 加 した.す ぐに5秒 間 混 和 後,室 温

に10分 間 放 置 し蛋 白 変 性 お よ びDiatomaceous

earth(R)へ 核 酸 を吸 着 させ た.再 度 混 和 後,12,000

rpm.,15秒 間 遠 心 し,上 清 を吸 引 除 去 後,沈 渣 に

Washing buffer L2 (10M Guanidium hydrochlor-

ide)を1ml入 れ 洗 浄 後,70%ethanolお よ び

acetone各1mlで 洗 浄 を行 った .acetoneを 吸 引

乾 燥 後,100μlの 蒸 留 水 で56℃ に て10分 間核 酸 溶

出 を行 い,そ の上 清 をPCR法 の試 料 とし た.

4. PCR法

RC-PCR法 は1検 体 あ た りマ ス タ ー ミ ッ ク ス5

μlと 抽 出 液5μlの 計10μlで 反 応 を 行 っ た.マ ス

タ ー ミ ッ ク ス はPCR buffer (4mM MgCl2

(Sucose)含 有;Idaho technology社Cat. No

1781)1μl, 2mM dNTPs 1μl, 20μM primers(4

種 類)各0.5μl, 0.5U/μl rTaq polymerase

(TOYOBO)1μlを そ れ ぞ れ 添 加 し調 整 した.抽 出

液 と混 和 後,10μl用 キ ャ ピ ラ リー 管(Idaho tech-

nology社)に 吸 引 し密 封 後,94℃ 瞬 間,50℃ 瞬 間,

72℃10秒 間 の 計40サ イ クル,温 度 変 化 率9 .9℃/秒

で 行 っ た.反 応 後,2%ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 法 に

よ り増 幅 産 物 の 有 無 を確 認 し た.

5. RapidCycler(R)に よ るPCR法 の評 価

RapidCycler(R)を 用 い て 実 施 し たPCR法 の 成

績 を 評 価 す る 目 的 で,ヒ ー トブ ロ ッ ク 方 式 の

Thermalcycler 9600-R(R) (Roche社)を 用 い た

PCR法(以 下TC-PCR法)を 同 時 に行 っ た.

検 出感 度 の 検 討 は,E.coli O157TH96-1001を

血 液 寒 天 平 板 で35℃,18時 間 培 養 後,TSBで

McFarland 0.5に 調 整 し,こ の 菌 液 で10nの 段 階 希

釈 系 列 を作 成 し,そ れ ぞ れ をTC-SMAC上 に 接 種

し菌 量 測 定 を行 う と同時 にDNA抽 出 を行 い,両

PCR法 を 実 施 した.患 者 糞 便 を用 い た検 討 で は 解

凍 した 糞 便 を直 接 試 料 と して使 用 す る と同 時 に,

液 体 培 養 後 の 増 菌 液 を も試 料 と し,培 養 法 と両

PCR法 の成 績 と を比 較 した.な おTC-PCR法 は

マ ス タ ー ミ ッ ク ス45μlと 抽 出 液5μlの 計50μl

で 反 応 を行 った.マ ス タ ー ミッ ク ス は蒸 留 水19μl,

10×PCR buffer (TOYOBO) 5μl, 2mM dNTPs

5μl, 25mM MgC12 5μl, 20μM primers(4種 類)

各2.5μlお よ び1U/μl rTaq polymerase

(TOYOBO)1μlを そ れ ぞ れ 添 加 し調 整 した.ま た

増 幅 条 件 は94℃30秒 間,60℃30秒 間,72℃30秒 間

感染症学雑誌 第71巻 第11号

Rapid-PCR法 によ るSTEC遺 伝 子 検 出 1139

の計35サ イ ク ル で行 った.

結 果

1. RGPCR法 とTC-PCR法 の 検 出感 度

2法 の増 幅 方 法 の違 い に よ る検 出感 度 の比 較 を

Fig1に 示 す.E.coli O157:H7 RIMD0509894

由 来DNAをTC-PCR法 で は1ア ッセ イ 中410

fgま で,RC-PCR法 で は4.1pgま で検 出 し得 た.

定 量 培 養 成 績 と比 較 す る と糞 便1g中,前 者 で103

CFU,後 者 で104CFUに 相 当 した.

2. 患 者 材 料 に よ る比 較 成 績

患者 糞 便22検 体 を直 接 お よび増 菌 後 に培 養 した

結 果 と,RC-PCR法(Table2)お よ びTC-PCR

法(Table3)で 得 た 成 績 と比 較 した.培 養 法 で は

直 接 接 種 で5件(23%),増 菌 法 で7件(32%)が

陽 性 とな った.RC-PCR法 で は糞 便 の 直 接 抽 出 で

7件(32%),増 菌 法 で9件(41%)が 陽 性 とな っ

た.TC-PCR法 で は直 接 抽 出 で10件(45%),増 菌

法 で9件(41%)が 陽 性 とな った.培 養 法 とPCR

Fig. I Comparison of sensitivity of ThermalCycler 9600-Rn and RapidCycler(R)

by 2% agarose gel electrophoresis. The amplicon was used ten micro liter-1.

Lane: M. base pair marker (ƒÓX174 Hae III digest), Lane: 1. 41pg of DNA

from E. coli TH96-1001, Lane : 2. 4.1pg, Lane : 3, 410fg, Lane: 4. 4lfg. The

detection levels of ThermalCycler 9600-R(R) (A) and RapidCycler (B) were 410

fg and 4.1pg of DNA, respectively.

A B

Table 2 Comparison between culture and PCR by RrapidCycler(R)

a ) The feces were directly used.

b ) Before 1'CR was performed, the feces were enriched with TCV-TSB culture

平成9年11月20日

1140 小松 方 他

Table 3 Comparison between culture and PCR by ThermalCycler 9600-R(R)

a) The feces were directly used.

b) Before PCR was performed, the feces were enriched with TCV-TSB culture

Table 4 Discrepancy of result of culture, RapidCycler(R), and ThermalCy-

cler 9600-R(R)

a) The feces were directly used .

b) Before the feces were used, the enriched culuture was performed by TCV-TSB .c) The minus , 1 pulus, 2 pulus, and 4 pulus indicate that the colony was detected

0 colony forming unit (CFU) , 10 CFU, 100 CFU, and 10,000 CFU, respectively.

d) The minus, and pulus indicate that the results were negative , and positive,respectively.

法 との成績比較では,直 接接種で培養陽性であっ

た5件 中RC-PCR法 では3件,TC-PCR法 で は

5件 が陽性 となった.増 菌後では培養陽性7件 は

すべて両PCR法 で陽性 となった.一 方直接接種

したうち,培 養で陰性であった17件 中RC-PCR法

では4件 が,TGPCR法 で は5件 が陽性 となっ

た.増 菌後には培養陰性が15件 あったが,そ のう

ち2件 がRGPCR法 およびTC-PCR法 で陽性 と

なった.

3. 不一致例の解析

感染症学雑誌 第71巻 第11号

Rapid-PCR法 に よるSTEC遺 伝 子 検 出 1141

培 養 法,RC-PCR法 お よびTGPCR法 の 間 で,

結 果 の不 一 致 が み られ た9件 に つ い て方 法 毎 の 分

析 結 果 をTable4に 示 した.こ れ ら の検 体 は全 て

直 接 接 種 に よ るTC-PCR法 で 陽 性 で あ り,そ の 内

4件(No.135,180,159お よ び144)は 培 養 で 菌

が 検 出 され た 検 体 で あ っ た.培 養 で 菌 陽性 と な っ

た4件 はRC-PCR法 で もす べ て 陽 性 と な っ た が,

う ち3件(No.135,180お よ び159)は 増 菌 後 の 検

体 で 陽 性 とな っ た もの で あ った.RGPCR法 で は

合 計7件(No,135,180,159,144,125,211お

よ び242)が 陽 性 とな った が,糞 便 の直 接 抽 出 液 か

らの 陽 性 は4件(No.144,125,211お よ び242)で

あ り,こ の 直 接 法 で9件 す べ て が 陽 性 と な っ た

TC-PCR法 との 問 に若 干 の 乖 離 が 認 め られ た.し

か し 増 菌 培 養 後 の 検 体 を 用 い た 成 績 で はTC-

PCR法 と完 全 一 致 し た結 果 が 得 られ た.

考 察

E.coli O157:H7に 代 表 さ れ るShiga-like

toxin産 生 性Eooli(STEC)が 原 因 とな り起 こ

るHemolytic uremic syndrome(HUS)は,出

血 性 腸 炎 患 者 の2～7%に 発 症 し3),極 め て 重 篤

な経 過 を た ど る疾 患 で あ る.HUS発 症 の 機 序 は

未 だ 解 明 さ れ て い な い が,発 症 初 期 に診 断 し適 切

な 治 療 を施 す こ とが,よ り良 い予 後 につ なが るの

で は な い か と思 わ れ る.E.coli O157は ソル ビ トー

ル の 分 解 性 や β グ ル ク ロ ニ ダ ー ゼ 活 性 が 陰 性 で

あ る点 で 他 のSTECと は異 な り,糞 便 か らの 菌 の

分 離 は比 較 的 確 立 され た 方 法 が とられ て い る.し

か し本 邦 に お け るSTEC感 染 症 は0157に と ど ま

らず0111や026を 始 め 少 な か ら ぬ血 清 型 が 分 離

さ れ て お り4)～6),0157に 標 的 を絞 り きれ な い こ と

が 検 査 室 に お け る対 応 を一 層 困 難 な もの に し て い

る.こ の よ うな 現 状 に鑑 み,ま た1996年8月 に厚

生 省 よ り出 され た 「出血 性 大 腸 菌 を指 定 伝 染 病 菌

とす る」 との 通 達 を真 摯 に受 け とめ る とす れ ば,

臨 床 検 査 室 に お け るSTECの 迅 速 か つ正 確 な 診

断 は,患 者 糞 便 中 のShiga-liketoxin検 出 を行 う

以 外 に合 理 的 な 方 法 は無 い.

PCR法 に よ る糞 便 か ら のSTECの 毒 素 遺 伝 子

検 出法 とし て は,こ れ ま で ヒー トブ ロ ッ ク方 式 に

よ る検 討 が な さ れ て き た1)7).し か し,本 方 式 は従

来の培養法 よりは迅速な結果が得 られるが,DNA

の抽出か らPCR,電 気泳動での検出に到るまで約

4時 間を要 し,緊 急対応が求められる外来診療に

対応するには,い ささか煩雑であり分析時間の短

縮が必要 と思われた.そ こでわれわれはマイクロ

キャピラリー方式により熱伝導性を高め,高 速で

温度 を変化 させPCR反 応 を従来の約1/6に 短縮

し得るRapidCycler(R)を 用い,糞 便中よりShiga-

like toxin遺 伝子を直接的かつ迅速に検出する方

法を検討 した.

糞便 か ら抽 出,精 製す る為 に用 いた方法2)は

Stacy-Phippsら8)も 糞便中の毒素原性大腸菌の毒

素遺伝子抽出法 として応用 し良好な成績を報告し

ている.本 法の特徴 は糞便中に存在す るPCR反

応のインヒビターを効率よく除去し,か つ,精 製

までの過程を1チ ューブで行 うため,ク ロスコン

タ ミネーションを最小限に防ぎ得る方法である.

試料中の遺伝子抽出は約50分 で行え,全 行程の時

間短縮に貢献すること,お よび操作の簡便 さか ら

臨床検査室への導入 も容易ない方法であると思わ

れた.

今回の検討に用いた患者糞便22件 は,過 去数カ

月以内にE.coli O157が 検出された患者糞便 を一

切の保存液を添加せず-30℃ に凍結した ものであ

り,菌 体がすでに死滅 した可能性が高 く,検 討対

象 とするには極めて厳しく,反 面それ故に絶好の

検体であったと思われた.事 実,著 者 らの培養方

法9)では増菌培養 を併用して も,22件 中7件 か ら

しか菌を分離 しえなかったことをみても,試 料 と

していかに過酷であったか推察で きる.このうち,

糞便の直接培養で陽性 となった5件 は,TGPCR

法では全て毒素遺伝子 を検出し得たが,RGPCR

法では2件 が増幅されなかった.培 養菌液を用い

た両方の感度比較 で も,RC-PCR法 はTC-PCR

法に比べ10倍 程度低 く,患 者検体 においてもその

差が両者および培養法9)との陽性数の差 となった

もの と思われた.し かし発症後一週間以内の抗菌

薬未投与の患者糞便中には,105CFU/9以 上の病

原菌が存在するとされてお り11)～13),急性期の患者

糞便 を対象 とする限 りRC-PCR法 の感度が問題

となることはないように思われる.ま たPCR法

平成9年11月20日

1142 小松 方 他

では,抗 菌剤投与や保存状態が劣悪で生菌が著 し

く少な く,培養では陰性 となる検体からでさえも,

糞便から直接遺伝子 を捉え得 ることを証明できた

ことは大 きな成果であった.

RC-PCR法 の所要時間は,抽 出に50分,PCR法

に15分,ア ガロース電気泳動に20分 を要するが,

一気 に行 えば検体提出か ら約90分 で検 出可能で

あった.

1検 体 あたりの コス トは核酸の抽出で260円,

PCR法 で150円 およびアガ ロース電気泳動で160

円の計570円 であり,採算性の上で も有用な方法で

あった.TC-PCR法 にくらべ10倍 程度低い検出感

度を補 うとすれば,糞 便を液体培地で増菌する方

法 や,PCR法 後 にDNA-probe法14)やELISA

法15)で増幅産物の検出同定を行 うことにより十分

であると思われた.

今回検討 したシリコンダイオキシサイ ドを用い

た核 酸 抽 出法 とRC-PCR法 を組 み 合 わ せ た

Shiga-liketoxin遺 伝子の検出法は,TC-PCR法

に比べやや検出感度で劣るものの,簡 便な操作性

と経済効率の良さは臨床検査室でも使用可能なレ

ベルのものであり,約90分 で結果が得られる迅速

性 は外来患者の診断や治療 に適用可能 な機動性 を

もつ方法であると思われた.

謝辞:本 研究に際し検体をご提供いただいた奈良衛生研

究所の梅迫誠一氏およびE.coli O157 RIMD0509894を 分

与下された大阪大学微生物病研究所の本田武司教授に深謝

致します.

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感染症学雑誌 第71巻 第11号

Rapid-PCR法 に よ るSTEC遺 伝 子 検 出 1143

Rapid Detection of Shiga-like Toxin Gene in Feces withRapid-Cycle Polymerase Chain Reaction

Masaru KOMATSU, Masanori AIHARA, Koichi SHIMAKAWA,Tohru YAMANAKA & Shuji MATSUO

Department of Clinical Pathology, Tenri Hospital

A rapid detection for Shiga-like toxin in feces was developed with the nucleic acid extraction

method by silicondioxide-guanidine thiothianate and rapid-cycle polymerase chain reaction by

RapidCycler(R) (model 1002; Idaho Technology, RC-PCR here after). Twenty-two fecal samples

that were collected from patients with diarrhoea caused by E. coil 0157 : H7 and frozen for 6

months were examined directly by RC-PCR, conventional PCR assay using by ThermalCycler(R)

9600-R (Roche, TC-PCR here after) and by the culture method using tellurite-cefixime sorbitol

MacConkey (direct method). These examinations were done also after being injected into

TCV-TSB and incutated at 35•Ž overnight (indirect method).

The sensitivity of RC-PCR and TC-PCR using a diluted suspenison of broth enriched at 35•Ž

overnight were 4.1 pg and 410 fg, respectively. Positive results in the direct method were

obtained in 7 for RC-PCR, 10 for TC-PCR and 5 for culture. Positive results on indirect assay

were obtained in 9 for RC-PCR, 9 for TC-PCR and 7 for culture.

It was demonstrated that the RC-PCR assay was able to detect Shiga-like toxin gene in feces

in less than 90 minutes after being recieved at the laboratory.

平成9年11月20日