Upload
others
View
19
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
1
RRAAPPOORRTT ŞŞTTIIIINNłłIIFFIICC ŞŞII TTEEHHNNIICC
EEttaappaa IIIIII
22000088
CUPRINS
1. Obiective generale
2. Obiectivele fazei de executie
3. Rezumatul fazei
4. Descrierea stiintifica si tehnica
5. Concluzii
2
1. Obiective generale
Obiectivul general al proiectului de platforma (PYRAMID) propune crearea
infrastructurii necesare dezvoltarii cercetarilor in diagnosticarea precoce in patologia
maligna digestiva. Proiectul isi propune folosirea tehnicilor imagistice de ultima
generatie (autofluorescenta endoscopica, tomografie cu coerenta optica,
endomicroscopie confocala laser, etc.), generind crearea unui curent unificator, cu
integrarea cercetatorilor tineri in obiectivele si aria de cercetare FP7.
2. Obiectivele fazei de executie
In cadrul fazei de executie nr 3, derulata in intervalul 21/07/2008-15/12/2008, s-a
urmarit :
Testarea si realizarea de masuratori comparative ut ilizând dispozitivele
de tehnica medicala achizitionate in etapele anteri oare
3. Rezumatul fazei
Relevanta obiectivelor
Proiectul PYRAMID are ca scop completarea si dezvoltarea infrastructurii de
cercetare a UMF Craiova determinind, prin cresterea gradului de utilizare a
infrastructurii de cercetare existente si nou achizitionate, valorificarea potentialului si
a resurselor CDI in plan regional si national, respectiv participarea Centrului de
Cercetare in Gastroenterologie in colaborare cu Disciplinele de Patologie si Biologie
Moleculara, la programe nationale si internationale de cercetare. Proiectul va
favoriza astfel participarea cercetatorilor din UMF Craiova la organizatii stiintifice si
tehnice (ST) internationale, in special prin crearea unor structuri compatibile care sa
permita participarea la programul FP7.
3
De asemenea, au fost achizitionate o serie echipamente necesare dotarii
laboratorului de imagistica digestiva (sistem autofluorescenta endoscopica si
endomicroscopie confocala laser), laboratorului de patologie (linie de citologie
monostrat) si laboratorului de biologie moleculara (secventiator ADN).
Toate achipamentele mai sus menŃionate au fost testate în această etapă
asigurându-se punerea lor în funcŃiune şi utilizarea pentru cercetarea medicală.
Metodologia de implementare a fazei
1. Corelarea dintre obiective si buget : stabilirea unei corelari logice intre
obiectivele fazei, planul de actiune, programul de desfasurare al activitatilor si buget,
stabilirea unui permanent control asupra costurilor, cresterea nivelului de implicare
individuala, a initiativei si colaborarii pentru fiecare membru al echipei proiectului.
2. Tehnicile folosite: Stabilirea procedurilor interne de implementare a fazei,
respectarea locatiilor stabilite pentru implementarea proiectului, asigurarea logisticii
pentru desfasurarea activitatilor fazei, comunicarea permanenta in cadrul echipelor
de lucru si intre echipe, schimburile interactive de informare.
3. Procedurile de evaluare intern ă.
Directorul de proiect, a urmărit in permanenta derularea activitatilor, atingerea
obiectivelor si a rezultatelor fazei prin:
• Raportări lunare privind îndeplinirea activităŃilor propuse în limita timpului alocat
desfăşurării acestora;
• Monitorizarea rezultatelor;
• Evaluarea eficienŃei utilizării resurselor faŃã de rezultatele obŃinute.
Prin aplicarea metodologiei propuse s-a asigurat:
♦ Atingerea obiectivelor fazei;
♦ Corelatia dintre buget si actiunile fazei;
♦ Concordanta dintre programarea activitatilor si perioada de derulare;
♦ Evaluarea permanenta a activitatilor si a rezultatelor obtinute;
♦ Mobilizarea echipei proiectului.
4
Procedurile de achizitie
În această faza nu au fot prevăzute achiziŃii de echipamente.
4. Descrierea stiintifica si tehnica
TESTAREA APARATURII DE CERCETARE
Laborator de imagistica digestiva
Sistem de autofluorescenta endoscopica
Principiul autofluorescentei este bazat pe interactiunea dintre lumina cu o
anumita lungime de unda si fluoroforii din tesuturi. Sursele de lumina folosite includ
surse incoerente (ex. xenon) sau lumina laser monocromatica. Caracterul fluorescent
(profilul spectral) al fiecarui tesut este dependent de
compozitia biochimica si arhitectura morfologica. Cand un
tesut este iluminat cu lumina ultravioleta sau cu lungime de
unda joasa din spectrul vizibil obtinute dintr-o sursa laser sau
lampa cu filtru, este emisa de moleculele endogene
(fluorofori) tisulare o lumina fluorescenta cu o lungime de
unda mai mare. Aceasta autofluorescenta provine din
componentele tesutului conjunctiv (colagen, elastina), din
enzimele metabolismului celular (NADH, etc.), din produsii
biosintezei hemului (porfirine) si din lipopigmenti (lipofuscina,
ceride). Diferite lungimi de unda activeaza diferiti fluorofori,
fiecare emitand intr-o alta lungime de unda. Detectia leziunilor prin autofluorescenta
depinde de schimbarile in concentratia diferitilor fluorofori, modificarile arhitecturale
tisulare sau ambele, incluzand alterarea grosimii mucoasei sau circulatiei sangvine
care pot afecta intensitatea fluorescentei.
Pornind de la principiile mai sus menŃionate sistemul achiziŃionat în cadrul
programului de infrastrcutură PYRAMID a fost pus în funcŃiune şi s-au realizat
primele explorări pentru pacienŃi.
5
Endoscopie digestivă superioară în mod white light (clasic): aspect normal al
mucoasei gastrice
Endoscopie digestivă superioară cu autofluorescenŃă (acelaşi pacient): leziune de
aproximativ 2 cm cu aspect modificat al mucoasei adiacente
6
Endoscopie digestivă superioară în mod NBI (acelaşi pacient): permite o mai buna
caracterizare a aspectului mucoasei şi vascularizaŃiei
Cazul mai sus prezentat relevă importanŃa deosebită a examinărilor
endoscopice cu tehnici de ultimă oră. Examinarea în mod clasic, cu lumină albă nu a
evidenŃiat nici un aspect patologic al mucoasei gastrice în timp ce examinarea cu
autofluorescenŃă a evidenŃiat o leziune de aproximativ 2 cm. Examinarea
anatomopatologică a biopsiilor prelevate a pus diagnosticul de certitudine de cancer
gastric precoce (adenocarcinom) limitat la mucoasă.
Datorită diagosticului extrem de precoce, în stadiu curabil, realizat datorită
noilor tehnici imagistice endoscopice, această pacientă are excelente şanse de
supravieŃuire şi vindecare.
7
TESTAREA APARATURII DE CERCETARE
Laborator de imagistica digestiva
Sistem de endomicroscopie confocala laser
Principiul endomicroscopiei confocale laser este bazat pe integrarea unui
microscop confocal laser in virful unui endoscop conventional. In timpul endoscopiei
se foloseste apoi o raza laser care genereaza o unda de excitatie de 488 nm,
permitind obtinerea de sectiuni optice tisulare de
7 µm cu o rezolutie laterala de 0,7 µm si o
penetratie intre 0 si 250 µm. Avantajul major
consta in obtinerea unor imagini histologice in
vivo cu posibilitatea de a obtine biopsii ghidate.
Desi microvascularizatia, celulele individuale si
tesutul conjunctiv au vizibilitate buna,
diferentierea dintre displazia joasa si inalta nu
sunt inca posibile cu agenti de contrast topici de
tipul fluoresceinei, deoarece contrastul nu
penetreaza nucleii celulelor. Alti agenti de
contrast de tipul acriflavinei sunt folositi cu grija
deoarece au risc potential de activitate mutagenic.
Endomicroscopia confocala laser are
aplicatii multiple: screening-ul carcinomului
colorectal, in special postpolipectomie si in colita
ulcerativa, permitind diagnosticul unor neoplazii intraepiteliale cu acuratete mai buna
decit endoscopia conventionala. Supravegherea esofagului Barrett si a leziunilor
preneoplazice gastrice este de asemenea mai usoara cu microendoscopie confocala
laser. Desi confirmarea diagnosticului necesita inca examene anatomopatologice
conventionale, este posibila folosirea tehnicilor de telemedicina care permit
transmisia in timp real a datelor imagistice catre specialistii anatomopatologi, in
timpul examinarilor endoscopice de catre gastroenterologi.
Sistemul de endomicroscopie achiziŃionat a fost testat şi a început să fie
utilizat în cadrul procedurilor desfăşurate în cadrul Centrului de Cercetare în
Gastroenterologie şi Hepatologie Craiova.
8
Endoscopie digestivă inferioară: aspect normal al mucoasei
Endomicroscopie confocală laser la nivelul colonului (acelaşi pacient):
aspect normal al mucoasei (dispoziŃie regulată a criptelor colonice cu vizaulizarea
celulelor columnare şi caliciforme)
9
Endoscopie digestivă inferioară: formaŃiune tumorală ulcero-vegetantă situată la
nivelul rectului
Endomicroscopie confocală laser la nivelul colonului (acelaşi pacient): arhitectura
glandulara este pastrata, dar glandele sunt inegale, prolifereaza anarhic, tapetate de
epiteliu malignizat - structură de adenocarcinom de colon bine diferenŃiat
10
TESTAREA APARATURII DE CERCETARE
Laborator de Biologie Moleculara
Sistem de secventiere ADN
Sistemul automat de secven Ńiere Beckman Coulter CEQ 8000 permite
detecŃia mutaŃiilor, deleŃiilor şi ambiguităŃilor, detecŃia automată a heterozigoŃilor,
identificarea automată a alelelor cu scor SNP, instabilitatea microsateliŃilor, pierderea
heterozigoŃilor.
Specificitatea sistemul de secvenŃiere a fost evaluată prin analizarea secvenŃei
nucleotidice a unui fragment de ADN plasmidic cu secvenŃă cunoscută.
11
De asemenea au fost evaluate mutaŃiile de la nivelul codonului 12 al genei K-
ras la pacienŃii cu cancer colorectal. ADN-ul a fost izolat şi purificat atât din probe de
Ńesut tumoral provenind de la pacienŃii cu cancer colorectal, cât şi din materiile fecale
ale acestor pacienŃi. Un fragment de 82 de perechi de baze de la nivelul exonului 1,
care conŃine codonul 12, a fost apoi amplificat prin PCR. SecvenŃa fragmentelor
amplificate a fost apoi analizată cu ajutorul sistemului automat Coulter CEQ 8000.
12
O a doua componentă a sistemului achiziŃionat, luminometrul Glomax 20/20
(Promega), a fost utilizat pentru evaluarea calitativă a acizilor nucleici, în paralel cu
evaluarea prin spectrofotometrie (biofotometrul Eppendorf), real-time PCR (în
prezent dispunem de un sistem RotorGene 6200 + HRM de la compania Corbett) şi
cu ajutorul sistemului de fotodocumentare cu camera CCD (Syngene G:Box HR).
Mikro-Dismembratorul U (Sartorius), cu o viteză de agitare de 2000 min-1,
este utilizat în etapa iniŃială de omogenizare a izolării acizilor nucleici. Acest aparat
permite omogenizarea rapidă a probei în condiŃiile reducerii riscului degradării ADN,
ARN şi proteinelor, evitându-se utilizarea enzimelor şi reducând riscul degradării
probelor.
In cadrul laboratorului, aparatul a fost utilizat pentru omogenizarea probelor de
Ńesuturi recoltate de la pacienŃii cu cancer colorectal şi cancer gastric, în vederea
izolării şi purificării ARN-ului.
Pentru extracŃia şi purificarea acizilor nucleici, a fost achiziŃionat extractorul
automat Maxwell® 16 (Promega). Cu ajutorul extractorului automat, a fost izolat
ADN din 32 de probe de sânge şi ARN dintr-o probă de Ńesut malign colorectal.
ConcentraŃiile şi purităŃile acizilor nucleici, măsurate spectrofotometric, sunt redate în
tabelul de mai jos.
NR. crt. Proba ADN µg/ml ADN
260/280 ADN
260/230
1 SP110 48,06 1,72 1,15 2 SP111 35,90 1,81 1,22 3 SP112 44,18 1,88 1,29 4 SP113 44,76 1,80 0,98 5 SP114 27,17 1,75 1,00 6 SP115 36,37 1,65 1,13 7 SP116 43,38 1,77 1,26
8 25Reu 56,92 1,76 1,22
9 FB6 51,46 1,62 1,01 10 FB7 13,97 1,44 0,53 11 71 26,22 1,49 0,83 12 72 26,68 1,83 1,13 13 73 95,28 1,63 1,37 14 73 20,09 1,57 0,99 15 29 36,02 1,74 0,87 16 29 30,24 1,77 1,20 17 SP158 27,99 1,86 0,41
13
18 SP159 44,82 1,69 1,13 19 SP160 100,33 1,76 1,14 20 SP161 58,32 1,80 1,12 21 SP162 55,65 1,78 1,22 22 SP163 50,19 1,79 1,03 23 SP169 52,04 1,79 1,32 24 SP170 42,73 1,82 1,04 25 SP171 67,26 1,48 1,10 26 SP172 29,05 1,83 0,90 27 SP174 23,83 1,84 0,78 28 SP175 44,30 1,78 1,16 29 SP176 10,18 1,90 0,53 30 SP177 40,66 1,81 1,05 31 SP178 60,99 1,80 1,46
32 SP179 58,48 1,84 1,46
ARN µg/ml ARN
260/280 ARN
260/230 33 CRC5 15,2 1,09 0,23
TESTAREA APARATURII DE CERCETARE
Laborator de Patologie
Linie de citologie monostrat
Sistemul de analiza citologica este superior celorlalte sisteme existente in
dotarea serviciului de anatomie patologica din cadrul UMF Craiova prin marile
avantaje pe care le ofera:
� păstrarea viabilităŃii celulelor: celulele prelevate şi incluse în soluŃia de
conservare CYTOFAST îşi păstrează caracteristicile citologice
nemodificate, ceea ce permite recoltarea şi din zone izolate şi
prelucrarea probelor într-un laborator central.
� standardizarea metodei: recoltarea, conservarea şi depunerea celulelor
pe lamă sunt specifice metodei CYTOFAST şi au ca rezultat obŃinerea
de lame standardizate şi de foarte bună calitate.
� sensibilitate: metoda CYTOFAST asigură obŃinerea de probe
reprezentative, permitand citologului o interpretare mult mai rapidă şi
corectă a preparatului microscopic. Pe lângă etalarea celulelor în
monostrat, lamele păstrează şi contextul inflamator al probei, astfel
încât se poate pune un diagnostic complet. Metoda CYTOFAST
permite laboratorului efectuarea şi a unor teste complementare, din
14
aceeaşi probă, fără a fi necesară rechemarea pacientului pentru o nouă
recoltare.
15
TESTAREA APARATURII DE CERCETARE
Realizarea infrastructurii IT si a retelelor de cal culatoare
Pentru a stoca si prelucra imensa cantitate de informatie video achizitionata in
cadrul procesului de cercetare, a fost necesara dezvoltarea unui centru IT dotat cu
tehnica de calcul moderna si performanta si o infrastructura de comunicatii rapida.
Primul pas pentru realizarea acestui obiectiv a fost identificarea si amenajarea
interioara a unui spatiu dedicat activitatilor IT, localizat in aceeasi cladire si in
imediata vecinatate a Centrului de Gastroenterologie si Hepatologie si apoi
interconectarea lor prin conexiuni UTP Cat.5e de mare viteza (gigabit ethernet)
pentru a asigura intercomunicatia de banda larga intre cele doua puncte.
Apoi au fost instalate cele doua servere de stocare si comunicatii, sisteme
Hewlett-Packard special concepute pentru montarea in rack de 19". Serverele sunt in
configuratie quadcore XEON dualprocesor cu harddisk-uri ultrarapide SAS-sff 2.5"
hotpluggable setate in configuratie RAID pentru a asigura o siguranta sporita in
functionare. De asemenea au fost dotate cu surse redundante de tensiune, cu
alimentare dubla, atat directa cat si prin sursa UPS de mare putere. Cu ajutorul unor
patchcord-uri UTP a fost realizata atat conectarea la Centrul de Gastroenterologie si
Hepatologie cat si la reteaua locala a cladirii cu acces de banda larga la Internet.
Toate datele şi imagistica achiziŃionată în timpul examinărilor efectuate în
cadrul Centrului de Cercetare în Gastroenterologie şi Hepatologie sunt transferate şi
stocate în format digital pe serverele achiziŃionate prin acest program. În acest scop
16
au fost create baze de date cu acces foarte rapid pentru introducerea şi obŃinerea de
date despre pacienŃii înregistraŃi.
17
5. Concluzii
Proiectul PYRAMID va completa si dezvolta infrastructura de cercetare a UMF
Craiova determinind valorificarea potentialului si a resurselor CDI in plan regional si
national, respectiv participarea Centrului de Cercetare in Gastroenterologie in
colaborare cu Disciplinele de Patologie si Biologie Moleculara, la programe nationale
si internationale de cercetare.
In cadrul acestei faze au fost testate echipamentele necesare infrastructurii IT si
echipamentele de cercetare de inalta performanta conform descrierii de mai sus.
Director contract,
Prof. Univ. Dr. Adrian Săftoiu